WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«Флавоноиды растений Fagopyrum sagittatum Gilib. (гречихи посевной) и серпухи венценосной (Serratula coronata L.) (методы выделения, идентификация веществ, перспективы использования) ...»

-- [ Страница 2 ] --

Препаративную ТСХ применяют чаще всего для доочистки индивидуальных соединений или разделения фракций, содержащих небольшое количество соединений [Юй, 2006]. При анализе флавоноидных соединений методом ТСХ флавоноиды идентифицируют по характеру свечения на хроматограммах в УФ–свете и после проявления хромогенными растворами.

Для проявления флавоноидов на хроматограммах используют пары 25%ного аммиака либо 2 – 5 % –ный спиртовый раствор хлорида алюминия. При этом происходит усиление окраски пятен в УФ свете или изменение окраски до желтой, в случае использования хлорида алюминия [Гришина, Погодин, Лукша, 2008].

Катехины проявляют 1 %–ным раствором ванилина в концентрированной соляной кислоте, при этом в видимом диапазоне наблюдается интенсивное красное окрашивание [Гришина, Погодин, Лукша, 2008].

Кроме ТСХ при анализе экстрактов, состоящих из смеси флавоноидов, используется бумажная хроматография (БХ), которая ранее являлась одним из самых применяемых методов в анализе флавоноидных соединений [Георгиевский, Комиссаренко, Дмитрук, 1990]. В БХ применяют растворители, обладающие высокой кислотностью. Это обусловлено тем, что флавоноидные соединения обладают свойствами слабых кислот и кислотность растворителя способствует уменьшению диссоциации флавоноидов. В БХ чаще всего для разделения флавоноидов используют систему бутанол – уксусная кислота – вода (БУВ). При разделении флавоноидов выделенных из видов Myosotis arvensis, M. krylovii, M.

austrobaicalensis, M. decumbens, M. pseudovariabilis, M. baicalensis, M. palustris, M.

asiatica [Шинкаренко, 2008], Astragalus membranaceus [Коцупий, 2007] использовали систему бутанол–уксусная кислота–вода (БУВ) (40:12:28); видов Serratula coronatа [Ангаскиева, 2006], Astragalus onobrychis [Гужва, 2009], Arctostaphylos uva–ursi, Vaccinium vitis–idaea, Vaccinium myrtillus, Vaccinium uliginosum [Исследование качественного...., 2009] (4:1:2); вида – Aslchemilla valgaris (10:3:7) [Андреева, Калинкина, 2000].

В анализе флавоноидов широкое распространение получил метод газо– жидкостной хроматографии (ГЖХ) благодаря его высокой чувствительности и эффективности. Преимущество метода газо–жидкостной хроматографии заключается в возможности определения качественного состава и количественного содержания разделяемых компонентов, а также в автоматизации процесса контроля при разделении веществ методом колоночной хроматографии.

Но использование данного метода ограничивается легколетучими и термостабильными компонентами. При анализе труднолетучих флавоноидов необходимо получать их летучие производные. В качестве летучих производных используют метиловые, этиловые или триметилсиллильные эфиры [Георгиевский, Комиссаренко, Дмитрук, 1990; Molnar–Perl, Fuzfai, 2005]. В методе ГЖХ наиболее распространено использование триметилсиллильных эфиров Это (ТМС).

обусловлено простотой их получения и высоким выходом летучих производных флавоноидов [Георгиевский, Комиссаренко, Дмитрук, 1990; Nolvachai, Marriott, 2013].

В работе [Molnar–Perl, Fuzfai, 2005] предложен способ идентификации флавоноидных гликозидов 29 видов рода Sempervivum и 34 видов рода Sedum методом газо–жидкостной хроматографии с масс–спектрометрическим детектированием (ГЖХ/МС), после их гидролиза до агликонов и последующим силлилированием с бис–триметилсиллиацетамидом (БСА). Идентификация и количественное определение флавоноидов видов рода Populus (P. lasiocarpa, P.

angustifolia, P. trichocarpa, P. euphratica, P. ciliate) проведены методом ГЖХ/МС и ГЖХ/ПИД в виде силлилированных эфиров с бистриметилсилил трифлуороацетамидом (БСТФА) [Molnar–Perl, Fuzfai, 2005].

Высокоэффективная жидкостная хроматография обладает неоспоримыми преимуществами среди современных методов анализа флавоноидов, т.к. не требует повышения летучести и термостабильности исследуемых компонентов.

Разделение флавоноидов проводится, как правило, на октадецилсилане (C18) при элюировании смесями ацетонитрил – вода и метанол–вода с небольшим содержанием фосфорной, уксусной, муравьиной или трифторуксусной кислоты.

Эти подвижные фазы удобны для разделения сложных смесей как флавоноидов, так и их гликозидов в условиях изократического и градиентного элюирования и допускают использование УФ– или диодно–матричных детекторов. Разделение флавоноидов (рутина, витексина, ориентина) шелухи гречихи проводили на обращенной фазе С18 при градиентном элюировании системой метанол – 5 % раствор HCOOH (содержание метанола изменялось от 5 до 90 об.

%) [Determination of optimised..., 2008]. D.Dietrych –Szostak et al. [2005] выбрали для разделения флавоноидов из шелухи гречихи на колонке Eurospher – 100 систему 3 % раствор HCOOH – 40 % CH3CN (концентрация ацетонитрила изменялась от 0 до 40 %). В работе М.М. Анисимовой [2011] описаны условия разделения рутина из экстракта травы гречихи посевной на сорбенте С18 в изократическом режиме при элюировании смесью растворителей ацетонитрил–вода (30 : 70) об./об. с добавкой 1 % СH3COOH. Количественное определение рутина проводили в экстрактах полученных из семян гречихи методом ОФ ВЭЖХ в изократическом режиме при элюировании смесью ацетонитрил – 2,5 % СH3COOH (20 : 80) [Rutin and flavonoid...,2007]. I.Choi et al. [Suppressive effects..., 2007] разделение флавоноидов (кверцетина, рутина и кверцетрина) проводили из семян гречихи на колонке Eclipse–XPD–C18 при градиентном элюировании. Раствор (А): 10 мМ раствор H3PO4 и (В): метиловый спирт: 0 –10 мин, 80–65 % (А); 10 –40 мин, 65–30 % (А); 40–50 мин, 30 % (А). Флавоноиды (апигенин, рутин, лютеолин, кверцетин) надземной части растения серпухи венценосной – Serratula coronata были разделены на неподвижной фазе С18 элюентом служила смесь ацетонитрил – 10 % CH3COOH (градиент концентрации ацетонитрила от 70 до 30 об. %) [Ангаскиева, 2006].

Для установления структуры флавоноидных соединений используют различные спектральные методы: УФ–, ИК–, ЯМР– спектроскопия и масс– спектрометрия с использованием различных источников ионизации.

Метод УФ–спектрометрии основан на способности молекул поглощать электромагнитное излучение в области 200 – 400 нм. В УФ–спектре флавоноидов наблюдается характерные для них максимумы поглощения в областях 250 – 270 нм и 330 – 370 нм [Andersen, Markham, 2006; Дренин, 2008; Лобанова, Турецкова, 2011]. Кроме того, методом УФ–спектрометрии можно определить положение гидроксильных групп в молекуле флавоноида. В этом случае применяют специальные ионизирующие и комплексообразующие реагенты (CH3ONa, CH3COONa, AlCl3), которые приводят к батохромному сдвигу полос поглощения основного хромофора на определенную длину волны в зависимости от положения функциональных групп. Батохромное смещение в УФ–спектре флавоноидов максимумов поглощения с добавкой ацетата натрия длинноволновых (10 – 15 нм) и коротковолновых (4 – 15 нм) полос характеризует наличие свободной гидроксигруппы у С–7 (рисунок 1).

3' 2' 4' 1' 5' 8 O 6' O Рисунок 1– Структура флавоноида При смещении максимума поглощения первой полосы в системе борная кислота – ацетат натрия на 10 – 16 нм, указывает на ортодиоксигруппировку (С– 3 и С–4) в В–кольце. В этилате натрия батохромный сдвиг максимума поглощения первой полосы на 45 – 60 нм, обуславливает наличие свободной гидроксигруппы у С–4. Батохромный сдвиг максимума поглощения первой полосы на 40– 60 нм в присутствии хлористого цирконила или хлорида алюминия показывает свободную С–5 гидроксигруппу. Исчезновение батохромного сдвига при добавлении лимонной кислотой к хлористому цирконилу свидетельствует об отсутствии гидроксигруппы в положении С–3 [Harborne, Swain, 1969; Клышев, Бандюкова, Алюкина, 1978; Гелла, 1991; Флавоноиды и терпеноиды..., 1999;

Andersen, Markham, 2006; Подгорная, 2008; Гужва, 2009; Ванидзе, Каландия, Шалашвили, 2009].

При идентификации и установлении структуры флавоноидов используются и методы масс–cпектрометрии, позволяющей определять

–  –  –

Рисунок 3 – Основные пути распада молекулярных ионов флавонолов при электронном ударе Наличие фрагмента «а» с массой 167 или 153 указывает на присутствие в кольце А флавоноида метокси– или гидроксигруппы соответственно.

Существование метокси– или гидроксигруппы в кольце В устанавливается по фрагменту «b». Массовый пик 135 на спектре указывает на наличие в структуре кольца В флавонола метоксигруппы, а пик 121 – гидроксигруппы. Пик 151 свидетельствует о присоединении в кольце В метокси– и гидроксигруппы одновременно в положениях 3 и 4. Помимо 7, 3, 4 положений, метоксигруппа может находится при атоме С–3 кольца С. Известно, что в масс–спектре флавоноидов с двумя гидроксигруппами при С–3 или С–5 сигналы иона «d»

имеют низкую интенсивность (18 – 20 %), а введение метоксигруппы в положение С–3 приводит к резкому возрастанию интенсивности пика рассматриваемого иона до 50 % [Ведерников, Рощин, 2011].

Использование инфракрасной спектроскопии при установлении строения флавоноидов является, в большинстве случаев, чисто эмпирическим. С помощью ИК – спектра можно получить предварительные данные о наличии в молекуле той или иной функциональной группы. Высокая полоса 3200 – 3500 см-1 обусловлена см-1 фенольными гидроксильными группами, полоса принадлежит карбонильной группе, ароматические С=С–связи дают полосы при 1610, 1580, 1510, 1460 см-1. Важной для идентификации флавоноидов является так называемая область «отпечатков пальцев» 800 – 1200 см-1. Совпадение полос указанных группами области «отпечатки пальцев» служит надежным признаком идентичности веществ [Глинкевич, Софрович, 1983; Дренин, 2008].

При проверке растительного сырья на присутствие флавоноидов используют качественные реакции. Общей реакцией на флавоноидные соединения является реакция восстановления атомарным водородом в кислой среде в присутствии магния по Шиноду (появление вишнево–красной окраски) или ее модификация с цинком [Васильев, Вичутинский, Черкасов, 1963;

Федосеева, Мирович, Горячкина, 2009].

Флавоноиды, благодаря наличию карбонильных и фенольных оксигрупп, способны образовывать комплексы с солями металлов, которые различаются по устойчивости в зависимости от природы металла, рH среды и других факторов.

Наиболее специфической и универсальной пробой на флавоноиды является возникновение зеленой, коричневой, черной или синей окраски комплексной соли в присутствии хлорида железа [Васильев, Вичутинский, Черкасов, 1963;

Федосеева, Мирович, Горячкина, 2009].

Флавоноиды с диоксифенольнымн группами дают осадки с раствором основного ацетата свинца, образуют окрашенные соединения с хлоридом сурьмы (III) и (V). Многие флавоноиды дают окрашенные комплексы с хлоридом алюминия (III), с солями циркония и другими металлами [Васильев, Вичутинский, Черкасов, 1963; Федосеева, Мирович, Горячкина, 2009].

Флавоноиды со свободной 7–оксигруппой легко образуют азокрасители с диазотированной сульфаниловой кислотой и другими производными ароматических аминов [Васильев, Вичутинский, Черкасов, 1963].

Для количественного определения суммарного содержания флавоноидов в растительном сырье наибольшее распространение получили физико-химические методы, прежде всего фотоколориметрия, спектрофотометрия, флуориметрия, потенциометрия и полярография.

1. Фотоколориметрический метод основан:

на цветных реакциях комплексообразования с солями различных металлов (циркония, галлия, кобальта) [Георгиевский, Комиссаренко, Дмитрук, 1990];

на реакции с лимонно-борным реактивом [Государственная фармакопея СССР, 1990];

на реакции восстановления флавоноидов магнием в присутствии соляной кислоты в спиртовом растворе и последующем фотометрировании полученного раствора [Лукьянчикова, Тираспольская, 1985].

2. Спектрофотометрические методы основаны на измерении поглощения комплекса флавоноидов со спиртовым раствором хлорида алюминия в интервале длинах волн от 408 до 435 нм [Андреева, Калинкина, 2000; Лобанова, Будаева, Сакович, 2000; Дудкин, Девяткина, Бурова, 2005; Бубенчикова, Кондратова, 2006;

Зиэп Т.Т. Нго, Жохова, 2007; Ломбоева, Танхаева, Оленников, 2008;

Мещерякова, Пупыкина, Закиева, Методика количественного 2008;

определения..., 2008; Правдивцева, Куркин, 2008; Чириков, Оленников, Танхаева, 2009; Исследование качественного и количественного....,2009; Анисимова, Куркин, Ежков, 2010; Куркина, 2011].

В работах Chatchawan Chotimarkorn et al. [2008], J. Boateng et al. [Effect of processing...,2008], J.Yang, R.H.Liu, L.Halim [2009] предложена модифицированная методика, основанная на поглощении комплекса флавоноидов с хлоридом алюминия в присутствии нитрита натрия в щелочной среде при длине волны 510 нм. В.А. Кудринская и др. [2010] предлагают определять флавоноиды по реакции азосочетания с тетрафторборатом В 4–нитрофенилдиазонилом (4–НФД).

щелочной среде 4–НФД вступает реакцию азосочетания с кверцетином, нарингенином, хризином, морином, рутином и нарингином с образованием окрашенных соединений с максимумом поглощения при длине волны 425 – 435 нм. Предел обнаружения методики составляет (1,5–3,9)10-7 М. Методика отработана для модельных смесей флавоноидов [Кудринская, Дмитриенко, Золотов, 2010].

3. Флуориметрический метод Предложена флуориметрическая методика определения кверцетина, основанная на регистрации интенсивности люминесценции комплекса кверцетина с алюминием, c пределом обнаружения 2·10–6моль/л [Lin, Chun – xia, 2001].

А.А. Мальцевой и др. [Пат. 2475724 Российская Федерация…., 2013] предложили методику количественного определения содержания индивидуальных флавоноидов кверцетина) в различных видах (рутина, лекарственного сырья без их предварительного разделения. Методика основана на регистрации интенсивности флуоресценции комплекса флавоноида с хлоридам алюминия, при длинах волн испускания, которая индивидуальна для конкретного флавоноида.

4. Потенциометрические методы Учитывая проявление флавоноидными соединениями слабо выраженных кислотных свойств (что обусловлено наличием в молекуле фенольных гидроксилов), используют кислотно–основное титрование в неводных растворителях: диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ацетоне [Коноплева, 2002]. О.В. Малахова и др. [2004] проводили потенциометрическое титрование соединения 6–бромкверцетина в изопропиловом спирте. Это вещество в амфипропном растворителе проявляет себя как двухосновная кислота.

Методика потенциометрического определения гидролизуемых флавоноидов [Сравнительное исследование мелиссы..., 2009], в траве мелиссы лекарственной – Melissa officinalis и шалфея лекарственного – Salvia officinaleis предусматривает титрование водных извлечений флавоноидов 0,02 н. раствором перманганата калия в диапазоне потенциалов от –50 мВ до + 250 мВ.

5. Полярографические методы Основаны на способности молекул флавоноидов окисляться как в растворе, так и на поверхности электродов из материалов различной природы. Предложено вольтамперометрическое определение флавонолов в фармпрепаратах, основанное на регистрации высоты волны окисления кверцетина на платиновом электроде на фоне 0,1М H2SO4, либо на фоне 0,1М HCl [Зиятдинова, Будников, 2005;

Слепченко, Анисимова, Слепченко, 2005].

Л.C. Анисимова и др. [Пат. 2215288 Российская Федерация..., 2003] предложили способ определения следовых количеств флавоноидов как в чистых растворах, так и растворах растительных экстрактов методом дифференциальной вольтамперометрии. Вольтамперометрическое определение проводили на стеклоуглеродном электроде по пикам восстановления при потенциалах от +0,41 до –0,63 В относительно насыщенного хлоридсеребренного электрода или по пикам окисления при потенциалах от –0,36 до +0,46 В на фоне 0,2 н Na2HPO4 или 0,2 н двухзамещенного лимоннокислого аммония, регистрацию пиков проводили при линейной скорости развертки потенциала 20 – 30 мВ/с в дифференциальном режиме съемки вольтамперограммы.

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

–  –  –

2.1.1 Гречиха посевная – Fagopyrum sagittatum Gilib.

Гречиха посевная (Fagopyrum sagittatum Gilib.) – однолетнее травянистое растение высотой см; стебель ребристый, красноватый; листья 20–70 сердцевидно–треугольные, со стреловидным основанием и пленчатым раструбом у основания черешков нижних листьев, верхние листья — сидячие. Цветки в кистях на длинных пазушных цветоносах, щитковидно собраны на верхушке.

Тычинок 8, пестик с 3 столбиками.

Рисунок 4 – Гречиха посевная - Fagopyrum sagittatum Gilib.

Свойственна гетеростилия. Плод 3 – 10–гранная зерновка. Цветение ремонтантное, оплодотворение легитимное, которое в редких случаях дает одинаковый урожай с легитимным. Встречаются самофертильные расы гречихи [Жуковский, 1971].

За последние годы имеется множество публикаций посвященных происхождению и распространению гречихи. Из литературы известно, что гречиху возделывают в Китае более 2500 лет и отмечают два пути распространения культурной гречихи: первый - из Южного Китая в Северный, затем на Корейский полуостров и в Японию; другой – Южный Китай–Бутан– Непал–Кашмир–Каракорум–Гиндукуш [Клыков, 2014].

Следы выращивания гречихи находят и в Афганистане. Из Европы и Азии гречиха распространилась на Американский континент, в США (штат Нью-Йорк, Западная Вирджиния, Пенсильвания), Канаду (Манитоба), Аргентину, Бразилию, а также в Южную Африку [Клыков, 2014].

В России благоприятными условиями для возделывания гречихи являются Центрально–Черноземная зона, южная часть Нечерноземной зоны, лесостепные районы Поволжья, предгородные районы Северного Кавказа, Урал, Алтай. Эти районы располагаются полосой в пределах 50 и 60 северной широты (рисунок 5) [Зотиков, Наумкина, Сидоренко, 2010].

Рисунок 5 – Зоны возделывания гречихи в России [www.agroatlas.ru] На Дальнем Востоке России вид гречихи встречается как культурное растение на сельскохозяйственных полях (Приморский край, Амурская область) и как заносное в Анадырском районе Чукотки (п. Марково, Усть–Белая), в Камчатском крае и Сахалинской области (рисунок 6) у дорог, в населенных пунктах, на приречных песках и галечниках [Цвелев, 1989; Клыков, 2014].

Рисунок 6 – Распространение видов гречихи на Дальнем Востоке России [Цвелев, 1989].

Объекты исследования:

а) шелуха гречихи посевной семейство

– Fagopyrum sagittatum, (Polygonaceae), ГШ–11, сорт «При–7», собранная в Приморском крае (г.

Дальнереченск), урожай 2004г, предоставленная д.х.н., заведующей лабораторией химии редких металлов Института химии ДВО РАН, д.х.н, Л.А. Земнуховой;

б) трава гречихи посевной – Fagopyrum sagittatum Gilib. (Polygonaceae), сорт «Башкирская красностебельная», собранная в Приморском крае А.Г.

Клыковым район, Приморский научно–исследовательский (Уссурийский институт сельского хозяйства РАСХН, 2010г). Образец предоставлен заведующим лабораторией хемотаксономии растений Тихоокеанского института биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН академиком П.Г. Горовым.

–  –  –

Серпуха венценосная (Serratula coronata L.s.l.) – многолетнее травянистое растение.

Рисунок 7 – Серпуха венценосная – Serratula coronata L.s.l.

Стебли ребристые, вверху ветвистые, все олиственные, голые, длиной до 150 см. Листья крупные, глубоко перисторассеченные, с увеличенной конечной долей; голые, реже снизу по жилкам немного волосистые; доли листьев ланцетные или яйцевидные. Корзинок несколько на концах ветвей, обвертка рыжевато-войлочная или с короткими прижатыми волосками, редко почти гладкая; листочки обвертки прижатые, красно–коричневые, наружные – заостренные, внутренние – линейно–ланцетные, окрашенные. Венчики лилово– пурпурные, некоторые цветки только женские, с узким 3–4 надрезным венчиком и неразвитыми тычинками. Плод – семянка, 4 –5 мм длиной, бурая, гладкая. Цветет с июля по август [Доржиева, 2005].

Встречается на юге Европейской части России, на Кавказе, в Западной и Восточной Сибири, Средней Азии [Махлюак, 1993; Буданцев, 2013].

На Дальнем Востоке России встречается в бассейнах Амура (Верхнего–Зея, Нижнего–Зея, Бурея) и Уссури (юго–западной части реки Уссури) (рисунок 8) [Баркалов, Коробков, Цвелев, 1992].

А – Serratula manshurica (S. coronata s.l.), Б – Serratula komarovii, В – Synurus deltoides Рисунок 8 – Распространение видов рода Serratula и Synurus на Дальнем Востоке России [Баркалов, Коробков, Цвелев, 1992].

На территории Китая серпуха венценосная – Serratula coronata главным образом распространена в районах северного, северно–восточного Китая (рисунок 9) [Fu Likuo, Hong Tao, 2005].

Рисунок 9 – Распространение Serratula coronata s.l. на территории Китая [Fu Likuo, Hong Tao, 2005].

Объекты исследования:

а) cоцветия серпухи венценосной – Serratula coronata, собранные в Приморском крае (Хасанский район, окрестности с. Андреевка, август 2009 г);

б) надземная часть (соцветия, листья и стебли) серпухи венценосной– Serratula coronata, собранные в Приморском крае (Хасанский район, окрестности с. Андреевка, сентябрь 2009 г);

в) надземная часть (соцветия и листья) серпухи венценосной – Serratula coronata, собранные в Приморском крае (Октябрьский район, окрестности с.

Чернятино, август 2010 г);

г) надземная часть (соцветия, листья и стебли) серпухи венценосной– Serratula coronata, собранные в Приморском крае (Шкотовский район, окрестности с. Штыково в долине реки Артемовка, сентябрь 2010 г).

Образцы надземной части (соцветия, листья, стебли) серпухи венценосной – Serratula coronata предоставлены, заведующим лабораторией хемотаксономии растений Тихоокеанского института биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН академиком П.Г. Горовым.

–  –  –

а) ВЭЖХ анализ флавоноидов проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC – 6A c УФ – детектором, рабочая длина волны 360 нм. Колонка Zorbax C18 (4,6 50 мм, 5 мкм). В качестве элюентов использовали смесь ацетонитрил : вода в различных соотношениях:

1) ацетонитрил : вода : ледяная уксусная кислота 15 : 80 : 1 (об./об./об.);

2) ацетонитрил : вода : ледяная уксусная кислота 20 : 80 : 1 (об./об./об.);

3) ацетонитрил : вода : ледяная уксусная кислота 23 : 77 : 1 (об./об./об.);

4) ацетонитрил : вода : ледяная уксусная кислота 40 : 60 : 1 (об./об./об.).

Скорость потока элюента – 0,5 мл/мин (для экстрактов травы и шелухи гречихи).

Скорость потока элюента – 2 мл/мин (для экстрактов надземной части серпухи венценосной).

б) ВЭЖХ анализ ситостеролина проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC – 6A c УФ – детектором, рабочая длина волны 210 нм. Колонка C18 (4,6 50 мм, 5 мкм). В качестве элюентов использовали ацетонитрил : метанол (90 : 10) об/об.

Скорость потока элюента – 0,5 мл/мин.

в) Количественное определение суммы флавоноидов и УФ – спектры регистрировали на cпектрофотометре Shimadzu UV mini 1240 в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

г) ИК–спектры исследуемых соединений регистрировали на спектрофотометре Perkin Elmer Spectrum BX в диапазоне 3500-2500 см-1, разрешение – 4 см-1, накопление – 16 сканов с последующим усреднением, в таблетках KBr.

д) Спектры ЯМР–(1H; 13

C) получены на спектрометре Bruker c рабочей частотой 400 МГц (в d6–ДМСО).

е) Масс-спектрометрический анализ проводили на приборах:

1) Agilent 6510 Q–TOF LC/MS с ионизацией электрораспылением (AP – ESI, в режиме сканирования положительных ионов;

2) Agilent 1100 Series LC/MS с химической ионизацией при атмосферном давлении (APCI), в режиме сканирования положительных ионов;

3) AMD 604S в режиме электронной ионизации (EI), при ионизирующем напряжении 70 В.

ж) Экстракцию флавоноидов из исследуемых растительных объектов проводили на перемешивающем терморегулируемом устройстве ЛАБ–ПУ–01.

з) Для концентрирования экстрактов использовали роторный испаритель BUCHI R-20 (температура водяной бани 70 С, при давлении 10 мм.рт.ст).

2.3 Очистка растворителей и приготовление растворов

–  –  –

1. Спирт этиловый, 96 %, пищевой сорт «Экстра».

2. Уксусная кислота, 99,5 %, х.ч., ГОСТ 61–75.

3. Ацетонитрил для ВЭЖХ, сорт 0.

4. Вода дистиллированная.

5. Четыреххлористый углерод, х.ч., ГОСТ 20288–74.

6. Силикагель, фракция 70 – 230 меш, производство «Merk» (Германия).

7. Хлорид алюминия AlCl3 6H2O, ч.д.а., ГОСТ 3759–75.

8. Натрий уксуснокислый CH3COONa 3H2O, ч.д.а., ГОСТ 199–68.

9. ГСО Рутин, ФС 42–2508–87.

10. ГСО Лютеолин, ФС 42–0174–06.

11. Ориентин, 97 %, CAS №: 28608–75–5.

12. Кверцетин дигидрат, 97 %, CAS №: 6151–25–3.

13. Натрий металлический, х.ч.

14. Борная кислота, х.ч., ГОСТ 9656–75.

–  –  –

Очистку этанола и четыреххлористого углерода проводили перегонкой с дефлегматором, собирая фракции в диапазоне температур для этанола 78 – 79°С и четыреххлористого углерода – 76 –77 С.

Для экстракции флавоноидов из растительного сырья использовали растворы этанол : вода в различных соотношениях. Рабочий раствор этанола готовили исходя соотношения:

(1) где Vi и Vp – объемы исходного и рабочего раствора соответственно;

i и p – объемные доли этанола в исходном и рабочем растворах.

В качестве ионизирующих и комплексообразующих регентов для установления структуры флавоноидов использовали: 1 % спиртовой раствор ацетата натрия. Растворяли 1,66 г CH3COONa 3H2O в 100 мл 96 % раствора этанола; 5 % спиртовой раствор хлорида алюминия. Растворяли 27,12 г AlCl36H2O в 300 мл 96 % раствора этанола.

Приготовление 1 % спиртового раствора этилата натрия В химическом стакане на 150 мл небольшими порциями растворяли 0,68 г металлического натрия в 50 мл 96 % раствора этанола. По окончанию реакции полученный раствор разбавляли до 100 мл 96 % раствором этанола.

2.3.3 Приготовление стандартных растворов (рутина, лютеолина, ориентина и кверцетина) и построение градуировочных графиков Для построения градуировочных графиков точные навески стандартных веществ (25мг) количественно переносили в мерные колбы вместимостью 25 мл, прибавляли 15 мл 95 % спирта, нагревали на водяной бане при 50 – 60°С до полного растворения вещества, охлаждали до комнатной температуры и доводили до метки 96 % спиртом. 2,5 мл исходных растворов стандартных веществ помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл, и доводили до метки 96 % этанолом. Концентрации рутина, лютеолина, ориентина и кверцетина в растворах составила 0,1 мг/мл. Градуировочные графики зависимости оптической плотности от массы введенного в хроматограф флавоноида представлены в приложении (Б2, Б4, Б5, Б6).

2.3.4 Приготовление рабочих растворов флавоноидов (витексина, 3 – метилкверцетина, апигенина и изокемпферида), выделенных из исследуемого растительного сырья Точные навески выделенных флавоноидов (5 мг) переносили в мерные колбы на 25 мл, прибавляли 15 мл 96 % этилового спирта, нагревали на водяной бане при 50 – 60 С до полного растворения вещества, охлаждали до комнатной температуры и доводили до метки 96 % спиртом. Концентрация витексина, 3– метилкверцетина, апигенина и изокемпферида в растворах составляла 0,2 мг/мл.

Градуировочные графики зависимости оптической плотности от массы введенного в хроматограф флавоноида представлены в приложении (Б3, Б7, Б8, Б9).

2.3.5 Приготовление рабочего раствора ситостеролина

Точную навеску ситостеролина 10 мг переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 70 % этилового спирта, нагревали на кипящей водяной бане до полного растворения ситостеролина, охлаждали до комнатной температуры и доводили до метки 96 % спиртом. Концентрация ситостеролина в растворе составила 0,1 мг/мл.

2.4 Определение влажности образцов растительного сырья На аналитических весах брали точные навески исследуемых растительных образцов (0,5–1 г), и помещали в стеклянных бюксах в сушильный шкаф. Сушили до постоянного веса, при температуре 105 С и определяли влажность по разности масс образцов до и после высушивания.

Влажность (W, %) рассчитывали по формуле:

(2) где m1 – масса образца до высушивания, г;

m2 – масса образца после высушивания, г.

2.5 Выбор оптимальных условий выделения флавоноидов из исходных растительных объектов Выбор соотношения этанол – вода, сырье – экстрагент, времени, температуры и кратности экстракции проводился следующим образом:

а) cоотношение этанол : вода.

Навески по 5,00 г исходных растительных образцов экстрагировали 100 мл

–  –  –

Экстракты, полученные при различных условиях, фильтровали через бумажный фильтр (синяя лента), замеряли их объем. Аликвоты (5 мл) анализируемых экстрактов помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл, добавляли по 2 мл 5 % спиртового раствора хлорида алюминия и доводили до метки 70 % этанолом. В качестве раствора сравнения использовали раствор анализируемого экстракта разведенного в 5 раз. Измеряли оптическую плотность через 30 мин при = 405 нм ( = 609,8) в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Для построения градуировочного графика, в мерные колбы емкостью 25 мл вносили по 2 мл 5 % спиртового раствора хлорида алюминия и следующие объемы стандартного раствора рутина с концентрацией 0,1 мг/мл: 0,1; 0,5; 1,0; 2,0;

4,0; 7,5 мл (объемы измеряли пипетками на 1 и 10 мл с погрешностью 0,01 и 0,1 мл). Содержимое колб доводили до метки 70 % этанолом. Оптическую плотность измеряли через 30 минут при =405 нм (=609,8) в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм [Лобанова, Будаева, Сакович, 2004; Бубенчикова, Кондратова, 2006; Ломбоева, Танхаева, Оленников, 2008; Выбор оптимальных условий...., Чирикова, Оленников, Танхаева, Исследование 2008; 2009;

качественного и количественного...., 2009].

Градуировочный график зависимости оптической плотности (А) от содержания рутина в растворе (С) имеет вид прямой линии, проходящей через начало координат (приложение Б1).

Массовую долю флавоноидов в пересчете на рутин и сухое сырье в процентах (X, %) вычисляли по формуле:

(3) C – содержание рутина в анализируемой аликвоте экстракта, определенное по градуировочному графику, мг/25 мл;

V1 – объем экстракта, измеренный после экстракции, мл;

V2 – объем аликвоты, мл;

m – масса навески растительного сырья, г;

W – потеря в массе при высушивании сырья, %.

–  –  –

Полученные результаты обрабатывали методами математической статистики. Статистическая обработка включала в себя оценку результатов анализа и анализ разбросов ошибки от средней величины [Дерффель, 1994].

Оцениваемые величины характеризовались выборками из пяти измерений.

Для оценки точности полученных результатов использовался метод объективной статистической оценки результатов анализа (метод Стьюдента). При применении этого метода предполагалось, что оцениваемая нами математическое ожидание выборки имеет заведомо нормальное или близкое к нормальному распределение, а представляющая его выборка имеет малый объем (n=5).

Метод позволяет найти интервальную оценку математического ожидания (µ) с фиксированной погрешностью (ст). Выбор метода обусловлен высокой точностью оценки малых выборок.

Алгоритм метода следующий: рассчитывали точечную оценку математического ожидания, как среднее по выборке:

1n (4) X= Xi n i =1 Вычисляли исправленное выборочное среднее квадратичное отклонение по формуле:

–  –  –

Грубые погрешности выявлялись при помощи Q–критерия по формуле:

(8) где X1 – подозреваемый на грубый промах результат;

X2 – результат, ближайший к подозреваемому;

R – размах варьирования.

2.8 Приготовление и разделение экстрактов флавоноидов 2.8.1 Приготовление экстракта шелухи гречихи посевной Навески шелухи (1030 г) экстрагировали 900 мл 40 % раствора этанола на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1,5 часов.

Объединенный спиртовый экстракт упаривали досуха на роторном испарителе.

2.8.2 Приготовление экстракта соцветий серпухи венценосной

–  –  –

экстрагировали 250 мл 70 % раствора этанола на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 часов. Объединенный спиртовый экстракт упаривали досуха на роторном испарителе.

2.8.3 Приготовление экстракта стеблей серпухи венценосной Навески измельченных стеблей серпухи венценосной (330г) экстрагировали 900 мл 70 % раствора этанола на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 часов. Объединенный спиртовый экстракт упаривали досуха на роторном испарителе.

2.8.4 Приготовление экстракта листьев серпухи венценосной Навески измельченных листьев серпухи венценосной (105г) экстрагировали 150 мл 70 % раствора этанола на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа. Объединенный спиртовый экстракт упаривали досуха на роторном испарителе.

К полученным сухим остаткам экстрактов добавляли по 10 мл 96 % раствора этанола и смешивали каждый экстракт с 10 г силикагеля (70 – 230 меш)5.

Смеси экстрактов и силикагеля высушивали на воздухе при комнатной температуре и вносили на колонки, заполненные силикагелем Merk с фракцией 70

– 230 меш (высота слоя сорбента – 25 см, диаметр колонки – 5 см). Смесь флавоноидов элюировали порциями по 150 мл четыреххлористым углеродом и смесями четыреххлористого углерода : этанола в различных соотношениях (90:10;

80:20; 70:30; 60:40; 50:50; 40:60; 30:70; 20:80; 10:90) об./об. Cкорость элюирования составляла – 3 мл/мин.

5 Мешвнесистемная единица измерения размера зерен, определяемый размером стороны ячейки двух смежных контрольных сит, через одно из которых зерна должны проходить, а на другом задерживаться.

–  –  –

анализировали методом ОФ ВЭЖХ, объединяли фракции, содержащие доминирующий флавоноид или ситостеролин.

Объединенные фракции упаривали на водяной бане при температуре 70 °С до половины объема раствора и оставляли на 24 часа для кристаллизации флавоноидов или ситостеролина. Очистку выделенных флавоноидов проводили перекристаллизацией из этилового спирта. Ситостеролин очищали перекристаллизацией из смеси четыреххлористого углерода : этанола (70 : 30) об./об.

В таблице представлены условия элюирования флавоноидов и

–  –  –

Идентификацию выделенных соединений проводили методами ИК–, УФ– ЯМР–13С, ЯМР–1H –спектроскопии и масс–спектрометрии с ионизацией электрораспылением и электронной ионизацией.

Идентификация изокемпферида: УФ–спектр (C2H5OH, нм): 349, 267, 218.

Масс-спектр (APCI, m/z): 301,07 [MH]+ (100 %). ЯМР– 13С (D6–ДМСО, м.д.): 156,3 (С–2), 138,2 (С–3), 178,6 (С–4), 161,9 (С–5), 99,2 (С–6), 164,8 (С–7), 94,4 (С–8), 157,0 (С–9), 104,9 (С–10), 121,2 (C–1’), 130,8 (C–2’), 116,3 (C–3’), 160,8 (C–4’), 116,3 (C–5’), 130,8 (C–6’), 60,4 (OCH3).

Идентификация апигенина: УФ–спектр (C2H5OH, нм): 339, 267, 215. Масс– спектр ( APCI, m/z): 271,06 [MH]+ (100%). ЯМР – 13С (D6–ДМСО, м.д.): 164,8 (С– 2), 103,5 (С–3), 182,4 (С–4), 161,8 (С–5), 99,5 (С–6), 164,4 (С–7), 94,6 (С–8),157,9 (С–9), 104,4 (С–10), 121,8 (C–1’), 129,2 (C–2’), 116,6 (C–3’), 162,1 (C–4’), 116,6 (C– 5’), 129,2 (C–6’).

Идентификация 3–метилкверцетина: УФ–спектр (C2H5OH, нм): 356, 258,

214. Масс–спектр ( APCI, m/z): 317,07 [MH]+ (100%). ЯМР – 13С (D6–ДМСО, м.д.):

155,6 (С–2), 137,7 (С–3), 177,9 (С–4), 161,3 (С–5), 98,6 (С–6), 164,2 (С–7), 93,6 (С– 8), 156,4 (С–9), 104,2 (С–10), 120,8 (C–1’), 115,4 (C–2’), 145,3 (C–3’), 148,8 (C–4’), 115,8 (C–5’), 120,6 (C–6’), 59,7 (OCH3).

Идентификация ситостеролина: ИК (КBr, -1): 3412, 2934, 1728, 1463, 1379, 1266, 1166, 1074, 1024. Масс – спектр (ЭИ, m/z): 577 [M].+ (1%); 533 (2 %);

414 (5%); 397 (100%); 383 (10 %); 255 (15%); 213 (8%); 145 (20 %); 121 (14 %); 83 (28 %); 44 (41 %). ЯМР – 13С (D6–ДМСО, м.д.): 37,5 (C–1), 29,5 (C–2), 77,4 (C–3), 42,5 (C–4), 141,1 (C–5), 120,2 (C–6), 33,9 (C–7), 32,1 (C–8), 50,2 (C–9), 36,9 (C–10), 21,1 (C–11), 39,4 (C–12), 45,8 (C–13), 56,8 (C–14), 28,5 (C–16), 56,1 (C–17), 12,5 (C–18), 19,8 (C–19), 36,2 (C–20), 19,3 (C–21), 26,0 (C–23), 38,8 (C–24), 29,3 (C–25), 23,2 (C–28), 12,2 (C–29), 101,4 (C–1’), 75,0 (C–2’), 78,1 (C–3’), 75,0 (C–4’), 72,8 (C– 5’), 62,1 (C–6’). ЯМР – 1H (D6–ДМСО, м.д.): 0,64 (c, H – 18), 0,79 (д, J= 7,3, H–21), 0,88 (д, J=6,4, H–29), 0,94 (c, H–19), 2,99 – 3,00 (м, H–3’, 4’–H), 4,19 (д, J=8, H–1’), 4,87 (м, H–5), 5,33 (H–6).

Идентификация витексина: УФ–спектр (С2H5OH, нм): 337; 269; 215. Масс– спектр (ESI(–), m/z): 431,0999 [M–H]- (100%), 311,0573 (30 %). ИК (KBr, -1):

3350, 2926, 1657, 1614, 1570, 1508, 1357, 1296, 1180, 1109, 1042. ЯМР – 13С (D6– ДМСО, м.д.): 164,6 (С–2), 103,0 (С–3), 182,8 (С–4), 161,8 (С–5), 98,8 (C–6), 161,8 (С–7), 105,3(C–8), 156,6 (С–9), 105,0 (C–10), 122,3 (С–1’), 129,6 (С–2’, C–6’), 116,5 (С–3’, C–5’), 161,0 (С–4’), 79,3 (C–1’’), 74.0 (C–2’’), 71,5 (C–3’’), 71,2 (C–4’’), 82,5 (C–5’’), 61,9 (C–6’’). ЯМР – 1Н (D6–ДМСО, м.д.): 13,16 (c, 5–OH), 8,00 (д, J = 12, 2'–H, H–6'), 6,89 (д, J=12, 3'–H, H–5'), 6,78 (c, 3–H), 6,26 (c, 6–H), 4,66 (д, J=8, H– 1"), 3,51 (м, 4"–H, H–5", 6"–H), 3,74 (м, 6"–H), 3,82 (т, 2"–H).

2.10 Идентификация флавоноидов методом обращенно–фазовой ВЭЖХ Идентификацию хроматографических пиков проводили, сравнивая времена удерживания пиков стандартных веществ (рутина, ориентина, кверцетина, лютеолина), а также выделенных в чистом виде флавоноидов (3– метилкверцетина, апигенина, витексина и изокемпферида) и пиков, полученных на хроматограмме смеси.

Совпадение времен удерживания пиков стандартных растворов и пиков исследуемого экстракта позволяет сделать заключение об идентичности этих соединений.

2.11 Количественное определение флавоноидов методом обращенно–фазовой ВЭЖХ

Количественное определение содержания идентифицированных флавоноидов в исследуемых экстрактах определяли методом градуировочного графика (приложения Б2 – Б9). Градуировочные графики отражают зависимость площади хроматографического пика от количества вещества, введенного в инжектор хроматографа.

В инжектор хроматографа последовательно вводили стандартные растворы флавоноидов с концентрациями 0,1 – 0,2 мг/мл объемом: 2, 5, 10, 15 мкл.

Хроматограммы стандартных растворов флавоноидов представлены в приложении Б10 – Б17.

Массовую долю флавоноидов в пересчете на сухое сырье в процентах (X, %) вычисляли по формуле:

(9) C – содержание флавоноида в объеме экстракта введенного в инжектор хроматографа, определенное по градуировочному графику, мкг;

V1 – объем экстракта, измеренный после экстракции, мл;

V2 – объем экстракта введенного в инжектор хроматографа, мкл;

m – масса навески растительного сырья, г;

W – потеря в массе при высушивании сырья, %.

3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1 Выбор оптимальных условий выделения флавоноидов из исходных растительных объектов Для практического применения того или иного сырья при получении биологически активных соединений необходимо оценить их содержание в исследуемых объектах.

Для объективной оценки большую роль играет выбор способа выделения, который должен отвечать следующим критериям:

1) выделение максимально возможного количества целевых соединений;

2) экономическая целесообразность;

3) минимальное содержание балластных веществ;

4) использование для целей выделения соединений и растворителей, не представляющих серьезной опасности окружающей среде;

5) возможность осуществления контроля за процессом.

Для выделения флавоноидов и других биологически активных соединений из растительного сырья обычно качестве экстрагента используют водные растворы низших спиртов: этанола или метанола [Исследование химического состава...., 2003; Optimal recovery..., 2005; Flavonoids of the aerial part of Centaurea pullata...., 2005; Flavonoids of Serratula cichoracea...., 2007; Kurkin, Sharova, 2007;

Louaar, 2007; Flavonoids from Chrysanthemum fuscatum, 2007; Flavonol glycosides..., 2007; Determination of optimised malting..., 2008; Flavonoids aglicones from Centaurea sphaerocephala, 2008; Анисимова, Куркин, Ежков, 2010; Флавоноиды листьев....,2012; Каримов, Юлдашев, Ботиров, Установлено, что 2012].

максимальный выход флавоноидов из большинства растительных объектов достигается при использовании в качестве экстрагента 70 % раствора этанола.

Степень извлечения флавоноидов из растительного сырья зависит не только от концентрации экстрагента, но и от других условий: размера частиц исходного сырья, соотношения сырье:экстрагент, кратности экстракции, времени и температуры экстракции [Андреева, Калинкина, 2000; Бубенчикова, Кондратова, 2006; Шарова, Куркин, 2007; Евдокимова, 2007; Ломбоева,Танхаева,Оленников, 2008; Мещерякова, Пупыкина, Закиева, 2008; Исследование фенольных...., 2009;

Чириков, Оленников, Танхаева, 2009; Анисимова, Куркин, Ежков, 2010;

Лобанова, Турецкова, 2011; Куркина, 2011].

Для оптимизации процесса извлечения флавоноидов из отходов производства семян (травы, шелухи) гречихи посевной – Fagopyrum sagittatum и надземной части серпухи венценосной (стеблей, листьев, соцветиев) – Serratula coronata исследовано влияние различных параметров процесса на выход флавоноидов из исходного растительного сырья: а) природы и концентрации экстрагента; б) времени и кратности экстракции; в) температуры; г) соотношения сырья и экстрагента.

В таблице 11 представлены результаты, полученные при варьировании параметров экстракции флавоноидов из шелухи гречихи посевной.

Таблица 11 – Условия извлечения флавоноидов из шелухи гречихи посевной Исследуемый Массовая доля Исследуемый Массовая доля параметр флавоноидов в параметр флавоноидов в сырье, % в пересчете сырье, % в пересчете на рутин на рутин Экстрагент (температура 70° С; время 4 ч) Соотношение сырье: экстрагент (40 % раствор этанола; температура 70°С; время 4 ч) Вода дистиллированная 0,07±0,03 1:10 0,09±0,02

–  –  –

30 0,09±0,01 20 0,04±0,01 60 0,13±0,01 40 0,08±0,01 90 0,14±0,01 55 0,11±0,01 120 0,14±0,01 65 0,13±0,01

–  –  –

Кратность экстракции, раз (40 % раствор Массовая доля флавоноидов в сырье, % в этанола; кипящая водяная пересчете на рутин баня;сырье:экстрагент 1:30; время 1,5 ч) 1 0,16 2 0,03 3 0,01 Наиболее полное выделение целевых веществ из исходного сырья достигается при экстракции 40%–ым раствором этанола. Флавоноиды из шелухи гречихи извлекаются практически в равных количествах, как 40 % так и 60 %–ым раствором этанола. По–видимому, использование в качестве экстрагента 40%– ного раствора этанола, экономически более выгодно.

Максимальное извлечение флавоноидов из сырья достигается двукратной экстракцией на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 90 минут (дальнейшее увеличение времени экстракции до 240 минут не приводило к увеличению выхода флавоноидов) и соотношении сырье:экстрагент 1:30.

Максимальное выделение флавоноидов из травы гречихи посевной достигается при двукратной экстракции с иcпользованием в качестве экстрагента

–  –  –

Время экстракции, мин (40 % раствор Температура экстракции, ° С (40 % раствор этанола;сырье:экстрагент 1:30; температура этанола;сырье:экстрагент 1:30; время 1,5 ч) 70° С; время 4 ч) 30 0,33±0,07 20 0,27±0,07 60 0,89±0,07 40 0,33±0,07 90 0,99±0,07 55 0,75±0,07 120 0,99±0,07 65 0,99±0,07

–  –  –

Кратность экстракции, раз (40 % раствор Массовая доля флавоноидов в сырье, % в этанола; кипящая водяная пересчете на рутин баня;сырье:экстрагент 1:30; время 1,5 ч) 1 0,99 2 0,08 3 0,02 Содержание флавоноидов в шелухе и траве гречихи посевной, составляет 0,2 и 1,09 % в пересчете на рутин соответственно. Таким образом, предложенные условия извлечения флавоноидов из шелухи и травы гречихи позволяют наиболее полно выделить эти соединения из исследуемых объектов.

Максимальное извлечение флавоноидов из надземной части серпухи венценосной (таблица 13) достигается двукратной экстракцией сырья 70 % этанолом при соотношение сырье:экстрагент: для листьев и стеблей – 1:30;

соцветий – 1:50. Дальнейшее увеличение доли экстрагента при выделении флавоноидов из листьев и стеблей приводит к уменьшению выхода флавоноидов из сырья в 1,5–2 раза. Для соцветий при уменьшении соотношения до 1:30 наблюдается уменьшение выхода флавоноидов почти в 3 раза, по сравнению с выходом флавоноидов из стеблей и листьев серпухи венценосной.

Для извлечения флавоноидов из соцветий, листьев и стеблей, оптимальным соотношением сырья и экстрагента является значение – 1:50. Оптимальным временем экстракции флавоноидов из сырья – 120 минут при температуре кипящей водяной бани.

–  –  –

Температура экстракции, °C 20 1,31±0,18 0,95±0,12 0,18±0,07 40 6,99±0,58 1,57±0,54 1,56±0,07 55 6,99±0,60 1,76±0,60 2,78±0,07 65 12,46±2,07 1,89±0,65 5,03±0,07

–  –  –

1:10 1,97±0,14 0,89±0,14 1:30 2,84±0,07 1,80±0,07 0,92±0,07 1:50 1,97±0,07 0,90±0,07 2,65±0,07 1:70 1,97±0,07 0,86±0,07 2,65±0,07 1:100 1,97±0,07 0,86±0,07 2,65±0,07

–  –  –

30 2,18±0,07 1,64±0,07 1,04±0,07 60 2,84±0,07 1,72±0,07 3,12±0,07 90 2,84±0,07 1,87±0,07 3,12±0,07 120 2,40±0,07 2,13±0,07 4,68±0,07

–  –  –

1 12,46 2,13 5,03 2 2,24 0,48 0,66 3 0,41 0,06 0,19 Эффективность экстракции оценивали по количеству выделенных флавоноидов. Содержание флавоноидов в экстрактах определяли методом дифференциальной спектрофотометрии [Андреева, Калинкина, 2000; Лобанова, Будаева, Сакович, 2000; Ангаскиева, 2006; Бубенчикова, Кондратова, 2006; Зиэп Т.Т. Нго, Жохова, 2007; Евдокимова, 2007; Ломбоева, Танхаева, Оленников, 2008; Мещерякова, Пупыкина, Закиева, 2008; Чириков, Оленников, Танхаева, 2009; Анисимова, Куркин, Ежков, 2011; Куркина, 2011].

Определение основано на способности флавоноидов образовывать окрашенный комплекс, со спиртовым раствором хлорида алюминия, который дает основной максимум поглощения для соцветий серпухи венценосной, травы и шелухи гречихи посевной при =405 нм, листьев и стеблей – 410 нм, а для стандартных образцов ГСО рутина – 405 нм, кверцетина и лютеолина – 430 нм (рисунок 10). Спектры поглощения исследуемых экстрактов имеют близкие максимумы поглощения к спектру комплекса рутина с алюминием, поэтому этот флавоноид выбран нами качестве стандартного образца. Использование в качестве раствора сравнения испытуемого экстракта без комплексообразователя позволяет исключить влияние окрашенных и других сопутcтвующих веществ.

А 1,3 1 2 1,2 1,1 0,9 0,8 0,7 3 0,6 5 6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

–  –  –

3.2 Очистка экстрактов и разделение смеси флавоноидов Основные применяемые методы, описанные в литературе для выделения и разделения флавоноидов из растительного сырья, включают несколько трудоемких последовательных стадий: спиртовую экстракцию исходного сырья, удаление экстрагента, очистка остатка от липидов и липофильных веществ, последовательную экстракцию остатка органическими растворителями (диэтиловым эфиром, этилацетатом, бутанолом). Заканчивают разделение каждой полученной фракции флавоноидов на колонке с силикагелем [Глинкевич, Софрович, 1983]. На выделение флавоноидов по описанным методикам уходит большое количество времени и дорогостоящих растворителей. Нами предложена упрощенная схема выделения и очистки флавоноидов из исходного растительного сырья. Данный метод не требует освобождения экстракта от липидов и последующей избирательной экстракции флавоноидов органическими растворителями. Схема выделения включает 3 стадии:

1) экстракция исходного сырья этанолом при выбранных оптимальных условиях;

2) упаривание экстракта досуха при пониженном давлении;

3) разделение полученного остатка методом препаративной колоночной хроматографии на силикагеле в режиме градиентного элюирования.

При разделении флавоноидов на индивидуальные соединения методом колоночной хроматографии на силикагеле обычно в качестве элюента используют смеси малополярного растворителя метилена, (хлористого хлороформа, четырехлористого углерода) с возрастающей добавкой более полярного (метанола или этанола) [Aglycone flavonoids of Centaurea tougourensis, 2006; Christa, Soral, 2008; Phytochemical investigation...., 2010].

В качестве элюента при разделении флавоноидов на колонке с силикагелем нами использован четыреххлористый углерод с последующей возрастающей добавкой этанола, содержание которого увеличивалось 0 до 100 %.

–  –  –



Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Похожие работы:

«CИЛИ ИВАН ИВАНОВИЧ УДК 621.341 ЭНЕРГОИНФОРМАЦИОННАЯ РАДИОИМПУЛЬСНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ И ЭЛЕКТРОННЫЕ СИСТЕМЫ УНИЧТОЖЕНИЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ КАРТОФЕЛЯ 05.11.17 – биологические и медицинские устройства и системы Диссертация на соискание научной степени кандидата технических наук Научный руководитель: Федюшко Юрий Михайлович доктор технических наук, профессор Мелитополь – 2015 СОДЕРЖАНИЕ...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Борисов Станислав Юрьевич Морфологические изменения во внутренних органах крыс при воздействии нано-, микрои мезоразмерных частиц цеолитовых туфов 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«КУЗЬМИЧЕВА ЕВГЕНИЯ АНДРЕЕВНА ДИНАМИКА РАСТИТЕЛЬНОСТИ И КЛИМАТА ГОР БАЛЕ (ЭФИОПИЯ) В ГОЛОЦЕНЕ ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.08 — экология Научный руководитель доктор биологических наук Савинецкий Аркадий Борисович Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...4 ГЛАВА 1. Физико-географическая...»

«ТОМОШЕВИЧ Мария Анатольевна ФОРМИРОВАНИЕ ПАТОКОМПЛЕКСОВ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» 03.02.08 – «Экология» Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: д.б.н., академик РАН Коропачинский И.Ю. Новосибирск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ: ВВЕДЕНИЕ.. 4 ГЛАВА 1. АНАЛИЗ...»

«СОНИНА АНЖЕЛЛА ВАЛЕРЬЕВНА Эпилитные лишайники в экосистемах северо-запада России: видовое разнообразие, экология 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Петрозаводск СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Степень изученности эпилитных...»

«Железнова Татьяна Константиновна ЭКОЛОГО-ГЕОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОРНИТОФАУНЫ СЕВЕРНОЙ ЕВРАЗИИ 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва-2015 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Северная Евразия занимает по площади около половины Палеарктики, это область умеренной зоны северного полушария с арктической периферией [Дарлингтон, 1966]. На протяжении всей...»

«НГУЕН ВУ ХОАНГ ФЫОНГ ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ КРУПНЫХ ГОРОДОВ В СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ ВЬЕТНАМ Специальность: 03.02.08экология (биология) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Чернышов В.И. Москва ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА...»

«Шершнева Анна Михайловна ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ: ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА, ПРИМЕНЕНИЕ Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Шишацкая Екатерина Игоревна...»

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«ЗОЛОТОВА Юлия Игоревна ПОЛИМЕРЫ-НОСИТЕЛИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ СОПОЛИМЕРОВ 2-ДЕОКСИ-2-МЕТАКРИЛАМИДО-D-ГЛЮКОЗЫ С N,N-ДИМЕТИЛИ N,N-ДИЭТИЛАМИНОЭТИЛМЕТАКРИЛАТАМИ Специальность 02.00.06 – высокомолекулярные соединения ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: чл.-корр. РАН, д.х.н., проф. Панарин...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«КОВАЛЕВА АННА ВАЛЕРЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ ФИТОСИРОПОВ И ФИТОЭКСТРАКТОВ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ Специальность 05.18.01 – Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор...»

«Вахшех Имад Наваф Найф УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЗАЩИТЫ ЯБЛОНИ И ГРУШИ ОТ ПАРШИ Специальность 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Белошапкина Ольга Олеговна, д.с.-х.н., профессор Москва 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ПО...»

«Иванова Марина Викторовна Взаимодействия вирусов с детонационными наноалмазными материалами и композитами на основе полианилина 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор медицинских наук Е.И.Бурцева Москва 201 Оглавление..2 ОБЩАЯ...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«КАДЕРМАС ИРИНА ГЕННАДЬЕВНА ФОРМИРОВАНИЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО И СИМБИОТИЧЕСКОГО АППАРАТОВ РАСТЕНИЙ И ИХ ВКЛАД В ПОВЫШЕНИЕ ПРОДУКТИВНОСТИ АГРОЦЕНОЗОВ ГОРОХА ПОСЕВНОГО (Pisum sativum L.) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор с. – х. наук,...»

«МУХА (DIPTERA MUSCIDAE) КАК ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКА ДЛЯ ПТИЦ НА ВОСТОКЕ КАЗАХСТАНА 16.02.02 – кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук КОЖЕБАЕВ БОЛАТПЕК ЖАНАХМЕТОВИЧ Научный руководитель – доктор биологических наук профессор Ж.М. Исимбеков...»

«ЯМБОРКО Алексей Владимирович ПОПУЛЯЦИОННАЯ ЭКОЛОГИЯ ЛЕСНЫХ ПОЛЕВОК (род CLETHRIONOMYS) СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ АЗИИ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Н.Е. Докучаев Магадан – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. Глава 1. МАТЕРИАЛ И...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.