WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 9 |

«РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ ...»

-- [ Страница 3 ] --

1). Для определения колициногенности производственного и штаммовизолятов использовали индикаторные штаммы E. coli К-12, Ж-116, для 56 определения лизоцимной активности использовали стандартную культуру M.

lysoidecticus.

Антигены: субъединичные антигены К88, К99, 987Р и F41, выделенные из культур E. coli, эндо- и энтеротоксин E. coli, вакцины против ротакоронавирусного энтерита (ТГС) и эшерихиозной диареи поросят инактивированная гидроокисьалюминиевая, формолвакцина поливалентная гидроокисьалюминиевая (ФВ ПВ ГОА).

Сыворотки и антисыворотки: антиадгезивные, антитоксические, агглютинирующие, коммерческие диагностические наборы сывороток к антигенам моновалентная антиколибациллезная, бивалентная E. coli, колипаратифозная сыворотка, антисыворотка к ассоциированному полиантигенному комплексу вакцины против рота-коронавирусного энтерита и эшерихиозной диареи поросят, 12 видов элюатов из органов и тканей, подвергнутых эшерихиозной интоксикации животных.

Кроме того, в качестве одного из новых иммуномодуляторов мы использовали апизан (пчелозан) из подмора пчел полученный в отделе радиобиологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» [104]. Апизан представляет собой природный биополимер – N-ацетил-2-амино-2-диокси-D-глюкозамин, лиофилизированный порошок светло-коричневого цвета, растворимый в кислой среде при рН 5,5, влажность – 8-10%, содержание золы – 1-2%, протеина 1-2%, вязкость – 5-10сП5.

2.1.2 Методы исследований

–  –  –

Характер проявления и клиническое течение колибактериоза поросят и телят наблюдали у 233 больных животных различных возрастов.

Патологоанатомические изменения изучали при вскрытии 153 трупов поросят и телят, в условиях санитарной бойни хозяйства по общепринятой методике.

Диагноз на колибактериоз устанавливали на основании данных эпизоотологического обследования, клинических признаков, патологоанатомических изменений с проведением бактериологического исследования, материалом для которого служили трупы павших и вынужденно убитых поросят и телят.

Бактериологические исследования патологического материала проводили согласно «Методическим указаниям по бактериологической диагностике кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» [160]. Видовую принадлежность микроорганизмов определяли в соответствии с рекомендациями, изложенными в определителе зоопатогенных микроорганизмов.

Выделение культур кишечной палочки из патологического материала от поросят и телят, павших от колибактериоза проводили по методике М.Н.

Еремеева [82]. При этом содержимое кишечника, мезентериальных лимфатических узлов (посмертно), фекалии (прижизненно) суспендировали в физиологическом растворе и засевали на среду Эндо, а затем выросшие колонии E.coli - в кровяной агар и бульон. По окраске (кровяно-лаковый цвет) бульонной культуры определяли гемолитические свойства изучаемого штамма. Посевы кишечного содержимого первоначально засевали на среду Эндо с последующим пересевом изолированных колоний в бульон с кровью.

У выделенных штаммов кишечной палочки определяли морфологические, культуральные, биохимические, гемолитические, серологические и патогенные свойства. Культуральные свойства гемолитических штаммов кишечной палочки изучали по результатам роста на МПБ, МПА, ПЖА (pH=7,2-7,4) и агаре Эндо после инкубирования температуре 37оС.

посевов в термостате в течение 18-24 ч при Тинкториальные и морфологические свойства выделенных культур устанавливали путем микроскопирования мазков из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Граму. Морфологию полученных колоний изучали микроскопией в косопадающем свете. Для этого исследуемые культуры засевали по методу Дрегальского на поверхность 1,5%-ного просветленного МПА.

Для изучения серологических свойств кишечной палочки использовали стандартные наборы агглютинирующих О-коли сывороток, выпускаемых Армавирской биофабрикой, состоящих из 4 поливалентных и 30 моновалентных сывороток к серовариантам 01, 02, 04, 08, 09, 015, 018, 020, 026, 033, 035, 041, 055, 078, 086, 0101, 0103, 0111, 0115, 0117, 0119, 0126, 0127, 0137, 0138, 0139, 0141, 0142, 0147, 0149. Реакцию агглютинации ставили согласно наставлению по их применению.

Патогенность культур кишечной палочки с определением LD50 устанавливали на белых мышах живой массой 14-16 г путем внутрибрюшинного введения смыва суточной агаровой культуры. Культуры считались патогенными в случае гибели одной или более мышей в первые 4 суток после заражения.

Для определения LD50 готовили последовательные десятикратные разведения из 500 млн микробной взвеси, из каждого разведения по 0,5 мл взвеси вводили внутрибрюшинно 6 мышам. Результаты учитывали в течение 7 дней. Для расчета LD50 использовали метод Рида-Менча.

Изолирование и очистку адгезивных антигенов осуществляли согласно методике, разработанной Kuzuya M. et al. [348].

В состав вакцины кроме адгезивных антигенов (пили) вводили иммуномодуляторы (Т-активин, а также апизан, полученный из подмора пчел). Методы и способы получения вакцины и специфических иммуноглобулинов, схемы их применения изложены в разделе «Результаты исследований».

При изучении возможности усиления терапевтической эффективности испытуемых средств, с целью составления многокомпонентных смесей и композиций на основе веществ фито-зоо-микробного и минерального происхождения, определяли их совместимость, безвредность, токсичность, раздражающие свойства, эмбриотоксичность и тератогенность в соответствии с общепринятыми в токсикологии, иммунологии, вакцинносывороточном деле сертифицированными методиками.

Гематологические и биохимические исследования крови проводили на анализаторе «Express Plus».

Содержание иммуноглобулинов А, М и G в крови животных и их концентрацию в молозиве коров и свиноматок определяли с помощью иммуноферментного анализатора «Униплан».

Количество Т-лимфацитов в крови определяли методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, В-лимфоцитов – методом комплементарного розеткообразования с использованием стандартного кроличьего гемолизина в качестве комплемента – свежей сыворотки коров.

Бактерицидную активность сыворотки крови определяли по О.В.

Смирновой и Т.А. Кузминой [220], лизоцимную – по методу В.Г.

Дорофейчук [74], фагоцитарный индекс и число – по И.П. Кондрахину [125].

Полученный в ходе экспериментов цифровой материал подвергали статистической обработке с использованием общепринятых параметрических методов, степень достоверности различий между сравнительными показателями определяли по критерию Стъюдента с применениями программ Microsoft Excel, Word 2007.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Состояние и тенденции развития животноводства в Нижегородской области РФ Результаты изучения состояния и тенденции развития животноводства в Нижегородской области РФ в динамике показали, что Нижегородская область является одним из крупных составных частей РФ как в плане производства продуктов растениеводства, так и животноводства. Здесь сохраняются основные традиционные отрасли животноводства: молочное скотоводство, свиноводство, получили «второе дыхание» птицеводство и овцеводство. Впервые за многие годы наметилась тенденция к росту численности овцепоголовья в области. По состоянию на 01.01.2013 г. в области не преодолена тенденция снижения численности поголовья крупного рогатого скота и свиней (табл. 1, 2, 3). Дефицит продуктов животного происхождения восполняется завозом их из других регионов и импортом из других стран. В связи с этим в области сохраняется спонтанный риск усложнения эпизоотической ситуации по ряду инфекционных болезней животных.

Таблица 1 – Поголовье крупного рогатого скота в сельскохозяйственных организациях Нижегородской области в динамике (на 1 января, голов)

–  –  –

Таким образом, животноводство Нижегородской области, несмотря на реструктуризацию и определенную депрессию в своем развитии, продолжает оставаться важным сектором экономики, влияющим на социальные, экономические, территориальные, трудовые и производственные ресурсы.

Такие объективные выводы в развитии животноводства в Нижегородской области весьма активно поддерживают в своих исследованиях Л.В. Шилкина [293], проведенных под руководством член-корреспондента РАН, профессора В.В. Сочнева.

–  –  –

Анализ данных табл.

4 показал, что большая часть падежа в Нижегородской области приходится на гибель от болезней органов пищеварения (37,7-45,8 %), дыхания (17,2-21,5 %) и нарушения обмена веществ (12,1-26,5 %), реже от других незаразных болезней. При этом на долю падежа свиней от инфекционных заболеваний, вызываемых условно патогенными микроорганизмами, приходится 6,8-12,2 % от общего количества павших животных. В этом случае больший падеж также происходит среди молодняка (99,9%). Анализируя полученные данные можно сказать, что отход свиней от инфекционных болезней с каждым годом увеличивается, хотя в 2009 году наблюдалось и снижение. Если общее количество падежа в 2010 году по сравнению с 2006 годом возросло на 2,6 %, количество падежа от инфекционных болезней за тот же период возросло на 55 %. Однако следует отметить, что общее количество падежа свиней, начиная с 2007 года, постепенно снижается, т.е. на фоне снижения общего количества падежа происходит увеличение падежа свиней от инфекционных болезней (рис. 1).

Рисунок 1 - Динамика общего падежа и падежа от инфекционных болезней

В хозяйствах Нижегородской области гибель свиней чаще происходит от колибактериоза, сальмонеллеза, гемофилезного полисерозита, отечной болезни и дизентерии. При лабораторных исследованиях патологического материала чаще выделялись E.Coli(O 41, O 33, O 18, O 1), Salmonella dublin, Salmonella choleraesuis, Salmonella tiphimurium, Pasteurella haemolitica, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis а также условно-патогенные микробы Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Citrobacter divercus, Klebsiella pneumoniae и другие. Сведения о количестве неблагополучных пунктов с 2006 по 2010 годы приведены в табл. 5.

Таблица 5 - Количество неблагополучных пунктов по инфекционным болезням свиней.

№№ Годы п/п Болезни Колибактериоз Сальмонеллез Гемофилезный

–  –  –

ТГС Стафилококкоз Парвовирусная инфекция Ротавирусная инфекция РРСС Как видно из табл. 5, наибольшее количество неблагополучных пунктов было зарегистрировано по колибактериозу и отечной болезни, чуть меньше сальмонеллезу и дизентерии. Больше всех неблагополучных пунктов при этом было в Арзамасском -10, Починковском – 10, Ковернинском 8, Богородском 8, Выксунском 6, Борском 6, Воротынском 5, Володарском 5, Лысковском, Большемурашкинском, Уренском, Шахунском районах по 4. В других районах – Бутурлинском, Дальнеконстантиновском, Семеновском, Кстовском, Пильнинском, Спасском, Павловском, Городецком, Дзержинском, Краснооктябрьском от 1-го до 3-х неблагополучных пунктов.

Для лечения болезней инфекционной этиологии применяются сыворотки и различные антибактериальные препараты тетрациклинового, сульфаниламидного и нитрофуранового ряда. В последнее время находят применение современные антибактериальные препараты широкого спектра действия. Применение лечебных препаратов позволяет частично снизить падеж свиней от инфекционных болезней. Для создания эпизоотического благополучия необходимо проводить вакцинопрофилактику, хотя и вакцинация зачастую не дает желаемого эффекта. Это, по всей видимости, связано с тем, что при нарушении условий содержания и кормления снижается естественная резистентность организма и у животных не образуется напряженного иммунитета против той или иной инфекции. Наше мнение поддерживает Шилкина Лариса Владиславовна [293], которая отмечает, что от 31,0 до 70% поголовья крупного рогатого скота и 37-76% свиней в регионе имеют субклинические отклонения в состоянии здоровья (отклонения от физической нормы показателей гомеостаза их организма).

Повышению эффективности применяемых вакцин, возможно, способствовало бы применение иммуностимуляторов.

Для установления причин гибели поросят проводили микробиологические исследования патологического материала от трупов поросят в хозяйствах разных форм собственности Большеболдинского и Краснооктябрьского районов Нижегородской области.

Выделение культуры возбудителей проводили путем высева суспензии, приготовленной из патологического материала, на различные питательные среды.

Всего было исследовано 88 проб патологического материала от поросят с подозрением на эшерихиоз. При этом в 56-и случаях была выделена культура гемолитической кишечной палочки различных штаммов, а именно О8 - в 13-и, О26 - в 9-и, О101 и О115 - в 7-и, О20 - в 6-и, О139 и О78 - в 4-х, О140 и О137 в 3-х случаях и О111 в 1-ом случае. В пробах патологического материала кроме кишечной палочки была обнаружена и другая микрофлора.

При этом в 14-и случаях из 56-и выделяли кокковую микрофлору Staphilococcus epidermidis - в 5-и случаях, Staphylococcus aureus и Streptococcus suis - по 1-му случаю. Кокковая микрофлора в остальных случаях не идентифицировалась. В исследуемых пробах патологического материала кроме кокков также обнаруживалась Pasteurella haemolitica - в 3-х и Citrobacter freundii –2-х случаях соответственно и Proteus vulgaris в одном случае. Эти микроорганизмы выделись как в отдельности, так и в ассоциации. Следует отметить, что при этом в пробе патологического материала обязательно присутствовал тот или иной штамм E.coli и выделенная условно-патогенная микрофлора самостоятельного заболевания не вызывала, а только осложняла течение основного заболевания – отечной болезни. Вышеизложенное показывает, что в 35,7 % случаях при заболевании поросят отечной болезнью в их организме содержится секундарная микрофлора. Возможно, этим можно объяснить в определенной степени большой отход поросят от отечной болезни и недостаточную эффективность лечебно-профилактических мер против этого заболевания, ввиду того, что борьба главным образом ведется только против возбудителя отечной болезни, не учитывая присутствие условно-патогенной микрофлоры, без определения чувствительности ее к антибактериальным препаратам.

Бессистемное применение (особенно малых количеств) препаратов, лишь осложняет эпизоотическую ситуацию в хозяйстве по отечной болезни.

Нами (Р.А. Сетдеков, 2003, 2010, 2011) проводились опыты по лечению отечной болезни поросят бактериофагами и антибактериальными препаратами в одном из сельхозпредприятий Большеболдинского района и личных подворьях граждан Краснооктябрьского района и в Нижегородской области.

При лечении и профилактике отечной болезни использовали поливалентный бактериофаг (полифаг) – смесь фагов против колибактериоза, пастереллеза, сальмонеллеза, стафилококкоза, протея, клебсиеллеза и различных штаммов E. coli, приготовленный в условиях лаборатории «ВакФАГ» УСХА. Опыты по испытанию поливалентного бактериофага проводили в стационарно неблагополучном по отечной болезни поросят СПК «Черновское» Большеболдинского района Нижегородской области.

Вначале препарат испытывали на новорожденных поросятах. Для этого из поросят было создано три группы по 100 голов – две опытные и одна контрольная. Возраст поросят - 10-15 дней. Животным в первой группе полифаг задавали внутрь один раз в день в течение 3-х дней в дозе 10 мл, поросята второй группы получали полифаг внутримышечно один раз в день в дозе 5 мл три дня подряд. Животные третьей группы служили контролем.

В дальнейшем поливалентный бактериофаг испытывали на супоросных свиноматках, учитывая при этом сохранность, получаемых от данных маток поросят к десятому дню после рождения и на момент отъема. При этом использовали 50 свиноматок, разделенных на две группы по 25 голов в каждой – первая группа опытная, вторая – контроль. Свиноматки первой группы полифаг получали внутримышечно в дозе 15 - 30 мл на голову в течение 3-х дней. Во второй, контрольной группе свиноматкам полифаг не вводили.

Для определения лечебной эффективности полифага в опытах использовали 180 голов поросят-отъемышей 50-60 дневного возраста, сравнивая результаты в опытных и контрольной группах.

За животными, находящимися в опытах вели постоянное клиническое наблюдение. При всех случаях падежа проводили патологоанатомическое вскрытие с целью постановки окончательного диагноза. В опытах для сравнения лечебно-профилактической эффективности также использовали антибактериальные препараты – неомицина сульфат, левомицетина сукцинат натрия, фуразолидон с сульфадимезином и гентамицин. При этом профилактическая эффективность от применения левомицетина сукцинат натрия составила 93,4 %, фуразолидона с сульфадимезином 84,1 %, неомицина сульфата – 83 % при 82 %-ной эффективности в контроле.

Лечебная эффективность гентамицина составила 82 %, левомицетина сукцинат натрия – 80,5 %, сульфадимезина с фуразолидоном 73,5 % при контроле 60 %.

На основании многочисленных исследований и наблюдений можно сделать вывод, что профилактика отечной болезни антибактериальными препаратами не дает желаемого эффекта, а лечение поросят при этом эффективно только в начальной стадии заболевания. Пероральное применение поливалентного бактериофага с профилактической целью позволило добиться сохранности поросят в 91 %, внутримышечное применение – 97 % при контроле 84 %. Среди поросят, полученных от обработанных поливалентным бактериофагом свиноматок, сохранность составила к десятому дню после рождения – 97 %, на момент отъема – 90,8 % при контроле 92 и 76,6 % соответственно. Нужно при этом отметить, что поливалентный бактериофаг, обладает хорошей профилактической эффективностью как при внутримышечном, так и при пероральном введении.

Обработка же данным препаратом свиноматок до опоросов позволяет значительно повысить сохранность, полученных от них поросят.

3.3 Эпизоотологический и иммунологический мониторинг крупного рогатого скота в отдельных хозяйствах Нижегородской области Проблема получения и сохранения здорового молодняка должна рассматриваться как комплексная, в которой, наряду с негативными факторами окружающей среды и возбудителем, основная роль отводится иммунологической реактивности новорожденного животного и его зависимости от состояния организма матери [130, 165, 216, 255, 256, 257].

Для эксперимента было отобрано три хозяйства: СПК «Пошатовский», ООО «Развитие» и ООО «Трехозерское», в которых имеется наибольший падеж скота в районе. Количество поголовья и падежа в вышеперечисленных хозяйствах приведены в таблице 6.

Таблица 6 - Поголовье и количество падежа скота в некоторых хозяйствах Краснооктябрьского района

–  –  –

Анализ данных таблицы 6 показывает, что больший отход животных происходил в ООО «Развитие». Падеж при этом наблюдался как среди взрослого скота, так и среди молодняка. Во всех трех хозяйствах скот содержится примерно в одинаковых условиях – коровники типовые. Стойла имеют деревянные полы, навозные и комовые проходы – бетонные.

Освещение в помещениях естественное и искусственное. Практикуется привязное содержание. Навозоудаление в хозяйствах механизированное – навоз удаляется при помощи скребковых транспортеров.

При анализе причин падежа скота в данных хозяйствах видно, что падеж происходит на фоне нарушения условий кормления и нарушения параметров микроклимата в помещениях для содержания скота – рационы кормления не сбалансированы по основным питательным веществам, макрои микроэлементам, имеет место совместное содержание животных различных половозрастных групп, высокая концентрация животных на ограниченных площадях, отсутствие активного моциона. Молодняк содержится в сырых помещениях с недостаточной вентиляцией и слабой освещенностью. При заполнении помещений для содержания молодняка не соблюдается принцип «все пусто – все занято», что приводит к высокой микробной загрязненности помещений.

В корм скоту не редко используются недоброкачественные корма. Так при исследовании пробы зерна из ООО «Развитие» в Сергачской межрайонной ветеринарной лаборатории был неоднократно выявлен рост грибов Mucor и Aspergillus. Исследования силоса из того же хозяйства выявили пониженное содержание молочной кислоты при повышенном содержании масляной, что является следствием грубого нарушения технологии заготовки силоса – отсутствие заквасок, нарушение сроков закладки и др.

Из патоморфологических изменений при вскрытии трупов взрослого крупного рогатого скота отмечали геморрагическое воспаление слизистой сычуга, тонкого и толстого отдела кишечника, цирроз печени, атрофию селезенки и поражения легких. У павших телят при вскрытии главным образом выявляли поражение желудочно-кишечного тракта, пневмонию различной степени выраженности, гиперемию слизистой оболочки носовых ходов, трахеи и гортани. При проведении лабораторных исследований патологического материала выделяли E.coli, стрептококки, стафилококки и диплококки, которые обладали определенной чувствительностью к препаратам тетрациклинового и пенициллинового ряда.

Таким образом, в хозяйстве, где проводились наши исследования, заболевание и падеж молодняка происходили от заболеваний желудочнокишечного тракта, вызываемых E. coli. Опыты по изучению иммунного статуса телят проводили в СПК «Пошатовский».

Для проведения опытов создали две группы новорожденных телят в возрасте 2-4 дней по 10 голов в каждой группе. При этом 10 телят имели симптомы желудочно-кишечного заболевания, а 10 животных являлись клинически здоровыми.

Для проведения лабораторных исследований у опытных животных брали кровь и получали сыворотку.

Исследования крови проводили с использованием стандартных методик [125], общее количество лейкоцитов подсчитывали с применением камеры Горяева. Для дифференциации лейкоцитов приготовленные мазки окрашивали по Романовскому-Гимза. Общий белок сыворотки крови определяли общепринятым рефрактометрическим методом, соотношение лимфоцитов к другим видам лейкоцитов показывали в процентах.

Определение лизоцимной активности сыворотки крови проводили нефелометрическим методом [74,118],бактерицидную активность сыворотки крови – фотонефелометрическим методом [220]. Методом диффузии в агар определяли количество лизоцима в сыворотке крови [61]. Данный метод основывается на способности лизоцима сыворотки крови, диффундируя из лунки, лизировать взвешенный в агаре тестмикроб Micrococcus Lysodeikticus.

При этом концентрация фермента соответствует диаметру прозрачной зоны, образованной вокруг лунки. Идентификацию Т- и В-лимфоцитов проводили методом розеткообразования [27], фагоцитарную активность – микрометодом [125]. Методом радиальной иммунодиффузии по G.Manchini, определяли количество иммуноглобулинов G и M в исследуемых сыворотках [357].

Такие биохимические показатели, как фосфор, кальций, щелочная фосфотаза, глюкоза, общий белок и его фракции, резервная щелочность, определяли используя реактивы фирмы «Lachema» согласно их методическим рекомендациям. Как уже отмечалось в СПК «Пошатовский», наблюдалась высокая заболеваемость и смертность крупного рогатого скота.

Так из имеющихся в хозяйстве 446 голов крупного рогатого скота в 2011 году пало 27 голов, 15 из которых молодняк старше 2 дневного возраста.

Проводя анализ структуры причин падежа, выявили различные нарушения условий содержания и кормления коров до отела, запоздалое скармливание молодняку первой порции молозива, нарушение гигиены и кратности поения.

Большая концентрация животных, нарушение принципа «пусто-занято» при заполнении телятников приводит к сильному микробному загрязнению помещений. Болели в основном телята 2-12 дней. Из клинических признаков отмечали общее угнетение, снижение аппетита, общее обезвоживание, каловые массы жидкой консистенции желтого цвета.

В условиях областной ветеринарной лаборатории проводили исследования на наличие бактериальных и вирусных инфекций. При этом из

–  –  –

Математический расчет данных таблицы показал, что абсолютное количество лимфоцитов было снижено у больных телят на 32,7%, лейкоцитов

– на 17,6%, относительное количество В-лимфоцитов – на 51,0% и Т лимфоцитов – на 25,5%, уровень иммуноглобулинов G – на 24,5%, иммуноглобулинов M – на 59,2% ниже средних показателей физиологической нормы. Значения фагоцитарной активности лейкоцитов были ниже среднего значения физиологической нормы на 16,8%, лизоцимной активности – на 59,7%, а бактерицидной активности сыворотки крови – на 21,2%.

При этом необходимо отметить, что у здоровых животных все эти параметры оставались на нижней границе физиологической нормы.

Все вышеизложенное позволяет утверждать, что развитие желудочнокишечных заболеваний бактериальной природы, сопровождается снижением содержания гуморальных и клеточных факторов естественной резистентности новорожденных телят по сравнению с физиологической нормой. Однако характер и интенсивность иммунологических процессов могут быть модулированы с применением фармакологических и биологических препаратов [182, 217, 218, 254, 302].

С учетом этих данных мы изучали влияние ксимедона на иммунологический статус новорожденных телят.

Опыты проводили в условиях СПК «Пошатовский» на 20 новорожденных телятах в возрасте 2-4 дней с начальными признаками желудочно-кишечной болезни. Животных разделили на две группы по 10 гол.

Телятам на опытной группы на 4-й день после рождения вводили ксимедон дважды из расчета 30 мг/кг живой массы. Предварительно готовили стерильный раствор ксимедона на фосфатном буфере MIS рН 7-7,4 в объеме 2 мл на каждое введение. Телятам контрольной группы вводили фосфатный буфер в объеме 2 мл.

Для лабораторных исследований использовали как цельную кровь, так и сыворотку крови подопытных животных.

Результаты исследований обобщены в табл. 8.

Таблица 8 - Показатели иммунного статуса новорожденных телят 2-4дневного возраста (М±m; n=10; p0,05)

–  –  –

Установлено, что у новорожденных телят с признаками диспепсии наблюдается снижение показателя естественной резистентности. У таких животных снижено абсолютное количество лейкоцитов, лизоцимная активность, содержание иммуноглобулинов IgG, IgM по сравнению с физиологической нормой. Двукратное введение телятам ксимедона из расчета 30 мг/кг живой массы способствует восстановлению изученных показателей.

При этом заметно повышается бактерицидная и лизоцимная активность, фагоцитарная активность лейкоцитов, содержание общего белка и его фракций, что указывает на стимулирующую роль ксимедона на иммунобиологическую реактивность организма.

Опыты с целью определения передачи специфических антител с молозивом проводились в условиях хозяйств Краснооктябрьского района Нижегородской области: ООО «Трехозерское», ООО «Развитие» и СПК им. 1 Мая. В каждом хозяйстве в опыт были взяты по 3 коровы, вакцинированные против ПГ-3, ИРТ и ВД-БС. От каждой группы опытных коров были взяты

–  –  –

Из приведенных данных видно, что в сыворотке крови коров, принадлежащих ООО «Развитие», специфические антитела выявлялись в низких титрах к вирусу ПГ-3, а к возбудителям ИРТ и ВД-БС не обнаруживались. Анализ результатов исследований сывороток крови телят, до и после получения ими молозива от своих вакцинированных коровматерей показал значительно отличающиеся данные. Так, у новорожденных телят в ООО «Трехозерское» у телят до выпойки им молозива антитела отсутствовали. После выпойки им молозива у двух антитела выявлены на уровне антител у матерей 1:160 и 1:400 к вирусам ПГ-3 и ВД-БС, а к возбудителю ИРТ они отсутствовали.

Результаты исследований сывороток крови телят в СПК им. 1 Мая после получения ими молозива антитела не обнаруживались даже в следовых концентрациях. При этом у матерей антитела в сыворотках крови содержались в значительных титрах 1:160, 1:320 и 1:800.

Приведенные данные подчеркивают справедливость мнения А.Г.

Шахова [283] о необходимости дальнейших, углубленных исследований по установлению прямой зависимости между уровнем неспецифической резистентности организма коров и состоянием здоровья новорожденных телят.

3.4 Изготовление полиантигенного комплекса на основе пилезных антигенов и специфических иммуноглобулинов Литературные данные, как было отмечено в обосновании, показывают, что использование живых и инактивированных цельноклеточных вакцин независимо, от количества (до 27 штаммов) и видов (до 24 серогрупп) использованных эшерихий, не обеспечивает желаемого профилактического эффекта, в связи, с чем мы поставили перед собой задачи получения субъединичных вакцин, сконструированных на основе очищенных адгезивных антигенов К99, К88, 987Р и F41 по методу Kuzuya M. et al. [348].

Для стандартности исследований в качестве продуцентов адгезивных антигенов (пилей) использовали референтные энтеротоксигенные штаммы E.

«ПЛ-6» продуцирующий антиген адгезии К88, «КВ-1»

coli: продуцирующий антиген адгезии - К99, «УК-2» - продуцирующий антиген адгезии 987Р и «ПЗ-3» - продуцирующий антиген адгезии F41, выделенные из организма больных эшерихиозной диареей поросят и телят, хранящиеся в лаборатории коллекции микроорганизмов ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». С целью получения пили антигенов бактерии E. coli выращивали на триптозном, соевом агаре с 5% лошадиной крови в течение 48 часов. Круглые с выпуклой, гладкой поверхностью, ровными краями диаметром 2-4 мм, колонии пересевали на среду Минка и МПА. Через 24 ч после пересева, выросшие на указанных средах культуры микроскопировали (окраска по Граму), затем, для выявления пили, исследовали в РА на стекле с агглютинирующими антиадгезивными коли-сыворотками: вначале с комплексной, а затем – моновалентными анти К88, К99, 987Р и F41 - сыворотками.

С целью накопления биомассы, колонии, содержащие вышеуказанные адгезивные антигены (пили), высевали в бульон Минка. Через 48 ч микробные клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. С целью отделения пили от бактериальных тел, полученный осадок бактерий ресуспендировали в охлажденном до нулевой температуры лизирующем буфере в соотношении 1:10 и клеточную суспензию инкубировали в ледяной бане в течение 30 минут. Затем клеточную суспензию гомогенизировали при нулевой температуре 10-20 движениями пестика в гомогенизаторе Даунса (стекло – стекло). На этом этапе при рассматривании препарата в микроскоп интактными должны оставаться только ядра клеток. Если присутствуют более 10% интактных клеток, то клеточную суспензию гомогенизировали 10 движениями пестика.

Гомогенат снова помещали в центрифужную пробирку и центрифугировали в центрифуге с охлаждением при 2000 об/мин для удаления ядер. Мутный супернатант собирали и добавляли к нему сахарозу до конечной концентрации 40% (вес/объем). После этого суспензию помещали в пробирку для ультрацентрифуги объемом 37 мл (пробирки для ротора SW28 (Бекман)).

Поверх суспензии мембран в 40%-ной сахарозе наслаивали до заполнения пробирки 30%-ный раствор сахарозы на лизирующем буфере.

Пробирки центрифугировали при 25000 об/мин в течение 3 ч в роторе SW28 (Бекман). Затем ее осторожно вынимали и собирали опалесцирующий слой пили, находящийся между двух сахарозных слоев, используя шприц или пастеровскую пипетку.

Концентрированную взвесь пили разгоняли на колонке, заполненной формил-целлюлофином, на частицах которого предварительно фиксировали гамма-глобулин из антиадгезивных колисывороток к соответствующим пили.

Наличие специфических анти К88, К99, 987Р и F41 – сывороток против соответствующих антигенов дает возможность быстро в один этап выделить пили из суммарных экстрактов антигенов и очистить их.

Для очистки пили использовали следующие реагенты:

1. Взвесь пили, выделенные по вышеописанной методике.

2. Специфические антипилезные антитела, иммобилизованные на формил-целлюлофине.

3. Солевой раствор с трисом, содержащий 0,1% тритона Х-100 (буфер ТСР-ТХ).

4. 10%-ный раствор тритона Х-100.

5. ТСР-ТХ, содержащий 1М NaCl.

Антигенные фракции из штамма E. coli с адгезивным антигеном К88 и обладающие наибольшей серологической активностью в РА с анти К88сывороткой, объединяли и использовали в качестве одного из компонентов при конструировании комплексного субъединичного антиэшерихиозного антигена.

В результате проведенных исследований нами было получено 4 пили – антигена E. coli (К88, К99, 987Р и F41), которые стандартизировали по белку до 10%-ной концентрации и оставляли на хранение для конструирования комплексного субъединичного (пилезного) антигена.

Учитывая, что в настоящее время в ветеринарной и медицинской практике применяются иммуномодуляторы различного происхождения для повышения иммунного ответа организма на введение любого антигена, в следующей серии опытов проводили исследования по отбору оптимальных модулирующих препаратов, которые были бы более активными по сравнению с известными и не оказывали бы инактивирующего воздействия на серологическую (антигенную) активность полученных пили антигенов.

С учетом сообщений ряда авторов о том, что совместное применение Т-активина и тимогена с инактивированными вакцинами против колибактериоза приводят к повышению иммунного ответа организма, в качестве испытуемых иммуномодуляторов мы выбрали эти препараты [50].

В последние годы расширились сведения о перспективности применения продуктов пчеловодства в животноводстве. Широкий спектр антимикробного и иммуномодулирующего действия по отношению к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам обуславливает целесообразность использования пчелиного подмора в качестве источника хитозана [120, 245].

Поэтому в качестве одного из иммуномодуляторов мы использовали апизан из продукта пчеловодства - подмора пчел, содержащего хитинмеланиновый комплекс – линейный полисахарид, состоящий из N – ацетил– 2–амино–2–диокси–D–глюкозамин, полученный в отделе радиобиологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» [108].

Апизан, представляющий собой природный биополимер –N-ацетил-2амино-2-диокси-D-глюкозамин, лиофилизированный порошок светлокоричневого цвета, растворяемый в кислой среде при рН 5,5, имеющий влажность 8-10%, вязкость – 5-10 сП5, степень депротеинирования – 98-99%, мы использовали в качестве одного из потенциальных иммуномодулятров нового поколения при изготовлении противоэшерихиозной вакцины.

Для пролонгирования действия антигенных веществ при иммунизации различными вакцинами, в качестве депонирующих средств используют различные иммуносорбенты (гидроокись алюминия, гидросиликаты алюминия и т.д.). Вместе с тем известно, что эффективными иммуносорбентами являются монтмориллониты, которые обладают не только депонирующими, но и биоактивными свойствами (способность связывать антигены, ферменты, аминокислоты, витамины, лекарственные субстанции), доставлять и передавать их клеткам – мишеням, адсорбируя одновременно токсические соединения, накапливающиеся в организме в процессе метаболизма или попавшие в организм ксенобионтов.

Сказанное послужило основанием для проведения исследований по изучению возможности использования природных монтмориллонитов – алюмосиликатов в качестве иммуносорбента и депонирующего агента при конструировании антиэшерихиозных профилактических (субъединичных вакцин из пили антигенов) и лечебных (полиглобулинов) препаратов.

В качестве иммуносорбента при конструировании субъединичной 4пилезной вакцины использовали высокодисперсную фракцию монтмориллонита, изготовленную в отделе радиобиологии ФГБУ «ФЦТРБВНИВИ». При этом в качестве технологического сырья разработчиками был использован алюмосиликат-бентонит Тарнварского месторождения Республики Татарстан.

Таким образом, в опытах в качестве иммуносорбентов (депонирующих и транспортирующих средств) испытывали два препарата – гидроокись алюминия и полученную экспериментальным путем в отделе радиобиологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», высокодисперсную (размеры частиц 60-90 мкм) фракцию монтмориллонита.

Для конструирования субъединичных противоэшерихиозных 4-пили вакцин, 0,1%-ные пили-антигены в равных объемах смешивали друг с другом и добавляли к смеси антигенов равные объемы соответствующих иммуномодуляторов (0,1%-ные растворы тимогена, Т-активина и апизана), и депонирующих иммуносорбентов (гидроокиси алюминия и монтмориллонитовой высокодисперсной фракции природного минерала – гидросиликата алюминия).

В результате исследований нами было сконструировано пять вариантов субъединичных противоэшерихиозных вакцинных препаратов. При этом экспериментальный образец вакцины № 1 представляет собой полиантиген, содержащий в 1 мл 5 мг активно действующего вещества (АДВ), из которых 4 мг (по 1 мг каждого) составляют пилезные антигены К88, К99, 987Р и F41 и 1 мг адъюванта тимогена. Состав вакцины № 2 аналогичен, но с той разницей, что в качестве адъюванта содержит 1 мг Т-активина. Вакцина № 3 имеет тот же антигенный состав, но включающий в качестве адъюванта биополимер – апизан в количестве 1 мг/мл и 1 мг высокодисперсной фракции бентонита; состав вакцины № 4 аналогичен предыдущим, но с той разницей, что в качестве адъюванта содержит 1 мг гидроокиси алюминия (ГОА) и состав вакцины № 5 аналогичен предыдущим, но с той разницей, что в качестве адъюванта содержит 1 мг высокодисперсной фракции монтмориллонита.

Полученные на предыдущем этапе работы антигенные комплексы на основе пили - антигенов и адъювантов, были использованы в качестве иммунизирующих средств с целью получения лечебных антиэшерихиозных сывороток. Опыты проводили на 20 кроликах, 5 из которых однократно подкожно вводили в дозе 2 мл 0,1%-ный раствор комплексного субъединичного пили антигена (однократная иммунизация). У иммунизированных кроликов в динамике (через 10, 20, 30 и 40 дней после иммунизации) брали пробы крови и выделяли сыворотки для изучения титров антител и испытания у них лечебных свойств на пораженных эшерихиозом животных.

Пять кроликов 2-й группы 4-кратно по отдельной схеме иммунизировали вышеуказанным пили-антигеном. Согласно этой схеме, 1-ю иммунизацию кроликов проводили путем внутрибрюшинного введения 100 мкг комплексного полиантигена, 2-ю – через 2 недели 200 мкг субъединичного полиантигена (СПА), 3-ю – через 3 недели 100 мкг СПА и 4ю – через 4 недели 100 мкг СПА.

Для определения активности полученных антисывороток, через неделю после 4-й иммунизации у животных брали пробы крови, выделяли сыворотки. Активность и специфичность сывороток крови контролировали непрямым методом иммуноферментного анализа визуально и спектрофотометрически при длине волны 492 нм с использованием диагностических антител против IgG кроликов, меченых пероксидазой хрена (НИИЭиМ им Н.Ф. Гамалеи).

Пяти кроликам 3-й группы подкожно вводили смесь эндотоксинов 4 вирулентных энтеротоксигенных штаммов E.coli №№ 378, 379, 380 и КВ1, обладающих К88, К99, 897Р и F41 антигенами, использованными нами для изолирования пили-антигенов. Смесь эндотоксинов инактивировали 0,3%ным формалином, после чего препарат вводили в дозе 40 мг (1/5 ЛД50). Через 10, 20, 30 и 60 дней после введения анатоксинов брали пробы крови для исследования сывороток на содержание противоколибактериозных антител (антитоксинов).

Пять кроликов заражали путем внутрибрюшинного введения смыва 24часовой смеси вирулентных культур 4 штаммов E.coli №№ 378, 379, 380 и КВ1 (возбудители эшерихиоза телят) в дозе 5108 м.к. За зараженными животными вели наблюдение в течение 30 дней с момента заражения. У выживших животных – реконвалесцентов тотально брали пробы крови, а также извлекали внутренние органы, из них готовили элюаты, изолировали из сывороток крови и элюатов глобулины.

В результате проведенных исследований было получено 12 образцов кроличьих антисывороток и 7 образцов элюатов из органов животных – реконвалесцентов.

Из гипериммунных сывороток и элюатов из органов выделяли глобулины методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония в соответствии с общепринятыми в экспериментальной иммунохимии методами [138]. Полученные сывороточные и тканевые иммуноглобулины, после скрининговых исследований, были использованы в качестве основных компонентов при конструировании противоэшерихиозных профилактических и лечебных препаратов.

3.4.1. Экстренная оценка (скрининг) эффективности потенциальных лечебно-профилактических препаратов в модельной in vitro тест-системе Учитывая, что нами было получено значительное количество потенциальных лечебно-профилактических препаратов (субъединичных антигенов, сывороточных и тканевых глобулинов), для предварительной оценки их эффективности в условиях in vivo потребовалось бы значительное количество дорогостоящих и дефицитных лабораторных животных, нами была использована модельная in vitro тест-система в описании Р.Р.

Гайзатуллина [45, 46, 47].

Перед началом основных опытов по оценке иммунопрофилактической эффективности испытуемых экспериментальных образцов субъединичных противоэшерихиозных пили - антигенов E. coli, изучали чувствительность культуры клеток (лимфоцитов) к патогенному агенту – эшерихиозному эндотоксину, полученному из энтеротоксигенного штамма E. coli «КВ1».

При этом исходили из того, что летальная доза (ЛД100) эшерихиозного эндотоксина, полученного из указанного вирулентного штамма кишечной палочки, для белых мышей составляла 7,9 мг (39,5 мг/кг) и поэтому в модельных опытах на культуре клеток испытывали различные концентрации токсина в диапазоне доз от 1 до 100 мкг/мл с шагом 10 мкг.

Для определения летальных доз эндотоксина E. coli для тест-культур клеток, лимфоциты инкубировали в стандартной питательной среде при 37 оС в течение 24 ч, затем во флаконы с культивируемыми клетками вносили испытуемые концентрации эндотоксина E. coli и вновь инкубировали в течение 24 ч при указанной температуре.

В связи с тем, что в составе субъединичного полиантигена в качестве адъюванта использованы природные минералы – монтмориллониты, параллельно изучали возможность токсического действия высокодисперсной фракции алюмосиликатов (бентонита) на лимфоциты. Для этого в культуральную среду в объеме 1 см3 с лимфоцитами внесли монтмориллонит в дозах 100, 300 и 500 мкг/мл. Инкубирование проводили в течение 24 час при 370С.

По истечении указанной экспозиции инкубирования из клеточной суспензии готовили мазки, фиксировали их в 70%-ном этаноле и окрашивали флуоресцирующим красителем – эритрозином с 0,01-0,02%-ным последующим микроскопированием на световом и флуоресцентном микроскопе. В качестве критерия оценки жизнеспособности клеток на фоне воздействия на них испытуемого эндотоксина и монтмориллонита использовали выживаемость и гибель иммуноцитов, выражая конечный эффект в количестве или процентах погибших или выживших лимфоцитов.

Результаты цитометрирования окрашенных эритрозином мазков культур клеток показали, что внесение в инкубационную среду эндотоксина E. coli «КВ1» в концентрации 42,6 мкг/мл вызывало полное (99,07%) ингибирование роста культуры клеток (лимфоцитов).

В мазках лимфоцитов, инкубированных в присутствии от 100 мкг/мл до 500 мкг/мл монтмориллонита погибших лимфоцитов не обнаружили, это свидетельствует об отсутствии токсичности монтмориллонита по отношению к лимфоцитам.

Таким образом, исследования показали, что гибель клеток тесткультуры наступает при внесении в суспензию клеток лимфоцитов эшерихиозного энтеротоксина в концентрации 42,6 мкг/мл.

После определения оптимальных летальных концентраций эшерихиозного энтеротоксина, параллельно изучали влияние испытуемых иммунопротекторов – субъединичных вакцинных препаратов – пили антигенов К88, К99, 987Р и F41 на жизнеспособность культуры клеток – лимфоцитов при совместном культивировании иммуногенов и испытуемых препаратов. При этом изучали оптимальные концентрации антигенов, не оказывающих угнетающего действия на метаболизм культур клеток в условиях совместного культивирования их с испытуемыми иммунопротекторами.

Для этой цели интактные лимфоциты инкубировали с различными концентрациями пили антигенов (субъединичных вакцинных препаратов) (от 1 до 1 тыс. мкг/мл по белку) в течение 4, 24 и 48 часов. Оценку влияния испытуемых антигенов на культуру клеток проводили по наличию, количеству или отсутствию окрашенных (нежизнеспособных) клеток в контрольных и опытных образцах – мазках из суспензии лимфоцитов, инкубированных в присутствии испытуемых препаратов.

Результаты микроцитометрических исследований показали, что внесение в инкубационную среду с лимфоцитами испытуемых антигенов в концентрациях от 1 до 1000 мкг/мл токсического действия не оказывало – в окрашенных эритрозином мазках увеличения количества окрашенных (нежизнеспособных) клеток по сравнению с контролем не происходило. С учетом полученных результатов концентрации вносимых в инкубационные среды испытуемых субъединичных антигенов, в зависимости от состава испытуемых вакцинных препаратов, составляли от 10 до 50 мкг/мл.

Полученные в предварительных опытах данные по определению летальных доз эшерихиозного эндотоксина для клеток in vitro тест-системы (лимфоцитов) и оптимально переносимые дозы испытуемых антигенов на культивируемые клетки послужили основанием для проведения скрининговых исследований по определению протективной активности антигенов.

Для этой цели в культивируемую лимфоциты среду вносили различные концентрации (10, 20, 30, 40, 50 мкг/мл) антигенов, затем инкубировали лимфоциты в течение 4 ч и по истечении указанной экспозиции в эти же среды вносили по 42,6 мкг/мл эшерихиозного энтеротоксина, лимфоциты повторно инкубировали в течение 4, 24 и 48 ч в присутствии энтеротоксина.

По истечении указанных экспозиций оценивали защитный эффект

–  –  –

Из представленных в таблице материалов видно, что наиболее высокой протективной активностью из испытанных вариантов экспериментальных образцов вакцин обладала субъединичная 4-пили вакцина № 3, изготовленная путем смешивания равных объемов 0,1%-ных растворов антигенов К88, К99, 987Р и F41 + 0,1%-ный апизан + 0,1%-ная высокодисперсная фракция монтмориллонита (0,6%-ный раствор антигенов, иммуномодулятора и иммуносорбента), которая обеспечивала защиту от эшерихиозной гибели 75,6% лимфоцитов.

Вакцины № 1 и 2, также обладали достаточно высокой протективной активностью, однако они уступали по этому показателю вакцине № 3 в 1,39 и 1,19 раза (Р0,05), что составляло 54,7 и 63,5% защиты от эшерихиозной гибели лимфоцитов в условиях преинкубации их в присутствии испытуемых антигенов.

Таким образом, предварительная обработка биологически активной тест-системы – лимфоцитов испытуемыми антигенами обеспечивала 54,7ную выживаемость при летальной интоксикации эшерихиозным эндотоксином.

3.4.2 Первичная оценка иммунотерапевтической активности сывороточных и тканевых глобулинов Для первичной оценки лечебной эффективности полученных в предыдущей серии экспериментов сывороточных и тканевых глобулинов, во второй серии опытов использовали ту же in vitro модель – клеточную культуру лимфоцитов.

Для моделирования поражения иммуноцитов эндотоксином, в инкубационную среду с лимфоцитами вносили эндотоксин E. coli в концентрации 42,6 мкг/мл (ЛД70), затем инкубировали лимфоциты в течение 30 мин и по истечении указанной экспозиции вносили испытуемые лечебные препараты (сывороточные и тканевые – гистоглобулины) в количестве от 0,010 до 0,020 мг/мл, инкубировали в течение 4, 24 и 48 часов.

Результаты микроцитометрического анализа мазков из суспензии лимфоцитов представлены в табл. 11.

–  –  –

Из представленных в таблице материалов видно, что из испытанных вариантов препаратов (глобулинов), наиболее высокой иммунопротекторной активностью обладала антисыворотка, полученная на 30 день опыта от выживших после экспериментального заражения возбудителем эшерихиоза животных, которая обеспечивала выживаемость 85,9% пораженных энтеротоксином E. coli лимфоцитов при совместном культивировании подвергнутых токсическому воздействию клеток с испытуемыми глобулинами.

Вторую позицию занимала антисыворотка (АС) крови кроликов, иммунизированных 1-кратно 4-пили антигеном (субъединичной вакциной), полученная на 30 день после иммунизации кроликов, которая при постинкубационном культивировании подвергнутых воздействию энтеротоксина E. coli лимфоцитов с испытуемым препаратом обеспечивала выживаемость 82,1% пораженных токсином иммуноцитов.

Третью позицию занимали гистоглобулины, полученные из элюатов печени животных реконвалесцентов на 30 день после заражения, которые обеспечивали выживаемость 79,3 % пораженных эшерихиозным эндотоксином лимфоцитов.

Антисыворотка (АС), полученная от 1-кратно иммунизированных смесью 4 анатоксинов из штаммов E. coli – носителей К88, К99, 987Р и F41 антигенов на 20 день после иммунизации, которая предупреждала гибель 66,7% пораженных эндотоксином лимфоцитов при совместном постинкубационном инкубировании их с испытуемой сывороткой (глобулином).

Гипериммунная сыворотка, полученная от 4-кратно иммунизированных 4-пили антигеном кроликов на 40 день после иммунизации, обеспечивала выживаемость 60,5% пораженных эшерихиозным эндотоксином лимфоцитов.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 9 |

Похожие работы:

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1.Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1 Экологическая...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.