WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |

«РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ ...»

-- [ Страница 6 ] --

Таблица 25 – Оптимальные соотношения сенситина (антигена) и иммуносорбента (бентонита) для получения антиэшерихиозного бентонитового диагностикума (АГЭД) на основе I фракции бентонита ТарнВарского месторождения Титр антисыворотки в РБФ с Соотношение компонентов нативным и фракционированным Вариант диагностикума (адсорбент:

(I фракция ФI) бентонитом опыта сенситин) нативный фракционированный

–  –  –

Из представленных в таблице данных видно, что полученная первая фракция бентонита позволяет повысить чувствительность реакции на 1-2 разведения, по сравнению с образцами, которые подвергались термохимической активации.

Это говорит о том, что фракционированием можно получить сырье, обладающее большей иммуносорбционной активностью. Следует отметить, что мы не отказываемся от термохимической активации сырья, а лишь показываем возможность применения его для структурной модификации бентонита с целью применения его в качестве иммуносорбента.

При проведении дальнейших исследований проводили подбор оптимальных параметров температуры сенсибилизации, оставляя при этом постоянными показатели времени и полученного ранее соотношения компонентов реакции. Сенсибилизацию сорбента проводили при различных температурных интервалах. Сенсибилизация происходила и при более низких температурах, но ее повышение вело и к ускорению процесса сенсибилизации. При этом влияние температуры оценивали в диапазоне температур от 5 до 45оС. Об оптимальном значении температуры судили по значениям титра антисыворотки в РБФ, определенного с помощью вышеописанного метода, в которых сенсибилизацию проводили в указанных диапазонах температур. Результаты исследований представлены в табл. 26.

–  –  –

Из представленных в таблице материалов видно, что оптимальной температурой сенсибилизации иммуносорбента являются значения в диапазоне 30-35оС.

Необходимо отметить, что при увеличении температуры количество прочно связанного сенситина (гипериммунная сыворотка) стабильно увеличивается, что в свою очередь отражается на взаимодействии комплекса бентонит – антигенный компонент. Однако ясно, что степеь прочного связывания сенситина бентонитом при повышении температуры повышается не бесконечно, а лишь до некоторого уровня. В данном случае этим пороговым значением температуры является 40оС. значит, при этом необходимо было выбрать наиболее оптимальное значение температуры, которое установлено опытным путем, что оно равно 30 оС. При этом значении параметра температуры титры антител в РБФ достигают своего наивысшего значения и составляют 1:512. Как показали результаты проведенных работ на процессы прочного связывания сенситина в значительной степени влияют (ТоС) такие параметры, как температура инкубирования смеси и концентрация сенситина.

Среди наиболее существенных факторов, предопределяющих конечный результат реакции бентонитовой флокуляции, является временной интервал сенсибилизации бентонитового сырья и сенситина. Повышение чувствительности РБФ и степени связывания сенситина при удлинении времени сенсибилизации бентонитов обнаружено во многих случаях.

Имеется также немало сведений об окончании сенсибилизации за несколько минут. Все это свидетельствует о том, что зависимость процесса сенсибилизации от длительности нуждается в тщательном исследовании. С этой целью нами были проведены работы по определению оптимальных параметров времени сенсибилизации. Оптимальные параметры соотношения компонентов реакции, а также температурный режим были установлены в работах проведенных ранее. Опыты проводили при следующих значениях экспозиции: 10, 20, 30, 40, 50 и 60 минут. Для этого бентонитовую суспензию смешивали с суспензией 4-пили антигена в соотношении 0,3:0,7 соответственно. Сенсибилизацию проводили при 30оС в течение заданных параметров экспозиции. Далее смеси подвергали центрифугированию, полученные осадки дважды отмывали в дистиллированной воде путем центрифугирования. После проведения двукратного отмывания надосадочную жидкость удаляли, а осадки ресуспендировали в дистиллированной воде до 0,5%-ной концентрации. Полученные образцы использовали при постановке РБФ. Для определения титра антител, в полистироловых планшетах готовили последовательные двукратные разведения антигена в дистиллированной воде в объеме 0,1 мл. Далее в каждую лунку добавляли по 0,1 мл полученных после сенсибилизации комплексов «сенситин – бентонитовая суспензия». Смеси тщательно встряхивали и выдерживали в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре. По истечении времени экспозиции по характеру осадка вели учет результатов реакции. Результаты исследований представлены в табл. 27.

–  –  –

Данные таблицы показывают, что оптимальным значением срока сенсибилизации является значение, равное 30 мин. При данном значении экспозиции сенсибилизации при постановке реакции агглютинации на бентоните титры антител имеют наивысшее значение и составляют 1:512.

При этом оказалось, что явление процессов прочного связывания сенситина и сенсибилизации бентонитов к агглютинирующему действию антисыворотки тесно связано с комплексным характером влияния различных условий на эти процессы. Имеется не одно, а множество сочетаний параметров ряда факторов (продолжительность сенсибилизации, концентрация сенситина, температура среды), обеспечивающих искомый результат взаимодействия сенситина и бентонита. Полученные результаты говорят о потенциальной возможности маневрирования параметрами процесса сенсибилизации при изготовлении диагностикумов.

Таким образом, в ходе проведенных исследований были подобраны оптимальные параметры процесса сенсибилизации иммуносорбента:

соотношение компонентов диагностикума – бентонитовая суспензия / антигенный материал – 0,3:0,7; время сенсибилизации – 30 мин; температура инкубирования смеси – 30оС. Полученные результаты сталиоснованием для составления антигенного бентонитового диагностикума для определения титра антиэшерихиозных, поствакцинальных и постинфекционных антител в организме животных.

Подобранные опытным путем оптимальные значения параметров сенсибилизации (время и температура сенсибилизации, соотношение компонентов) послужили основанием для создания противоэшерихиозного диагностикума нового поколения для бентонитовой флокуляции – АГБД.

При этом в качестве антигена (сенситина) использовали субъединичный 4пили полиантиген, полученный путем аффинной хроматографии пилезных фракций микробных клеток штаммов E. coli, несущих К88, К99, 987Р и F41 антигены. Иммуносорбент – фракция № 1 бентонита в количестве 200 мг суспендировали в 100 м3 дистиллированной воды (0,2%-ный раствор сорбента), в результате чего получали высокоактивную дисперсную суспензию бентонита. Бентонитовую суспензию смешивали с 0,4%-ным раствором сенситина 4-пили антигена в соотношении 3:7 (3 см3 бентонитовой суспензии и 7 мл 0,4%-ного антигена).

Сенсибилизацию проводили в термостате при температуре 30 оС в течение 30 минут. Далее смесь центрифугировали в течение 7 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли. для удаления непрореагировавшей части антигена, не вступившего в реакцию (сенсибилизацию) с бентонитом, полученный осадок двукратно отмывали в 10 мл дистиллированной воды центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин. Супернатант также удаляли, а осадок ресуспендировали в 3,5 мл дистиллированной воды.

Для визуальной оценки комплекса антиген – антитело в тест-системе, образованный комплекс сенситин – бентонитовая суспензия метили специальным индикаторным красителем – метиленовым синим.

Количественное соотношение красителя определяли опытным путем. Для этого использовали различные концентрации индикаторного красителя в пределах от 1,0 до 0,05%. При этом количество вносимого раствора индикатора при определении его оптимальной концентрации было

–  –  –

Из представленных в таблице данных видно, что наиболее оптимальной концентрацией индикаторного красителя – метиленового синего является 0,1%-ный раствор.

После установления оптимальной концентрации индикаторного компонента в бентонитовом диагностикуме, в следующей серии опытов устанавливали оптимальный объем вносимой индикаторной метки, для чего использовали объемы вносимого красителя в диапазоне от 0,1 до 1,0 мл.

Оценку оптимального количества вносимого красителя проводили по результатам реакции бентонитовой флокуляции, а также визуально.

Результаты исследований обобщены в табл. 29.

–  –  –

Данные таблицы 29 показывают, что наиболее оптимальным объемом вносимого индикатора является 0,7 мл - достигается наиболее четкая регистрация результатов реакции и максимальный титр антител.

Таким образом, в результате проведенных работ нами была разработана технология получения экспериментального варианта противоэшерихиозного антигенного бентонитового диагностикума (АГБД). При этом экспериментальным путем были подобраны оптимальные значения параметров сенсибилизации, обеспечивающие наиболее эффективное взаимодействие сенситина и иммуносорбента, что в свою очередь способствовало получению максимально точных результатов РА.

Полученные варианты антиэшерихиозных диагностикумов (антигенные варианты эритроцитарного – АГЭД и бентонитового – АГБД) были использованы в РНГА и РБФ тестсистемах для изучения синтеза поствакцинальных антител на фоне иммунизации животных испытуемыми вариантами субъединичных 4-пили вакцин на основе различных адъювантов.

3.6.3 Оценка гуморального иммунного ответа у лабораторных животных, иммунизированных экспериментальными образцами субъединичной вакцины СП4ПВ Для оценки гуморального иммунного ответа у лабораторных животных были изготовлены различные варианты вакцины СП4ПВ на основе комплекса пили-антигенов и различных адъювантов, состав которых представлен в табл. 30.

–  –  –

контроля. Образцы вакцин, содержащие ГСА (высокодисперсной фракции бентонита) расслаивались на отдельные составляющие фракции – верхнюю – антигенную часть и нижнюю – адъювант. Однако при встряхивании осадок легко разбивался, и образовалась гомогенная масса. Образцы вакцин, содержащие гидроокись алюминия, оставались стабильными в течение всего срока хранения при 4оС, при этом происходило образование рыхлого осадка, легко переходящего в гомогенную взвесь при встряхивании.

Результаты изучения безвредности изготовленных образцов вакцин показали, что все использованные в опытах белые мыши оставались живыми, на месте введения вакцины местных воспалительных реакций или других патологических изменений не вызывали.

Таким образом, изготовленные нами экспериментальные серии вакцины СП4ПВ, содержащие в своем составе пилезные антигены и различные адъюванты, соответствовали требованиям безвредности, стерильности, оставались стабильными при изготовлении и в процессе хранения. Далее проводили изучение реактогенных, серологических и иммуногенных свойств изготовленных вариантов вакцин при экспериментальном эшерихиозе лабораторных животных.

Для изучения антигенной активности опытных вариантов вакцины СП4ПВ в качестве подопытных животных использовали белых мышей массой 18-20 г.

Каждым образцом вакцины прививали группу животных (n=10), сформированную по принципу аналогов. Инъекцию вакцины проводили подкожно в дозе 0,1 см3. Перед иммунизацией препарат (вакцину) разводили в 10 раз, исходная концентрация которой составляла 0,4%, т.е. в 1 см3 препарата содержалось 4 мг антигена (белка), а после 10-кратного разведения концентрация антигена составляла 0,04 мг/см3. Следовательно, в 1 см3 вакцины содержалось 0,04 мг пилезного (белкового) антигена. Взятие крови для серологических исследований осуществляли перед вакцинацией (0), и

–  –  –

К99 – 0,1% 4,5±0,09 7,3±0,51** 8,1±0,35** 987Р – 0,1% 5,7±0,71 8,7±0,45** 9,3±0,55**

–  –  –

К99 – 0,1% 4,6±0,11 7,5±0,45* 7 8,3±0,53* 987Р – 0,1% 5,8±0,25 8,8±0,51** 9,5±0,75**

–  –  –

ПАГ К88 – 0,1% 0,39±0,01 1,0±0,05 1,2±0,03 К99 – 0,1% 4,1±0,07 7,0±0,69* 7,7±0,29* 987Р – 0,1% 4,9±0,57 7,8±0,85* 8,9±0,37*

–  –  –

ГСА(ВФБ) – 0,1% ГСА (ВФБ) – гидросиликат алюминия – высокодисперсная фракция бентонита.

Из данных, представленных в табл. 35 видно, что использование высокодисперсной фракции бентонита (ГСА – ВФБ) в испытуемой вакцине также оказывало адъювантное действие, стимулируя синтез антиэшерихиозных антител в организме иммунизированных белых мышей, занимая 4-ую позицию по эффективности испытуемых вариантов вакцины.

Хотя по иммуностимулирующей активности этот препарат уступал вакцине СП4ПВ № 3 (адъювант апизан), однако он незначительно уступал тимогену и Т-активину, однако был предпочтительнее, чем гидроокись алюминия.

Сопоставительный анализ исследований показал, что введение всех вариантов экспериментальных серий вакцины СП4ПВ № 1, № 2, № 3, № 4 и № 5 вызывало формирование выраженного иммунного ответа у подопытных животных. При этом также достоверно установлено, что использование различных типов адъювантов в составе экспериментальных образцов вакцин, оказывало неодинаковый иммуностимулирующий эффект на организм лабораторных животных, что выразилось в различиях титров антител, синтезируемых в ответ на введение того или иного образца вакцины.

По степени стимуляции синтеза антител использованные адъюванты противоэшерихиозной вакцины занимали следующий убывающий ряд:

апизан+ВФБ Т-активин тимоген ГСА (ВФБ) ГОА. При этом индекс стимуляции иммуногенеза (ИСИ) у препарата апизан по отношению к базовому адъюванту – ГОА (гидроокись алюминия) составлял 1,78; Тактивина – 1,15; тимогена – 1,19; ГСА (ВФБ) – 1,08 раза.

3.6.3.1 Изучение иммуногенной активности противоэшерихиозной вакцины СП4ПВ Опыты по изучению иммуногенных свойств испытуемых вариантов вакцин СП4ПВ № 1, № 2, № 3, № 4 и № 5 проводили на 160 белых мышах, разделенных на 16 групп по 10 животных в каждой. Животных 1-й, 2-й и 3-й групп вакцинировали однократно подкожно в дозе 0,1 см3 вакциной СП4ПВ № 1, содержащей 0,04 мг/см3 субъединичного антигена (0,008 мг/мышь) и через 7 (1-я группа), 14 (2-я) и 30 дней (3-я группа) внутрибрюшинно заражали суточной культурой вирулентного штамма E. coli «КВ1» в дозе 0,5 см3, содержащей 1109 м.к./см3. Животных 4-й, 5-й и 6-й групп прививали вакциной СП4ПВ № 2 и заражали возбудителем эшерихиоза в аналогичных дозах вакцины и вирулентного штамма E. coli. Животных 7-й, 8-й и 9-й групп прививали вакциной СП4ПВ № 3 и заражали E. coli «КВ1» в аналогичных дозах и условиях, что и 1-й, 2-й и 3-й групп соответственно. Животных 10-й, 11-й и 12-й групп иммунизировали вакциной СП4ПВ № 4, через 7, 14 и 30 сут заражали вирулентным штаммом возбудителя эшерихиоза, используя аналогичные дозы иммунизации и заражения животных 1-й, 2-й и 3-й групп соответственно. Животных 13-й, 14-й и 15-й групп иммунизировали вакциной СП4ПВ № 5 и заражали через 7, 14 и 30 дней в аналогичных дозах и условиях, использованных для 1-й, 2-й и 3-й групп соответственно.

Неиммунизированные, но зараженные животные 16-й группы служили контролем заражения. Опыты проводили совместно с к.в.н. Спиридоновым Г.Н. За привитыми и зараженными эшерихиозным возбудителем животными вели клинические наблюдения, учитывая при этом сроки и количество павших мышей по группам. В качестве показателя оценки профилактической эффективности испытанных вариантов вакцин использовали выживаемость в процентах (ПЗ, %) или абсолютный иммунитет (АИ, %).

Результаты изучения иммуногенности экспериментальных вариантов вакцин СП4ПВ на основе пили-антигенов и различных адъювантов приведены в табл. 36.

Таблица 36 – Иммуногенность субъединичной вакцины СП4ПВ для белых мышей в зависимости от вида использованных адъювантов Вариант Срок после Группа Число вакцины иммуниза- Пало Выжило ПЗ, % животных животных СП4ПВ ции, сут №1 2 14 10 4 6 60 №2 5 14 10 4 6 60 №3 8 14 10 2 8 80 №4 11 14 10 5 5 50 №5 14 14 10 5 5 50

–  –  –

Из представленных в таблице материалов видно, что все варианты экспериментальной вакцины показали достаточно высокую иммуногенную активность, защищая животных от гибели при экспериментальном эшерихиозе в 70-90% случаев. При этом видно, что одинаковой протективной активностью обладали варианты вакцины, приготовленные с содержанием в качестве адъювантов тимоген (СП4ПВ № 1), Т-активин (СП4ПВ № 2) и гидросиликат алюминия (СП4ПВ № 5), которые защитили от гибели 70% животных, зараженных возбудителем эшерихиоза.

Вариант вакцины, где в качестве адъюванта использовали гидроокись алюминия оказался наименее иммуногенным - сохранность зараженных возбудителем эшерихиоза животных в этих группах (10-я, 11-я и 12-я) составляла 40 (на 7-й день после вакцинации), 50 (14-й день) и 60% (30-й день после вакцинации).

Из всех экспериментальных вариантов вакцины наибольшую эффективнсть проявила вакцина СП4ПВ № 3, которая уже на 7-й день после инъекции обеспечивала сохранность 70% зараженных животных, на 14-й день – 80% и достигнув максимума к 30-м суткам, обеспечивала 90% сохранность животных при экспериментальном эшерихиозе.

Данные, полученные в ходе исследований говорят о значительном преимуществе прививки животных вакциной СП4ПВ № 3, составленной на основе 4-пили антигенов с добавлением 0,1% апизана и 0,1% высокодисперсной фракции монтмориллонита в качестве адъюванта.

Сопоставительный анализ данных таблиц 35-39 и 40 показал, что между титрами антител и выживаемостью животных существует прямая корреляция. Так, наиболее высокие титры антител в РНГА и ИФА тестсистемах были зафиксированы уже на 7-й день после иммунизации животных вакциной СП4ПВ № 3 (8,7 log2 и 9,3 log2 соответственно), которые

–  –  –

Данные таблицы 37 показывают, что титры поствакцинальных специфических антиэшерихиозных антител в ИФА тест-системе с индексом защиты 8,1-8,5 обеспечивают создание иммунитета с 50%-ной защитой животных от экспериментального заражения возбудителем эшерихиоза. Для 60%-ной защиты животных от экспериментального заражения индекс защиты составляет 9,3-9,8. При индексе защиты в пределах 9,3-10,6 абсолютный иммунитет составляет 70%, а для 80-90%-ной защиты животных от экспериментального заражения возбудителемэшерихиоза, рассчитанные индексы защиты составляют в диапазоне от 10,7 до 12,6.

Таким образом, при ИЗ сывороток крови, равном 7,7 и ниже животные частично устойчивы к экспериментальному эшерихиозу (иммунитет 40%),

–  –  –

Из данных таблицы видно, что в изученных пределах доз наблюдается прямая корреляция между защитной эффективностью и дозой вводимого препарата. Сохранность белых мышей при однократном подкожном введении вакцины СП4ПВ № 3 составила 80%. Подобный профилактический эффект достигался при однократной иммунизации белых мышей 0,10 мл субъединичной вакцины. Расчеты показали, что иммунизирующая доза, которая обеспечивала 50%-ную сохранность привитых животных достигается при применении 0,011±0,002 мл исходного препарада (IД50 = 0,011 мл), а число иммунизирующих доз в 1 мл вакцины составляет 90,9±13 IД50.

Введение регламентированной при эшерихиозе формолвакцины поливалентной гидроокисьалюминиевой (контроль) в дозах, использованных для испытуемой вакцины СП4ПВ (0,1; 0,02; 0,004 и 0,0008 мл) оказалось менее эффективным – доза 0,1 мл обеспечивала защиту от экспериментального зэшерихиоза только 40% животных, 0,02 – 20%, 0,004 – 13,3% и 0,0008 мл – 6,7% животных, что уступает субъединичной вакцине в 2 раза (Р0,05).

Таким образом, экспериментальная субъединичная вакцина, разработанная нами, проявляет высокую иммуногенность и обеспечивает сохранность более 80% лабораторных животных от смертельных доз возбудителя, что позволило провести испытание ее на сельскохозяйственных животных.

3.6.4 Оценка эффективности разработанной вакцины для защиты телят и поросят от колибактериоза 3.6.4.1 Изучение профилактической эффективности субъединичной вакцины СП4ПВ для защиты телят Работу проводили в условиях СПК им. 1 Мая Нижегородской области, неблагополучного по колибактериозу.

Под опытом находились 30 стельных коров черно-пестрой породы. При этом было использовано 2 вида вакцины: субъединичная 4-пили вакцина СП4ПВ № 3 на основе адъюванта апизана и высокодисперсной фракции бентонита; формолвакцина поливалентная гидроокисьалюминиевая биофабричного производства.

Коровам (10 голов) 1-й группы вводили подкожно субъединичную 4пили вакцину в дозе 5 мл за 6 недель до отела. Коровам 2-й группы (10 голов) аналогичного срока стельности вводили внутримышечно, двукратно с интервалом в 14 дней в дозах по 15 мл на каждое введение, формолвакцину поливалентную гидроокисьалюминиевую (ФВ ПВ ГОА). Коров 3-й группы не иммунизировали и они служили контролем.

У вакцинированных и контрольных коров до и после иммунизации в динамике в сыворотке крови определяли уровень антител в ИФА тестсистеме с 4-пили полиантигеном. Параллельно до и после отела в молочной сыворотке иммунизированных двумя различными вакцинами коров определяли уровень антител к К88, К99, 987Р и F41 – антигену в ИФА тестсистеме с использованием антигенного варианта диагностикума на основе К88, К99, 987Р и F41 – пили антигенов. За народившимися телятами вели клиническое наблюдение, регистрируя число заболевших и павших от диареи животных.

Результаты серологического исследования сывороток крови и молозива вакцинированных испытуемыми препаратами и невакцинированных коров представлены в таблицах 39, 40.

–  –  –

Из материалов табл. 39 видно, что оба использованных варианта противоэшерихиозных вакцин индуцировали в организме коров синтез специфических антител, уровень которых зависел от состава использованных препаратов. Так, если у иммунизированных регламентированной антиэшерихиозной вакциной титры специфических антител в сыворотке крови на 14-й день после введения вакцины повышались в 2,08 раза (Р0,01), то после применения экспериментального образца субъединичной вакцины СП4ПВ титры антител превышали контрольный уровень в 3,02 раза (Р0,001), а уровень сравниваемой вакцины – в 1,48 раза (Р0,05).

Результаты параллельных серологических исследований проб сывороток молозива вакцинированных и невакцинированных коров, а также сывороток крови полученных от них телят показали достоверную разницу титров антител в указанных объектах, полученных от иммунизированных и неиммунизированных животных. При этом установлено, что сыворотка молозива коров и сыворотка крови телят, полученных от иммунизированных коров, содержали достоверно высокий уровень специфических антител.

Как видно из табл. 40, сыворотка молозива иммунизированных регламентированной при эшерихиозе формолвакциной поливалентной гидроокисьалюминиевой (ФВ ПВ ГОА) коров титр антител в ИФА тестсистеме составлял 5,78 log2 против 2,21 в контроле (невакцинированные) (Р0,02). Применение субъединичной 4-пили вакцины оказывало на иммунную систему более высокое антигенное воздействие – уровень специфических антител в сыворотке молозива составлял 8,57 log2, что превышает уровень антител в молозиве невакцинированных коров в 3,71 раза (Р0,001), а таковой иммунизированных регламентированной вакциной (ФВ ПВ ГОА) коров – в 1,48 раза (Р0,05).

Результаты изучения выживаемости народившихся от иммунизированных 2 видами вакцин и невакцинированных коров представлены в табл. 41.

–  –  –

Из данных таблицы видно, что в контрольной группе телят (от невакцинированных коров) из 10 народившихся телят 8 заболело диареей и пало 7 в течение 24-72 часов. У телят от коров, иммунизированных субъединичной 4-пили вакциной (СП4ПВ), диареи наблюдали у 3-х животных, 1 из которых пало. Сохранность составила 90%. Из 10 телят от коров, иммунизированных двукратно с интервалом в 14 дней внутримышечно формолвакциной поливалентной гидроокисьалюминиевой (ФВ ПВ ГОА) заболело 6 и пало 2 животных в течение 24-72 часов.

Сохранность составила 80%.

Из сопоставительного анализа полученных данных видно, что при серологических исследованиях сывороток молозива коров контрольной группы титр колостральных антител был минимальным (2,31 log2), что не могло обеспечить защиту животных от эшерихиозной диареи. В молозиве вакцинированных коров 1-ой группы (субъединичная 4-пили вакцина СП4ПВ) выявлены антитела в ИФА тест-системе в титрах 8,57 log2 против 2,31 log2 контроля. Молочная сыворотка коров, иммунизированных регламентированной против колибактериоза телят вакциной (ФВ ПВ ГОА) также содержала антитела к К88, К99, 987Р и F41 антигенам, что обеспечивала сохранность 80% новорожденных телят от диареи.

Следовательно, отмечена корреляция между титром колостральных антител и сохранностью телят в неблагополучном по колибактериозу хозяйстве.

3.6.4.2 Изучение профилактической эффективности субъединичной вакцины СП4ПВ для защиты поросят Работу проводили в неблагополучном по эшерихиозной диарее поросят хозяйстве - ООО «Авангард» Нижегородской области.

В опытах использовали 36 супоросных свиноматок, разделенных на 3 группы по 12 животных в каждой. Животных 1-й группы за 5-6 недель до опороса однократно подкожно иммунизировали субъединичной 4 пилезной вакциной СП4ПВ в дозе 5 мл. Животных 2-й группы двукратно с интервалом 14 дней внутримышечно иммунизировали формолвакциной поливалентной гидроокисьалюминиевой (ФВ ПВ ГОА) против колибактериоза поросят в дозе по 5 мл на первое и 6 мл на второе введение. Супоросных свиноматок 3й группы не иммунизировали и они служили контролем.

У вакцинированных и контрольных животных до и после иммунизации в динамике в сыворотке крови определяли уровень специфических антител в ИФА тест-системе с использованием 4 пилезного полиантигена. Параллельно до и после опороса в молочной сыворотке иммунизированных различными вакцинами свиноматок определяли уровень специфических антител к поли – К88, К99, 987Р и F41 – антигену в ИФА тест-системе.

За народившимися поросятами вели клиническое наблюдение, регистрируя число заболевших и павших от диареи животных.

Результаты динамического наблюдения за поросятами показали, что смертность в контрольной (невакцинированной) и опытных (вакцинированных) группах зависела как от иммунизации свиноматок, так и от вида использованного профилактического средства (вакцины) (табл. 42).

–  –  –

Из данных табл. 42 видно, что в группе поросят, полученных от иммунизированных субъединичной 4 пилезной вакциной СП4ПВ число случаев заболевания колибактериозной диареей была минимальной и сохранность составляла 91,8%. В контрольной группе поросят, полученных от невакцинированных свиноматок сохранность составляла 41,9%.

Двукратное с интервалом в 14 дней внутримышечное введение формолвакцины поливалентной гидроокисьалюминиевой оказывало защитный эффект при колибактериозе, обеспечивая 78,1%-ную сохранность поросят.

Результаты серологических исследований сывороток крови, иммунизированных испытуемыми вакцинами и невакцинированных свиноматок, показали наличие хорошей корреляции между уровнем антител и защитой новорожденных поросят, что иллюстрируется данными табл. 43 и 44.

–  –  –

Из данных, приведенных в табл. 43 и 44, видно, что у вакцинированных препаратами СП4ПВ и ФВ ПВ ГОА свиноматок и родившихся от них поросят появились и накапливались агглютинирующие антитела против 4 пилезных (адгезивных) антигенов. При этом, как видно из данных таблиц, синтез антител в ответ на введение субъединичной вакцины СП4ПВ был более интенсивным – титры антител в сыворотке крови в ИФА тест-системе у свиноматок 1-й группы на 15-й день после иммунизации превышали таковые контрольных (невакцинированных) в 5,28 раза (Р0,001), составляя 7,92 log2 против 1,50 log2 в контроле. Применение регламентированной вакцины ФВ ПВ ГОА индуцировала выработку антител в титре 5,08 log2.

Аналогичная тенденция синтеза антител просматривалась при исследовании сывороток крови поросят, полученных от иммунизированных двумя различными по антигенному составу противоэшерихиозных вакцин.

Так, из данных таблицы 47 видно, что титры специфических антител в сыворотке крови поросят 1-й группы, полученных от иммунизированных субъединичной вакциной СП4ПВ свиноматок, превышали контрольный уровень в 6,69 раза (Р0,001), а уровень поросят 2-й группы (ФВ ПВ ГОА) – в 1,77 раза (Р0,01).

Из анализа данных таблиц видно, что просматривается хорошая корреляция между уровнем антител и защитой новорожденных поросят. Так, использование субъединичной 4 пилезной вакцины СП4ПВ на 15-30 дни после вакцинации индуцирует синтез специфических антител в титрах 7,92log2, что обеспечивает выживаемость 91,8% народившихся поросят.

Титры антител 5,08-6,01 log2, синтезированных в ответ на введение в организм свиноматок регламентированной при эшерихиозе поросят вакцины ФВ ПВ ГОА, обеспечивали защиту 78,1% животных от колидиареи, что в 1,19 раза менее эффективно по сравнению с испытуемой вакциной.

Таким образом, однократное подкожное введение субъединичной 4 пилезной вакцины СП4ПВ в дозе 5 мл за 6 недель до опороса свиноматок, обеспечивает выживаемость 91,8% новорожденных поросят при колибактериозе. Такая степень антиэшерихиозной защиты новорожденных поросят достигается за счет синтеза специфических антител против 4 пилезных антигенов (К88, К99, 987Р и F41).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В современных условиях массовые желудочно-кишечные заболевания новорожденных телят и поросят регистрируются в различной степени тяжести более чем в 80% животноводческих хозяйст и причиняют огромный экономический вред животноводству многих стран. Широкому распространению их способствует, с одной стороны, воздействие многочисленных технологических и техногенных стресс-факторов, оказывающих негативное влияние на физиологическое состояние организма животных и приводящих к снижению естественной резистентности, и с другой – наличием благоприятных условий для многократного пассажа условно-патогенной микрофлоры из-за высокой скученности поголовья, неоднородности его иммунного статуса, комфортных условий среды обитания для возбудителей [11, 50, 72, 100, 210, 239, 283, 295]. Известно, что 70-80% падежа молодняка молодняка сельскохозяйственных животных приходится на первые 2-3 недели после рождения, а общие потери от падежа по причине желудочно-кишечных болезней, с признаками диареи, в течении продолжительного времени составляют примерно 50% от общего количества падежа молодняка [56, 57, 137, 212, 213, 237, 238, 295].

В настоящее время основным направлением борьбы с желудочнокишечными заболеваниями новорожденных телят и поросят является активная иммунизация глубокостельных коров и супоросных свиноматок для создания колострального иммунитета с целью защиты новорожденных от данных инфекций. В последние годы большинство авторов сходится во мнении, что с целью создания у новорожденных животных колострального иммунитета необходимо вакцинировать стельных коров и нетелей за 50-60 дней до отелов, свиноматок – за 30-35 дней до опороса против основных бактериальных и вирусных инфекций. При этом потомство будет получать готовые антитела с молозивом [144, 146, 192, 210, 237, 238, 246, 248, 274].

Вакцинацию следует всегда рассматривать как мероприятие вынужденное, проводить ее следует только в тех случаях, когда для этого есть эпизоотологические показания.

В России разработаны различные ассоциированные и моновалентные вакцины против желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят и поросят бактериальной и вирусной этиологии, в том числе против эшерихиозов, которые применяются в различных регионах [3, 189, 190, 192, 200, 201, 222, 225, 226, 227, 228, 258, 274, 296, 303].

Однако из-за наличия большого множества серотипов, сложной антигенной структуры возбудителя эшерихиоза, несмотря на определенные успехи в борьбе с колидиареей молодняка сельскохозяйственных животных, до настоящего времени вопросы специфической профилактики и лечения данной патологии остаются несовершенными.

Анализ литературы показывает, что для конструирования антиэшерихиозного профилактического (вакцинного) препарата более эффективным является использование не цельноклеточных, а субъединичных вакцин на основе адгезивных антигенов, полученных из очищенных пилей (фимбрий), выделенных из штаммов, содержащих антигены К88, К99, 987Р и F41.

При этом, с учетом литературных данных о том, что сочетание антигенов с иммуномодуляторами ведет к существенному повышению иммунного ответа, мы поставили перед собой задачу получения комплексных антигенов на основе пилезных антигенов и продуктов пчеловодства, как одного из эффективных иммуномодуляторов, а в качестве депонирующих агентов – субъединичные фракции природных адсорбентов – монтмориллонитов.

На 1-м этапе работы проводили исследования по выделению (очистке) адгезивных (пилезных) антигенов. В качестве продуцентов адгезивных антигенов (пилий) использовали энтеротоксигенные штаммы E. coli: «ПЛ-6»

- продуцирующий адгезивный антиген К88, «КВ-1» - продуцирующий адгезивный антиген К99, «УК-2» - продуцирующий адгезивный антиген 987Р и «ПЗ-3» - продуцирующий адгезивный антиген F41, выделенные из организма больных эшерихиозной диареей поросят и телят. Изолирование и очистку пили осуществляли согласно методике, разработанной M.Kuzuya et al. [348].

В результате проведенных исследований на этом этапе работы нами было получено 4 пили – антигена E. coli (К88, К99, 987Р и F41), которые стандартизировали по белку до 10%-ной концентрации и оставляли на хранение для конструирования комплексной субъединичной (пилезной) вакцины.

При составлении композиционного препарата использовали в качестве иммуномодуляторов Т-активин, тимоген а также апизан, полученный из подмора пчел проф. Низамовым Р.Н. в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» [170].

Учитывая, что в соответствии с требованиями Фармакопеи РФ, каждый препарат, предлагаемый для лечения и профилактики заболеваний, должен пройти токсикологическую экспертизу, проводили исследования по определению острой токсичности апизана на белых мышах.

В результате проведенных токсикологических исследований установили, что 50%-ная летальная доза (ЛД50) апизана при пероральном введении и рассчитанная по методу Кербера, составила 2410 мг/кг веса, на основании чего препарат отнесен к группе малотоксичных веществ.

Хитозан, полученный из пчел, обладает уникальными биологическими (гепатопротекторным – защита печени от избытка жира, холестерина, противоязвенным, антитоксическим, радиопротекторным, антиоксидантным,

–  –  –

Вышеперечисленные уникальные свойства хитозана (апизана) послужили основанием для использования его в качестве одного из потенциальных иммуномодуляторов и иммуностимуляторов при конструировании антиэшерихиозных лечебно-профилактических препаратов.

В качестве иммуносорбента при конструировании субъединичного 4пили полиантигена использовали монтмориллонитовую фракцию алюмосиликатов (бентанитов) Тарн-Варского месторождения Республики Татарстан, как наиболее активного представителя алюмосиликатов, содержащих максимальное количество активно действующих компонентов глин – монтмориллонитовую фракцию глинистых минералов.

В результате исследований нами было сконструировано пять вариантов субъединичных противоэшерихиозных вакцин.

При этом экспериментальный образец вакцины № 1 представляет собой полиантиген, содержащий в 1 мл 5 мг активно действующего вещества (АДВ), из которых 4 мг (по 1 мг каждого) составляют пилезные антигены К88, К99, 987Р и F41 и 1 мг адъюванта тимогена. Состав вакцины № 2 аналогичен, но с той разницей, что в качестве адъюванта содержит 1 мг Тактивина. Вакцина № 3 имеет тот же антигенный состав, но включающий в качестве адъюванта биополимер – апизан в количестве 1 мг и 1 мг высокодисперсной фракции бентонита; состав вакцины № 4 аналогичен предыдущим, но с той разницей, что в качестве адъюванта содержит 1 мг гидроокиси алюминия (ГОА) и состав вакцины № 5 аналогичен предыдущим, но с той разницей, что в качестве адъюванта содержит 1 мг высокодисперсной фракции монтмориллонита.

В следующей серии опытов, полученные на предыдущем этапе работы антигенные комплексы на основе пили антигенов и адъювантов были использованы в качестве иммунизирующих агентов с целью получения лечебных антиэшерихиозных сывороток.

В результате проведенных исследований было получено 12 образцов кроличьих антисывороток и 7 образцов элюатов из органов животных – реконвалесцентов.

Из гипериммунных сывороток и элюатов из органов выделяли глобулины методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония в соответствии с общепринятыми в экспериментальной иммунохимии методами [138]. Полученные сывороточные и тканевые иммуноглобулины, после скрининговых исследований, были использованы в качестве основных компонентов при конструировании противоэшерихиозных лечебных препаратов.

Для экстренной оценки эффективности потенциальных лечебнопрофилактических препаратов использовали культуру лимфоцитов, выращенных in vitro в описании Р.Р. Гайзатуллина [46].

В качестве критерия оценки жизнеспособности клеток на фоне воздействия на них испытуемого энтеротоксина использовали выживаемость и гибель иммуноцитов, выражая конечный эффект в количестве или процентах погибших или выживших лимфоцитов.

Исследования показали, что гибель клеток тест-культуры наступает при внесении в суспензию клеток лимфоцитов эшерихиозного энтеротоксина в концентрации 42,6 мкг/мл. В отдельных опытах определяли оптимальные концентрации антигенов, не оказывающих угнетающего действия на метаболизм культур клеток в условиях совместного культивирования их с испытуемыми иммунопротекторами. Для этой цели интактные лимфоциты инкубировали с различными концентрациями испытуемых пили антигенов (субъединичных вакцинных препаратов) (от 1 до 1 тыс. мкг/мл по белку) в течение 4, 24 и 48 часов.

Результаты микроцитометрических исследований показали, что внесение в инкубационную среду с лимфоцитами испытуемых антигенов и монтмориллонитов в концентрациях от 1 до 1000 мкг/мл токсического действия не оказывало – в обработанных эритрозином мазках увеличения количества окрашенных (нежизнеспособных) клеток по сравнению с контролем не происходило. С учетом полученных результатов концентрации вносимых в инкубационные среды испытуемых субъединичных антигенов, в зависимости от состава испытуемых вакцинных препаратов, составляли от 10 до 50 мкг/мл.

Полученные в предварительных опытах данные по определению летальных доз эшерихиозного эндотоксина для клеток in vitro тест-системы (лимфоцитов) и оптимально переносимые дозы испытуемых антигенов на культивируемые клетки послужили основанием для проведения скрининговых исследований по определению протективной активности антигенов.

Исследования показали, что наиболее высокой протективной активностью из испытанных вариантов экспериментальных образцов вакцин обладала субъединичная 4-пили вакцина № 3, изготовленная путем смешивания равных объемов 0,1%-ных растворов антигенов К88, К99, 987Р и апизан + 0,1%-ная высокодисперсная фракция F41 + 0,1%-ный монтмориллонита (0,6%-ный раствор антигенов, иммуномодулятора и иммуносорбента), которая обеспечивала защиту от эшерихиозной гибели 75,6% лимфоцитов.

–  –  –

Первичную оценку иммунотерапевтической активности сывороточных и тканевых глобулинов проводили также в культуре лимфоцитов.

При этом в инкубационную среду с лимфоцитами вносили эндотоксин E. coli в концентрации 42,6 мкг/мл, затем инкубировали лимфоциты в течение 30 мин и по истечении указанной экспозиции вносили испытуемые лечебные препараты (сывороточные и тканевые – гистоглобулины) в количестве от 0,010 до 0,020 мг/мл, инкубировали в течение 4, 24 и 48 часов.

Было установлено, что из испытанных 20 вариантов препаратов (глобулинов), наиболее высокой иммунопротекторной активностью обладала антисыворотка, полученная на 30 сут опыта от выживших после экспериментального заражения возбудителем эшерихиоза животных, которая обеспечивала выживаемость 85,9% пораженных энтеротоксином E. coli лимфоцитов при совместном культивировании подвергнутых токсическому воздействию клеток с испытуемыми глобулинами.

Вторую позицию по степени иммунопротекторной активности препаратов занимала антисыворотка крови кроликов, иммунизированных 1кратно 4-пили антигеном (субъединичной вакциной), полученная на 30 сут после иммунизации кроликов, которая при постинкубационном культивировании подвергнутых воздействию энтеротоксина E. coli лимфоцитов с испытуемым препаратом обеспечивала выживаемость 82,1% пораженных токсином иммуноцитов.

Антисыворотка, полученная от 1-кратно иммунизированных смесью 4 анатоксинов из штаммов E. coli – носителей К88, К99, 897Р и F41 антигенов на 20 день после иммунизации, предупреждала гибель 66,7% пораженных эндотоксином лимфоцитов при совместном постинкубационном инкубировании их с испытуемой сывороткой (глобулином).

Кроме того, следует отметить, что из испытанных 7 вариантов тканевых глобулинов (гистоглобулинов), наиболее активными оказались глобулины, полученные из печени, лимфатических узлов, обеспечивая выживаемость пораженных энтеротоксином E. coli лимфоцитов в 79,3% (печень), 75,5 (лимфатические узлы) случаев соответственно.

В целом препараты при совместном постинкубационном культивировании лимфоцитов обеспечивали 79,3-85,9%-ную выживаемость пораженных энтеротоксином E. coli иммуноцитов. Поэтому указанные глобулины были отобраны в качестве основных компонентов для конструирования антиэшерихиозных лечебных препаратов.

Результаты исследований, проведенных в последние годы по повышению устойчивости организма к экстремальным воздействиям, основанные на концепции о биологическом действии комплексных адаптогенов, показали, что вещества фитогенного, зоогенного, микробного и природного (минерального) происхождения способны регулировать гомеостаз путем стимулирующего и тонизирующего действия на организм [101, 106, 107, 179, 218].

С учетом этой концепции нами сконструирован композиционный противоэшерихиозный лечебно-профилактический препарат «Пабисорб» в жидкой форме на основе полиглобулинов (компонент I), включающий 0,7 объема (частей) глобулинов сыворотки крови 1-кратно иммунизированных субъединичной противоэшерихиозной 4 – пили вакциной животных, 0,3 объема (частей) 4%-ного раствора экстракта биологически активной кормовой добавки «Вита-Форце М», в которых растворены порошки из продуктов метаболизма B. bifidum в количестве 0,2% и высокодисперсной фракции монтмориллонита в количестве 2% от общего объема препарата. В целом в 1 л композиции «Пабисорб» содержится 104,0 г (10,4%-ный раствор) биологически активных веществ (БАВ), из которых 70 г составляют сывороточные и тканевые глобулины, 12 г сухих экстрактивных веществ фитозоопрепарата «Вита-Форце М», 2 г – продуктов метаболизма B. bifidum и 20 г – высокодисперсной фракции природного минерального сорбента – монтмориллонита.

В результате подбора оптимального соотношения компонентов в сконструированном противоэшерихиозном препарате достигается значительное (на 30%) снижение расхода одного из дорогостоящих компонентов композиции – полиглобулинов за счет использования в препарате усилителей его фармакологической активности: натуральной биологически активной кормовой добавки «Вита-Форце М» (фито-зооаписогенный компонент), метаболиты (бифидогенный – B. bifidum пробиотический компонент) и микрочастиц природного минерала – монтмориллонита (сорбционно-детоксикационный, депонирующий и доставляющий терапевтические компоненты композиции пораженным клеткам – мишеням организма).

Учитывая, что в зависимости от формы, характера, напряженности и длительности течения колибактериоза, возникает необходимость длительного перорального применения антибактериальных лекарственных средств, параллельно готовили порошковую (пероральную) форму препарата.

Для составления композиции «Пабисорб 1», в расчете на 1 кг (масс.%), брали 630 г порошка препарата «Вита-Форце М», 150 г хвойной муки, 100 г кровяной муки, 100 г бентонита и 20 г метаболита B. bifidum.

Сконструированные в результате проведенных на 1-м этапе работы экспериментальные серии противоэшерихиозных лечебно-профилактических композиционных препаратов («Пабисорб», «Пабисорб 1»), изготовленных как в жидкой (инъекционной), так и порошковой (пероральной) формах, на следующем этапе работы были испытаны на иммунотерапевтическую активность на больных колибактериозом телятах и поросятах личных подворий граждан и сельхозпредприятий Краснооктябрьского и Сеченовского районов Нижегородской области.

Перед началом основных опытов по оценке антиэшерихиозной активности разработанных экспериментальных серий лечебнопрофилактических препаратов «Пабисорб» и «Пабисорб 1», в соответствии с требованиями Фармакологического комитета МЗ РФ, проводили изучение токсичности и безвредности препаратов на лабораторных животных (белые мыши, крысы, морские свинки) путем фармакологических и токсикологических исследований с целью выявления возможного развития и характера побочных явлений, связанных со скармливанием препарата, и установления соотношения между дозами, дающими терапевтический эффект и вызывающими токсические явления.

Результаты токсикологических исследований показали, что препарат является малотоксичным (IV класс опасности), не обладает кумулятивным, аллергизирующим, тератогенным и раздражающим действием на кожу и слизистую оболочку желудка. Он повышает физиологический и иммуногемопоэтический статус, росто-весовые качества крыс, а также оказывает стимулирующее влияние на факторы неспецифической резистентности организма, которые в совокупности могут обеспечить эффективную защиту организма в условиях воздействия на него инфекционных агентов.

–  –  –

В качестве биологической модели эшерихиозного поражения организма использовали белых мышей, а в качестве поражающего агента – вирулентный штамм возбудителя эшерихиоза поросят – E. coli «КВ-1», продуцирующий адгезивный антиген К99. Опыты показали, что развитие эшерихиозного инфекционного процесса в зараженном вирулентным штаммом E. coli «КВ-1» организме сопровождалось существенными изменениями системы клеточного и гуморального иммунитета, к моменту гибели белых мышей от эшерихиозной инфекции наступило почти двукратное (в 1,96 раза, Р0,05) снижение количества В-лимфоцитов при одновременном увеличении (в 1,16 раза, Р0,05) содержания Т-лимфоцитов.

Увеличение содержания Т-лимфоцитов происходило за счет уменьшения Тхелперов при одновременном увеличении содержания Т-супрессоров.

Исследования показали, что однократная подкожная инъекция препарата «Пабисорб» оказывало выраженный лечебный эффект, обеспечивая выживаемость 80% зараженных возбудителем эшерихиоза белых мышей в летальной дозе (вариант I) и 75% (вариант II) случаев при гибели 100% животных в контрольной группе. Применение регламентированных при эшерихиозе средств терапии оказывало менее выраженный лечебно-профилактический эффект, защищая 55% животных при профилактическом (вариант III) и 60% при лечебном варианте (IV) применения препаратов, что в 1,45 и 1,33 раза ниже, чем у разработанных нами препаратов.

Таким образом, однократное подкожное введение белым мышам препарата «Пабисорб» после (через 24 ч) заражения вирулентным штаммом возбудителя эшерихиоза, оказывало модифицирующее действие на течение эшерихиозной инфекции и ее исход, обеспечивая выживаемость 75-80% зараженных животных. Механизм антиэшерихиозного эффекта препаратов реализуется по данным ряда авторов [2, 5, 6, 7, 8, 9, 22, 170, 171, 172] путем регулирования воспалительного потенциала макрофагов с торможением биосинтеза провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ТНФ- и ИНФ-), нейтрализации бактериальных токсинов, снижения бактериальной обсемененности органов и блокирования проникновения E. coli из кишечника во внутренние органы, усиления факторов специфической (восстановление уровня синтеза иммуноглобулинов, иммунорегуляторного индекса ThTs) и неспецифической (бактерицидной, лизоцимной активности сыворотки, функциональной активности макрофагов и микрофагов) резистентности организма, что приводит к повышению сохранности зараженных эшерихиозом животных.

Изучение иммуногенных свойств комплексных субъединичных противоэшерихиозных 4-пили вакцин (СП4ПВ) проводили путем определения уровня специфических антител в сыворотке крови иммунизированных лабораторных и сельскохозяйственных животных, а также устойчивости их к заражению вирулентным штаммом E.coli.

Учитывая, что для изучения поствакцинальных серологических реакций при эшерихиозе используют реакцию агглютинации (РА) с адгезивным антигеном К99 и антисыворотки к нему, что исключает возможность регистрации анти К88, 987Р и F41 – антител в организме иммунизированных животных, мы, с целью повышения чувствительности и унификации серологических тест-систем, разработали антигенные варианты эритроцитарного и бентонитового диагностикумов, а также метода ИФА согласно существующим методическим подходам.

При изготовлении антигенного варианта эшерихиозного эритроцитарного диагностикума в качестве иммуносорбента использовали формалинизированные и танизированные эритроциты барана.

Результаты иммунохимического анализа активности контрольной антипили – сыворотки показали, что она вступала в реакцию с гомологичным 4пили антигеном в разведении 1:256 (8 log2).

–  –  –



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |

Похожие работы:

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.