WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 |

«СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ РАЗЛИЧИЯ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ИЗОФОРМ АКТИНА В НЕМЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Рис. 6. Различия в распределении - и -CYA на ведущем крае клеток при движении в рану. (A) HSCF и (Б) PtK2. Распределение -CYA (зеленый) и -CYA (красный) на ведущем крае при движении в рану. -CYA-сеть в протрузиях. -CYA стресс-фибриллы (звездочка). Желтая окраска раффлов – колокализация CYAs в ламеллиподии (стрелка). Изображение б показывает большее увеличение ограниченного белой рамкой участка клетки (а). LSM. Масштаб 10 мкм.

Рис. 7. - и -CYA специфически локализованы в митозе. Клетки HaCaT в митозе: метафаза (А), анафаза (Б), телофаза (В). LSM. Масштаб 5 мкм.

Разная чувствительность цитоплазматических актинов к ингибиторам малых ГТФаз и агентам, меняющим полимеризацию актина. Образование стрессфибрилл и ламеллиподий регулируется ГТФ-связывающими белками RhoA и Rac1, соответственно (Ridley, Hall, 1992; Ridley et al., 1992). Инкубация клеток с селективным ингибитором Rho киназы, приводила к дезорганизации -CYA пучков, а сеть -CYA оставалась без изменений. Ингибитор Rac1 блокировал протрузионную активность, что видно по отсутствию ламелл/ламеллиподий, исчезновению -CYA сети и повышенному образованию - и -CYA стресс-фибрилл. Для исследования роли Rac1-зависимых сигнальных путей в сегрегации актиновых изоформ был использован вискостатин, селективный ингибитор N-WASP, который предотвращает активацию Arp2/3 комплекса. Инкубация с вискостатином предотвращала образование ламеллярных протрузий, обогащенных -CYA. Вместо этого, клетки формировали многочисленные -CYA филоподии и раффлы.

В работе были также использованы цитохалазин Д, который с высокой аффинностью связывается с оперенными концами актиновых филаментов, и латрункулин А, который взаимодействует с актиновыми мономерами и блокирует включение мономеров в филаменты (Spector et al., 1989). Низкие дозы цитохалазина ингибировали образование -CYA стресс-фибрилл и вызывали появление агрегатов

-CYA. Локализация -CYA в ламеллиподиальных протрузиях и распределение p34Arc и Arp3 не менялось от добавления цитохалазина. Латрункулин разрушал CYA сеть на ведущем крае, но не ингибировал образование -CYA стресс-фибрилл.

Действие siRNA -CYA и -CYA на морфологию и подвижность фибробластов.

HSCF были трансфицированы siRNA для -CYA, -CYA или scramble в качестве контроля. Иммуноблоттинг с mAbs к CYAs проводили через 72 часа после трансфекции. Cнижение экспрессии -CYA специфическими siRNA было 31 ± 4 % (p0,001), при этом уменьшения экспрессии -CYA не выявлено (Рис.8А), что подтверждает специфичность воздействия siRNA на изоформы актина. Cнижение экспрессии -CYA специфическими siRNA было 41 ± 7 % (p0,001), при этом количество -CYA оставалось неизменным, но возрастала экспрессия -SMA (Рис.

8А). Уменьшение экспрессии каждой CYA от siRNA даже такого уровня вызывало изменение морфологии, полярности и подвижности. Неполный нокдаун можно объяснить относительно долгим (2-3 дня) временем полужизни молекулы актина (Antecol et al., 1986) при оптимальном времени воздействия siRNA 3 сут. В клетках со сниженной экспрессией - или -CYA, изменения морфологии выявлены через 3 сут воздействия siRNA:

-CYA-дефицитные клетки имели широкие протрузии на ведущем крае, уменьшенное количество и размеры стресс-фибрилл, -CYA исчезал из ламеллиподий, но сохранялась -CYA сеть (Рис. 8Б). При уменьшении экспрессии CYA клетки не продуцировали ламеллиподии и формировали хорошо выраженные пучки, позитивные как на - и -CYA (Рис. 8Б), так и на -SMA (в 80% -CYA дефицитных клеток по сравнению с 30% в контроле; Рис.8Б, нижний ряд, вставка), что предполагает «сократимый» фенотип. После уменьшения экспрессии -CYA площадь клетки увеличивалась по сравнению с контролем (от 2962 ± 431 мкм2 до 5631 ± 937 мкм2, p0,01), при уменьшения экспрессии -CYA эта величина не менялась. Циркулярность (характеристика, обратная полярности) увеличивалась после снижения экспрессии -CYA (от 0,360 ± 0,005 до 0,545 ± 0,020, p0,001) и уменьшалась после снижения экспрессии -CYA (0,203 ± 0,047, p0,01).

Рис. 8. Изменение морфологии и подвижности фибробластов после siRNA -CYA или -CYA. HSCF: (A) Иммуноблоттинг после -, -CYA или контрольной (scramble) siRNA; (Б) фазовый контраст и иммунофлуоресценция после siRNA трансфекции; (В) Репрезентативные миграционные треки; (Г) количественная оценка скорости и направленности клеточной миграции.

Миграцию одиночных клеток через 3 сут после трансфекции - и -CYA siRNA изучали в течение 13 час (Рис.8В). Были выявлены различия в миграционных характеристиках при снижении экспрессии каждого из CYAs (Рис.8В). Средняя скорость статистически значимо снижалась у -CYA-дефицитных клеток (~33%) (Рис.8Г). Скорость, рассчитанная только в периоды движения, была снижена (15как у -CYA, так и у -CYA-дефицитных клеток (Рис.8Г). Снижение экспрессии

-CYA уменьшало направленность миграции (Рис.8Г), а снижение экспрессии -CYA увеличивало этот параметр. Т.о., -CYA отвечает за поддержание направления миграции, а -CYA, возможно, за кратковременные быстрые движения. Свойства ведущего края также менялись: ламеллиподиальные протрузии и ретракции, а также раффлы в контроле; продолжительные ламеллиподиальные протрузии в -CYAдефицитных клетках; филоподии и поджатия края клетки при -CYA -дефиците.

siRNA -CYA и -CYA в эпителиальных клетках. HaCaT были трансфицированы -, -CYA или контрольными siRNA. Иммуноблоттинг показал специфическое уменьшение -CYA на 28 ± 4 % (p0,01), а -CYA на 35,5 ± 6 % (p0,01). -CYA дефицитные клетки продуцировали широкие протрузии; -CYA дефицитные клетки имели вытянутый или полигональный фенотип без протрузий. В

-CYA дефицитных клетках уменьшалось количество -CYA пучков в базальной части и межклеточных контактах, а -CYA сеть не менялась. Морфология -CYA дефицитных клеток была изменена в сторону сократимого фенотипа с -CYA-стрессфибриллами. При уменьшении экспрессии -CYA выявлялось некоторое количество клеток с блебами, что подтверждает роль кортикального -CYA в поддержании формы клетки. Снижение экспрессии -CYA увеличивало долю многоядерных клеток (29 ± 2 %, p0,001, по сравнению с 2 % в контроле и -CYA-дефицитных клетках).

Индивидуальные роли - и -CYA в регуляции эпителиальных апикальных межклеточных контактов. Основными маркерами адгезионных межклеточных контактов (AJ) являются белки Е-кадгерин, - и -катенины. Eкадгерин экспрессируется в клетках большинства нормальных эпителиальных тканей.

В клетках нетрансформированных HaCaT и MDCK Е-кадгерин концентрируется в зоне межклеточных контактов. В поляризованных MDCK LSM выявила Е-кадгерин, колокализованный с -CYA в AJ. -CYA сеть в дистальной части апикальных компартментов не колокализована с AJ. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание Abs к белкам плотных контактов (TJ) - ZO-1 или окклюдину, и -CYA выявляет участки колокализации в TJ, на границе латеральных и апикальных компартментов.

Функциональные роли CYAs в межклеточных контактах были изучены методом siRNA к -CYA и -CYA (Baranwal et al., 2012). Эти эксперименты продемонстрировали уникальные роли -CYA и -CYA в регуляции и поддержании целостности AJ и TJ, соответственно. Было обнаружено, что обе CYAs необходимы для разных аспектов реорганизации адгезионных комплексов. Важным результатом является селективное функциональное соответствие разных изоформ актина различным типам контактных комплексов. При созревании AJ и TJ филаменты CYA и -CYA объединяются, становятся микроскопически не всегда различимыми, но их уникальные биохимические и функциональные свойства сохраняются.

Изучение реорганизации актинового цитоскелета при неопластической трансформации в различных экспериментальных системах. Одним из подходов для исследования путей преобразования мембранных сигналов и влияния активации сигнальных путей на цитоскелет является применение опухолевого промотора ТФА.

ТФА – это активатор протеинкиназы С, одного из важнейших регуляторных ферментов фосфоинозитольного пути передачи сигнала с поверхности клетки. При инкубации фибробластов 152/15 с ТФА изменение морфологии сопровождалось реорганизацией пучков актиновых микрофиламентов (их дезорганизацией) и актинового кортекса (обогащением кортикальной сети). На основании этих результатов и анализа литературных данных возникла гипотеза о существовании двух различных популяций микрофиламентов, играющих разные роли при неопластической трансформации.

Для изучения изменений CYAs, связанных с неопластической трансформацией N-RAS у фибробластов, мы использовали нормальные фибробласты HSCF, трансформированные N-RAS.

В нормальных фибробластах -CYA и -CYA были организованы в стресс-фибриллы и сети, соответственно. В трансформированных NRAS клетках не выявлялись -CYA стресс-фибриллы, тогда как -CYA сеть сохранялась. Кроме того, изучение изменений CYAs, связанных с неопластической трансформацией, проводилось на нормальных фибробластах WI38 и MRC5 и их SVтрансформированных производных: WI38-VA13 и MRC5-V1/-V2. В нормальных фибробластах WI38 и MRC5 -CYA и -CYA были организованы в стресс-фибриллы и сети, соответственно; в трансформированных клетках стресс-фибриллы не были выявлены, -CYA концентрировался в раффлах и филоподиях, а -CYA сеть выявлялась равномерно в кортексе. В менее трансформированных MRC5-V1 клетках сохранялось небольшое количество -CYA пучков. При сравнительной оценке соотношения CYAs оказалось, что в трансформированных клетках снижается доля CYA относительно -CYA.

Рассеивающий фактор HGF/SF - это белок, стимулирующий подвижность эпителиальных клеток в культуре (Stoker, Perryman, 1985). Реорганизации морфологии, индуцируемые HGF/SF в культуре, рассматривают как модель процессов in vivo, при которых эпителиальные клетки отделяются друг от друга и мигрируют. После инкубации с HGF/SF клетки приобретали характерную для подвижных фибробластов поляризованную морфологию с образованием ведущего края и хвостового отростка. Краевые кольцевые пучки исчезали, но появлялись прямые пучки актина. Окрашивание mAbs к -CYA и -CYA показало, что пучки образованы -CYA, а подвижные широкие ламеллы обогащены -CYA.

Возможность изменения распределения и соотношения CYAs при неопластической трансформации эпителиальных клеток была проверена на кератиноцитах, трансформированных N-RAS и H-RAS. Контрольные (Рис.9A, Б), NRAS (Рис.9В, Г) и H-RAS (Рис. 9Д, Е) - HaCaT были окрашены mAbs к CYAs. При трансформации исчезали кольцевые пучки -CYA, но выявлялась сеть -CYA. По данным иммуноблоттинга, относительное количественное соотношение CYAs при RAS трансформации менялось в сторону уменьшения -CYA (Рис. 9Ж).

Организация актинового цитоскелета в культивируемых опухолевых кератиноцитах. В отличие от иммортализованных кератиноцитов HaCaT, в которых

-CYA организован в пучки, в клетках рака шейки матки был выявлен, в основном, диффузный -CYA, лишь небольшая часть была организована в аберрантные фибриллы и раффлы. Во всех исследуемых культурах опухолевых кератиноцитов интенсивно окрашивалась кортикальная и ламеллиподиальная сеть -CYA. Сравнение соотношения CYAs показало относительное снижение содержания -CYA и увеличение содержания -CYA в более трансформированных кератиноцитах (Шагиева и др, 2012).

Рис.9. Изменения в организации и относительном содержании CYAs в кератиноцитах при трансформации онкогенами RAS. Контрольные (A, Б), N-RAS (В, Г) и H-RAS (Д, Е) трансформированные HaCaT были окрашены mAbs к -CYA (зеленый) и -CYA (красный). DRAQ5 (ДНК, синий). (Ж) Изменение соотношения CYAs при RAS-трансформации. Данные иммуноблоттинга.

Изучение внутриклеточной локализации и функций - и -CYA в фибробластах и эпителиальных клетках в стационарном состоянии и при реорганизациях актинового цитоскелета. Вероятность того, что - и -CYA выполняют различные биологические функции, была под вопросом, несмотря на предположения о функциональной специфичности мышечных изоформ (Chaponnier, Gabbiani, 2004; Lambrechts et al., 2004). Результаты, представленные в данной работе, получены с помощью специфической иммунодетекции - и -CYA в одной и той же клетке. Впервые продемонстрировано, что эти изоформы актина сегрегированы в цитоплазме мезенхимальных и эпителиальных клеток в состоянии покоя, а также при движении и делении. Селективное уменьшение экспрессии - или -CYA с помощью siRNA показало, что каждая изоформа принимает разное участие в организации клеточной морфологии, полярности и подвижности.

Два типа структур, которые образуют актиновые филаменты, т.е. пучки и ветвящиеся сети, были ранее охарактеризованы в немышечных клетках с помощью электронной микроскопии (Abercrombie et al., 1971; Small, 1981; Svitkina et al., 1995) и специальных методик иммунодетекции (Svitkina, Borisy, 1999). Пучки микрофиламентов представлены в виде стресс-фибрилл, филоподий, сократимых колец и структур межклеточных контактов, в то время как ветвящиеся филаменты образуют кортикальные и ламеллиподиальные сети.

Каждая из систем микрофиламентов характеризуется преобладанием одной из изоформ актина:

-CYA в пучках и -CYA в ветвящихся филаментах (Dugina et al., 2009; Рис.10). Селективное распределение наблюдалось во всех изученных типах нормальных немышечных клеток, что указывает на универсальность данного феномена.

–  –  –

Полученные данные частично противоречат публикациям, в которых -CYA детектировали, в основном, на ведущем крае клеток (Gimona et al., 1994; Hoock et al., 1991). Доступность эпитопа зависит от условий фиксации-пермеабилизации, что объясняет некоторые противоречия. После тестирования различных способов фиксации, была выбрана последовательная фиксацию 1%PFA и метанолом, что привело к регулярному выявлению -CYA стресс-фибрилл в дополнение к ранее описанной локализации на ведущем крае, а также продемонстрировало лучшие условия детекции N-концевого эпитопа актина.

В соответствии с результатами иммунофлуоресцентных изучений находятся и данные по локализации -CYA с помощью экспрессии CYA, в котором флуоресцентный белок сшит с С-концом молекулы для сохранения специфичности изоформы:

-CYA-GFP встраивается в стресс-фибриллы. Для -CYA описанная выше фиксация также оптимальна и совпадает с локализацией экзогенного флуоресцентного белка. В отличие от -CYA, распределение -CYA в эпителиальных и мезенхимальных клетках не было описано.

В работе представлены экспериментальные доказательства различного распределения цитоплазматических актинов в нормальных немышечных клетках:

1) Эксперименты с siRNA показали, что в -CYA-дефицитных клетках сильно редуцировано содержание стресс-фибрилл, тогда как -CYA-дефицитные клетки не образуют ламеллиподиальные протрузии.

2) Формирование стресс-фибрилл и ламеллиподий регулируется малыми ГТФ-азами RhoA и Rac1, соответственно (Ridley, Hall, 1992). Селективные ингибиторы RhoAкиназы и Rac1 специфически воздействуют на распределение - и -CYA.

3) Обнаружено, что системы - и -CYA обладают дифференцированной реакцией на агенты, деполимеризующие актин, при использовании данных веществ в минимальных концентрациях в процессе реорганизации актина.

4) Специфический маркер ламеллиподий (белок p34Arc семейства Arp2/3) колокализован на ведущем крае с -CYA, тогда как -CYA колокализован с белком VASP в сайтах инициации полимеризации актина.

Важным свойством, связанным с организацией актина, является клеточная полярность. В эпителиальных клетках плазматическая мембрана и цитоскелетные белки организованы в апикальные и базо-латеральные домены, обладающие структурными и функциональными отличиями (Nelson, 2003; Yeaman et al., 1999). В эпителиальных клетках - и -CYA сегрегированы в базо-латеральный и апикальный домены, соответственно (Рис. 11).

Эксперименты с siRNA предполагают роли - и CYA для формирования правильной эпителиальной полярности:

-CYA-дефицитные клетки теряют организованные AJ и становятся более распластанными; -CYAдефицитные кератиноциты приобретают сократимый фенотип, который выражается в формировании стресс-фибрилл.

–  –  –

В культивируемых фибробластах планарная полярность характеризуется выбрасыванием ламеллиподий в направлении миграции и ретрактирующей «хвостовой» частью клетки (Abercrombie et al., 1970). Метод экспериментальных ран в культуре продемонстрировал градиент изменений от сократимого фенотипа, с преобладанием -CYA-стресс-фибрилл в глубине монослоя до подвижного фенотипа с преобладанием -CYA в протрузиях. - и -CYA колокализованы в ламеллиподии, обе изоформы присутствуют в ламелле, но распределены в разных филаментных структурах. -CYA, локализуется в пучках, концы которых соединены с ФК. В нормальных фибробластах мРНК -CYA концентрируется во фронтальной части ламеллы, но заново синтезированный актин вносит незначительный вклад во фракцию мономерного актина на ведущем крае клетки (Condeelis, Singer, 2005).

Методом трекинга одиночных -CYA мРНК было показано, что транспортировка этих мРНК к ФК приводит к их стабилизации (Katz et al., 2012). Эти результаты согласуются с нашими данными о роли -CYA в клетке.

Ведущая роль -CYA в контроле направленности движения следует из результатов siRNA экспериментов. Помимо поляризации, в миграцию фибробластов вовлечены и другие процессы: выбрасывание ведущей ламеллы, прикрепление клетки к субстрату путем формирования ФК с ECM, передвижение тела клетки и высвобождение мест прикрепления (Lauffenburger, Horwitz, 1996; Ridley et al., 2003).

Протрузионная активность блокирована при пониженной экспрессии -CYA, но ненаправленная двигательная активность в этих условиях сохраняется. -CYA также играет роль в клеточной миграции, что было выявлено при оценке скорости движения клеток, которая у -CYA-дефицитных клеток была ниже, чем в контроле, при сравнении этого параметра только в периоды движения.

Сравнение нормальных и трансформированных клеток показало, что при различных типах неопластической трансформации происходит изменение специфической изоформы актина -CYA. Фенотипическая нормализация трансформированных фибробластов и эпителиальных клеток под действием митохондриально-направленных антиоксидантов приводила к восстановлению CYA системы пучков и сопряженных с ними ФК у фибробластов и AJ в эпителии.

Сортинг -CYA в миозин II-зависимые сократимые структуры показывает роль этой изоформы в клеточном сокращении. Специфическое ингибирование сократимости блокировало образование -CYA-содержащих стресс-фибрилл, но не разрушало сеть -CYA. Подобный подвижный фенотип, меньшее количество стрессфибрилл и ведущий край с активными протрузиями наблюдали у миозин IIAдефицитных клеток (Even-Ram et al., 2007; Sandquist et al., 2006). Блеббистатин блокировал клеточное натяжение, приводил к диссоциации стресс-фибрилл и ингибировал соединение миозина II с актином (Goeckeler et al., 2008). В наших экспериментах ингибирование активности миозина мешало формированию -CYA стресс-фибрилл. Вероятно, -CYA специфически взаимодействует с миозином IIA, что также следует из колокализации этих двух белков.

Еще одним аргументом в пользу роли -CYA в клеточной сократимости является локализация этой изоформы в сократимом кольце при цитокинезе, в то время как -CYA всегда концентрируется в кортексе. Образование многоядерных клеток в -CYA-дефицитных кератиноцитах полностью согласуется с данными об участии -CYA в образовании сократимого кольца при клеточном делении.

Продолжением митотических исследований была совместная работа с эмбриологической группой (Brockmann et al, 2011), в которой показано, что CYAs поразному распределены в созревающих ооцитах. -CYA локализован в кортикальном слое ооцитов и отсутствует в зоне межклеточных контактов от поздней метафазы II до бластоцистной стадии. -CYA концентрировался в сократимых структурах при цитокинезе, в межклеточных контактах и вокруг бластоцистной полости.

Сократимый фенотип -CYA-дефицитных фибробластов характеризуется редукцией протрузионных структур и появлением -SMA в стресс-фибриллах. Такое повышение экспрессии -SMA может быть одним из последовательных этапов дифференцировки в направлении миофибробластного фенотипа (Hinz et al., 2002).

Однако, нельзя исключить, что наблюдаемое повышение количества -SMA является результатом компенсаторного синтеза в ответ на уменьшение экспрессии -CYA.

ЧАСТЬ 4. Исследование реорганизации изоформ актина в нормальных и опухолевых тканях человека Распределение изоформ актина в клетках нормальной, диспластической и опухолевой ткани молочной железы человека.

Проведено иммуноморфологическое исследование локализации CYAs в структурах нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека. Исследование распределения изоформ актина сопровождалось определением кератина 8 (К8), типичного для выстилающего эпителия, базального кератина 17 (К17) и -SMA, выявляющих миоэпителий, а также маркера базальных мембран – ламинина. Ранее было показано, что сочетание этих маркеров позволяет отличать диспластические структуры от злокачественных (Guelstein et al., 1988; 1993): сочетание базальных и люминальных кератинов встречается обычно при доброкачественной пролиферации, а присутствие исключительно люминальных или простых кератинов, таких как К8, указывает на злокачественные структуры. Данные характеристики не относятся к особым формам рака молочной железы (РМЖ).

Специфические mAbs к -CYA и -CYA полярно окрашивали клетки однослойного выстилающего эпителия нормальных структур молочной железы человека:

-CYA выявлен в апикальной части клеток выстилающего эпителия, а CYA выявлен в виде базо-латеральных точечных и филаментозных структур.

Базальный слой нормальных структур образован миоэпителиальными клетками. mAb к -CYA выявляли ярко окрашенные пучки микрофиламентов в этом слое.

Миоэпителиальная природа этих клеток была подтверждена выявлением -SMA в стресс-фибриллах, а также окраской К17 в протоках и больших альвеолах. Окраска на ламинин выявляла базальную мембрану, окружающую миоэпителиальный слой.

Исследование распределения изоформ актина в доброкачественных опухолях и диспластических структурах молочной железы человека.

Интенсивное окрашивание mAbs к - и -CYA было выявлено практически во всех рассмотренных случаях доброкачественных пролифератов молочной железы. В тех случаях, когда не была нарушена двуслойная структура железы, пролиферирующие клетки сохраняли полярное распределение CYAs подобно нормальному выстилающему эпителию: апикальное для -CYA и базо-латеральное для -CYA.

Сохранение двуслойной папиллярной структуры подтверждалось окрашиванием К8 в выстилающем эпителии и К17 в миоэпителии. В клетках доброкачественных пролифератов многослойного типа исчезало полярное распределение -CYA и CYA, окрашивание mAbs к -CYA было гомогенным, а -CYA окрашивание подчеркивало полигональные контуры клеток. Доброкачественная природа пролифератов подтверждалась одновременной окраской на К8 и К17. Базальный слой всех доброкачественных пролифератов состоял из миоэпителия, позитивного на К17 и -SMA, окруженных базальной мембраной, выявляемой Abs к ламинину (Рис.12).

Исследование распределения изоформ актина в злокачественных опухолях люминального типа. При исследовании инфильтративных карцином различного строения большинство опухолевых клеток были гомогенно окрашены mAbs к -CYA с примембранным усилением интенсивности окраски. Такой тип окрашивания CYAs был выявлен как в структурах in situ, так и в инфильтративном компоненте и метастазах. Клетки карцином, заполняющие просвет железистой структуры, экспрессировали только К8, что подтверждало их злокачественную природу.

Интенсивность окраски на -CYA существенно снижалась (Рис.12). Исключение Рис. 12. Распределение изоформ актина, кератинов и ламинина при гиперпластическом процессе (А-Г) и в сходных структурах протокового РМЖ in situ (Д-З). (А, Д) – гематоксилин-эозин; Б-Г, Е-З – двойное окрашивание mAbs к: (Б,

Е) К8 (зеленый) и ламинину (красный); (В, Ж) -SMA (зеленый – миоэпителий) и К17 (В, красный, окраска клеток внутри пролиферата) в отличие от внутрипротокового РМЖ (Ж, положительная окраска в миоэпителии, желтый- совместно с -SMA); (Г, З) - (зеленый) и -CYA (красный): клетки внутри пролиферата окрашены на - и CYA (Г, желтый, коэкспрессия), в отличие от внутрипротокового РМЖ (З, положительная окраска -CYA выявляется только в миоэпителии, клетки внутрипротокового РМЖ окрашены mAbs к -CYA. Серийные криостатные срезы.

Иммунофлуоресцентная микроскопия. Увеличение х120.

составляли низкодифференцированные формы инфильтративных РМЖ высокой степени злокачественности, у которых в клетках опухоли часто встречались маркеры базального эпителия, поэтому их называют базальноподобными РМЖ (Perou et al., 2000; Sorlie et al., 2001). Окраска на -CYA в солидных участках этих форм РМЖ была сохранена, но снижена в скиррозном компоненте.

Распределение изоформ актина в клетках нормальной, диспластической и опухолевой ткани молочной железы человека. Результаты иммуногистологических исследований показали, что в клетках нормального железистого эпителия молочной железы существует полярное распределение CYAs, а именно, селективное распределение - и -CYA в разных клеточных компартментах (базолатеральном и апикальном, соответственно). Феномен сегрегации CYAs, обнаруженный при изучении клеток в культуре, получил подтверждение при изучении экспрессии и распределения CYAs в нормальной ткани молочной железы in vivo. При окраске на CYAs клетки дисплазий имели смешанный фенотип: - и -CYA выявлялись в одних и тех же клетках без видимых различий в распределении, в то время как в карциномах экспрессия -CYA значительно уменьшалась. Таким образом, -CYA возможно использовать в качестве дополнительного маркера в дифференциальной диагностике доброкачественных гиперплазий и люминального РМЖ.

Реорганизация изоформ актина и адгезионных контактов в клетках цервикальных карцином. Иммуногистологическое исследование выявило снижение окрашивания -CYA в структурах рака in situ и инвазивного рака по сравнению с нормальной тканью экзоцервикса и интраэпителиальными неоплазиями. При ЭМП в культурах клеток цервикальных карцином, помимо изменений в распределении и экспрессии известных маркеров Snail, Е- и N-кадгеринов и виментина, происходит реорганизация -CYA структур и относительное снижение экспрессии этой изоформы актина (Шагиева и др., 2012). Иммуноморфологическое исследование клинического материала подтверждает данные, полученные на клеточных культурах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итогом экспериментальных исследований было, в первую очередь, получение достоверных данных о роли гладкомышечной изоформы актина (-SMA) в немышечных клетках – фибробластах. Проведено сравнение -SMA негативных и SMA позитивных фибробластов разного органного и тканевого происхождения, их морфологии, актинового цитоскелета и контактных структур. Показано, что морфологические и цитоскелетные характеристики фибробластов различны в зависимости от присутствия -SMA. Роль -SMA при индукции миофибробластной дифференцировки изучена с помощью TGF. Для выполнения данной задачи была использована LSM с 3D реконструкцией изображения, а также биохимические методы. Обнаружено, что индукция миофибробластного фенотипа сопровождается значительным увеличением размеров ФК с образованием 3D структур, названных «суперзрелыми» ФК, которые были связаны с -SMA позитивными пучками;

экспрессия винкулина, паксиллина, тензина, FAK и интегрина 51 в таких ФК повышена. Особую роль в индукции экспрессии -SMA играл ED-A FN. Комплексная структура контактов с ECM и растущая устойчивость ED-A FN сети к натяжению, продуцируемому клетками с -SMA, были необходимы для суперсозревания ФК.

Окончательное состояние ФК определяется балансом двух сил – центробежным актомиозиновым натяжением и устойчивостью ECM.

Для сравнительного исследования цитоплазматических изоформ актина - и CYA протестированы разные линии и первичные культуры клеток животных и человека. Особое внимание было уделено линиям клеток нормального эпителия, а также линиям опухолевых клеток эпителиального происхождения, т.к. в клетках этого типа экспрессируются только две изоформы актина, - и -CYA. Получены новые данные о сравнительной структуре и белковой композиции кортикальных и ламеллиподиальных -CYA сетей, а также -CYA пучков и контактных структур в нормальных и неопластически трансформированных клетках.

Анализ 3D взаимной организации - и -CYA проведен с использованием LSM. Показано, что -CYA преимущественно локализован в филоподиях, стресс-фибриллах, кольцевых пучках и адгезионных межклеточных контактах, что означает роль этой изоформы в клеточной адгезии и сокращении. -CYA организован по-разному в зависимости от клеточной активности: в виде кортикальных и ламеллиподиальных сетей в движущихся клетках, что предполагает его роль в клеточной подвижности; в стационарных клетках -CYA также может быть локализован в дорзальных пучках. Исследованы изменения в организации актиновых структур в условиях обработки клеток ингибиторами сигнальных путей, в различной степени воздействующими на разные актиновые системы.

Изучение функций изоформ было продолжено в экспериментах с помощью специфического уменьшения экспрессии - и -CYA РНК-интерференционным методом с последующим анализом функциональных изменений. Мы обнаружили, что снижение экспрессии - и -CYA с помощью siРНК вызывает морфологические и функциональные изменения нормальных фибробластов и эпителиальных клеток.

Уменьшение количества -CYA приводит к усилению распластывания и направленной подвижности, тогда как снижение экспрессии -CYA усиливает сократимый фенотип у нормальных клеток и тормозит направленную подвижность.

Проведены исследования организации - и -CYA в митотическом процессе, а также в мейотических делениях клетки и ранних эмбриональных делениях. Эти модели являются важными аналогами процессов, происходящих при опухолевой трансформации с предполагаемым вовлечением клеток-предшественников так называемого стволового происхождения.

Обнаружено, что трансформированные клетки теряют -CYA-содержащие пучки микрофиламентов, но в них выявляются хорошо развитые -CYA сети. Основное свойство клеточной трансформации состоит в реорганизации актинового цитоскелета, ведущее к измененной клеточной подвижности и инвазии. Многочисленными исследованиями было показано исчезновение стресс-фибрилл в трансформированных клетках, но о специфическом изменении актиновых изоформ при онкогенной трансформации было известно мало. Сравнение организации CYAs у нормальных и трансформированных фибробластов показало, что трансформированные клетки отличаются от нормальных редукцией -CYA пучков и развитием кортикальных и ламеллиподиальных -CYA протрузий. Количественная оценка экспрессии была проведена с помощью анализа соотношения изоформ на 2D электрофорезе, а также с помощью иммуноблоттинга. Выявлена связь клеточной трансформации с реорганизацией CYAs и модуляциями в их экспрессии.

Изучена возможность применения иммунодетекции в CYAs патоморфологической диагностике. Снижение экспрессии -CYA при опухолевой трансформации было обнаружено при иммуноморфологическом исследовании клинического материала (нормальной и опухолевой ткани молочной железы и шейки матки человека). Предложено использовать специфические mAbs к -CYA в качестве дополнительного иммуногистологического маркера для дифференциального диагноза между доброкачественными неоплазиями и РМЖ люминального типа. Исключение составляли редкие формы РМЖ высокой степени злокачественности. Сочетание различных цитоскелетных маркеров было использовано для более точной диагностики базальноклеточных РМЖ.

Проведено сравнительное исследование эпителия шейки матки на разных стадиях опухолевой прогрессии: при диспластических процессах, раке in situ и инвазивном раке. Исследование клинического материала – образцов опухолевой ткани выявило снижение экспрессии -CYA по сравнению с нормальной цервикальной тканью и интраэпителиальными неоплазиями, что подтверждает данные, полученные на клеточных культурах. Дальнейшие исследования покажут, является ли соотношение актиновых изоформ и их структурная реорганизация в неопластических клетках определяющими для проявления опухолевых свойств – способности к инвазии и метастазированию.

Разрушение адгезионных межклеточных контактов (AJ) является ключевым шагом опухолевой прогрессии, приводящим к инвазии и метастазированию. Роли - и

-CYA в поддержании межклеточных контактов были выявлены с помощью специфических siRNA к - и -CYA, а также при использовании проникающих в клетку ингибирующих пептидов. Одним из наиболее важных результатов данного изучения является селективное функциональное соответствие разных изоформ актина различным типам контактных комплексов. Дальнейшие исследования помогут прояснить механизмы и биологические роли - и -CYA в нормальном эпителиальном морфогенезе и при патологических состояниях.

При опухолевой трансформации большое значение имеют процессы реорганизации цитоскелета, которые лежат в основе способности опухолевых клеток к инвазии и метастазированию. Перестройка актинового цитоскелета и AJ является важным шагом в приобретении инвазивности эпителиальными опухолями. В наших экспериментах были показаны изменения в организации -CYA в опухолевых клетках по сравнению с нормальными кератиноцитами. Инкубация опухолевых клеток с митохондриально-направленными антиоксидантами приводила к восстановлению эпителиальной организации: пучков -CYA и AJ.

Перспективы исследований и дальнейшей разработки темы:

избирательная реорганизация - и -CYA в линиях опухолевых клеток. Метод трансфекции siRNA имеет некоторые ограничения и не позволяет проводить длительные эксперименты по изучению изменений клеточных функций, поэтому в дальнейших исследованиях мы планируем использовать метод shRNA, а также экзогенно повышать экспрессию - и -CYA в нормальных и опухолевых клетках.

Сравнение инвазивных свойств клеток с измененными уровнями экспрессии - и CYA будет проведено с помощью тестирования направленного движения в 3D системе. Планируется также проверить влияние изменения соотношения изоформ на опухолеродность клеток в экспериментальных системах на животных моделях.

Предварительные функциональные данные подтверждают наши предположения о роли -CYA в поддержании нормального фенотипа и противоположной роли -CYA в усилении неопластических свойств некоторых типов опухолевых клеток.

ВЫВОДЫ

Целью данной диссертационной работы было установить потенциальные морфофункциональные различия изоформ актина в нормальных и неопластически трансформированных клетках. В соответствии с задачами работы установлено:

1. Морфологические и цитоскелетные характеристики фибробластов зависят от экспрессии -SMA в стресс-фибриллах, а не от их тканевого происхождения.

2. Ростовой фактор TGF вызывает дифференцировку фибробластов в миофибробласты в культуре с последовательной индукцией ED-A FN и -SMA.

3. Экспрессия -SMA и включение его в состав стресс-фибрилл вызывает увеличение размеров ФК (созревание) с формированием «суперзрелого» ФК.

4. Формирование «суперзрелых» ФК зависит от молекулярного состава микрофиламентов и фибрилл ECM. Для образования «суперзрелого» ФК необходим синтез и встраивание в пучок -SMA, ответственного за повышенную сократимость.

5. -CYA и -CYA по-разному распределены в немышечных клетках, где они играют определяющую роль в ключевых клеточных процессах. -CYA локализован в базальных стресс-фибриллах, кольцевых пучках, ФК и AJ. -CYA организован в зависимости от активности клетки: в кортикальных и ламеллиподиальных сетях, в дорзальных пучках и TJ. Две системы актиновых микрофиламентов (-CYA и -CYA) находятся под контролем различных сигнальных путей.

6. Снижение экспрессии -CYA уменьшает количество стресс-фибрилл, стимулирует распластывание и направленное движение клеток. Снижение экспрессии -CYA индуцирует сократимый фенотип и блокирует направленное движение.

7. При неопластической трансформации клеток в культуре происходит преимущественное нарушение системы -CYA содержащих пучков и уменьшение относительного содержания -CYA, а при фенотипической нормализации наблюдается обратный процесс.

8. При исследовании распределения изоформ актина в злокачественных новообразованиях молочной железы и шейки матки выявлено снижение иммунофлуоресцентного окрашивания -CYA по сравнению с нормальной тканью и доброкачественными неоплазиями в тех же тканях человека.

9. Таким образом, изоформы актина в нормальных и трансформированных клетках морфологически и функционально различаются:

-SMA обеспечивает повышенную сократимость; -CYA отвечает за поддержание нормального дифференцированного фенотипа, адгезию и сократимость; -CYA связан с подвижностью клетки и пластичностью актинового кортекса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах, соответствующих перечню ВАК РФ:

1. Dugina, V.B., Svitkina, T.M., Vasiliev, Ju. M., Gelfand, I.M. Special type of morphological reorganization induced by phorbol ester: reversible partition of cell into motile and stable domains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1987 – V. 84. – Р. 4122-4125.

2. Alexandrova, A.Y., Dugina, V.B., Paterson, H., Bershadsky, A.D.,Vasiliev, J.M.

Motility of intracellular particles in rat fibroblasts is greatly enhanced by phorbol ester and by over-expression of normal N-ras product // Cell Motility Cytoskeleton – 1993 – V. 25. – P. 254-266.

3. Dugina, V.B., Alexandrova, A.Y., Lane, K., Bulanova, E., Vasiliev, J.M. The role of the microtubular system in the cell response to HGF/SF // J. Cell Science – 1995 – V.108. – P.1659-1667.

4. Dugina, V.B., Alexandrova, A.J., Chaponnier, C., Vasiliev, J.M., Gabbiani, G. Rat fibroblasts cultured from various organs exhibit differences in -smooth muscle actin expression, cytoskeletal pattern and adhesive structure organization // Exp. Cell Research – 1998 – V.238. – P.481-490.

5. Alexandrova, A.J., Dugina, V.B., Ivanova, O.Y, Kaverina, I.N., Vasiliev, J.M. Scatter factor induces segregation of multinuclear cells into several discrete motile domains // Cell Motility Cytoskeleton – 1998 – V. 39 – P. 147-158.

6. Dugina, V., Fontao, L., Chaponnier, C., Vasiliev, J., Gabbiani, G. Focal adhesion features during myofibroblastic differentiation are controlled by intracellular and extracellular factors // J. Cell Science – 2001 – V. 114. – P. 3285-3296.

7. Дугина, В. Б., Александрова, А. Ю. Габбиани, Дж., Васильев, Ю. М. Влияние акто-миозиновой сократимости на фокальные контакты миофибробластов и структуру стресс-фибрилл // Цитология – 2002 – V. 44 (1). – P. 48-55.

8. Hinz, B., Dugina, V., Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Chaponnier, C. Alpha-smooth muscle actin is crucial for focal adhesion maturation in myofibroblasts // Mol. Biol. Cell. – 2003 – V.14 (6). – P. 2508-2519.

9. Clement, S., Hinz, B., Dugina, V., Gabbiani, G., Chaponnier, C.. The N-terminal AcEEED sequence plays a role in -smooth muscle actin incorporation into stress fibers // J.

Cell Sci. – 2005 – V. 118. – P. 1395-1404.

10. Дугина, В. Б., Чипышева, Т.А., Ермилова, В.Д., Габбиани, Д., Шапонье, К.

Васильев, Ю.М. Распределение изоформ актина в клетках нормальной, диспластической и опухолевой ткани молочной железы человека // Архив патологии

– 2008 – T. 70. – №2. – P. 28-31.

11. Агапова, Л.С., Черняк, Б.В., Домнина, Л.В., Дугина, В.Б., Ефименко, А.Ю., Фетисова, Е.К., Иванова, О.Ю., Калинина, Н.И., Хромова, Н.В., Копнин, Б.П., Копнин, П.Б., Коротецкая, М.В., Личиницер, М.Р., Лукашев, А.Л., Плетюшкина, О.Ю., Попова, Е.Н., Скулачев, М.В., Шагиева, Г.С., Степанова, Е.В., Титова, Е.В., Ткачук, В.А., Васильев, Ю.М., Скулачев, В.П.. SKQ1 подавляет развитие опухолей из p53-дефицитных клеток // Биохимия – 2008 – V. 73 (12) – P. 1622- 1640.

12. Dugina, V., Zwaenepoel, I., Gabbiani, G., Clment, S., Chaponnier, C. Beta and gamma-cytoplasmic actins display distinct distribution and functional diversity // J. Cell Science. – 2009 – V. 122. – P. 2980-2988.

13. Дугина, В.Б., Ермилова, В.Д., Чемерис, Г. Ю., Чипышева, Т.А. Актины и кератины как цитоскелетные маркеры в диагностике базальноподобного рака молочной железы человека // Архив патологии. – 2010 – Т.72. – №2. – С. 12-15.

14. Popova, E.N., Pletjushkina, O.Y., Dugina, V. B., Domnina, L.V., Ivanova, O.Y., Izyumov, D.S., Skulachev, V.P., Chernyak, B.V. Scavenging of reactive oxygen species in mitochondria induces myofibroblast differentiation // Antiox. Redox Signal. – 2010. – V.

13(9). – P.1297-1307.

15. Демьяненко, И.А., Васильева, Т.В., Домнина, Л.В., Дугина, В.Б., Егоров, М.В., Иванова, О.Ю., Ильинская, О.П., Плетюшкина, О.Ю., Попова, Е.Н., Сахаров, И.Ю., Федоров, А.В., Черняк, Б.В. Новые митохондриально-направленные антиоксиданты на основе «ионов Скулачева» ускоряют заживление кожных ран у животных // Биохимия – 2010 – Т. 75. – №3. – C. 337-345.

16. Brockmann, C., Huarte, J., Dugina, V., Challet, L., Rey, E., Conne, B., Swetloff, A., Nef, S., Chaponnier, C., Vassalli, J.-D. Beta and Gamma Cytoplasmic Actins Are Required for Meiosis in Mouse Oocytes // Biology Reprod. – 2011. – V. 85. – P. 1025-1039.

17. Шагиева, Г.С., Домнина, Л.В., Чипышева, Т.А., Ермилова, В.Д., Шапонье, К., Дугина, В.Б. Реорганизация изоформ актина и адгезионных контактов при эпителиально-мезенхимальном переходе в клетках цервикальных карцином // Биохимия – 2012 – Т.77. – №11. – С.1513-1525.

18. Baranwal, S., Naydenov, N. G., Harris, G., Dugina, V., Morgan, G., Chaponnier, C., Ivanov A. I. Nonredundant roles of cytoplasmic - and -actin isoforms in regulation of epithelial apical junctions // Mol Biol Cell. – 2012 – V. 23. – № 18. – P. 3542-3553.

19. Latham, S. L., Chaponnier, C., Dugina, V., Couraud, P.-O., Grau, G. E. R., Combes, V.

Cooperation between - and -cytoplasmic actins in the mechanical regulation of endothelial microparticle formation // FASEB J. – 2013 – V. 27. – № 2. – P. 672-83.

20. Arnoldi, R., Hiltbrunner, A., Dugina, V., Tille J.-C., Chaponnier C.. Smooth muscle actin isoforms: A tug of war between contraction and compliance // European Journal of Cell Biology – 2013. – V. 92. – № 6-7. – С. 187-200.

Главы в книгах:

21. Dugina, V., Arnoldi, R., Janmey, P. A., Chaponnier, C. Chapter 1. Actin // In: ”The Cytoskeleton and Human Disease”, Ed. M. Cavallaris, Humana Press, Springer – 2012. – P. 3-28.

22. Ермилова, В.Д., Петров, С.В., Должиков, А.А., Дугина, В.Б., Чипышева, Т.А.

Иммуногистохимическая диагностика доброкачественных поражений и рака молочной железы // В книге: «Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека» под ред. С. В. Петрова, Н. Т. Райхлина. Казань – 2012. – С.

121Тезисы докладов на научных конференциях:

1. Dugina V.B. Role of microtubules in the morphological reorganization of MDCK epithelial cells induced by HGF/SF // Asia Pacif. J. Molec. Biol. Biothec. – 1994. – V.2. – N3. – P.274.

2. Alexandrova A.Y., Dugina V.B. The significance of the microtubular system in response of the epithelial cells to HGF/SF // Cytosk. Cell Func. Meet. Cold Spring Harbor – 1995. – P. 20.

3. Dugina V.B., Alexandrova A.Y., Chaponnier C., Vasiliev J.M., Gabbiani G. Fibroblasts expressing and not expressing -Smooth muscle actin exhibit differences in morphology, cytoskeletal pattern and adhesive structure organization // “Mechanisms involved in tissue repair and fibrosis”. – 1997. – P. 32.

4. Дугина В.Б., Васильев Ю.М. Роль изоформ актина в эволюции фокальных контактов клетка - матрикс // 2-й съезд биофизиков России. – 1999.

5. Dugina V.B., Gabbiani G. The role of ED-A fibronectin organisation in the development of myofibroblastic cell-matrix adhesions // The 14th Meeting of ECF. – 1999.

6. Дугина В.Б., Васильев Ю.М., Габбиани Дж. Роль изоформ актина в эволюции фокальных контактов клетка-матрикс // “Цитоскелет и клеточная регуляция”. – 2000.

7. Dugina V., Fontao L., Chaponnier C., Vasiliev J., Gabbiani G. TGF--induced maturation of focal adhesions during myofibroblast differentiation: the role of ED-A fibronectin // J. Submicr.

Cytology and Pathology – 2000. – V.32. – N.3. – C006.

8. Dugina V., Hinz B., Celetta G., Gabbiani G., Chaponnier C. Tensile force production by myofibroblast stress fibers: role of the NH2-terminal sequence of a-smooth-muscle actin // The 17th Meeting of European Cytoskeleton Foru. – 2002.

9. Hinz B., Dugina V., Ballestrem C., Wehrle-Haller B., Chaponnier C., Gabbiani G. Alphasmooth muscle actin is crucial for myofibroblast focal adhesion formation // The 17th Meeting of European Cytoskeleton Forum – 2002.

10. Hinz B., Dugina V., Ballestrem C., Wehrle-Haller B., Chaponnier C.. Alpha-smooth мuscle actin mediated contractile activity leads to focal adhesion supermaturation of myofibroblasts // Gordon Research Conference on Tissue Repair and Regeneration – 2003.

11. Clement S., Hinz B., Dugina V., Gabbiani G., Chaponnier C. Investigation of the NH2terminal peptide AcEEED effect on alpha-smooth muscle actin-GFP // The 18th ECF Meeting EMBO/FEBS “Frontiers in Cytoskeleton Research” – 2003.

12. Дугина В.Б. Роль изоформ актина в организации фокальных контактов // Цитология – 2003. – Т.45. – P. 871.

13. Dugina V., Gabbiani G., Chaponnier C. The cytoplasmic actins and are differentially distributed in motile cells // FEBS “From Cell Biology to Development and Disease” – 2004. – P.

47.

14. Dugina V., G.Gabbiani, C. Chaponnier. The cytoplasmic actins and are differentially distributed in stationary and motile cells. “Tissue Repair, Contraction and the Myofibroblast” // European Tissue Repair Society Focus Meeting – 2004. – P. 22.

15. Clement S., Hinz B., Dugina V., Gabbiani G., Chaponnier C. The N-terminal Ac-EEED sequence plays a role in -smooth muscle actin incorporation into stress fibers // “Tissue Repair, Contraction and the Myofibroblast” – 2004. – P.19.

16. Dugina V, Gabbiani G, Chaponnier C. Cytoplasmic Actins and are differentially distributed in stationary and motile Cells // Wound Repair Regeneration – 2005. – V.13. – A19.

17. Dugina V., Tchypysheva T., Ermilova V., Vasiliev J., Gabbiani G., Chaponnier C. Cytoplasmic actins are differentially distributed in normal, displastic and carcinoma cells of human breast // FEBS-ESF workshop “Integrated Approaches in Cytoskeleton Research” – 2005.

18. Zwaenepoel I., Dugina V., Chaponnier C. Expression of cytoplasmic actins is modulated in transformed compared to normal cells. FEBS-ECF “Integrated Approaches in Cytoskeleton Research” – 2005.

19. Tomas A., Chaponnier C., Dugina V., Pessin J.E., Halban P.A. Involvement of cortical actin dynamics in regulated insulin secretion // Diabetologia – 2005. – Sup.1. – V.48. – P. 462.

20. Tomas A., Chaponnier C., Dugina V., Pessin J. E., Halban P. A. Involvement of Cortical Actin Dynamics in Regulated Insulin Secretion // SGED/SSED Annual Meeting – 2005. – P.30.

21. Zwaenepoel I., Dugina V., Chaponnier C. Expression of cytoplasmic actins is modulated in transformed compared to normal cells. Swiss Biomedical Research 2006, SSEB Annual Meeting.

22. Дугина В. Б., Чипышева Т.А., Ермилова В.Д., Васильев Ю.М. Различия в распределении изоформ актина в нормальных и опухолевых клетках // Вопросы онкологии – 2006. – Т.52. – N1. – P.15.

23. Дугина В.Б. Цитоплазматические изоформы актина организуют различные цитоскелетные структуры в клетке // «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза:

эмбриогенез, геномы, эволюция» ИБР им. Н.К.Кольцова РАН – М. – 2006. – 24.

24. Дугина В.Б. Различная структурная и пространственная организация цитоплазматических изоформ актина в клетке // Цитология – 2006. – Т.48. – №9. – P.761- 762.

25. Clment S., Dugina V., Hinz B., Zwaenepoel I., Gabbiani G., Chaponnier C.. The N-terminus of actin isoforms: a domain for function? // I International Congress Macromolecular Biochemistry Genetic. (CIBMG1) – 2007. – L.20.

26. Zwaenepoel I., Dugina V., Clment S., Gabbiani G., Chaponnier C. Distinct Sorting of Beta and Gamma-Cytoplasmic Actins: Implications for Function // ASCB-ECF – 2007. – P. 45.

27. Титова Е.В., Иванова О.Ю., Домнина Л.В., Черняк Б.В., Дугина В.Б. Действие митохондриальных антиоксидантов на нормальные и трансформированные фибробласты в культуре // Вопросы онкологии – 2008. – Т.54. – №2. – P. 28.

28. Dugina V., Zwaenepoel I., Clment S., Gabbiani G., Chaponnier C. The two cytoplasmic actins display functional diversities // FEBS/ECF “Mechanics and Dynamics of the Cytoskeleton” – 2008. – P. 41.

29. Дугина В. Б., Ермилова В.Д., Васильев Ю.М., Чипышева Т.А. Иммуногистологическое изучение базальноклеточных карцином молочной железы человека // Вопросы онкологии – 2008. –Т.54. – №2. – С.10.



Pages:     | 1 || 3 |

Похожие работы:

«СМАГИН АНДРЕЙ ИВАНОВИЧ ЭКОЛОГИЯ ВОДОЕМОВ ЗОНЫ ТЕХНОГЕННОЙ РАДИАЦИОННОЙ АНОМАЛИИ НА ЮЖНОМ УРАЛЕ 03. 00. 16 Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пермь – 2008 Работа выполнена на Опытной научно – исследовательской станции, Центральной заводской лаборатории «ФГУП ПО «МАЯК» Федерального агентства Росатом и в Отделе континентальной радиоэкологии Института экологии растений и животных УрО РАН Научный консультант: доктор...»

«Горовой Александр Иванович БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ И ШИШЕК PINUS KORAIENSIS SIEBOLD ET ZUCC. (ПОЛУЧЕНИЕ, СОСТАВ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ) 03.02.14 – биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток, 2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении «Дальневосточный научно-исследовательский институт лесного хозяйства» Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тагильцев Юрий...»

«ЗАКС Михаил Михайлович ЭКОЛОГИЯ ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК (Rana esculenta complex) ПЕНЗЕНСКОЙ ОБЛАСТИ: РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ПОПУЛЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ, ВЛИЯНИЕ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пенза – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенский государственный университет на кафедре...»

«Бирюкова Лидия Игоревна Диагностика, клинико-морфологическая характеристика и лечение накожного папилломатоза и дерматоза внутренней поверхности ушной раковины у лошадей 06.02.04 – ветеринарная хирургия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва 2015 Работа выполнена в ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии МВА имени К.И. Скрябина» Научный руководитель: Сотникова Лариса Федоровна, доктор...»

«ЗАХАРОВА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ПОЛУЧЕНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК ИЗ ГОНАД ПРЕСНОВОДНЫХ РЫБ БАЙКАЛЬСКОГО РЕГИОНА Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2012 Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (ФГБОУ ВПО «ВСГУТУ») Доктор...»

«АЛИМОВА ФАРИДА КАШИФОВНА «Биологическое разнообразие видов рода Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) и их роль в функционировании микробиоты и защите растений в агроценозах различных почвенно климатических зон на территории Республики Татарстан» 03.00.07 микробиология 06.01.11 защита растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук КАЗАНЬ 2006 Работа выполнена на кафедрах микробиологии и биохимии Казанского государственного...»

«УДК 597.554.3 НИКИТИН Виталий Дмитриевич ГОЛЬЯНЫ ОСТРОВА САХАЛИН (систематика, распространение, экология) Специальность 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2010 Работа выполнена в Сахалинском государственном университете (СахГУ) и Сахалинском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (СахНИРО). Научный руководитель: кандидат биологических наук, профессор Сафронов Сергей Никитич...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА 2015 Работа выполнена на кафедре экологии Дмитровского рыбохозяйственного технологического института ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет» (ДРТИ ФГБОУ ВПО «АГТУ»), п. Рыбное Научный руководитель: Вундцеттель Михаил...»

«МИНГАЛЕВА Нина Анатольевна ЖИЗНЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ЗЕЛЕНЫХ НАСАЖДЕНИЙ В УРБАНИЗИРОВАННОЙ СРЕДЕ (НА ПРИМЕРЕ Г. СЫКТЫВКАР) 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сыктывкарский государственный университет» Научный руководитель: Загирова Светлана Витальевна доктор биологических наук,...»

«Гафаров Рамиз Рафикович Совершенствование лабораторной диагностики краснухи в условиях проведения массовой вакцинопрофилактики 03.02.02 Вирусология 14.03.10 Клиническая лабораторная диагностика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук Научные...»

«ЕВТУШЕНКО АНАТОЛИЙ МИХАЙЛОВИЧ ЗАЩИТНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ ПОКРЫТИЯ СО СПЕЦИАЛЬНЫМ КОМПЛЕКСОМ СВОЙСТВ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ 05.17.06 – Технология и переработка полимеров и композитов АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва 2008 www.sp-department.ru Работа выполнена в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова на кафедре «Химия и технология высокомолекулярных соединений» им. С.С.Медведева...»

«Яшина Людмила Николаевна ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ХАНТАВИРУСОВ В ПОПУЛЯЦИЯХ ГРЫЗУНОВ И НАСЕКОМОЯДНЫХ АЗИАТСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.01.03 – молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Кольцово 2012 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Минздравсоцразвития Российской Федерации Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент...»

«Гузеева Елена Александровна МОЛЕКУЛЯРНАЯ ТАКСОНОМИЯ И МОРФОЛОГИЯ НЕМАТОД НАДСЕМЕЙСТВА THELASTOMATOIDEA, ОБИТАЮЩИХ В НАЗЕМНЫХ ЧЛЕНИСТОНОГИХ 03.02.04 – зоология 03.02.11 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА 2010 Работа выполнена в лаборатории фауны и систематики паразитов Центра паразитологии Института проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН и на кафедре зоологии беспозвоночных Биологического...»

«ГЕНС ГЕЛЕНА ПЕТРОВНА РОЛЬ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ И МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНОГО БЕЛКА YB-1 В ЛЕЧЕНИИ И ПРОГНОЗЕ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 Онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения...»

«Николаева Ольга Владимировна БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ПРИЕМЫ ВЫРАЩИВАНИЯ УКРОПА В УСЛОВИЯХ СЕВЕРО –ЗАПАДА РФ Специальность 06.01.01 – общее земледелие АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Санкт-Петербург – 2012 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный аграрный университет» (ФГБОУ ВПО СПбГАУ) Научный...»

«Антипова Екатерина Михайловна ФЛОРА СЕВЕРНЫХ ЛЕСОСТЕПЕЙ СРЕДНЕЙ СИБИРИ 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Томск 2008 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО «Красноярский государственный педагогический университет им. В.П. Астафьева» Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Иван Моисеевич Красноборов Официальные оппоненты: Академик РАН, доктор биологических наук, профессор Игорь Юрьевич...»

«Курбонов Косим Муродович СОВРЕМЕННЫЕ ЭПИЗООТОЛОГО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И НАДЗОР ЗА БРУЦЕЛЛЕЗОМ В РЕСПУБЛИКЕ ТАДЖИКИСТАН 14.02.02 – эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Таджикском научно-исследовательском институте профилактической медицины Министерства здравоохранения и социальной защиты населения Республики Таджикистан Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор...»

«Вайсвалавичене Валентина Юрьевна СТРУКТУРА СРЕДСТВ, МЕТОДОВ И УСЛОВИЙ РАЗВИТИЯ ДВИГАТЕЛЬНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ У ДЕТЕЙ СТАРШЕГО ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА 5-7 ЛЕТ 13.00.04 – теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Москва – 2015 Диссертационная работа выполнена на кафедре теории и методики базовых видов физического воспитания...»

«Вудс Екатерина Анатольевна ФАРМАКОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ АНТИАНГИОГЕННОЙ ТЕРАПИИ ЭКССУДАТИВНОЙ ФОРМЫ ВОЗРАСТНОЙ МАКУЛЯРНОЙ ДЕГЕНЕРАЦИИ 14.01.07 — глазные болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт глазных болезней». Научные руководители: доктор медицинских наук Будзинская Мария Викторовна...»

«Жакова Светлана Николаевна РЕПРОДУКТИВНАЯ БИОЛОГИЯ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ И КУЛЬТИВАРОВ РОДА СИРЕНЬ (SYRINGA L.) 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь – 2015 Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики растений Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет» Научный руководитель:...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.