WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1, О139 СЕРОГРУПП УСКОРЕННЫМИ МЕТОДАМИ ...»

-- [ Страница 3 ] --

Рисунок 2 – Эффективность реклонирования гибридом-продуцентов МКА О139 Клоны гибридом, несмотря на одинаковые размеры колоний, отличались по количеству МКА, секретируемых в культуральную жидкость (КЖ): их титры в ИФА варьировали в пределах 1:5 – 1:100. Отмечены также различия среди гибридных культур по способности к росту в различных объемах среды и пролиферативной активности. С учетом указанных параметров для экспериментальной работы были отобраны клоны трех гибридом 3Е4, 3В5 и 3А9, рост которых оценивали на средах различного состава с целью выявления наиболее оптимальной для культивирования in vitro.

Гибридомы пассировали многократно в среде RPMI-1640 («Sigma», США) с добавлением сыворотки плода коровы («HyClone»), глутамина и стимуляторов роста (пируват натрия, витамины, аминокислоты – в концентрациях, указанных производителями). В качестве критерия оценки пролиферативной активности клеток использовали: определение числа живых клеток путем подсчета их в суспензии с помощью камеры Горяева.

Как видно на рисунке 3, добавление в среду пирувата в большей степени влияет на пролиферативную активность гибридом 3Е4, 3В5 и 3А9. Это объясняется тем, что пируват объединяет несколько ключевых метаболических процессов клетки (конечный продукт гликолиза, цикл Кребса, глюконеогенез) и является универсальным веществом, которое может быть превращено в жирные кислоты, аминокислоты и другие соединения. Увеличение числа жизнеспособных клеток также наблюдалось и при использовании аминокислот и витаминов, причем последние оказывали больший эффект. Полученные результаты позволили выбрать в качестве обязательных компонентов культуральной среды, кроме сыворотки плода коровы и глутамина, пируват и витамины (вариант среды

– кривая 5), одновременное добавление которых приводило к большему повышению пролиферативной активности. Так, пируват и витамины способствовали увеличению клеток на 3 – 4 сутки культивирования 3Е4 с 800тыс.кл./мл до 1100 тыс. кл./мл, 3В5 с 780 тыс. кл./мл до 1050 тыс. кл./мл.

Менее выраженный эффект наблюдали при росте на 5 варианте среды у гибридомы 3А9: на 3 – 4 сутки 800 тыс. кл./мл, а на среде без стимуляторов этот показатель составил 700 - 600 тыс. кл./мл. Таким образом, добавление в среду пирувата и витаминов приводит к повышению роста клеток, что позволяет

–  –  –

Рисунок 3 – Рост гибридных клеток на культуральных средах различного состава: А) Рост гибридомы 3Е4, Б) Рост гибридомы 3В5, В) Рост гибридомы 3А9.

Кривая 1 – среда RPMI, 15 % сыворотки и 2 мМ глутамина; кривая 2 – среда RPMI, 15 % сыворотки, 2 мМ глутамина, пируват натрия; кривая 3 – среда RPMI, 15 % сыворотки, 2 мМ глутамина, витамины; кривая 4 – среда RPMI, 15 % сыворотки, 2 мМ глутамина, аминокислоты; кривая 5 – среда RPMI, 15 % сыворотки, 2 мМ глутамина, пируват натрия; витамины 56

3.2. Получение и выведение в массовую культуру гибридом, продуцирующих видоспецифические МКА О1 Для решения поставленных перед нами задач требовалось расширение имеющегося в лаборатории набора гибридом, стабильно продуцирующих МКА О1. Поэтому следующий этап исследований был направлен на получение гибридом-продуцентов, узнающих видоспецифические детерминанты V. cholerae O1. Гибридизацию проводили по схеме, описанной в главе «Материалы и методы».

–  –  –

+ 10% ДМСО Рисунок 4 – Схема получения гибридом Иммунные спленоциты получали по двум схемам путем иммунизации мышей линии Balb/c клетками штамма V. cholerae eltor 5879, убитых термическим способом (100C – 30 мин). При таком щадящем режиме инактивации микробных клеток, согласно имеющимся данным, поверхностные антигенные детерминанты претерпевают минимальные изменения по сравнению с нативными клетками.

В первой схеме иммунизации антиген (108 м.к./мышь) вводили трижды в смеси с неполным адъювантом Фрейнда внутрибрюшинно с интервалом в 14 дней, бустерную инъекцию (107 м.к./мышь антигена в физиологическом растворе) проводили за три дня до гибридизации. Во второй схеме увеличили дозу антигена до 109 м.к./мышь, а интервалы между инъекциями сократили до 10 дней. Бустер вводили за 4 дня в количестве 109 м.к./мышь. Сравнение титра специфических антител в сыворотках животных, иммунизированных по двум схемам, показало, что они достоверно не отличаются (таблица 2). В то же время в крови мышей происходило нарастание титров антител к иммуногену, что свидетельствовало об увеличении числа В-антителопродуцирующих клеток. У животных, титр сывороточных антител которых был на уровне не менее 1:16000 извлекали селезенку, выделяли В-лимфоциты и проводили слияние с клетками перевиваемой линии мышиной миеломы NSO, находящейся в логарифмической фазе.

Таблица 2 – Схемы иммунизации мышей для получения гибридом Интервал Аг, Способ Адъювант Титры Ат в №инъекции

–  –  –

После гибридизации и культивирования на селективной среде рост гибридных клонов наблюдали в 86 из 288 засеянных лунок (30 %). Скрининг специфических антител, продуцируемых гибридомами, проводили на 10 - 21 день при достижении в лунках плотности клеток более 30%. Первичное тестирование супернатантов (СН) гибридных культур осуществляли методом ТИФА, используя

–  –  –

Как видно (таблица 4), МКА гибридом ГХ-F8/О1, F11 взаимодействовали с клетками штаммов V. cholerae О1 сероваров Огава, Инаба, то есть выявляли их видоспецифические антигенные детерминанты. Тогда как гибридомы Е9, А5 продуцируют антитела, вступающие в реакцию только с вибрионами серовара Инаба. В отношении гибридом ГХ-F8/О1, Е9 зарегистрирована высокая продукция МКА в КЖ и подтверждение тому показатели ОП в ТИФА, равные 2,980 и 2,056. Не выявлено также перекрестной реактивности МКА этих гибридом с представителями V. cholerae О139 и V. cholerae не О1/не О139, что свидетельствует об их строгой специфичности. Такая же характеристика имела место и в отношении гибридом 3Е4, 3В5, 3А9, которые синтезируют МКА, узнающие соответствующие им эпитопы исключительно только у штаммов V. cholerae О139 (таблица 4).

Наряду с продукцией иммуноглобулинов существенной характеристикой являются ростовые свойства гибридом. При одинаковой посевной дозе (200тыс.клеток/мл) наибольшее число жизнеспособных клеток на 4 сутки культивирования отмечено в случае гибридом ГХ-F8/О1, Е9 и 3Е4, 3В5, для которых этот показатель составил более 1 млн. клеток/мл (рисунок 5). Количество клеток в 1 мл гибридом А5, F11 и 3А9 находилось в пределах 800 тыс., тем не менее, специфических иммуноглобулинов в КЖ было достаточно для того, чтобы обеспечить положительную реакцию в ТИФА.

–  –  –

Рисунок 5 – Оценка ростовых свойств гибридом Все вышеотмеченные параметры важны при отборе диагностически значимых гибридом. Однако повышенного интереса в первую очередь заслуживают гибридомы, продуцирующие МКА, которые направлены к эпитопам, локализованным на поверхности всех исследуемых штаммов холерных вибрионов. Поскольку в задачи работы входила разработка диагностических препаратов для постановки РИФ и слайд-агглютинации, то активность МКА испытуемых гибридом оценивали на расширенном наборе штаммов холерных вибрионов в соответствующих серологических реакциях (таблица 5). В опыт брали КЖ гибридом в разведении 1:4.

–  –  –

РНИФ РНИФ РНИФ РНИФ РНИФ РНИФ РНИФ РА РА РА РА РА РА

–  –  –

О139 Результаты в РНИФ и 8 Plesiomonas слайд-агглютинации отрицательные 9 Aeromonas 1 10 Comamonas 1 11 Vibrio parahaemolyticus 1 Суммарные результаты таблицы 5 показывают, что положительную реакцию слайд-агглютинации и РНИФ со всеми взятыми в опыт штаммами холерных вибрионов О1 серогруппы обеспечивали гибридомы ГХ-F8/О1 и F11.

Две из тестируемых гибридом Е9 и А5 проявили активность в иммунологических реакциях с V. cholerae Inaba, однако следует отметить образование агглютината и специфическое свечение с 1 штаммом V. cholerae Ogawa из 6. Этот штамм 62 выделен из воды в 1991 г Крымской ПЧС и, как показывают данные, содержит в составе поверхностных структур эпитопы, идентичные вибрионам Инаба. В отличие от гибридом-продуцентов МКА О1, гибридомы 3Е4, 3В5, 3А9 одинаково выявляли все штаммы холерных вибрионов О139 серогруппы. Что касается близкородственных микроорганизмов, то они не взаимодействовали ни с Инабаспецифическими МКА, ни с видоспецифическими МКА О1 и О139, т. е.

перекрестная реактивность отсутствовала.

Анализ полученных результатов показывает, что диагностическим требованиям отвечают следующие гибридомы: ГХ-F8/О1 и F11 как продуценты видоспецифических МКА О1, 3Е4 и 3В5 – МКА О139. Две из тестируемых гибридом Е9 и А5 оказались Инаба-специфическими – это не отвечало поставленным задачам выявить все штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп. А гибридома 3А9 при длительном культивировании теряла способность синтезировать специфические иммуноглобулины, что исключало ее использование в качестве стабильного источника МКА.

3.4. Получение и накопление в препаративных количествах МКА в виде АЖ Источником МКА могут быть КЖ или АЖ гибридом. Для разработки препаратов требовалось достаточное количество МКА, поэтому были проведены опыты по получению препаративных количеств МКА в виде АЖ. В условиях in vitro гибридомы пассировали в среде RPMI-1640 с целью накопления клеток для последующего введения мышам линии BALB/c массой 16 - 20 грамм. Важным моментом является использование препаратов, которые оказывают стимулирующее действие на процесс образования асцитных опухолей, вызывая раздражение брюшной стенки и наработку асцитного выпота в брюшную полость.

Их введение предотвращает врастание гибридомных клеток в стенку брюшной полости и образование солидных опухолей. Мы применяли следующие вещества:

1) пристан (2, 6, 10, 12-тетраметилпентадекан) - представляет собой один из компонентов легкой фракции минерального масла, наиболее часто используется для получения АЖ;

2) неполный адъювант Фрейнда (НАФ) - представляет собой смесь вазелинового масла с ланолином и твином-80;

3) фортум - цефалоспориновый антибиотик III поколения + НАФ На рисунке 6 на примере гибридомы ГХ-F8/О1 представлены варианты стимуляции асцитообразования различными препаратами. Мы установили, что больший процент формирования АЖ (60 %) наблюдается в двух случаях: при использовании пристана в количестве 0,5 мл на мышь за 7 - 14 дней до введения гибридных клеток и при инокуляции смесью гибридом с НАФ.

–  –  –

Рисунок 6 – Асцитообразование при культивировании гибридомы ГХ-F8/О1 in vivo Необходимо отметить наличие в АЖ остатков НАФ при одновременном введении его с гибридомами, что в дальнейшем вызывает трудности при выделении иммуноглобулинов. Поэтому наиболее оптимальной схемой получения АЖ была выбрана первая, согласно которой и проводили дальнейшее накопление МКА. В таблице 6 представлены данные, характеризующие способность гибридом-продуцентов МКА О1 и МКА О139 к асцитообразованию, что является важным этапом накопления специфических иммуноглобулинов.

–  –  –

Как видно из таблицы 6, в более короткий срок (2 – 4 недели) и в большем объеме (до 10 мл) гибридома ГХ-F8/О1 образовывала асцит у 60 % животных.

Тогда как для F11 асцитообразование отмечалось только у 20 % мышей и по времени занимало более месяца. Кроме того, объем АЖ, получаемый от одной мыши, и активность специфических иммуноглобулинов оказались значительно ниже, чем у гибридомы ГХ-F8/О1. Что касается гибридом-продуцентов МКА О139, то получены следующие результаты: прививаемость клеток 3Е4 и 3В5 в виде АЖ составила 50 %, накопление АЖ наблюдалось через 2 – 4 недели, а количество специфических иммуноглобулинов составило в среднем 10 мг/мл. То есть для накопления МКА О139 в виде АЖ может быть использована как 3Е4, так и 3В5. Важным моментом является высокий титр антител в АЖ гибридом (1:100 – 1:400 тыс.), что позволяет использовать их для постановки реакции слайдагглютинации в достаточно высоких разведениях без предварительного осаждения сульфатом аммония. Необходимо только центрифугировать АЖ для осаждения клеточных элементов (1000 об/мин, 10 мин) и фильтровать (поры 0,45мкм).

Таким образом, в результате проведенных экспериментов установлено, что введение гибридомных клеток животным не всегда позволяет получить АЖ с достаточно высоким титром МКА. Поэтому из четырех гибридом F11 оказалась непригодной для получения препаративного количества МКА в виде АЖ.

65

3.5. Выделение и очистка специфических иммуноглобулинов различными методами В настоящее время описано немало методических приемов выделения иммуноглобулинов из КЖ и АЖ, но выбор метода обусловлен, как правило, следующими критериями: количественный выход специфических Ig и их активность в серологических реакциях. Процесс выделения МКА также имеет свои особенности, в частности, работу проводят при температуре, близкой к 0°C, не применяют сильнокислых и сильнощелочных растворов. Аффинная хроматография позволяет получить чистые Ig, но использование низких значений рН может привести к значительной потере активности некоторых МКА и выпадению их в нерастворимый осадок, поэтому чаще используются нехроматографические методы:

1) высаливание белков насыщенным раствором сульфата аммония с последующим диализом (зависимость растворимости белков от концентрации сульфата аммония);

2) очистка МКА осаждением балластных белков каприловой кислотой с последующим концентрированием насыщенным раствором сульфата аммония.

Для сравнительной оценки эффективности методов выделения иммуноглобулиновой фракции использовали образцы КЖ гибридом ГХ-F8/О1, 3Е4 и 3В5 в объемах не меньше 200 мл. В процессе очистки произошли потери Ig, которые могут быть связаны с их денатурацией и частичным попаданием в отбрасываемый супернатант. Данные приведенные на рисунке 7, свидетельствуют о том, что при одностадийном осаждении (NH4)2SO4 выход МКА составил 3 % из КЖ ГХ-F8/О1, то есть 25,5 мг специфических Ig, и около 2 % из КЖ 3Е4 (14 мг) и 3В5 (12,7 мг). Использование во втором методе с каприловой кислотой аналогичных объемов КЖ привело к значительным потерям белка, так как выход Ig составил 0,5 % из КЖ ГХ-F8/О1 (4,2 мг), около 0,3 % из КЖ 3Е4 (2,2 мг) и 3В5 (2 мг).

2 3В5 3Е4 2,2

–  –  –

Рисунок 7 – Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральной жидкости гибридом-продуцентов: 1 – количество белка в КЖ гибридом; 2 – количество белка в концентрате МКА после преципитации КЖ насыщенным раствором (NH4)2SO4; 3 – количество белка в препарате КЖ после очистки каприловой кислотой Сравнение данных количественного выхода специфических Ig показывает, что быстрая одностадийная очистка преципитацией насыщенным раствором сульфата аммония в большей степени отвечала нашим требованиям. Поэтому для концентрирования МКА О1 и МКА О139 использовали только высаливание белков (NH4)2SO4 с последующим диализом.

Полученные результаты позволяют говорить о том, что КЖ являются полноценным источником иммуноглобулинов при условии культивирования гибридом in vitro до стадии максимального антителообразования. При этом КЖ могут использоваться для отработки технологии получения препаратов и накопления их в виде экспериментальных серий. Но, если говорить о масштабном производстве, то целесообразнее применять АЖ, содержащие большее количество специфических иммуноглобулинов.

67

–  –  –

Считается, что МКА способны преципитировать антиген, если в его структуре имеются идентичные, многократно повторяющиеся детерминанты.

Поэтому была поставлена реакция преципитации с КЖ гибридом, осажденными сульфатом аммония (рисунок 8). Известно, что взаимодействие МКА с антигенными детерминантами не всегда приводит к формированию преципитатов. Как видно на рисунке 8, гибридома F11 не обладала преципитирующей активностью в отличие от ГХ-F8/О1 (1/4), что коррелирует с высокими значениями титра МКА, продуцируемых гибридомой ГХ-F8/О1, в ИФА (1/80000) и РНИФ (1/32).

Г В А Б Рисунок 8 – Титры МКА, выделенных из КЖ гибридом, в реакции преципитации: А – взаимодействие МКА гибридомы ГХ-F11/О1 с клетками О1 5879; Б – взаимодействие МКА гибридомы F11 с клетками V.cholerae О1 5879; В - взаимодействие МКА гибридомы 3Е4 с клетками V.cholerae V.cholerae О139 16064; Г - взаимодействие МКА гибридомы 3В5 с клетками V.

cholerae О139 16064 Что касается МКА О139, то 3Е4 и 3В5 продуцировали специфические иммуноглобулины в равном количестве и с одинаковой активностью. Так, титры в ИФА составили 1/40000 (из КЖ) и 1/200000 (из АЖ), в РНИФ и реакции агглютинации – 1/64 (из КЖ) и 1/200 (из АЖ). Антитела гибридом-продуцентов МКА О139 взаимодействовали с бактериальными антигенами V. cholerae О139 (Ри в реакции преципитации (рисунок 8). Это свидетельствует о значительной концентрации специфических иммуноглобулинов не только в АЖ, но и в КЖ указанных гибридом.

Оценку специфической направленности МКА исследуемых гибридом проводили в ТИФА с препаратами ЛПС (таблица 8) и в ДИА на расширенном наборе микроорганизмов (рисунок 9). Как видно из таблицы 8, МКА О1, синтезируемые гибридомами ГХ-F8/О1 и F11, специфически взаимодействуют с ЛПС О1, причем показатели ОП в случае ГХ-F8/О1 оказались выше, чем у F11.

–  –  –

Рисунок 9 – Результаты определения специфичности МКА гибридом в ДИА: I ряд – МКА гибридомы ГХ-F8/О1 (1/1000), II ряд – МКА гибридомы F11 (1/100), III ряд – МКА гибридомы 3Е4 (1/1000), IV ряд – МКА гибридомы 3В5 (1/1000); 1 - V. cholerae cholerae 569B, 2 – V. cholerae eltor 5879, 3 - V. cholerae eltor 14863, 4 - V. cholerae eltor 13813, 5 - V. cholerae eltor 15960, 6 - V. cholerae O139 Р-16064, 7 - V. cholerae O139 MO-45, 8 - V. cholerae O1 17905 RO, 9 V.cholerae O1 17685 RO, 10 - V. cholerae не O1/ не О139 5444, 11 V.parahaemolyticus 17094, 12 - V. mimicus 16466, 13 - V. vulnificus 17518, 14 Comаmonas P-229, 15 - Aeromonas P-143, 16 - Plesiomonas 101 Результаты ДИА, представленного на рисунке 9, также свидетельствуют о специфичности МКА О1 и МКА О139. В работе использовали расширенный набор штаммов: V. cholerae cholerae 569В, V. cholerae eltor 5879 и 14863 (КМ 254), V. cholerae О139 Р-16064 и МО-45 – типичные по культуральным, морфологическим, серологичесиким, биохимическим свойствам; штаммы V.cholerae eltor 13813 и 15960 со сниженной агглютинабельностью видовой О1 сывороткой (1/100 и 1/400 соответственно); штаммы V. cholerae О1 RO варианты 17905, 17685; штаммы холерных вибрионов не О1/не О139; представители родов

Comamonas, Plesiomonas, Aeromonas, а также другие виды рода Vibrio:

V. parahaemolyticus 17094, V. mimicus 16466, V. vulnificus 17518.

В ходе проведения анализа было установлено, что МКА О1 гибридомы ГХF8/О1 (разведение 1/1000) обеспечивают положительную реакцию в виде интенсивно окрашенного пятна на НЦМ не только с типичными штаммами холерных вибрионов О1 серогруппы, но и с низкоагглютинабельными. При этом отсутствовали перекрестные реакции с представителями близкородственных и гетерологичных микроорганизмов. Если говорить о специфических иммуноглобулинах, синтезируемых гибридомой F11, то они позволяют выявлять холерные вибрионы О1 серогруппы в разведении не более, чем 1/100. На рисунке 10 представлен ДИА, свидетельствующий о недостаточно высокой активности МКА гибридомы F11, которые в титре 1/1000 не обеспечивают положительную реакцию с V. cholerae O1, характеризующимися сниженной агглютинабельностью видовой О1 сывороткой.

cholerae 569B

–  –  –

Для установления локализации эпитопов, узнаваемых МКА О1 и О139, проводили иммуноблоттинг с клеточными лизатами штаммов V. cholerae О1 (5879), V. cholerae О139 (Р-16064), которые электрофоретически разделили в ДСН-ПААГе, затем осуществили перенос на НЦМ и проинкубировали е с МКА О1 и О139 исследуемых гибридом-продуцентов (рисунок 11). У штамма 5879 после инкубации с МКА ГХ-F8/О1 обнаружена одна интенсивно окрашенная полоса в районе маркерных белков 35 - 40 кДа. Связывание МКА F11 c V. cholerae О1 происходило в области 25 – 35 кДа. Ранее [15, 60, 67, 104, 119] было показано, что у О-антигена V. cholerae О1 в процессе электрофореза не формируется «лесенка», а выявляется одна зона в нижней трети фореграммы, это дает основание предполагать принадлежность эпитопов, узнаваемых видоспецифическими МКА О1, О-полисахаридной цепи ЛПС.

116,0 66,2 45,0 35,0 25,0 18,4 14,4 Рисунок 11 – Иммуноблоттинг клеточных лизатов штаммов V. cholerae О1 (5879), V. cholerae О139 (Р-16064): 1 – маркеры молекулярных весов, 2 – МКА гибридомы ГХ-F8/О1, 3 – МКА гибридомы F11, 4 – МКА О1 с V. cholerae О139 (Р-16064), 5 – МКА гибридомы 3Е4, 6 –МКА гибридомы 3В5, 7 - МКА О139 с V.cholerae О1 (5879) Иммуноблот с МКА О139 гибридом 3Е4 и 3В5 позволил выявить интенсивную полосу на уровне ниже 14 кДа (рисунок 11). Ранее в исследованиях 72 K. Hisatsune et al. (1993) было показано, что ЛПС V. cholerae О139 имеет короткий О-полисахарид с небольшой молекулярной массой, подобно R-формам V.cholerae О1 [135]. М.Н. Джапаридзе с соавт. (1996 г.) указывали на гетерогенный характер липополисахарида V. cholerae О139 [41]. В работе О.С. Чемисовой [112] отмечено, что в верхней части иммуноблота МКА О139 обнаруживают углеводные эпитопы, связанные с белками с молекулярной массой 50 - 60 кДа, в нижней углеводную структуру, состоящую из низкомолекулярных гомологичных фрагментов, которую, по-видимому, можно считать Ополисахаридом ЛПС V. cholerae О139. В качестве доказательства этому О.С. Чемисовой проведен иммуноблот с клеточными лизатами, подвергнутыми протеолитической обработке. МКА О139 взаимодействовали с эпитопами, расположенными в низкомолекулярной области, которую выявляли и МКА исследуемых гибридом 3Е4 и 3В5.

Резюмируя полученные результаты, следует отметить, что эпитопы к МКА О1 гибридом ГХ-F8/О1 и F11 локализованы в районе 35 – 40 кДа и 25 – 35 кДа, что соответствует локализации ЛПС, а антигенные детерминанты, узнаваемые МКА О139 гибридом 3Е4 и 3В5, находятся ниже 14 кДа.

4.2. Определение класса специфических иммуноглобулинов Класс синтезируемых гибридомой специфических иммуноглобулинов является важным показателем не только при выборе параметров очистки препаратов, но и определяет предпочтительную область применения.

Изотипический анализ МКА проводили методом ИФА с помощью набора «Hybridoma Isotypinq Kit» («Calbiochem», США) по прилагаемой инструкции изготовителя. По данным, представленным на рисунке 12, исследованные супернатанты гибридных культур принадлежат двум классам: Ig G и Ig М.

К иммуноглобулинам класса Ig G, имеющим мономерное строение, относятся ГХ-F8/О1, А5, F11 - продуценты МКА О1. Для них характерна высокая аффинность - сила специфического взаимодействия антитела с антигеном (или энергия их связи). К классу Ig М, молекулы которых крупнее и являются пентамером, принадлежат гибридомы-продуценты МКА О139 (3Е4, 3В5 и 3А9) и

–  –  –

МКА О139 Рисунок 12 – Классы специфических иммуноглобулинов исследуемых гибридом-продуцентов МКА О1 и О139

4.3. Оценка сохранности О-антигенных детерминант холерных вибрионов при различных способах инактивации Диагностические препараты используются в исследовательской и лабораторной практике для детекции холерных вибрионов, выделяемых из различных источников, что в свою очередь не исключает утрату или модификацию отдельных антигенных детерминант. Как известно, высокая специфичность МКА обусловлена направленностью к единственному эпитопу и поэтому практический и теоретический интерес представляет исследование, касающееся их сохранности при воздействии химическими и физическими факторами. Антигенный анализ подобного рода позволяет установить, какие из них в меньшей степени повреждают эпитопы.

Для инактивации вибрионов использовали химические агенты и воздействие температурой. Микробные взвеси испытуемых штаммов V. cholerae Ogawa 12214, V. cholerae Inaba 5879, V. cholerae О139 16064 (выделенный от человека) и 17793 (выделенный из воды) были обработаны следующим образом:

1) кипячение на водяной бане в течение 30 минут при 100°С;

2) действие 10 М и 1 М раствором NaOH в течение 1 часа при 37°С;

3) действие 10М и 1 М раствором HCl в течение 1 часа при 37°С;

4) действие 6% раствором Н2О2 в течение 2 часов при комнатной температуре;

5) действие 1,5% раствором хлороформа в течение 4 часов при комнатной температуре;

6) действие 1,5 % раствором формалина в течение 4 часов при комнатной температуре;

7) действие раствором трипсина 1:50 в течение 1 часа при 37°С.

Инактивированные клетки V. cholerae О1 и О139 исследовали в ТИФА. В качестве источников специфических иммуноглобулинов использовали препараты МКА, выделенные из КЖ гибридом ГХ-F8/О1, F11, 3Е4 и 3В5, в разведении 1/10000. На рисунке 13 представлена в виде кривых зависимость показателей оптической плотности (ОП) от способа воздействия на вибрионы. Результаты ИФА показывают, что после обработки холерных вибрионов 1М щелочью, 10М и 1М кислотой, 1,5% хлороформом, 1,5% формалином, трипсином, а также после кипячения в течение 30 минут показатели оптической плотности сопоставимы с контрольными значениями (живая культура). Согласно полученным данным, только действие 10М NaOH и 6% Н2О2 приводило к снижению ОП, по сравнению с контролем, что могло быть связано с утратой или нарушением структуры части эпитопов ЛПС, тогда как оставшиеся обеспечивали положительную реакцию в ИФА. Если сравнивать активность специфических иммуноглобулинов гибридом ГХ-F8/О1 и F11 в отношении исследуемых штаммов, то более высокие показатели ОП отмечены в отношении ГХ-F8/О1. Это свидетельствует о большей устойчивости детерминант, комплементарных ГХ-F8/О1, к действию инактивирующих факторов и высокой частоте их представленности в структуре ЛПС холерных вибрионов.

–  –  –

Рисунок 13 – Оценка сохранности антигенных детерминант V. cholerae O1 при воздействии на них физических и химических факторов Сравнение способов инактивации холерных вибрионов с помощью МКА гибридомы F11 показало, что наибольшую сохранность антигенных детерминант обеспечивает трипсин. Это объясняется тем, что, являясь ферментом класса гидролаз и расщепляя пептиды и белки, он не может оказывать никакого воздействия на молекулу полисахарида. В остальных случаях наблюдалось снижение антигенной реактивности эпитопов, узнаваемых МКА F11, особенно выраженное при обработке 10М NaOH и 6% Н2О2. Это дает основание говорить, что детерминанты, выявляемые F11, более чувствительны к инактивирующему воздействию щелочью, кислотой, перекисью, хлороформом и формалином и, вероятно, в составе ЛПС они содержатся в меньшем количестве или замаскированы другими структурами.

В случае МКА О139 активность иммуноглобулинов, синтезированных гибридомами 3Е4 и 3В5, была практически одинаковой, так как ОП в ТИФА находится в пределах 1,8 – 2,3 оптических единиц (рисунок 14). Сопоставимые показатели активности 3Е4 и 3В5 позволяют констатировать, что их эпитопы не претерпевают существенных изменений при большинстве способов воздействия на клетку. Снижение наблюдалось в случае обработки 6% Н2О2 и 10М NaOH, что возможно связано со свойством «едкой щлочи» разъедать органические вещества (кожу, бумагу и другие).

2,5

–  –  –

1, 1, 3Е4 (16064) 3Е4 (17793) 3В5 (16064) 3В5 (17793) Рисунок 14 – Оценка сохранности антигенных детерминант V. cholerae O139 при воздействии на них физических и химических факторов Проведенный анализ наглядно демонстрирует, что в исследовательской и лабораторной работе можно использовать достаточно широкий спектр способов инактивации, которые не оказывают существенного влияния на структуру антигенных детерминант. Выраженная чувствительность холерных вибрионов к действию 10М NaOH и 6% Н2О2 связана, по-видимому, с маскировкой или с разрушением отдельных эпитопов. Однако и в условиях жесткой обработки часть эпитопов ЛПС сохранялась и их взаимодействие с соответствующими МКА регистрировалось в виде окрашенных лунок на планшете. Способность МКА реагировать с клетками холерных вибрионов после обработки их химическими агентами с показателями ОП, аналогичными живой культуре, свидетельствует о направленности специфических иммуноглобулинов к эпитопам углеводной природы [67].

Следует также отметить, что одной из задач данной работы является конструирование диагностикумов на основе МКА и возможность их применения в лабораторной практике, поэтому предпочтением пользуются гибридомы-продуценты МКА, специфически взаимодействующих с детерминантами, наиболее устойчивыми ко всякого рода воздействиям. На этом основании представляется целесообразным использовать в качестве основного источника МКА О1 гибридому ГХ-F8/О1, а МКА О139 - 3Е4 и 3В5.

4.4. Эпитопная направленность МКА О1 и О139 Для определения топографического расположения антигенных детерминант ЛПС и эпитопной направленности МКА О1 и О139 гибридом ГХ-F8/О1, F11 и 3Е4, 3В5 мы использовали ИФА, основанный на том, что при совместной инкубации двух МКА увеличение ОП произойдет только в том случае, если иммуноглобулины распознают различные детерминанты. Принцип теста заключается в оценке числа антигенных сайтов на макромолекуле, одновременно доступных паре МКА. Определение эпитопной специфичности начинали с нахождения минимальной дозы микробных клеток возбудителя холеры и подбора минимальной насыщающей концентрации МКА (определяли точку эквивалентности взаимодействия антиген-антитело). Данные титрования показали, что минимальная доза антигена в 96-луночных планшетах составила 105м.к./мл. Далее вносили в лунки МКА по одному и парами (инкубировали 1 час при 37 C для каждого вида антител). Результаты ТИФА представлены на рисунке 15.

1,395 1,408 3Е4+3В5 3В5 1,314 3Е4

–  –  –

Рисунок 15 – Показатели ОП в ТИФА при совместной инкубации МКА гибридом ГХ-F8/О1 и F11, 3Е4 и 3В5 Как видно на рисунке, у пары гибридом ГХ-F8/О1 и F11 при совместной инкубации специфических иммуноглобулинов с клетками холерных вибрионов происходило увеличение ОП с 1,994 и 1,004 до 2,857 (ОП (ГХ-F8/О1 + F11) ОП (ГХ-F8/О1) + ОП (F11)). Такие значения ОП свидетельствуют о том, что испытуемые МКА О1 реагируют с антигенными детерминантами, достаточно удаленными друг от друга на поверхности антигена. Подтверждением этому являются и результаты иммуноблота, представленные на рисунке 11: связывание специфических иммуноглобулинов ГХ-F8/О1 и F11 с клеточными лизатами холерных вибрионов происходило в разных областях полисахаридной цепи ЛПС.

В этом случае не возникало стерических помех при взаимодействии с антителами.

В результате одновременной инкубации МКА О139 исследуемых гибридом показатели ОП (1,395) достоверно не отличались от значений, полученных при взаимодействии вибрионов как с 3Е4 (1,314), так и с 3В5 (1,408), что свидетельствует о направленности к одной и той же или близко расположенным антигенным детерминантам.

Проведенное исследование позволяет говорить о пространственной разобщенности детерминант, узнаваемых МКА О1 гибридом ГХ-F8/О1 и F11, то есть об их разной эпитопной специфичности. В случае гибридом 3Е4 и 3В5 эпитопы пространственно сближены на молекуле антигена, что приводит к активной конкуренции за центры связывания.

ГЛАВА 5. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ НА

ОСНОВЕ МКА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ

ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1 И О139 СЕРОГРУПП

5.1. Оптимизация условий получения видоспецифических флуоресцирующих моноклональных препаратов для идентификации V. cholerae O1 и O139 По результатам исследований гибридом-продуцентов МКА О1 и МКА О139 наиболее перспективными для разработки моноклональных препаратов являются ГХ-F8/О1, 3Е4 и 3В5. Кроме выделения основного компонента высокоактивных флуоресцирующих иммуноглобулинов – МКА, важным моментом является оптимизация условий конъюгации их с ФИТЦ. Как отмечалось выше, источником МКА, необходимых для получения диагностических препаратов могут быть как АЖ, так и КЖ. В составе АЖ, как правило, не менее 10 мг/мл специфических иммуноглобулинов, однако они в значительной степени контаминированы другими мышиными белками, и требуется немало усилий для их очистки.

Определенные трудности состоят в том, что, являясь соединениями одного класса, они обладают сходными свойствами и эти небольшие различия лежат в основе фракционирования хроматографическими методами. Следует учитывать и другой момент – для формирования асцитных опухолей в условиях in vivo необходимо как минимум один месяц с момента праймирования мышей. В то же время пассирование гибридом в условиях in vitro сопровождается накоплением больших объемов КЖ, которые содержат сывороточные альбумины и специфические Ig. Несмотря на то, что количество последних в АЖ значительно больше, в процессе приготовления флуоресцирующих диагностикумов применяли и КЖ. На рисунке 16 представлена схема получения моноклональных флуоресцирующих препаратов.

С целью совершенствования технологии нами изучены различные условия конъюгации МКА с ФИТЦ для получения флуоресцирующих препаратов. Анализ публикаций на эту тему показал [17, 24, 31, 50, 66, 110], что параметры конъюгации варьируют, поэтому были апробированы различные условия получения ФИТЦ-МКА, которые представлены в таблице 9.

–  –  –

Рисунок 16 – Схема получения моноклональных флуоресцирующих препаратов В ходе отработки методики получения флуоресцирующих препаратов было установлено, что лучшие результаты обеспечивали второй и третий методические варианты. Оптимальными условиями конъюгации, в соответствии с таблицей 9, были: концентрация белка не ниже 5 мг/мл, ФИТЦ - 0,5 мг на 10 мг белка, 10% КББ, рН реакционной смеси 9,0. Отмечено, что после добавления красителя происходит снижение рН и значительная часть ФИТЦ не вступает в реакцию с белком, поэтому необходимо проводить либо предварительный диализ раствора иммуноглобулинов против КББ (2 способ), либо корректировку рН в течение первых 30 минут раствором КББ (3 способ). Конъюгацию проводили в условиях холодильника в течение 18 часов или при комнатной температуре 4 часа.

–  –  –

В таблице 9 также представлены и другие часто встречающиеся условия получения флуоресцирующих препаратов, в частности время реакции сокращалось до 2 часов, но при этом конъюгацию проводили при комнатной температуре, и не предусматривался этап диализа раствора МКА против КББ для достижения нужного значения рН. Следует отметить, что первый вариант конъюгации не позволял получать высокоактивные ФИТЦ-МКА: при окрашивании микробных клеток холерных вибрионов регистрировали свечение на «4+» только у 12 штаммов из 20 (рисунок 17).

Рисунок 17 – Оценка эффективности различных способов конъюгации МКА с ФИТЦ Наилучшие серии конъюгатов получены 2 и 3 способом, о чем свидетельствует положительная реакция на «4+» всех взятых в опыт штаммов возбудителя холеры. Предпочтительным, по нашему мнению, является 3 методический вариант, так как в этом случае время реакции сокращено до четырех часов.

5.2. Наработка экспериментальных серий флуоресцирующих препаратов для испытания на широком наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов и подготовка нормативно-технических документов По отработанной схеме мы приготовили экспериментальные образцы флуоресцирующих моноклональных препаратов для выявления V. cholerae О1 и V. cholerae О139. С целью определения рабочего разведения мазки нескольких штаммов холерных вибрионов обрабатывали конъюгатами в разведениях от 1:4 до 1:32 по общепринятой методике. Было установлено, что красящий титр ФИТЦМКА О1 равняется 1:16, ФИТЦ-МКА О139 - 1:8. Определение чувствительности препаратов ФИТЦ-МКА показало, что она находится на уровне 105 м.к./мл. Также следует отметить, что специфическое свечение наблюдалось и в мазках с меньшей концентрацией холерных вибрионов, но в поле зрения выявлялись единичные вибрионы.

В число задач данной работы входила разработка современных высокоспецифичных диагностикумов, поэтому нами был подготовлен набор реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические флуоресцирующие сухие для серологической идентификации V. cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РИФ «Иг - V. cholerae О1/О139 – РИФ», в состав которого вошли следующие реагенты:

I) иммуноглобулины моноклональные диагностические холерные О1 флуоресцирующие - для выявления холерных вибрионов О1 серогруппы;

сухие;

II) иммуноглобулины моноклональные диагностические холерные О139 флуоресцирующие - для выявления холерных вибрионов О139 серогруппы;

сухие;

III) смесь солей для приготовления промывающего раствора; сухая, концентрат 10.

Набор рассчитан на выявление холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в 30 исследуемых образцах. Для эффективного использования ФИТЦ-МКА находятся в комплекте в рабочем разведении. Расход растворов иммуноглобулинов О1 и О139 на одно исследование составляет 30 мкл.

Для оценки диагностической значимости набора реагентов были проведены лабораторные испытания. Специфическую активность полученных препаратов исследовали на широком наборе штаммов. Результаты представлены в таблице 10.

Как видно, у 70 штаммов V. cholerae О1 при взаимодействии с ФИТЦ-МКА О1 зарегистрирована положительная реакция, из них 41 светились на 4+ и 29 на 3+. Установлено также, что два штамма холерных вибрионов О1 серогруппы имели иммунофлуоресценцию не больше 2+, они же отличались низкой агглютинабельностью. По нашему мнению, это обусловлено тем, что часть Оантигена, локализованная на поверхности клетки, утрачивается или изменяется (в процессе хранения холерных вибрионов, перехода их из S- в R-форму, воздействия различных факторов, в результате культивирования на обедненных питательных средах), и как следствие уменьшается пул специфических эпитопов и снижается интенсивность серологических реакций с соответствующими им МКА. Что касается флуоресцирующих препаратов для выявления холерных вибрионов О139 серогруппы, то из 35 штаммов V. cholerae О139 большая часть штаммов - при взаимодействии с ФИТЦ-МКА О139 интенсивно светились на 4+ с четко выраженной морфологией клеток, 13 штаммов на 3+, 2 штамма от человека имели свечение на 2+. Согласно данным таблицы 10, все серии иммуноглобулинов моноклональных диагностических холерных О1 и О139 флуоресцирующих не вступают в реакцию с близкородственными (V. cholerae не О1/не О139, V. cholerae RO, V. parahaemolyticus) и гетерологичными микроорганизмами, что свидетельствует об их высокой специфичности.

Таблица 10 – Оценка специфичности иммуноглобулинов моноклональных диагностических холерных О1 и О139 флуоресцирующих

–  –  –

Результаты проведенных исследований, включающие получение флуоресцирующих конъюгатов и их испытание, явились основанием для оформления нормативной документации: инструкции по применению, справки об изделии медицинского назначения и технических условий (ТУ 9398-001

–  –  –

Результаты испытаний разработанного набора реагентов показали, что они отличаются строгой специфичностью, чувствительностью на уровне 105 м.к./мл, воспроизводимостью, и могут быть использованы для выявления возбудителя холеры О1 и О139 серогруппы прямым вариантом методом флуоресцирующих антител. Следует отметить, что полученные нами холерные флуоресцирующие МКА нашли применение в лабораториях института и входят в перечень укомплектования диагностическими препаратами специализированных противоэпидемических бригад. На рисунке 18 представлено фотоизображение набора «Иг - V. cholerae О1/О139

– РИФ».

Рисунок 18 – Фотоизображение медицинского изделия набор реагентов «Иг - V. cholerae О1/О139 – РИФ».

5.3. Лиофилизация флуоресцирующих МКА Нам удалось не только оптимизировать технологию производства флуоресцирующих препаратов, но и отработать условия их стабилизации методом лиофильного высушивания (сушка Heto PowerDry PL9000 (Thermo Scientific), Дания).

Жидкие препараты расфасовывали по 1 мл в стеклянные флаконы емкостью 5 мл с резиновыми пробками и замораживали. Далее проводили лиофилизацию флуоресцирующих иммуноглобулинов (рисунок 19) в течение 11 часов, плавно изменяя температуру сушки с -25C до +30C. Высушенные флуоресцирующие иммуноглобулины герметично укупоривали резиновыми пробками, завальцовывали алюминиевыми колпачками и хранили при +4C.

40

–  –  –

Рисунок 19 – Условия лиофилизации «Иг - V. cholerae О1/О139 – РИФ»

Оценка серологической активности флуоресцирующих 5.4.

препаратов после лиофилизации и в процессе хранения Препараты флуоресцирующих иммуноглобулинов лиофилизировали и хранили при +4°С в течение 3 лет. Стабильность физико-химических и биологических показателей высушенных препаратов определяли после растворения в дистиллированной воде при хранении в течение 7 суток (+3суток) в режиме реального времени при температуре от 2 до 8C.

Результаты представлены в таблице 13.

Установлено, что приготовленные серии препаратов после растворения сохраняют специфическую активность в течение 7 суток хранения при температуре от 2 до 8C на исходном уровне. Через 10 суток регистрировали свечение тест-штаммов на «3+» и «2+», что не соответствовало характеристикам ТУ, поэтому при необходимости более длительного хранения (до 1 месяца) раствор антител необходимо разлить на аликвоты и хранить при температуре минус 20C.

–  –  –

2,5 1,5 2,5

–  –  –

Таким образом, разработанный на основе МКА набор реагентов «Иг V. cholerae О1/О139 – РИФ» обладает высокой специфичностью и стабильностью при хранении в течение трех лет (срок годности) в режиме реального времени.

ГЛАВА 6. ПРИМЕНЕНИЕ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ МКА ДЛЯ

ИДЕНТИФИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1 И О139

СЕРОГРУПП В РЕАКЦИИ СЛАЙД-АГГЛЮТИНАЦИИ

6.1. Исследование агглютинабельности МКА, выделенных из АЖ и КЖ, в реакции слайд-агглютинации В задачи данного этапа работы входило изучение агглютинирующих свойств препаратов МКА, источником которых являются КЖ или АЖ гибридом-продуцентов. Чтобы получить АЖ (препараты №2 и №4), мышам внутрибрюшинно вводили значительное количество гибридомных клеток (10 млн.), наращивая их путем многократных пассажей в жидкой питательной среде. Пассирование гибридом-продуцентов в условиях in vitro сопровождалось накоплением больших объемов КЖ. Специфические иммуноглобулины из КЖ концентрировали преципитацией с помощью насыщенного раствора сульфата аммония (препараты №1 и №3).

Изучение агглютинирующей способности препаратов проводили на ограниченном наборе штаммов холерных вибрионов О1 (27 штаммов) и О139 (7 штаммов) серогрупп, RO (6 штаммов) и V. cholerae О22 (1 штамм).

Вначале был установлен минимальный титр иммуноглобулинов, обеспечивающих образование агглютината с клетками холерных вибрионов, а затем проведена реакция слайд-агглютинации исследуемых штаммов с препаратами в установленном титре и в разведении, превышающем его в два раза. Результаты таблицы 15 свидетельствуют, что все штаммы V. cholerae О1 агглютинировались препаратом МКА №1, выделенном из КЖ гибридомы ГХ-F8/О1, в титре 1/4, а при разведении 1/8 – только 18 из 27. Высокая агглютинабельность зарегистрирована в отношении препарата №2 – иммуноглобулинов, осажденных из АЖ. Как видно, из 27 штаммов V. cholerae О1 он агглютинировал 27 в титре 1/64 и 21 – 1/128, что в 16 раз превышает активность первого препарата. Это объясняется большим содержанием специфических иммуноглобулинов в АЖ, имеющей МКА порядка 10 – 15 мг/мл. Также вполне возможно, что это связано не только с концентрацией Ig в препаратах, но и со структурной организацией и эпитопным составом О-антигена V. cholerae О1. Как видно, при большем разведении препаратов №1 (1/8) и №2 (1/128) не все штаммы холерных вибрионов серовара Инаба давали положительную реакцию. Так, первый препарат в титре 1/8 агглютинировал только с тремя штаммами V. cholerae Inaba, а №2 — с шестью из двенадцати, в свою очередь V. сholerae Ogawa обеспечивали образование агглютината в полном объеме.

Таблица 15 – Результаты агглютинабельности различных препаратов МКА О1 и МКА О139

–  –  –

детерминант на поверхности холерных вибрионов О1 серогруппы также отражаются на их агглютинирующей способности. Известно, что для образования агглютината необходимо определенное соотношение микробных клеток и специфических иммуноглобулинов и для V. cholerae eltor серовара Inaba оно является оптимальным, если используются концентрированные препараты.

Что касается МКА О139, то они независимо от источника выделения (КЖ или АЖ) давали положительную реакцию со всеми взятыми в опыт штаммами V. choleraе О139. Объяснить этот факт вероятно можно принадлежностью МКА О139 к классу IgM, которые благодаря наличию 4-х субъединиц в составе молекулы агглютинируют лучше, чем IgG.

Свидетельством специфичности препаратов является отрицательная реакция с V. cholerae О22 и V. cholerae RО.

Таким образом, можно констатировать, что МКА О1 и МКА О139 подобно диагностическим поликлональным сывороткам агглютинируют клетки холерных вибрионов соответствующих серогрупп. Однако их преимущество в том, что они отличаются высокой специфичностью, свидетельство тому – отсутствие перекрестных реакций. На агглютинирующие свойства препаратов МКА, как свидетельствуют полученные данные, влияют частота экспонирования видоспецифических Одетерминант на поверхности холерных вибрионов, количество специфических иммуноглобулинов в составе препарата, класс Ig. С практической точки зрения каждый из препаратов имеет свой плюс: МКА в виде АЖ могут не подвергаться предварительной очистке, так как пул сопутствующих иммуноглобулинов невысок в сравнении со специфическими и не вызывает перекрестных реакций; МКА из КЖ несмотря на более низкие титры по отношению к асцитным, не требуют наличия лабораторных животных и процесс их получения технологически проще, а по агглютинабельности они сопоставимы, как в случае с V. choleraе О139. По совокупности этих показателей для конструирования препаратов использовали асцитные МКА, наиболее отвечающие диагностическим требованиям.

Получение экспериментальных серий диагностических 6.2.

агглютинирующих МКА и их испытание на широком наборе штаммов На основании полученных результатов агглютинабельности был укомплектован набор реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические cухие для серологической идентификации V. cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РА «ИГ –V.cholerae О1/О139 — РА», в состав которого входят:

1. иммуноглобулины моноклональные диагностические холерные О1 агглютинирующие; сухие – 1 флакон (6 мг);

2. иммуноглобулины моноклональные диагностические холерные О139 агглютинирующие; сухие – 1 флакон (6 мг).

К набору прилагается инструкция по применению и аналитический паспорт на поставляемую серию. На рисунке 20 представлено фотоизображение медицинского изделия.

Рисунок 20 – Фотоизображение медицинского изделия набор реагентов «ИГ - V. cholerae О1/О139 - РА»

Технология приготовления иммуноглобулинов моноклональных холерных О1 и О139 заключается в выделении иммуноглобулиновых фракций классов G и М с помощью насыщенного раствора сульфата аммония из АЖ мышей линии BALB/с (при необходимости можно использовать КЖ гибридом-продуцентов). Как отмечалось выше, предпочтительным сырьем для получения агглютинирующих препаратов является АЖ, имеющая более высокий рабочий титр и позволяющая проводить большее число анализов.

Так, один флакон набора в разведении 1/30 рассчитан на серологическую идентификацию 600 штаммов V. cholerae О1 и О139, если расход рабочих растворов иммуноглобулинов на одно исследование составляет 50 мкл.

Важным этапом являлось определение диагностической эффективности разработанных препаратов, поэтому на базе ФКУЗ РостНИПЧИ были проведены испытания экспериментальных серий «ИГ- V.

cholerae О1/О139 – РА» на широком наборе штаммов. Материалом для исследования являлись типичные колонии в S-форме, отобранные с агара Мартена или Хоттингера рН 7,7±0,1. Бактериальной петлей равномерно смешивали культуру сначала с каплей 0,9% раствора натрия хлорида (контроль культуры на спонтанную агглютинацию), затем с иммуноглобулинами моноклональными агглютинирующими. Для ускорения выпадения агглютината слегка покачивали стекло. На рисунке 21 показано образование крупно- (А) или мелкозернистого (Б) агглютината на «4+», заметного на тмном фоне, положительная реакция учитывается при проявлении в течение 3 мин.

Б А Б

–  –  –

МКА О139 МКА О139

–  –  –

В течение 2012 г диагностикум «ИГ- V. cholerae О1/О139 – РА»



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Похожие работы:

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«ХАФИЗОВ ТОИР ДАДАДЖАНОВИЧ ОСОБЕННОСТИ РОСТА, РАЗВИТИЯ И ПРОДУКТИВНОСТИ ЧАЙОТА (SECHIUM EDULE L. – CHAYOTE) В УСЛОВИЯХ ГИССАРСКОЙ ДОЛИНЫ ТАДЖИКИСТАНА Специальность: 06.01.01. – общее земледелие, растениеводство ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор, Гулов С.М. Душанбе – 201 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ВУДС ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА Фармакогенетические аспекты антиангиогенной терапии экссудативной формы возрастной макулярной дегенерации» 14.01.07 – Глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Будзинская Мария Викторовна кандидат биологических наук Погода Татьяна Викторовна Москва – 2015...»

«ГЕНС ГЕЛЕНА ПЕТРОВНА Роль молекулярно-биологических маркеров и многофункционального белка YB-1 в лечении и прогнозе больных раком молочной железы 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант:...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Дулепова Наталья Алексеевна ФЛОРА И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ РАЗВЕВАЕМЫХ ПЕСКОВ ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., c.н.с., А.Ю. Королюк Новосибирск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования 1.1. Район и объект исследования 1.2....»

«МУХАМЕТОВ ИЛЬЯС НИАЗОВИЧ Палтусы прикурильских вод: биология, состояние запасов, перспективы промысла 03.02.06 – ихтиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н. А.М. Орлов Южно-Сахалинск – 2014 г. СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ОКЕАНОГРАФИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ РАЙОНА 3. ИССЛЕДОВАНИЙ ОСОБЕННОСТИ...»

«Гуськов Валентин Юрьевич МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БУРОГО МЕДВЕДЯ URSUS ARCTOS LINNAEUS, 1758 ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, с.н.с. А.П. Крюков Владивосток – 2015 Оглавление Введение Глава 1. Обзор...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» УДК 637.54.087.73 НА ПРАВАХ РУКОПИСИ ШАРИПОВА АЛЬФИЯ ФАРИТОВНА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И МЯСНЫЕ КАЧЕСТВА ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ «ВЕТОСПОРИН-АКТИВ» 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«ГАБЫШЕВ Виктор Александрович ФИТОПЛАНКТОН КРУПНЫХ РЕК ЯКУТИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ТЕРРИТОРИЙ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ 03.02.10 – Гидробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант Доктор биологических наук Доцент Л.Г. Корнева Якутск 2015 Оглавление ВВЕДЕНИЕ Глава 1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 2. ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНА И ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ...»

«ЗОЛОТОВА Юлия Игоревна ПОЛИМЕРЫ-НОСИТЕЛИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ СОПОЛИМЕРОВ 2-ДЕОКСИ-2-МЕТАКРИЛАМИДО-D-ГЛЮКОЗЫ С N,N-ДИМЕТИЛИ N,N-ДИЭТИЛАМИНОЭТИЛМЕТАКРИЛАТАМИ Специальность 02.00.06 – высокомолекулярные соединения ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: чл.-корр. РАН, д.х.н., проф. Панарин...»

«Чечулова Анна Васильевна ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ НАСЛЕДСТВЕННЫХ И ПРИОБРЕТЕННЫХ ФАКТОРОВ РИСКА ВЕНОЗНОГО ТРОМБОЭМБОЛИЗМА У ПАЦИЕНТОВ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА 14.01.21 – гематология и...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Кузнецова Татьяна Сергеевна ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РЕФРАКЦИОННОГО РЕГРЕССА ПОСЛЕ ЭКСИМЕР-ЛАЗЕРНОЙ КОРРЕКЦИИ БЛИЗОРУКОСТИ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ПРИ МЕХАНИЧЕСКОЙ И ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ ТЕХНОЛОГИЯХ ФОРМИРОВАНИЯ ЛОСКУТА РОГОВИЦЫ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Очиров Джангар Сергеевич НАРУШЕНИЯ МИКРОНУТРИЕНТНОГО СТАТУСА ОВЕЦ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор ветеринарных...»

«Регузова Алёна Юрьевна Исследование специфической активности полиэпитопных Т-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«ГОРБУНОВА Анна Николаевна ГИДРОЛИЗ РАЦЕМИЧЕСКИХ АМИДОВ ФЕРМЕНТАМИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Максимов А. Ю. Пермь – 201 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.