WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1, О139 СЕРОГРУПП УСКОРЕННЫМИ МЕТОДАМИ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Продолжаются работы по получению новых МКА в целях создания на их основе диагностических и лекарственных средств [27, 31, 40, 47, 54, 84, 117]. За последние годы появился целый ряд протеомных методов исследования, среди которых важное место занимают белковые микрочипы на основе МКА. Так, в НИИ гриппа Минздрава России (г. Санкт-Петербург) разработали биочип для выявления вирусов гриппа А и В с помощью тип-специфических МКА, направленных к нуклеопротеину NP и конъюгированных с флуоресцентным красителем Cy3 (для флуоресцентной детекции) и пероксидазой хрена (для колориметрической детекции) [59].

В НИИ вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова РАМН (г. Москва) использовали метод проточной цитометрии с применением МКА для изучения особенностей экспрессии TLRs у больных мигрирующей эритемой (патогномоничный маркер болезни Лайма) [94] и хронической крапивницей [95]. Понимание ранних событий иммунного ответа, связанных с активацией клеток иммунной системы через TLRs, и в динамике в ходе проведения терапии способствует повышению эффективности элиминации патогена и лечения в целом.

Использование МКА в качестве терапевтических агентов привело к смене концепции лечения: переход от неспецифической к специфической терапии («таргетная терапия»). На сегодняшний день моноклональные препараты активно используются в онкогематологии и лечении солидных опухолей и аутоиммунных заболеваний. Примерами терапевтических МКА, разрешенных FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и медикаментов, США), являются следующие [46]:

Erbitux (химерное) – взаимодействует с рецептором эпидермального фактора роста, применяют при колоректальном раке;

Simulect (химерное) и Zenapax (гуманизированное) – связываются с рецепторами IL-2 а, используют при отторжении трансплантата;

ReoPro (химерное) – действует на рецептор гликопротеида IIb/IIIa, применяют при остром коронарном синдроме;

Humira и Remicade (гуманизированные антитела) - ингибиторы фактора некроза опухоли-, применяют при аутоиммунных заболеваниях;

Raptiva (гуманизированное) – действует на адгезивный рецептор, препарат против псориаза;

Tysabri (гуманизированное) – блокатор адгезивного рецептора VLA-4 предотвращает адгезию иммуновоспалительных клеток и их перемещение через гематоэнцефалический барьер и стенку кишечника, применяется при лечении рассеянного склероза и болезни Крона;

Campath (гуманизированное) – мишенью является CD52, используется при хроническом лимфоцитарном лейкозе;

Avastin (гуманизированное) – блокатор фактора роста эндотелия сосудов, применяют при колоректальном раке;

Soliris (гуманизированное) – действуя на систему комплимента С 5, применяется при воспалительных заболеваниях, в том числе и при параксизмальной гемоглобинурии;

Xolair (гуманизированное) – мишенью являются иммуноглобулины Е, применяют при иммуновоспалительных заболеваниях (при астме);

И др.

29 Говоря о механизмах воздействия МКА, следует отметить их высокоспецифичное взаимодействие с клеточными мишенями или сигнальными путями, что в итоге приводит к гибели клеток. Кроме этого, МКА способствуют активации опухолеспецифического иммунного ответа. Но, несмотря на привлекательность терапии моноклональными препаратами, только комплексный подход (вакцины, химиотерапия, МКА и др.) способен обеспечить желаемый эффект с минимальным риском для пациента.

Таким образом, производство МКА – развивающийся сегмент мировой индустрии: к 2014 г. количество белковых препаратов увеличится до 50%, причем большая часть прийдется на МКА – продукт гибридомной технологии.

1.2. Серологические методы исследования в лабораторной диагностике холеры При постановке диагноза холеры большое значение имеют эпидемиологические данные, которые позволяют установить вероятность контакта с возбудителем холеры, и клинические данные (характерные симптомы холеры). Однако не менее важными являются данные лабораторной диагностики, позволяющие подтвердить диагноз. Одно из ведущих мест в лабораторной диагностике холеры принадлежит бактериологическому методу с выделением чистой культуры вибриона и определением его основных таксономических признаков, необходимых для идентификации. Являясь традиционным, этот метод вс же совершенствуется путем автоматизации: в центрах ГСЭН применяется микробиологический анализатор "Бак Трак 4100", который позволяет повысить оперативность и эффективность эпидемиологического надзора [26].

Несмотря на приоритет бактериологического метода, серологические также важны, так как одним из специфических признаков, на которых базируется в настоящее время идентификация возбудителя холеры, является способность вибрионов вступать в реакцию с видо- и серовароспецифическими сыворотками.

Проблема усовершенствования диагностикумов и разработка новых препаратов постоянно находятся в центре внимания исследователей, потому что периодический анализ кроличьих сывороток по заданию ВОЗ показал, что диагностические лаборатории нуждаются в обеспечении высокоактивными и специфическими реагентами.

В настоящее время для серологической диагностики холеры официально рекомендован к использованию набор препаратов, включающий поликлональные сыворотки лошадиного происхождения для V. cholerae О1 и кроличьи антитела для V. cholerae О139. Основной недостаток указанных препаратов – невысокий титр специфических иммуноглобулинов, что является следствием неоднократной адсорбции сывороток близкородственными микроорганизмами, и наличие перекрестных реакций. Как следствие неспецифичности лошадиных сывороток из-за низкой концентрации специфических Ig и перекрестной реактивности в отечественной практике предусмотрена постановка развернутой реакции агглютинации. Это занимает дополнительное время и требует дополнительных экономических затрат. Если говорить о препаратах для выявления холерных вибрионов О139, то на сегодняшний день единственным в РФ лицензированным является кроличья сыворотка для РА на стекле.

За рубежом многие проблемы были решены путем привлечения в лабораторную диагностику возбудителя холеры МКА, которые поддаются стандартизации, а при наличии гибридом-продуцентов их можно получать по мере необходимости и работать постоянно с одними и теми же антителами.

Процесс замены поликлональных антител в диагностических наборах на моноклональные начался в 1982 г. с работы B. Gustafsson et al. [132], которые предложили выявлять холерные вибрионы в реакции слайд-агглютинации с помощью МКА к коровой области ЛПС V. cholerae О1. Поскольку полученные антитела относились к классу IgG, их недостаточно высокая агглютинирующая способность была увеличена путем коагглютинации антител с белком А Staphilococcus aureus. Также этой группе авторов удалось получить МКА к A-, Bи С-антигенам V. cholerae О1, специфичность (отсутствие перекрестных реакций с гетерологичными микроорганизмами) и чувствительность которых была проверена в ИФА (5106 - 5107 м.к./мл) и реакции слайд-агглютинации. На основе этих МКА также были получены флуоресцирующие препараты для ускоренной диагностики холерных вибрионов О1 серогруппы [129, 130, 131, 133].

Позже другие зарубежные авторы сконструировали высокоэффективные тестсистемы: для слайд-агглютинации [120], набор CholeraeScreen для реакции коагглютинации [125], дот-блот-ИФА [152], флуоресцирующие иммуноглобулины [123, 134]. J.A. Hasan с соавторами в 1994 г. [134] создали набор для выявления V. cholerae О139, включающий реагенты для реакции коагглютинации и прямой иммунофлуоресценции. Препараты МКА, меченные ФИТЦ, отличались высокой специфичностью и чувствительностью: могли выявлять холерные вибрионы О139 серогруппы в низкой концентрации. С целью идентификации V. cholerae О139 другими исследователями (F. Qadri et al., 1994) был разработан моноклональный диагностикум для реакции коагглютинации, чувствительность этого теста составила 92%, а специфичность - 100% [145]. Ими же в 1995 году был предложен Бенгал-СМАРТ тест, предназначенный для быстрого обнаружения холерных вибрионов О139 в стуле больных, и повышена его чувствительность до 100% [144]. В 1996 г. T. Ramamurthy et al. [146] предприняли попытку одновременного применения моно- и поликлональных антител в ИФА для выявления в клинических образцах холерного токсина (ХТ) V. cholerae O139, что обеспечило существенное повышение точности и скорости серологического анализа. Этот принцип для постановки ИФА был использован в 2007 г. U. Tuteja et al. [154], которые разработали простой, специфичный и быстрый двухщуповый ИФА на основе кроличьих поликлональных сывороток к двум рекомбинантным антигенам (r-белкам - субъединице В холерного токсина) и мышиных МКА к r-белкам и белку внешней мембраны W (OmpW). Кроличьи поликлональные сыворотки наносили раздельно на кончики нитроцеллюлозных мембран с двух сторон нитроцеллюзной полоски в качестве связывающихся с антигеном антител и смесь двух МКА использовали для выявления этих антител.

Тест был специфичным для штаммов V. cholerae O1, V. cholerae O139, V. cholerae не О1/не О139 и не давал перекрстных реакций со штаммами близкородственных бактерий. Сделан вывод, что двухщуповый ИФА с МКА может использоваться для одновременного выявления токсигенных и нетоксигенных штаммов V. cholerae в клинических образцах и пробах воды.

В настоящее время в зарубежных публикациях описаны биосенсоры прямого действия на основе МКА к ЛПС с латеральным потоком для одновременной детекции V. cholerae О1 и О139 серогрупп в щелочной пептонной воде [156]. Анализ основан на иммунохроматографическом принципе, в соответствии с которым реакция антиген-антитело должна приводить к скоплению золотых наночастиц и к появлению красной линии на тестируемой полоске. Использование в биосенсоре сухого реагента и принципа "дипстик" обеспечивает простоту применения, быстрое получение результатов, которые можно увидеть невооруженным глазом, а также хранение, не требующее холодовой цепочки.

Вышеизложенное свидетельствует о том, что за рубежом моноклональные реагенты положительно зарекомендовали себя, не уступают поликлональным по чувствительности, а по специфичности и активности превосходят в несколько раз.

В России работы по получению и созданию набора стабильных гибридомпродуцентов МКА к антигенным детерминантам возбудителей особо опасных инфекций целенаправленно были начаты в 90-е годы прошлого столетия.

Сведения о холерных моноклональных препаратах, имеющих диагностическую значимость, появились в 1988 году в публикациях Л.П. Алексеевой с соавторами [5, 8, 28]. В начале 90-х годов С.Н. Бабицын в диссертационной работе [20] описал получение эритроцитарного диагностикума и ИФА тест-системы на основе МКА, направленных к различным эпитопам холерного энтеротоксина.

Высокая чувствительность (20 нг/мл для эритроцитарного диагностикума и 0,1 – 10 нг/мл для ИФА) и специфичность препаратов позволяла обнаружить токсин в различных объектах и оценивать эпидемическую значимость штаммов холерного вибриона. О.С. Бурлаковой [29, 30] показана возможность использования МКА к О-антигену V. cholerae О1 для конструирования коагглютинационных и иммунофлуоресцентных диагностикумов. Сотрудники института «Микроб» (1997 г.) для экспресс-диагностики токсигенных штаммов V. cholerae предложили использовать МКА к В-субъединице ХТ в дот-иммуноанализе, который показал высокую чувствительность (2,4106 – 4,9106 микробных клеток/мл, что соответствует 16 нг/мл ХТ), оперативность и простоту технического исполнения.

Специфичность ДИА была подтверждена отрицательной реакцией при изучении цельных клеток, лизатов, а также культуральной жидкости 35 штаммов гетерогенных микроорганизмов и 6 vct- штаммов V. cholerae не О1 группы [38, 39]. Но сложившаяся в науке ситуация (1995 – 2002 г.) в силу объективных и субъективных причин отодвинула на многие годы работы по конструированию и внедрению в практическое здравоохранение препаратов на основе МКА.

Однако работы продолжались по пути улучшения диагностических препаратов за счет оптимизации получения поликлональных сывороток. Так, с целью исключения этапа адсорбции, снижающего титр специфических иммуноглобулинов, Б.Л. Мазрухо и Е.В. Ишина (1998 г.) использовали в качестве иммуногена химически изолированные антигены. Ими были получены сыворотки к клеточным оболочкам штамма О139, на основе которых разработали коагглютинирующий диагностикум [71]. В работе В.А. Федоровой с соавторами (2001 г.) [106] использованы следующие методики выделения О-антигена V.

cholerae О139: 1) метод A. Boivin et al. (1933 г.) – экстрагирование с помощью ТХУ - О-AgB; 2) метод М.Н. Джапаридзе с соавт. (1996 г.) - высаливание 25 - 50% сульфатом аммония из бесклеточных культуральных супернатантов, обработанных формальдегидом – О-AgD; 3) термическое выделение антигена – ОAgН. Ими установлено, что антитела к первым двум антигенам были абсолютно специфичны к холерным вибрионам О139 серогруппы в отличие от сыворотки к О-AgН. Е.Г. Абрамова с соавт. (2002 г.) разработали диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины для идентификации V. cholerae О139 на основе кроличьей сыворотки, полученной иммунизацией препаратом О-антигена из культуральной жидкости (КЖ) [4]. Позже авторами (2004 г.) было показано, что этот диагностикум можно успешно использовать и в других методах: в прямом и непрямом вариантах ДИА, ТИФА и в слайд-агглютинации [2, 3]. В частности, активность флуоресцирующих иммуноглобулинов О139 в непрямом 1,5107 ДИА составила 1:4000, а чувствительность м.к./мл. Затем флуоресцирующие иммуноглобулины конъюгировали с пероксидазой и применяли в прямом варианте ДИА, что позволило значительно ускорить получение результатов. Активность их составила 1:500 1:1000, а чувствительность - 7,8106 м.к./мл. При постановке прямого и непрямого вариантов ИФА активность "двойного" конъюгата составила 1:4000 - 1:8000, а чувствительность 1109 - 5108 м.к./мл. Перекрстные реакции отмечены только в низких титрах (1:16). Проведенные исследования свидетельствуют о возможности использования флуоресцирующих иммуноглобулинов О139 для детекции холерных вибрионов "Бенгал" не только методом иммунофлуоресценции, но и в непрямых вариантах ИФА, ДИА и в реакции слайд-агглютинации [3].

Т.В.Аленкина с соавторами (2007 г.) предложили схему получения сыворотки в 3 раза короче той, что была предложена ранее разработчиками поликлональных флуоресцирующих препаратов. Затем эту схему авторы рекомендовали для серийного производства иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих холерных О139 адсорбированных кроличьих сухих. В настоящее время этот препарат прошел все этапы Государственных приемочных испытаний и может быть применен в практическом здравоохранении [13, 14], но следует иметь в виду, что удаление неспецифических антител путем неоднократной адсорбции близкородственными микроорганизмами сопровождается значительными потерями специфических Ig и соответственно отражается на качестве препарата.

С целью привлечения ИФА тест-систем в диагностику холеры Т.Л. Захарова с соавторами в 2008 г. [45] предложили многокомпонентную тест-систему, представляющую собой модифицированный вариант ДИА и состоящую из набора шести очищенных протективных антигенов (холерный токсин, его Всубъединица, токсин-корегулируемые пили адгезии (ТКПА), антигены О1 серовариантов Инаба и Огава, О139 антиген) и шести специфичных поликлональных антисывороток к ним. Несмотря на специфичность (отсутствие перекрестных реакций) и достаточную чувствительность (ТКПА, ХТ, Всубъединица – 0,3 мкг/мл; О1- и О139-антиген – 0,14 - 0,16 мкг/мл), вопрос о ее широком применении остается открытым.

Из вышеизложенного очевидно, что существует потребность в серологических методах, отличающихся высокой специфичностью, чувствительностью, эксрессностью, простотой выполнения. Начиная с 2000 г.

исследования в этом направлении были продолжены путем привлечения достижений гибридомной технологии. В лаборатории гибридом Ростовского противочумного института были выведены стабильные гибридомы, продуцирующие МКА к V. cholerae О139 (2002 г.). Оценка их активности в реакциях агглютинации, ИФА, дот-ИФА, РНИФ на всей коллекции штаммов холерного вибриона О139, имеющейся в институте, показала их строгую специфичность и отсутствие перекрестных реакций с антигенно-близкими микроорганизмами [9, 10]. Также в РостНИПЧИ (2003 г.) для выявления V.сholerae О139 были получены экспериментальные образцы люминесцирующих моноклональных иммуноглобулинов, отличающихся строгой специфичностью и отсутствием перекрестных реакций с представителями гетерологичных микроорганизмов. Содержание холерных вибрионов в пробах, подлежащих тестированию, должно быть не ниже 1105 – 106 м.к./мл. [12]. В диссертации О.С.Чемисовой (2006 г.) описаны МКА к ЛПС V. cholerae О139, на основе которых были начаты работы по созданию экспериментальных серий флуоресцирующих препаратов [112].

В институте «Микроб» проводились работы по конструированию иммуноферментных тест-систем с использованием МКА. Так, в диссертации Н.Е. Терешкиной (2004 г.) описано создание на основе разноэпитопных МКА и поликлональных антител к ЛПС V. cholerae О139 экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции возбудителя холеры независимо от наличия у него капсулы [102]. Н.А. Сырова в своей работе (2005 г.) показала преимущества применения разработанных высокочувствительных ТИФА (0,3 – 0,5 мкг/мл), включая ДИА (0,06 – 0,25 мг/мл), на основе мышиных МКА к типоспецифическим О-антигенам V. cholerae О1, выделенным химическим путем, для контроля их биосинтеза при производстве бивалентной химической вакцины [98]. В работе В.А. Федоровой с соавторами (2007 г.) описано конструирование экспериментальных иммуноферментных тест-систем с использованием МКА к V. cholerae О139, их чувствительность составила 2,3106 (непрямой вариант ТИФА) и 1,5105 - 1,2106 (прямой вариант ТИФА) [107]. В Ростовском противочумном институте О.В. Маркина (2008 г.) отработала и оптимизировала на основе МКА к холерному токсину иммуноферментный анализ двойных антител (ИФА-2АТ), который позволяет оценить токсинопродукцию штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп с чувствительностью метода 50 нг/мл [72]. В институте «Микроб»

Е.А.Михеева с соавторами (2012 г.) применили МКА для обнаружения холерного токсина в ДИА на ацетатцеллюлозной мембране [75]. В настоящее время в РостНИПЧИ проводятся работы по конструированию моноклональных пероксидазных конъюгатов для детекции V. cholerae О1 и О139 в прямом варианте ИФА [61].

Имеющиеся на сегодняшний день данные в отношении прямых и непрямых вариантов ИФА свидетельствуют об их перспективности и возможности включения в схему лабораторной диагностики холеры, разработки в этом направлении, безусловно, отвечают интересам практических лабораторий.

Начиная с 2000 г. в Государственном Научном Центре ФГУП «ГосНИИ биологического приборостроения» (г. Москва) ведутся работы в области создания отечественных иммунохроматографических (ИХ) тест-систем, чувствительность и специфичность которых повышается, если используются МКА. В ФГУН ГНЦ ПМБ была оценена возможность использования в ИХ тест-системах МКА, продуцируемых гибридомами, полученными в Ростовском противочумном институте. Проведенные экспериментальные исследования показали, что антитела сохраняют свою иммунохимическую активность после конъюгирования с коллоидным золотом, поэтому на их основе были разработаны ИХ-полоски [11, Результаты испытания полученных диагностикумов для выявления 21].

V. cholerae О1 показали, что их применение позволяет выявить холерные вибрионы О1 серогруппы, если их концентрация в исследуемых пробах будет не ниже 108 м.к./мл. В случае низкоагглютинабельных штаммов содержание вибрионов в пробах должно быть не менее 109 м.к./мл. Е.В. Баранова с соавторами [22] сконструировали на основе МКА, высокоспецифических к холерному токсину, предназначенный для обнаружения токсигенных штаммов V. cholerae диагностикум «Тест-полоска V. cholerae tox+». Однако следует отметить, что ИХ тест-полоски не лишены недостатков: сравнительно низкая чувствительность порядка 108 - 109 м.к./мл зависит от качества используемых антител и концентрации антигена в биоматериале. И.В. Шиленко с соавторами (2007 г.) увеличили чувствительность ИХ анализа, заменив подложку, пропитанную конъюгатом антител с коллоидным золотом, на подложку, содержащую конъюгат антител с люминесцирующими латексами. Разработанные таким методом индикаторные иммунохроматографические элементы (ИИХЭ) с люминесцентной детекцией для выявления холерного экзотоксина имели чувствительность, в 5 - раз превышающую чувствительность ИИХЭ на основе коллоидного золота [116, 118]. Однако набор реагентов для иммунохроматографической идентификации возбудителя холеры пока не внедрен в лабораторную диагностику. При этом ИХ тест-системы не могут быть использованы для исследования нативного материала.

Из современных технологий обращает на себя внимание и технология биомикрочипов. Так, в работе Е.С. Петровой с соавторами (2009 г.) описано создание тест-системы на основе специфичных к холерному токсину МКА в формате микрочипа и в планшетном варианте иммуноферментного анализа [80].

Предел обнаружения токсина достигает 0,2 нг/мл в планшетном формате ИФА и 0,44 нг/мл в формате микрочипа. Присутствие в пробах с холерным токсином молока, мясного бульона и воды из открытого водоема не снижает чувствительность методов. На основе биочип-технологии ФОСФАН (планшет с «напечатанными» на дне лунок иммуночипами) в «ГосНИИ биологического приборостроения» разработан комплект индикаторных средств для одновременного выявления в пробах возбудителей опасных инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной природы, а также ряда токсинов. Высокая чувствительность (не более 1000 молекул с микроплощадки 1000 квадратных микрон) и специфичность мультиплексного анализа позволяет обнаружить отдельные клетки микроорганизмов [33]. Применение современной технологии биомикрочипов дает точные результаты в сжатые сроки. Однако фактор достаточной сложности и высокой себестоимости анализа не позволяет использовать его практическими лабораториями, которым требуются высокочувствительные, специфичные и простые экспресс-методы.

Новым направлением по повышению диагностической значимости латексной агглютинации является система видеоцифровой регистрации, которую апробировали в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (г. Москва) [96]. При помощи сканерных систем (аппаратно-програмный комплекс «Эксперт-ЛабАгглютинация-Микро») получают точные количественные характеристики реакций, автоматическую интерпретацию результатов, а сохранение изображения аналитического объекта в памяти компьютера способствует формированию баз данных.

Перечисленные выше серологические реакции направлены на определение родовой, видовой и типовой принадлежности возбудителя холеры или его антигенов. Не менее важным с диагностической точки зрения является выявление в сыворотке крови больных, переболевших и вибриононосителей, а также вакцинированных специфических антител (агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела) при наличии набора известных антигенов. Такие серологические методы исследования, как правило, имеют дополнительное значение и лишь в отдельных случаях, при проведении оперативного и ретроспективного эпидемиологического анализа, их результаты могут быть решающими. На сегодняшний день остаются нерешенными вопросы, касающиеся оценки состояния антибактериального и антитоксического иммунитета.

Необходимо отметить, что коммерческие эритроцитарные диагностикумы выпускает «Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций имени Масгута Айкимбаева», поэтому применение их в отечественной практике ограничено. Препараты, которые позволяют составить представление об антитоксическом иммунитете, в настоящее время в России не выпускаются, хотя работы в этом направлении проводились в 2002 г. в Ставропольском противочумном институте И.В. Савельевой. Для фиксации холерного энтеротоксина ею использовались ганглиозидсодержащие липосомы. С помощью такого препарата (ЛХЭД) можно выявлять холерные антиэнтеротоксические антитела в реакции связывания комплимента начиная с 5 дня заболевания и в последующие 2 – 3 месяца [86, 87]. Полученная липосомальная диагностическая тест-система позволяет выявлять антитоксические антитела в титре 1:3200 – 1:6400 [88]. В Ростовском-на-Дону противочумном институте проводятся работы по созданию антигенного полимерного О1 и О139 холерного диагностикума для ретроспективной серологической диагностики холеры, выявления контактных с больными холерой в очагах инфекции и проведения эпидемиологического расследования [64, 65, 100]. Для сенсибилизации авторы использовали полиакролеиновые микросферы, применение которых более предпочтительно по сравнению с биологическими носителями. Разработчики отмечают, что аналогов подобных диагностикумов для обнаружения противохолерных антител за рубежом нет.

Вышеизложенное свидетельствует о том, что серологические методы исследования широко применяются в лабораторной диагностике холеры. Они позволяют выявлять возбудителя, фиксируя реакцию специфического взаимодействия антиген-антитело. Однако актуальным остается потребность практического здравоохранения в доступных методах. Если принять во внимание схему лабораторных исследований (МУК 4.2.2218-07), то наиболее востребованные в широкой лабораторной практике такие методы, как РА и МФА.

Отсюда очевидно, что приоритетными являются исследования, направленные на их усовершенствование или создание новых высокоспецифичных препаратов, доступных каждому звену лабораторной службы при эпиднадзоре и в случае возникновения эпидемического очага холеры.

40

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Лабораторные животные Для получения перитонеальных макрофагов, иммунных спленоцитов и асцитических жидкостей использовали инбредных мышей линии Balb/c и беспородных белых мышей массой 16 - 20 грамм в возрасте 6 – 10 недель.

2.2. Бактериальные штаммы В работе были использованы 90 штаммов V. cholerae О1, 40 штаммов V. cholerae О139, 100 штаммов V. cholerae не О1/не О139, 10 штаммов V. cholerae RO. С целью контроля специфичности препаратов МКА также использовали 12 штаммов V. parahaemolyticus, 4 – E. coli, 4 – Brucella spp., 4 – Salmonella spp., 108

– Aeromonas, 7 – Plesiomonas, 30 – Comamonas, 1 - V. mimicus, 1 - V. vulnificus.

Взвеси холерных вибрионов и гетерологичных микроорганизмов готовили в 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2±0,1) по стандартным образцам мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича 5 единиц (ОСО 42-28-86П) и 10 единиц (ОСО 42-28П), соответствующего года выпуска, эквивалентных концентрации 1109м.к./мл. Далее из 1 млрд. взвеси готовили мазки на тщательно обезжиренных стеклах по общепринятой методике. Для постановки ТИФА, ДИА, РП и иммунизации животных использовали бактериальные взвеси, обеззараженные кипячением в течение 30 минут.

Для оценки диагностических возможностей флуоресцирующих и агглютинирующих препаратов были использованы штаммы холерных вибрионов, выращенные в анаэробных условиях, в присутствии желчи (1% и 5%) и глицерина (10% и 15%).

В работе использовали препараты ЛПС V. cholerae О1 5879 (ЛПС О1) и V. cholerae О139 Р-16064 (ЛПС О139), которые разводили в ФСБ до концентрации 1 мг/мл. Отрицательным контролем являлся коммерческий препарат ЛПС E. coli 055:В5 (Fluka, Израиль).

2.3. Клеточные линии позвоночных 41 Для получения гибридом использовали мышиные миеломные линии NS0 и P3-X63/Ag8.653, которые не синтезируют собственные иммуноглобулины или их цепи, дефектны по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ), резистентны к 8-азагуанину и погибают в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ-среда) [74]. В качестве продуцентов специфических иммуноглобулинов дополнительно использовали гибридому-продуцент МКА О1 ГХ-F8/О1, депонированную ранее в «Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» Института Цитологии (г. Санкт-Петербург) под номером РККК (П) 386Д, и набор гибридом-продуцентов МКА О139, имеющийся в криохранилище Ростовского-на-Дону противочумного института.

2.4. Питательные среды и реактивы Миеломные и гибридомные клетки выращивали в CO2-инкубаторе (Nuaire) на среде RPMI-1640 («Sigma») и DMEM («Sigma») с добавлением 10 - 15 % сыворотки плода коровы («HyClone»), 2 мМ глутамина («Serva»), 120 мкг/мл гентамицина. Среды готовили из сухого порошка на деионизированной воде по инструкции изготовителя. Стерилизацию сред проводили фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм [74].

В работе использовали химические реактивы отечественного и импортного производства со степенью очистки – «х.ч.», «rein», «analytical grade» (таблица 1).

Таблица 1– Основные реактивы, использованные в работе № Реактивы Фирма-изготовитель п/п Пируват «Sigma», США

–  –  –

привести максимальное количество специфически активированных В-клеток в состояние, оптимальное для гибридизации.

В стерильных условиях извлекали селезенку иммунизированных мышей и 2.2.

измельчали ее с помощью гомогенизатора. Взвесь клеток переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 минут при 1000 об./мин.

Лимфоциты отмывали дважды средой RPMI-1640, затем осадок суспендировали в 5 мл среды без сыворотки и подсчитывали концентрацию в камере Горяева.

3. Подготовка миеломных клеток. Миеломные клетки в логарифмической фазе роста переносили из культуральных сосудов в центрифужные пробирки, центрифугировали 10 минут при 1000 об./мин. Осадок суспендировали в 5 мл среды без сыворотки и подсчитывали концентрацию в камере Горяева.

4. Проведение гибридизации:

Клетки миеломы ((10 – 12)106) смешивали с иммунными спленоцитами 4.1.

((30 – 60)106) в соотношении от 1:3 до 1:5. Суспензию тщательно перемешивали и центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 минут.

Смесь клеток отмывали один раз в 50-миллилитровой центрифужной пробирке.

Супернатант декантировали, полученный осадок осторожно встряхивали и 4.2.

медленно по каплям в течение 2 минут добавляли 1 мл 50% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) (1500; «Fluka»), следя за равномерным смешиванием жидкостей. Для разведения избытка ПЭГ к смеси прибавляли с интервалом в 2 минуты 1, 2, 4 и 8 мл бессывороточной среды RPMI-1640, добиваясь равномерного распределения клеток во всем объеме жидкости. Взвесь клеток центрифугировали 10 минут при 1000 об./мин.

После этого супернатант декантировали и осадок осторожно 4.3.

суспендировали в 40 мл полной ростовой среды (RPMI-1640 или ДМЕМ с добавлением 20% сыворотки плода коровы («HyClone»), 2 мМ глутамина («Serva»), 0,1 М пирувата натрия, 50х НАТ («Gibco»)).

5. Культивирование гибридом.

44

5.1. Суспензию слившихся клеток в полной ростовой среде разливали по 0,1 мл в четыре 96-луночных плоскодонных культуральных планшета на фидерный слой предварительно высеянных перитонеальных макрофагов мышей и инкубировали при 37оС в СО2-инкубаторе.

5.2. Наблюдение за ростом клонов осуществляли с помощью инвертированного микроскопа. Видимые колонии гибридных клеток появлялись на 7 – 10 день.

Гибридомы культивировали 14 дней на среде с НАТ («Gibco»), затем 7 – 10 дней на среде с НТ («Gibco»). После чего переводили на ростовую среду без селективных компонентов.

6. Скрининг гибридом. Культуральные жидкости гибридом отбирали для тестирования в ИФА - определение антителопродукции.

2.6. Клонирование гибридом Клонирование и реклонирование гибридных культур осуществляли методом предельных разведений [155], который на сегодняшний день является самым распространенным. Смысл его состоит в том, чтобы суспензию клеток развести в ростовой среде до такой концентрации, чтобы при пересеве клеток на планшет в каждой лунке оказалась бы одна гибридомная клетка. На практике этого достичь сложно: в одни лунки попадает две или более клеток, в другие не попадает вовсе.

Поэтому делали несколько разных разведений клеток, в первом из них брали 10 клеток на лунку, во втором – 5 клеток на лунку, в третьем – 1 клетка на лунку.

Затем приготовленные суспензии разливали по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета с фидерными клетками, панель помещали в СО2-инкубатор.

Образование клонов контролировали при помощи инвертированного микроскопа.

Лунки с одним растущим клоном осматривали особенно тщательно на предмет отсутствия в них вторых мелких и малозаметных клонов. Затем, когда клоны достигали достаточного для тестирования размера, проводили скрининг их супернатантов методом ИФА. Среди клонов, давших при тестировании положительный результат, отбирали самые продуктивные и здоровые на вид и повторяли процедуру клонирования. После второго клонирования все оттестированные клоны давали положительный результат, лучшие из них по 45 антителопродукции и ростовым свойствам отбирали для дальнейшей работы (накопление, заморозка и т.д.). В случае обнаружения несекретирующих клонов, что говорит о неустойчивости секреции антител, необходимо повторять клонирование, либо отказаться от дальнейшего использования этого клона.

2.7. Культивирование гибридом in vitro и in vivo Обычные условия культивирования гибридомных клеток - 37C и 5% СО2 (CO2-инкубатор «Nuaire»). Основа и состав питательных сред описаны в пункте

2.4. Культивирование клеток необходимо проводить в условиях, максимально приближенных к стерильным. Попавшие в культуру клеток бактерии и грибы, опережая гибридомы в скорости роста, быстро исчерпают питательные вещества ростовой среды и насытят ее своими токсинами, что приведет к гибели гибридомных клеток. Во избежание инфицирования пользовались стерильными средами и стерильной культуральной посудой, применяли антибиотики, а все манипуляции с клетками проводили в ламинарном боксе с принудительной подачей стерильного воздуха.

Массовая наработка гибридомных клеток после отбора позитивных клонов включала следующие этапы культивирования in vitro:

1. После покрытия клетками 2/3 поверхности дна 96-луночного планшета их аккуратно суспендировали и переносили в лунки объемом 2 мл, в которые предварительно за 24 ч были внесены перитонеальные макрофаги.

2. После разрастания гибридом их пересевали в чашки Петри и культуральные флаконы емкостью 50 - 100 мл (посевная доза 150 – 200 тыс. кл./мл).

Гибридомы необходимо поддерживать в логарифмической фазе роста и избегать повышения концентрации клеток выше 800 – 900 тыс. кл./мл. Замену ростовой среды проводили по мере ее закисления в результате роста клеток (каждые 2 - 3 дня).

Культивирование гибридных клеток in vivo проводили в организме беспородных и линейных мышей Balb/c, предварительно за 14 дней до введения гибридом праймированных пристаном (Sigma») в дозе 0,5 мл/мышь. Гибридомы вводили в культуральной среде внутрибрюшинно в количестве 10 7 клеток на 46 мышь [74]. Иммунную асцитическую жидкость собирали по мере формирования опухолей через 2 – 4 недели.

2.8. Криоконсервирование гибридом Гибридные клетки суспендировали в культуральной среде, определяли их концентрацию в тесте с трипановым синим и центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали до концентрации 107 м.к./мл в охлажденной среде для замораживания, содержащей 95 % сыворотки плода коровы («HyClone») и 5 % ДМСО. Суспензию клеток разливали по 1 мл в полипропиленовые ампулы, охлаждали на 1оС в минуту до –70оС и переносили в жидкий азот [16].

2.9. Подъем из жидкого азота гибридом При размораживании клеток ампулу помещали в водяную баню при 37оС, добавляли 10-кратный объем теплой культуральной среды, аккуратно перемешивали и центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 минут.

Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в среде, содержащей 15% сыворотки плода коровы («HyClone»), определяли их жизнеспособность и концентрацию в тесте с трипановым синим, разносили в лунки культуральных панелей [16].

2.10. Очистка специфических иммуноглобулинов Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных супернатантов гибридом и асцитических жидкостей мышей осуществляли преципитацией сульфатом аммония [16, 50, 148].

К охлажденным супернатантам медленно, постоянно перемешивая, добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до конечной концентрации 50%. Пробы оставляли на магнитной мешалке в холодильнике на 2 часа, после чего центрифугировали при скорости 4,5тыс.об/мин и +4C в течение 15 минут на центрифуге серии Allegra X-22 компании Beckman Coulter. Осадок иммуноглобулинов суспендировали в минимальном объеме, равном 1/10 исходного объема супернатанта, фосфатносолевого буфера (ФСБ) и диализовали против 500 - 1000 объемов ФСБ с 47 трехкратной сменой в течение 18 - 24 часов. Очищенные препараты иммуноглобулинов консервировали добавлением мертиолата или азида натрия до конечной концентрации 0,01%. После проверки титра антител препараты разливали по аликвотам и хранили при температуре –20оС.

2.11. Маркировка иммуноглобулинов ФИТЦ Конъюгацию специфических иммуноглобулинов с ФИТЦ осуществляли по методу [17, 50, 66] с некоторыми модификациями: концентрация белка не ниже 5 мг/мл, ФИТЦ - 5 мг на 100 мг белка, 10% КББ, рН реакционной смеси 9,0 (достигалась предварительным диализом раствора иммуноглобулинов против КББ). Процесс конъюгирования происходил при температуре 6 ± 2 °C в течение 18 ч или при комнатной температуре в течение 4 ч при постоянном перемешивании на магнитной мешалке.

Для удаления химически несвязанного белка от флуорохрома раствор флуоресцирующих антител диализовали против ФСБ с трехкратной сменой буфера в течение 24 часов или пропускали через колонку с сефадексом G-50, предварительно промытую ФСБ. На колонку сверху осторожно наслаивали флуоресцирующий конъюгат, подлежащий очистке от непрореагировавшего с белком флуорохрома. Для элюирования меченого белка из колонки применялся ФСБ. В процессе фильтрации в колонке появлялись 2 интенсивно окрашенные зоны: верхняя зона - непрореагировавший с белком свободный флуорохром, а нижняя - белок, связанный с ФИТЦ. На выходе из колонки белковую фракцию собирали с момента появления первых окрашенных капель и прекращали после прохождения через колонку всей интенсивно окрашенной нижней зоны.

2.12. Метод иммунофлуоресценции Различают прямую (РПИФ) и непрямую иммунофлуоресценцию (РНИФ) [50]. В основе прямой иммунофлуоресценции лежит реакция взаимодействия искомого антигена и видоспецифических флуоресцирующих иммуноглобулинов.

Непрямая иммунофлуоресценция позволяет обнаружить комплексы антигенов с предварительно нанесенными немечеными антителами с помощью антиглобулиновых конъюгатов.

РПИФ. На фиксированные мазки холерных вибрионов микропипеткой наносили по 30 мкл раствора флуоресцирующих моноклональных антител.

Препараты помещали во влажную камеру (чашку Петри с увлажненной ватой) при температуре 37C, не допуская высыхания нанесенного раствора антител.

Через 30 минут мазки промывали 2 раза по 5 минут в промывающем растворе (ФСБ) и 1 раз ополаскивали дистиллированной водой. Препараты высушивали на воздухе и просматривали под люминесцентным микроскопом с применением иммерсионного нефлуоресцирующего масла.

РНИФ. На первом этапе на фиксированные мазки холерных вибрионов микропипеткой наносили по 30 мкл раствора МКА. Препараты помещали во влажную камеру при температуре 37C, не допуская высыхания нанесенного раствора антител. Через 30 минут мазки промывали 2 раза по 5 минут в промывающем растворе (ФСБ) и 1 раз ополаскивали дистиллированной водой.

Препараты высушивали на воздухе. Второй этап – окраска специфического комплекса антиген–антитело люминесцирующей сывороткой против глобулинов мыши производства института им. Н.Ф. Гамалеи в течение 30 мин при 37C.

Затем окрашенные мазки так же промывали в ФСБ и в дистиллированной воде, высушивали и просматривали под люминесцентным микроскопом.

Результаты реакции в зависимости от степени яркости флуоресценции бактерий, «окрашенных» люминесцирующими иммуноглобулинами, оценивали по четырехкрестовой системе:

«4+» - сверкающая флуоресценция желтовато-зеленого цвета по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки;

«3+» - яркая флуоресценция по периферии микробной клетки;

«2+» - слабое свечение всей клетки;

«1+» - едва заметные контуры клетки.

Специфическим считается свечение с яркостью на «4+» и «3+», свечение с яркостью на «2+» или «1+» принято считать неспецифическим. Обнаружение светящегося ореола на 3+/4+ хотя бы у единичных клеток свидетельствует о наличии в исследуемом материале холерного вибриона [50].

49

2.13. Иммуноферментные методы Благодаря методической простоте, специфичности и высокой чувствительности широкое распространение получил твердофазный вариант ИФА (ТИФА). Его несложно модифицировать в «дот»-ИФА.

Постановку ТИФА осуществляли общепринятым методом [101] в 96луночных плоскодонных планшетах («Costar»). Процедура включала в себя следующие основные этапы:

1. Сенсибилизация микропланшетов антигеном (2 часа при 37C или 24 часа при 6 ± 2 °C), использовали миллиардную взвесь холерных вибрионов в дозе 10 7 – 108 микробных клеток на лунку.

2. Отмывка планшетов от не связавшегося с пластиком антигена ФСБ (рН 7,4) с добавлением 0,1 % Твин-20 (ФСБ - Т).

3. Внесение в лунки исследуемых антител, инкубация в течение 1 часа при 37 С.

4. Отмывка ФСБ – Т.

5. Внесение в лунки антимышиного пероксидазного конъюгата производства института им. Н.Ф. Гамалеи, инкубация 1 час при 37 С.

6. Отмывка ФСБ.

7. Внесение хромогенной смеси (5 мг ортофенилендиамина «Serva» растворяли в 10 мл 0,1 М натрий-цитратного буфера, рН 4,5 и добавляли 50 мкл 30 % Н2О2), инкубация при комнатной температуре в течение 20 минут в темном месте.

8. Остановка цветной реакции путем внесения 1М серной кислоты.

9. Учет реакции с помощью спектрофотометра при длине волны 492 нм и визуально.

Принцип ДИА аналогичен принципу ТИФА, но в качестве твердой фазы используется нитроцеллюлозная мембрана (НЦМ) с диаметром пор 0,2 мкм.

Схема реакции включала следующие этапы:

1. Нанесение на НЦМ («Schleicher&Schuelle») раствора антигена в количестве 105 – 106 микробных клеток на точку, высушивание.

2. Отмывка НЦМ от несвязавшегося антигена ФСБ - Т.

50

3. Блокирование свободных сайтов 1% БСА (30 мин на ротационном встряхивателе).

4. Инкубация НЦМ в растворе антител в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном встряхивателе.

5. Отмывка ФСБ - Т.

6. Инкубация НЦМ в растворе антимышиного пероксидазного конъюгата в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном встряхивателе.

7. Отмывка ФСБ.

8. Внесение хромогенной смеси. В качестве хромогена использовали 3,3диаминобензидин 4-гидрохлорид (ДАБ) («Serva»).

9. Остановка реакции (промывание дистиллированной водой).

10. Визуальный учет реакции. За положительный результат принимали четко окрашенные коричневые пятна.

2.14. Иммуноблоттинг Постановку иммуноблоттинга осуществляли, как описано H. Towbin et al.

(1984). Подвергнутые электрофоретическому разделению антигены переносили на НЦМ с диаметром пор 0,2 мкм («Schleicher&Schuell») в течение 1,5 ч при силе тока 55 мА с использованием буфера для переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицин и 20% метанол, рН 8,3), после чего мембраны высушивали. Свободные сайты НЦМ блокировали 1% раствором БСА при 37оС в течение 30 мин. После 3-кратной отмывки ФСБ - Т НЦМ инкубировали 1 час с препаратами МКА в рабочем разведении при 37оС. Затем мембрану отмывали и проявляли конъюгатом кроличьих антимышиных иммуноглобулинов с пероксидазой хрена (НИИЭМ им.

Н.Ф. Гамалеи). После 3-кратного отмывания НЦМ помещали в хромогенную смесь, в качестве хромогена использовали 3,3-диаминобензидин 4-гидрохлорид (ДАБ) («Serva»). Реакцию останавливали через 15 - 20 мин, ополаскивая блот дистиллированной водой [153].

2.15. Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони

Процедура включала в себя следующие основные этапы [143]:

51

1) Готовили 1 % агарозу («Serva») на ФСБ (рН 7,4) и разливали в чашки Петри так, чтобы получился слой равномерной толщины;

2) После застывания агарозы на определенном расстоянии друг от друга (5 мм) вырезали лунки диаметром 5 мм для антигена и антител и заполняли их соответствующими растворами. Два варианта внесения МКА: А) В центральную лунку вносили препарат МКА в рабочем разведении, а в периферические – антигены (взвеси изучаемых культур). Изучаемые культуры использовали в виде суточной агаровой взвеси в физиологическом растворе с концентрацией 10 - 30 млрд. м.к./мл, инактивированной нагреванием в течение 30 минут при 100оС. Б) Центральную лунку заполняли раствором антигена.

Для определения титра МКА готовили последовательные двукратные разведения иммуноглобулинов и равные объемы каждого из них вносили в лунки, расположенные по периферии.

3) Чашку помещали во влажную камеру и инкубировали при температуре 37 оС в течение 24 - 48 часов.

4) Предварительный учет реакции производили через 18 20 часов, окончательный – через 36 - 48 часов при просмотре на темном фоне в косопроходящем свете, направленном под углом 45о. При оценке результатов иммунодиффузии учитывали: расстояние, определяющее линию преципитации от центральной и периферической лунок; интенсивность и ширину полос преципитации; последнее разведение МКА, при котором еще можно видеть преципитат. При оптимальном соотношении антигена и МКА линия преципитации располагается почти посередине между лунками.

Количественное преобладание одного из реагентов сдвигает линию преципитации к лунке другого.

2.16. Реакция агглютинации РА на предметном стекле проводили по общепринятой методике. На обезжиренное спиртом предметное стекло наносили препараты МКА в рабочих разведениях. С агара Мартена или Хоттингера отбирали типичные колонии в Sформе. Бактериальной петлей равномерно смешивали исследуемую культуру 52 сначала с каплей 0,9% раствора натрия хлорида (контроль культуры на спонтанную агглютинацию), затем - с иммуноглобулинами моноклональными агглютинирующими. Для ускорения выпадения агглютината слегка покачивали стекло.

Учет реакции. Результаты реакции в зависимости от степени зернистости агглютинации, оценивали по четырехкрестовой системе:

- 4 креста - крупно- или мелкозернистая агглютинация при полном просветлении жидкости;

- 3 креста - крупно- или мелкозернистая агглютинация при легкой опалесценции жидкости;

- 2 креста - слабая агглютинация; осадочная жидкость непрозрачная;

- 1 крест - следы агглютинации; осадочная жидкость непрозрачная.

Реакция считается положительной при проявлении в течение 3 мин крупноили мелкозернистого агглютината на 3 - 4 креста, заметного на тмном фоне.

Реакцию на 1 - 2 креста считают отрицательной.

Реакция считается неспецифической, если агглютинат появляется позднее, чем через 3 мин после внесения культуры в каплю с агглютинирующими иммуноглобулинами или при наличии агглютината в контрольной реакции с 0,9% раствором натрия хлорида.

В контроле с 0,9% раствором натрия хлорида микробная взвесь должна быть гомогенной [73].

2.17. Методы статистической обработки результатов Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами [19], вычисляя среднеарифметические величины, их средние ошибки, доверительный интервал и достоверность различий по критерию Стьюдента. Результаты считали достоверными, если вероятность ошибки не превышала 0,05 (p0,05) по отношению к контролю.

53

ГЛАВА 3. ГИБРИДОМЫ-ПРОДУЦЕНТЫ МКА К АНТИГЕНАМ

V.CHOLERAE O1 И О139

3.1. Подъем из азота и оптимизация условий культивирования гибридом-продуцентов МКА, направленных к поверхностным эпитопам V.

cholerae О139 Из криохранилища были подняты полученные ранее гибридомы 3Е4, 3В5, 3А9, 2F6, 3E8, продуцирующие иммуноглобулины класса IgM, узнающие антигенные детерминанты в составе поверхностных структур V. cholerae О139 (МКА О139). Гибридомы с жизнеспособностью не ниже 60 - 70% успешно восстанавливались из условий глубокого замораживания. Далее проводили тестирование супернатантов клеточных культур методом ИФА из тех лунок, где гибридомы покрывали 2/3 поверхности дна. В процессе данной работы было установлено, что гибридомы 2F6 и 3E8 после выемки из азота утратили способность секретировать антитела. Только 3Е4, 3В5 и 3А9 сохранили антителопродукцию на исходном уровне, поэтому их неоднократно реклонировали с целью выявления высокопродуктивных. На рисунке 2 представлена эффективность реклонирования, которая составила 85 % для 3Е4, 80 % - 3В5 и 60 % - 3А9.

% реклонирования 50 40

–  –  –



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Похожие работы:

«CИЛИ ИВАН ИВАНОВИЧ УДК 621.341 ЭНЕРГОИНФОРМАЦИОННАЯ РАДИОИМПУЛЬСНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ И ЭЛЕКТРОННЫЕ СИСТЕМЫ УНИЧТОЖЕНИЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ КАРТОФЕЛЯ 05.11.17 – биологические и медицинские устройства и системы Диссертация на соискание научной степени кандидата технических наук Научный руководитель: Федюшко Юрий Михайлович доктор технических наук, профессор Мелитополь – 2015 СОДЕРЖАНИЕ...»

«Минаева Наталья Викторовна Отдаленные последствия высокодозной химиотерапии и аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами 14.01.21 – гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель...»

«Елизаров Николай Владимирович ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ГИПСА НА СВОЙСТВА СОЛОНЦОВ БАРАБИНСКОЙ НИЗМЕННОСТИ 03.02.13 – почвоведение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, Семендяева Н.В....»

«Миранцев Георгий Валерьевич МОРСКИЕ ЛИЛИИ НЕВЕРОВСКОЙ СВИТЫ ВЕРХНЕГО КАРБОНА МОСКОВСКОЙ СИНЕКЛИЗЫ: CИСТЕМАТИКА, МОРФОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ 25.00.02 Палеонтология и стратиграфия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, чл.-корр. РАН Рожнов Сергей Владимирович Москва – 2015 Оглавление ВВЕДЕНИЕ... стр. 4 Глава 1. История изучения...»

«Калинкин Дмитрий Евгеньевич ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ ГОРОДОВ В ЗОНЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРЕДПРИЯТИЙ АТОМНОЙ ИНДУСТРИИ 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание учной степени доктора медицинских наук Научный консультант: д-р мед. наук, профессор Тахауов Равиль Манихович Томск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«ВАСИЛЬЕВА ИРИНА ОЛЕГОВНА РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МЯСНОГО ПРОДУКТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОМПОЗИТА НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО КОЛЛАГЕНА И МИНОРНОГО НУТРИЕНТА 05.18.04 – Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов и биологических...»

«Жабина Виктория Юрьевна Экспериментальная и производственная оценка элективных питательных сред и дезинфектантов при туберкулезе крупного рогатого скота 06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата...»

«Гилёв Андрей Николаевич ЛАТЕРАЛИЗАЦИЯ ФУНКЦИЙ ПЕРЕДНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ У СУМЧАТЫХ (MAMMALIA: MARSUPIALIA) 03.02.04 – Зоология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Е. Б. Малашичев Санкт-Петербург – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»

«ХОАНГ ЗИЕУ ЛИНЬ ЭКОЛОГИЗАЦИЯ ЗАЩИТЫ КАПУСТНЫХ КУЛЬТУР ОТ ОСНОВНЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ ВРЕДИТЕЛЕЙ В УСЛОВИЯХ МОСКОВСКОГО РЕГИОНА Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попова Татьяна Алексеевна, кандидат биологических наук, доцент...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«Зотина Екатерина Николаевна КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА В АСИМПТОМАТИЧЕСКОЙ ФАЗЕ 14.01.21 – гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук,...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«ПЛОТНИКОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА ИНДИКАЦИЯ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ЭШЕРИХИОЗА ПТИЦ Специальность: 06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук...»

«ХУДЯКОВ Александр Александрович ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT В РАЗВИТИИ АРИТМОГЕННОЙ КАРДИОМИОПАТИИ НА МОДЕЛИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ И БИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск 201...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Чапуркина Оксана Викторовна ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДСТВА БАРАНИНЫ И УЛУЧШЕНИЕ ЕЕ КАЧЕСТВА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК «ЛАКТОФИТ» И «ЛАКТОФЛЭКС» 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель...»

«ШАЯХМЕТОВ МАРАТ РАХИМБЕРДЫЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ПОЧВЕННОГО ПОКРОВА ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ НА ОСНОВЕ ДИСТАНЦИОННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ ЗЕМЛИ 03.02.13 – почвоведение Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Л.В. Березин Уфа...»

«ФЕДИН Андрей Викторович КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИНОСИНУСИТОВ 14.03.09 – аллергология и иммунология 14.01.03 – болезни уха, горла и носа ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.