WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1, О139 СЕРОГРУПП УСКОРЕННЫМИ МЕТОДАМИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ КАЗЁННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

«РОСТОВСКИЙ-НА-ДОНУ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ»

ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ

ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи

КРЕТЕНЧУК ОКСАНА ФЕДОРОВНА

РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРНЫХ

ВИБРИОНОВ О1, О139 СЕРОГРУПП УСКОРЕННЫМИ МЕТОДАМИ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Л.П. Алексеева Ростов-на-Дону 2014 г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЖ – асцитическая жидкость БСА – бычий сывороточный альбумин ГАТ – селективная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин ДАБ – диаминобензидин ДИА – дот-иммунофементный анализ ДМСО – диметилсульфоксид ИФА – иммуноферментный анализ КББ – карбонат-бикарбонатный буфер КЖ – культуральная жидкость ЛПС - липополисахарид МКА – моноклональные антитела МФА – метод флуоресцирующих антител НАФ – неполный адъювант Фрейнда ОП – оптическая плотность ПАФ – полный адъювант Фрейнда ПЭГ – полиэтиленгликоль РА – реакция агглютинации РИФ – реакция иммунофлуоресценции РПИФ – реакция прямой иммунофлуоресценции РНИФ – реакция непрямой иммунофлуоресценции РП – реакция преципитации ТУ – технические условия ФИТЦ – флуоресцеинизотиоцианат ФСБ – фосфатно-солевой буфер

- штаммы со сниженной агглютинабельностью видовой О1 сывороткой

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………….

...

Гибридомная технология получения МКА………………………. 14 1.1.

Серологические методы исследования в лабораторной 1.2.

диагностике холеры………………………………………………...

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………… Лабораторные животные…………………………………………...

2.1.

Бактериальные штаммы…………………………………………....

2.2.

Клеточные линии позвоночных…………………………………… 40 2.3.

Питательные среды и реактивы…………………………………… 2.4.

Гибридизация клеток………………………………………….........

–  –  –

Оценка сохранности О-антигенных детерминант холерных 4.3.

вибрионов при различных способах инактивации………………. 73 Эпитопная направленность МКА О1 и О139…………………….. 77 4.4.

ГЛАВА 5. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ

НА ОСНОВЕ МКА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И

ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1 И О139

СЕРОГРУПП……………………………………………………………… 79 Оптимизация условий получения видоспецифических 5.1.

флуоресцирующих моноклональных препаратов для идентификации V. cholerae O1 и O139 ………………………………... 79 Наработка экспериментальных серий флуоресцирующих 5.2.

препаратов для испытания на широком наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов и подготовка нормативно-технических документов……………… 82 Лиофилизация флуоресцирующих МКА……………………….... 87 5.3.

Оценка серологической активности флуоресцирующих 5.4.

препаратов после лиофилизации и в процессе хранения………... 88

ГЛАВА 6. ПРИМЕНЕНИЕ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ МКА ДЛЯ

ИДЕНТИФИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1 И О139

СЕРОГРУПП В РЕАКЦИИ СЛАЙД-АГГЛЮТИНАЦИИ………….. 91 Исследование агглютинабельности МКА, выделенных из АЖ и 6.1.

КЖ, в реакции слайд-агглютинации……………………………… 91 Получение экспериментальных серий диагностических 6.2.

агглютинирующих МКА и их испытание на широком наборе штаммов…………………………………………………………….. 94 Стабильность лиофилизированных диагностических 6.3 агглютинирующих МКА при хранении…………………………... 98 Оценка возможности применения диагностических наборов для 6.4.

выявления холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, подвергнутых воздействию различных факторов……………….. 99 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………. 103 ВЫВОДЫ…………………………………………………………………... 113 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………... 115

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Первое десятилетие ХХI века отмечено крупными эпидемиями и вспышками холеры в странах Африки и Азии, а также Северной Америки с заносами инфекции из эндемичных очагов практически ежегодно на все континенты, с тенденцией к росту мировой заболеваемости, что определяет неблагоприятный прогноз и для России [77]. Поэтому в нашей стране постоянно проводятся мероприятия, направленные на предупреждение заноса и распространения этого особо опасного заболевания. Одной из важнейших составных частей эпидемиологического надзора за холерой является своевременная диагностика, эффективность которой зависит от наличия высокочувствительных и специфичных препаратов для серологического анализа.

Как отмечалось на 64-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения, трудность в борьбе с холерой вызвана недостаточным количеством диагностических экспресс-тестов для выявления холерных вибрионов и своевременного принятия мер, что определяет необходимость дальнейших научных исследований по разработке таких тестов.

В последние годы активно развиваются инновационные технологии по созданию рекомбинантных белков, в частности антител, получаемых с помощью молекулярно-генетических манипуляций. Благодаря разработке гибридомной технологии широкое распространение в лабораторной диагностике получили и моноклональные антитела (МКА). Уже первые МКА продемонстрировали уникальные преимущества перед поликлональными сыворотками: высокая специфичность и активность, стандартность, стабильность, возможность получения в неограниченном количестве. Очевидно, что МКА в силу своей уникальной направленности к индивидуальным антигенным детерминантам позволяют разработать на их основе препараты для серологической идентификации и дифференциации холерных вибрионов, отвечающие современным требованиям. Процесс замены поликлональных антител в диагностических наборах на моноклональные начался еще в начале 80-х годов и активно продолжается в настоящее время в направлении создания новых препаратов на основе МКА [37]. Зарубежные публикации, касающиеся использования МКА в серодиагностике холеры, появились еще в 1982 году, то есть намного раньше, чем отечественные. B. Gustafsson et al. получили МКА к коровой области ЛПС V. cholerae О1, которые выявляли в реакции слайдагглютинации антигенную детерминанту, общую для всех представителей вида V. cholerae [132]. Также этой группе авторов удалось получить МКА к A-, B- и Сантигенам О1, на основе которых были приготовлены V. cholerae флуоресцирующие препараты для экспресс-диагностики холерных вибрионов О1.

Позже другие зарубежные авторы сконструировали на основе МКА высокоэффективные тест-системы: для слайд-агглютинации [120], набор CholeraeScreen для реакции коагглютинации [125], дот-блот-ИФА [152], флуоресцирующие иммуноглобулины [123, 134]. J.A. Hasan с соавторами в 1994 г.

создали набор для выявления V. cholerae О139, включающий реагенты для реакции коагглютинации и прямой иммунофлуоресценции [134]. Несомненно, такие препараты эффективны и полезны как в случае ранней диагностики холеры, так и на различных этапах исследования. В России работы по получению и созданию набора стабильных гибридом-продуцентов МКА к антигенным детерминантам возбудителей особо опасных инфекций целенаправленно были начаты в 90-е годы прошлого столетия. В отечественной практике сведения о холерных моноклональных препаратах, имеющих диагностическую значимость, появились в 1988 году в публикациях Л.П. Алексеевой с соавторами [5, 8, 28, 30].

В диссертации О.С. Бурлаковой (1993 г.) показана возможность использования МКА к О-антигену V. cholerae О1 для конструирования коагглютинационных и иммунофлуоресцентных диагностикумов Для экспресс-диагностики [29].

токсигенных штаммов V. cholerae З.Л. Девдариани с соавторами в 1999 г.

предложили использовать МКА в дот-иммуноанализе [38]. В работе Н.Е. Терешкиной (2004 г.) описано создание на основе разноэпитопных МКА и поликлональных антител к ЛПС V. cholerae О139 экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции возбудителя холеры независимо от наличия у него капсулы [102]. С 2000 г. в Государственном Научном Центре ФГУП «ГосНИИ биологического приборостроения» (г. Москва) ведутся работы в области создания отечественных иммунохроматографических тест-систем, чувствительность и специфичность которых повышается, если используются МКА. В ФГУН ГНЦ ПМБ была оценена возможность использования в иммунохроматографических (ИХ) тест-системах МКА, продуцируемых гибридомами, полученными в Ростовском противочумном институте. Проведенные экспериментальные исследования показали, что антитела сохраняют свою иммунохимическую активность после конъюгирования с коллоидным золотом, поэтому на их основе были разработаны ИХ-полоски [11].

Результаты испытания полученных ИХ тест-систем для выявления V. cholerae О1 показали, что их применение позволяет выявить холерные вибрионы О1 серогруппы, если их концентрация в исследуемых пробах будет не ниже 108 м.к./мл. В случае низкоагглютинабельных штаммов содержание вибрионов в пробах должно быть не менее 109 м.к./мл. Е.В. Баранова с соавторами (2010 г.) сконструировали на основе МКА, высокоспецифических к холерному токсину, предназначенный для обнаружения токсигенных штаммов V. cholerae диагностикум «Тест-полоска V. cholerae tox+» [22]. Однако следует отметить, что ИХ тест-полоски не лишены недостатков: сравнительно низкая чувствительность порядка 108 - 109 м.к./мл зависит от качества используемых антител и концентрации антигена в биоматериале. Экономически затратным является и производство ИХ полосок, так как их себестоимость в итоге получается достаточно высокой. Из современных технологий обращает на себя внимание технология биомикрочипов. Так, в работе Е.С. Петровой с соавторами [80] описано создание тест-системы на основе специфичных к холерному токсину МКА в формате микрочипа и в планшетном варианте иммуноферментного анализа. Предел обнаружения токсина достигает 0,2 нг/мл в планшетном формате ИФА и 0,44 нг/мл в формате микрочипа. Присутствие в пробах с холерным токсином молока, мясного бульона и воды из открытого водоема не снижает чувствительность методов. Применение современной технологии биомикрочипов дает точные результаты в сжатые сроки. Однако сложная технология приготовления наряду с высокой себестоимостью анализа ограничивает возможность их использования практическими лабораториями, которым требуются высокочувствительные, специфичные и простые экспресс-методы. На сегодняшний день в лабораторной диагностике холеры согласно МУК 4.2.2870-11 используются лошадиные агглютинирующие О1-сыворотки, иммуноглобулины О1 флуоресцирующие и кроличья агглютинирующая О139-сыворотка производства института «Микроб». Однако существующие препараты не отвечают в полной мере современным требованиям, так как обладают рядом недостатков: разнородность и гетерогенность популяций антител, низкие титры специфических иммуноглобулинов, наличие перекрестных реакций. Применение агглютинирующих МКА позволит исключить перекрестные реакции с представителями холерных вибрионов не О1/не О139, среди которых увеличивается число штаммов, агглютинирующихся холерной сывороткой О1 в низком титре [70]. Проблема повышения качества диагностических препаратов и, как следствие, повышение достоверности лабораторной диагностики холеры была и остатся в центре внимания специалистов. В институте «Микроб» в последние годы разработан новый диагностический препарат для выявления холерных вибрионов О139 с помощью прямого метода иммунофлуоресценции [13, 14]. В технологии предусмотрено получение кроличьей сыворотки путем иммунизации убитыми клетками вибрионов и для удаления неспецифических антител необходима неоднократная адсорбция близкородственными микроорганизмами, что сопровождается значительными потерями специфических иммуноглобулинов и соответственно отражается на качестве препарата.

Несмотря на неоднократную адсорбцию, не удается избавиться от антител, обеспечивающих перекрестную активность с V. cholerae О22. Одним из перспективных направлений является создание на основе МКА флуоресцирующих и агглютинирующих препаратов для выявления V. cholerae О1 и О139, так как в ряду других иммунодиагностических тестов, предназначенных для ранней диагностики холеры, эти методы обладают рядом преимуществ: экспрессность анализа и простота исполнения.

В связи с вышеизложенным, исследования, направленные на совершенствование и разработку новых холерных иммунодиагностикумов, не утратили своей актуальности и практической значимости.

Цель исследования – совершенствование лабораторной диагностики холеры путем конструирования диагностических препаратов на основе МКА для идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в реакциях прямой иммунофлуоресценции и слайд-агглютинации.

Задачи исследования:

1. Расширить спектр имеющихся гибридом за счет получения новых, продуцирующих МКА к видоспецифическим эпитопам холерных вибрионов О1 серогруппы, охарактеризовать их изотип, направленность, аффинность, наличие перекрестной активности внутри вида, рода.

2. Получить в препаративных количествах видоспецифические МКА, провести их очистку с помощью различных методов, оценить их специфическую активность в реакциях непрямой иммунофлуоресценции, слайд-агглютинации, преципитации и иммуноферментном анализе.

3. Разработать на основе охарактеризованных МКА биотехнологическую схему получения флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для выявления V. сholerae О1 и О139 в реакции прямой иммунофлуоресценции, наработать экспериментальные серии препаратов в лиофилизированном виде.

4. Изучить агглютинирующие свойства видоспецифических МКА О1, МКА О139, выделенных из культуральных и асцитических жидкостей, в реакции слайд-агглютинации на наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов, отобрать диагностически значимые агглютинирующие МКА.

5. Провести лабораторные испытания экспериментальных серий видоспецифических флуоресцирующих и агглютинирующих МКА О1, МКА О139, оформить нормативную документацию для их государственной регистрации.

Научная новизна. Набор видоспецифических гибридом, которыми располагает лаборатория, расширен за счет получения новых, продуцирующих МКА, направленные к детерминантам О-антигена ЛПС V. сholerae О1. На основании иммунохимического анализа штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп установлены диагностически значимые МКА, отличающиеся тем, что они выявляют консервативные эпитопы ЛПС с высокой плотностью представленные на клеточной поверхности, пространственно расположенные так, что при взаимодействии с антителами не возникает стерических помех.

Установление эпитопов, в меньшей степени подверженных модификации и утрате при воздействии различных факторов, способствует повышению диагностической ценности препаратов.

Впервые показана возможность использования в качестве полноценного источника МКА для изготовления препаратов не только асцитической, но и культуральной жидкости, которая в больших объемах накапливается при пассировании гибридом-продуцентов in vitro.

Отработана и оптимизирована технология изготовления моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. сholerae О1 и О139, заключающаяся в выделении активной фракции иммуноглобулинов сульфатом аммония, обессоливании диализом, выборе оптимального соотношения флуорохрома и МКА, стабилизации конъюгатов путем лиофильного высушивания.

Теоретическая и практическая значимость работы. Набор гибридом, стабильно продуцирующих видоспецифические МКА О1 и О139, является источником стандартных моноклональных иммуноглобулинов, на основе которых сконструированы диагностические препараты нового поколения.

Разработана экспериментально-производственная технология изготовления моноклональных флуоресцирующих конъюгатов для диагностики холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в реакции прямой иммунофлуоресценции.

Создан диагностический набор агглютинирующих МКА для идентификации и дифференциации V. сholerae О1 и О139 в реакции слайд-агглютинации. По результатам проведенных исследований оформлен комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению, справку об изделии медицинского назначения и технические условия на наборы реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические флуоресцирующие сухие для серологической идентификации V. cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РИФ «Иг - V. cholerae О1/О139 – РИФ» и «Иммуноглобулины моноклональные диагностические cухие для серологической идентификации V. cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РА «ИГ –V. cholerae О1/О139 — РА», которые в настоящее время находятся на регистрации в Росздравнадзоре.

На гибридомы, стабильно продуцирующие МКА к видоспецифическим эпитопам возбудителя холеры О1 и О139, получены два патента на изобретение №2425874 от 13.04.2010 «Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител, специфичных к О-антигену холерных вибрионов О1 серогруппы» и №2425875 от 07.06.2010 «Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител, специфичных к ЛПС холерных вибрионов О139 серогруппы».

Экспериментальные серии флуоресцирующих МКА О1 и МКА О139 были использованы при выполнении кандидатской диссертационной работы Куликаловой Е. С. на базе ФГУЗ «Иркутского научно-исследовательского противочумного института». Разработанные наборы используются при выполнении научно-исследовательских работ во ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, в работе СПЭБ, также для оценки качества препараты в коммерческом виде переданы в Волгоградский и Ставропольский противочумные институты, в ГНЦ ПМБ (г. Оболенск).

Методология и методы исследования. В работе использованы различные методы исследования: микробиологические (культивирование штаммов микроорганизмов), гибридомная технология, методы иммунохимии (ИФА, РИФ, слайд-агглютинация, преципитация, иммуноблот), биохимические и микроскопические.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Набор гибридом-продуцентов обеспечивает получение диагностически значимых, стандартных, воспроизводимых МКА, узнающих видоспецифические эпитопы О-антигена холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, позволяет конструировать диагностические препараты нового поколения.

2. Видоспецифические МКА выявляют консервативные эпитопы ЛПС, с высокой плотностью представленные на клеточной поверхности вибрионов и в меньшей степени подверженные модификации или утрате при воздействии различных факторов, что способствует повышению диагностической ценности препаратов.

3. Для создания диагностических препаратов впервые использована культуральная жидкость, являющаяся полноценным источником иммуноглобулинов, получение которой не требует привлечения лабораторных животных.

4. Разработанная биотехнологическая схема экспериментальнопроизводственного изготовления холерных О1, О139 флуоресцирующих иммуноглобулинов позволяет получать препараты, характеризующиеся высокой специфичностью и чувствительностью.

5. Набор диагностических агглютинирующих МКА без дополнительной постановки развернутой реакции агглютинации обеспечивает выявление холерных вибрионов О1, О139 серогрупп.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на научных конференциях: проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» (г. Ростов-на-Дону, 2009 - 2013 г.); научно-практическая конференция «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных природноочаговых болезней», посвященная 75летнему юбилею ФГУЗ Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока (г. Иркутск, 2009 г.); конференция молодых ученых ФГУЗ РостНИПЧИ (г. Ростов-на-Дону, 2011 г.); Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора с международным участием:

«Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения»

(г. Пермь, 2012 г.). Диссертационная работа выполнена в рамках государственной темы № 121-4-10 «Создание видоспецифических моноклональных препаратов для идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп с помощью тестов слайд-агглютинации, прямой иммунофлуоресценции и иммунохроматографии (2010 – 2014)» (номер государственной регистрации 01200907528).

Личный вклад соискателя. Основные разделы диссертационной работы выполнены О.Ф. Кретенчук самостоятельно на базе группы гибридом Ростовского-на-Дону противочумного института. Разработка идей, постановка научных задач, методическая часть работы, конструирование препаратов, получение научных результатов и их обоснование были выполнены автором под руководством д.б.н., профессора Л.П. Алексеевой.

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, 5 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК. Получены 2 патента на изобретение №2425874 (13.04.2010 г.) и №2425875 (07.06.2010 г.) План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора (протокол №8 от 19.06.2012 г.) Структура диссертации.

Работа изложена на 134 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 156 источников, в том числе зарубежных – 37. Диссертация иллюстрирована 21 рисунками и 19 таблицами.

14

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гибридомная технология получения МКА 1.1.

История развития гибридомной технологии является примером стремительного проникновения идей и методов фундаментальной науки в прикладные области исследований и производственную сферу. Гибридизация соматических клеток, зародившись как метод исследования в области клеточной биологии, становится вс более значимой областью биотехнологии.

Гибридомы как продуценты моноклональных антител заданной специфичности были открыты в 1975 г. G. Kohler, C. Milstein [137]. Гибридные клетки, продуцирующие иммуноглобулины и антитела известной специфичности были описаны и ранее, например, в 1969 г. S. Sinkovics из отдела клинической вирусологии и иммунологии университета в Техасе сделал сообщение о спонтанном получении гибридных клеток между лимфоцитами и плазматическими клетками лейкозных мышей [150]; в 1971 г. B. Mohin опубликовал работы по продукции иммуноглобулинов гибридами, образованными клетками миеломы и лимфомы мышей [142]. Но ни одно из сообщений не привело к скачку в развитии этой отрасли науки [24]. Методика Келера и Мильштейна решила одну из основных проблем, которую иммунологи пытались решить на протяжении многих лет, - проблему длительного воспроизводства больших количеств гомогенных антител к разнообразным антигенам [76]. Именно они, предварительно введя в организм антиген и вызвав таким образом иммунный ответ, извлекли лимфоидные клетки, продуцирующие соответствующие антитела, и объединили их с клетками опухоли (миеломы). В результате получился непрерывно делящийся клеточный гибрид (гибридома), способный синтезировать антитела с заданной специфичностью. Гибридома унаследовала от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой – бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту [25]. Продуцировать антитела способны только единичные гибридомы, которые и отбирают после тестирования (рисунок 1).

–  –  –

Тестирование (ИФА) Положительный ответ Отдельный Отдельный гибридный клон гибридный клон Положительный Отрицательный Рисунок 1 – Скрининг клеток, вырабатывающих моноклональные антитела Антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток, стали называть моноклональными за их происхождение. Но понятие моноклональности существовало в иммунологии давно. Так в понимании Ф. Бернета [85], одна клетка иммунной системы продуцирует антитела только против одного антигена, то есть иммунная система клонирована по антигену. И то, что моноклональность гибридомных антител (физическая моноклональность) в подавляющем большинстве случаев совпадает с моноклональностью в понимании Бернета (антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток одинаковы), явилось блестящим экспериментальным подтверждением клонально-селекционной теории иммунитета. МКА, продуцируемые одной гибридомой, абсолютно идентичны друг другу по всем параметрам, они взаимодействуют только с одной из представленных в структуре антигена детерминантой. В клинической практике с такими антителами сталкиваются при миеломной болезни. У больных миеломой около 95 % иммуноглобулинов сыворотки крови вырабатываются одним злокачественно трансформированным клоном плазматических клеток. К МКА относят и белки Бенс-Джонса – димеры легких цепей иммуноглобулинов, часто обнаруживаемые в большом количестве в моче больных миеломой [78]. Что касается препаратов, то до гибридомной технологии в иммунологии не было специфических антител такой степени гомогенности.

После публикации известной статьи в 1975 г. метод гибридизации претерпел существенные изменения. Многочисленна и многообразна литература, посвященная способам получения МКА, что свидетельствует о важности методической части гибридомной технологии, которая состоит из следующих этапов: получение линий опухолевых клеток, иммунизация доноров селезеночных клеток, слияние клеток, селекция гибридом, выявление позитивных культур и их клонирование.

Большинство полученных к настоящему времени гибридом – мышиные по происхождению, потому что мыши являются наиболее доступным источником миеломных клеточных линий, а гибридомы «мышь-мышь» более стабильны и секретируют больше антител, чем межвидовые. Также получают гибридомы крыс, а менее успешно – гибридомы человека [16, 44, 52]. Хотя если мы говорим о терапии с помощью МКА, то мышиные антитела зачастую распознаются иммунной системой человека. Развивающийся при этом иммунный ответ приводит к снижению эффективности вводимых препаратов из-за связывания их с антителами, вырабатываемыми в ходе ответной реакции. Для решения этой проблемы проводят работы по конструированию химерных и гуманизированных антител, имеющих большие преимущества в качестве терапевтических и диагностических препаратов. Для создания химерного антитела константную часть мышиных антител замещают соответствующей константной областью иммуноглобулина человека. Как известно, в константных доменах находится большая часть антигенных детерминант, с которыми связаны основные эффекторные функции (взаимодействие с Fc-рецепторами, системой комплемента и др.), поэтому использование химерных иммуноглобулинов мышь/человек обусловливает нормальное их взаимодействие с иммунной системой человека при сохранении специфичности и сродства к антигену мышиных моноклональных антител. Что касается гуманизированных антител, то для их создания в иммуноглобулинах человека заменяют только аминокислоты, образующие взаимодействующую с антигеном зону (гипервариабельные регионы), на соответствующие аминокислоты мышиного антитела [25]. Такие антитела практически не вызывают в организме человека специфического иммунного ответа.

Важный этап получения гибридом, можно сказать самый «творческий» подготовка иммунных спленоцитов. Успех иммунизации зависит от ряда факторов: свойств иммуногена, природы антигена, генотипа животного. Для получения высокого титра антител должна быть оптимизирована схема иммунизации. Если речь идет о мышах, то могут быть использованы животные в возрасте 3 – 4 месяцев любого пола. Существуют два основных способа иммунизации [91, 105, 128]:

1) in vivo:

а) короткая схема – введение антигена дважды с двухнедельным интервалом в подушечки задних лапок (антиген+ПАФ, антиген+НАФ);

б) длинная схема – введение антигена с интервалом 2 – 4 недели внутрибрюшинно или подкожно, реже внутривенно или орально (первый этап антиген+ПАФ, последующие - антиген+НАФ) [122].

Важным моментом является то, что спустя неделю после заключительной иммунизации необходимо провести тестирование крови на наличие нужных антител. Обычно иммунизируют ряд животных и выбирают селезенки тех мышей, у которых самый высокий титр антител.

Заслуживает внимание и внутриселезеночная инъекция антигена, разработанная M. Spitz et al. Ее применяли с успехом при получении МКА к различным вирусным антигенам, но в этом случае, как правило, наблюдается образование гибридом к поверхностным антигенам и не всегда гибридизация дает высокую эффективность [127, 151].

2) in vitro:

а) преимущества – 1) сокращение сроков иммунизации до 4 – 5 дней;

2) непосредственный контакт антигена с иммунокомпетентными клетками, минуя барьеры живого организма; 3) возможность контролировать эффективность иммунного ответа;

б) недостатки – 1) стерильность используемого антигена; 2) наличие качественной культуральной среды и биологически активных иммунофакторов.

Особое значение придается иммунизации in vitro при получении гибридом на основе лимфоцитов человека из-за запрета на иммунизацию in vivo.

Каждый из методов имеет недостатки, поэтому исследования по вопросу введения антигена являются актуальными и направлены в основном на сокращение сроков иммунизации при высоком выходе стабильных гибридом заданной специфичности. Следует отметить, что применяется сейчас и ДНКиммунизация, которая эффективна в тех ситуациях, когда белок оказывается малодоступным [90].

Еще одним направлением развития гибридомной технологии стало создание клеточных линий плазмоцитом, лишенных способности продуцировать иммуноглобулины и их фрагменты. Сейчас выведено множество линий плазмоцитом, наиболее широкое распространение получили мышиные миеломы в основном генотипа BALB/с. Существует ряд критериев для выбора опухолевой линии клеток в качестве партнера для слияния [24, 105]:

1. Природа клеток должна быть такова, чтобы объединение их хромосом с хромосомами лимфоцитов не приводило к нарушениям биосинтеза антител (генетически и эпигенетически родственные клетки);

2. Клетки должны легко расти в культуре (возможность in vitro пролиферировать на минимальных средах), иметь время генерации около 12 часов;

3. Способность опухолевых клеток расти в брюшной полости сингенных животных, что даст возможность гибридным клеткам накапливать большие объемы МКА в виде асцитов;

4. Высокая гибридизуемость клеток – каждая сотая клетка из общей смеси должна давать жизнеспособный гибрид;

5. Опухолевые клетки должны быть мутантны по определенным генам, контролирующим экспрессию жизненно-необходимых ферментов (гибель на специальных селективных средах). Широко используются линии, дефектные по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе.

Одна из самых популярных мышиных миеломных линий, широко используемая для гибридизации, - линия Р3-Х63-Ag 8.653, так как она не синтезирует никаких цепей иммуноглобулинов, отличается быстрой пролиферацией и хорошей гибридизуемостью.

Линии миелом зависимы от ростовых факторов эмбриональной сыворотки.

Получение клеток-партнеров для слияния, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, на протяжении многих лет оставалось важной задачей.

Наблюдение, что культуральные среды, кондиционированные клетками, секретирующими IL-6, способны увеличивать выход гибридом-продуцентов МКА, позволило создать новый штамм миеломы - Sp2/mIL-6 (в клетки линии SPO с помощью ретровируса были введены гены, обеспечившие постоянную экспрессию мышиного IL-6).

Слияние клеток Sp2/mlL-6 с иммунными Влимфоцитами позволило увеличить выход стабильных гибридом, продуцирующих МКА искомой специфичности. Другой экспериментальный подход состоял во введении в миеломные, а также в гибридомные клетки экзогенных генов Вс1-2, регулирующих апоптоз, что способствовало снижению клеточной гибели в условиях разреженной культуры, дефицита питательных веществ или увеличения кислотности среды. Эти данные могли бы указывать путь создания линий миелом, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, однако, они не нашли подтверждения в ряде независимых исследований [90].

Работы по модификации миеломных мышиных клеток продолжаются и сейчас.

Одним из важных этапов получения гибридом является слияние миеломы и спленоцитов. Отцы гибридомной технологии добивались слияния клеток при помощи вируса Сендай – биологический метод. Но следует отметить, что данный метод не всегда дает положительные результаты. Некоторые авторы [76] объясняют это тем, что не все клетки миеломы имеют рецепторы для вируса. Как более удобный, эффективный и безопасный индуктор используется ПЭГ химический метод гибридизации [128]. Главное требование к нему – химическая чистота. Были предприняты попытки вызвать гибридизацию клеток воздействием электрическим или магнитным полями, так как мембраны клеток заряжены и электропроводны (физический метод гибридизации) [139]. Эффективность электрогибридизации, как правило, на один - два порядка выше, чем гибридизации биологическими и химическими методами, также возможен визуальный контроль через микроскоп, а отделение гибридных клеток от неслившихся исключает необходимость метаболической селекции. Однако данный метод требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала, поэтому наибольшее распространение в настоящее время получил относительно простой и достаточно эффективный метод гибридизации с использованием ПЭГ с молекулярной массой от 1000 до

6000. При использовании ПЭГ частота гибридизации составляет обычно один гибрид на каждые 2105 клеток селезенки. Многие исследователи пытаются повысить частоту образования гибридом путем манипулирования различных переменных (концентрация ПЭГ, значение рН при слиянии, соотношение селезеночных и миеломных клеток, использование различных типов питательных сред, различные варианты посевов). Однако до настоящего времени ни одна из вышеперечисленных попыток манипулирования переменными не привела к существенному повышению абсолютного выхода получаемых гибридом. Стоит только отметить экономичную и эффективную технологию получения МКА против белков - продуктов новых генов, для которых известна только нуклеотидная последовательность, - это использование клеточных сортеров для предварительной селекции B-лимфоцитов, несущих АГ-специфные рецепторы [90]. В общем, этап подготовки клеток к слиянию и сама процедура слияния за истекшие 37 лет не претерпели значительных изменений. Поэтому вопрос о преимуществах различных модификаций остается открытым.

Совершенствование гибридомной технологии невозможно без выяснения тонких механизмов процесса, который еще недостаточно изучен.

Предположительно, сначала происходит склеивание клеток, затем слияние клеточных мембран, потом слияние ядер и перестройка хромосомного материала.

Имеются данные, что сливаются, в основном, клетки, находящиеся в стадии интенсивного деления, поэтому за 24 часа до гибридизации миеломные клетки переводят в условия максимальной скорости роста клеток (повышение концентрации фетальной сыворотки, витаминов и ростовых факторов в культуральной среде). Иммунизация в свою очередь стимулирует рост клонов Влимфоцитов – продуцентов специфических к антигену антител. Если мы говорим о растительных клетках, слияние протопластов происходит вследствие высокой концентрации ПЭГ, которая способствует поглощению свободной воды между протопластами, вызывая их слипание. Кроме того, дегидратация индуцирует образование пор в мембране, через которые перетекает внутриклеточное содержимое. Повреждения мембран обратимы, поэтому слипшиеся протопласты регенерируют клеточную стенку [89].

Рост гибридом и синтез ими антител зависят от физико-химических характеристик микроокружения клеток. При этом особое внимание уделяется регулированию рН, концентрации растворенного кислорода, температуре и содержанию питательных веществ. Гибридная клетка, помещенная в качественную питательную среду, размножается и вырабатывает МКА в надосадочную жидкость. Полученные антитела являются молекулярно однородными и доступными для получения в относительно больших количествах.

Следует отметить, что присутствие в культурах фидерных клеток повышает жизнеспособность гибридом и стимулирует образование колоний, так как они синтезируют факторы, увеличивающие пролиферативную активность гибридом, и утилизируют компоненты погибших клеток, оказывающие токсическое действие на гибридомы [147].

В процессе культивирования необходимо проводить постоянный контроль МКА на специфичность Для определения стабильных [78].

антителопродуцирующих гибридных культур применяют различные методы:

иммуноферментный, иммунофлуоресцентный, реакцию агглютинации, радиоиммунный и другие. Но не все методы обнаружения сывороточных антител пригодны для тестирования гибридом, так как МКА могут не вызывать преципитации или агглютинации антигена, не связывать комплемент.

Наибольшее распространение получил твердофазный иммуноферментный анализ, который пригоден как к растворимым антигенам, так и к бактериальным и соматическим. Как известно, из-за утраты в отдельных гибридомных клетках хромосом, контролирующих синтез МКА, антителообразование является нестабильным признаком в первые дни и недели после слияния [128, 149], что объясняет необходимость раннего клонирования и реклонирования для выделения устойчивых субклонов. В настоящее время на смену полужидкому агару, в котором Келер и Мильштейн культивировали гибридные клетки, пришла техника лимитирующих разведений – самый распространенный сегодня метод клонирования, позволяющий избежать проблем, связанных с технологией приготовления агара, от качества и консистенции которого зависит эффективность метода. Клонирование лучше проводить в 96-луночных плоскодонных планшетах с помощью последовательных разведений клеточной взвеси. Преимущество такого подхода заключается в том, что образование антител единичными колониями, растущими в лунках, в которые предварительно засеяли по одной клетке, может быть просто проконтролировано. Метод лимитирующих разведений легко воспроизводится [16].

Важным аспектом гибридомной технологии, которому уделяется большое внимание, является разработка способов массового производства МКА.

Культивирование гибридом in vivo в организме сингенных мышей сочетает в себе экономичность и достаточно высокую продуктивность: от одной мыши можно забрать до 10 мл асцитической жидкости, что в среднем составляет 50 мг МКА.

Однако при получении очень больших количеств антител использование животных уже нецелесообразно, поскольку для выделения 1 кг очищенного продукта потребуется 20000 животных, а наличие неспецифических мышиных иммуноглобулинов усложнит очистку МКА. Более того, в 1999 г. было принято решение Европейского комитета по этике - введены значительные ограничения на работу с лабораторными животными. Поэтому особого внимания заслуживает культивирование гибридом in vitro. Еще в 1933 - 1972 гг. были решены основные задачи по конструированию, созданию и внедрению в практику промышленного оборудования, в том числе биореакторов. Начиная с 1972 г. и по 2000 г.

проводились работы по автоматизации и компьютеризации производства биотехнологической продукции. В настоящее время для наработки МКА в промышленных масштабах используют различные приспособления (цитокультиваторы, ферментеры и др.), в которых соблюдаются необходимые условия (температура, уровень углекислого газа и влажности), а также частично или полностью автоматизированы подача питательных сред и отбор супернатантов. Такая технология получения моноклональных антител in vitro имеет следующие преимущества:

1) не используются животные;

2) уменьшается риск загрязнения целевого продукта различными веществами из животных-хозяев (низкие концентрации примесных антител);

3) размеры сосудов для культивирования можно легко увеличивать без особых затрат на масштабирование (при культивировании in vivo масштабирование приводит к трудозатратам и расходам на капитальное строительство);

4) высокая воспроизводимость за счет оптимизации процесса;

5) в организмах грызунов трудно культивировать клетки человеческих гибридом и лимфобластоиды, трансформированные ВЭБ.

Определенного внимания заслуживают два подхода к культивированию клеток:

I. Первый подход - иммобилизация и включение клеток в твердую матрицу (перфузия в пористые волокна, применение микрокапсул, агарозных микрошариков или керамических кассет).

II. Второй подход - культивирование клеток в гомогенной суспензии.

Выбор одного из этих двух методов накопления МКА определяется особенностями производственного процесса, важно чтобы система получения иммуноглобулинов соответствовала следующим требованиям:

1) сравнительно простая и легкая в управлении;

2) воспроизводимая для обеспечения высокого качества продуктов;

3) легко стерилизуемая и способная работать асептически в течение длительного периода времени;

4) просто и эффективно масштабируемая.

В зависимости от области применения антител и от их свойств можно использовать самые различные способы выделения и очистки МКА из культуральной и асцитической жидкости. Для диагностических целей часто достаточно иметь препараты антител 70 - 95%-ной степени чистоты. С другой стороны, при применении антител in vivo их чистота должна быть намного выше.

В сывороточных средах содержание специфических антител не превышает 10% от общего количества белка. Поэтому не прекращаются работы по подбору добавок к базальным средами (RPMI-1640, DMEM), которые бы поддерживали пролиферацию и антителопродукцию гибридом, и были бы дешевле эмбриональной сыворотки. Кроме снижения себестоимости МКА, разработка бессывороточных сред имеет важную цель – упростить очистку антител [24].

Хотя проведение процесса на таких средах и облегчает очистку, на практике относительно легко достичь 90%-й и даже более высокой степени чистоты независимо от содержания сывороточных белков. При очистке антител для их использования in vivo на последних стадиях очистки приходится решать одни и те же проблемы независимо от природы питательной среды. Ранее для очистки МКА широко применяли фракционирование сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией [128]. Использование этих методов осложняется тем, что различные МКА имеют разные изоэлектрические точки. Кроме того, после ионообменной хроматографии чистота антител не превышает 90%, поэтому для дальнейшей очистки необходимы другие методы, например гель-фильтрация [50, 93]. В настоящее время разработаны адсорбционные концентраторы, которые представляют собой исключительно простое в использовании оборудование для концентрирования и/или очистки МКА из разбавленных растворов. В зависимости от конфигурации и объема резервуара стартовый объем может варьировать от 0.5 до 20 мл, при этом достигается 750-кратную степень концентрирования. В таких концентраторах используются гидрофильные мембраны, обладающие низкой степенью связывания белка и обеспечивающие высокую скорость фильтрации. Также применяют ультрафильтрационные системы, отличающиеся простотой и экономичностью в сочетании с высокой производительностью: 1 литр концентрируется в 50 раз менее чем за полчаса.

Кроме того, для такого оборудования характерна уникальная конструкция модулей и наличие специальных коннекторов для масштабирования процесса.

Таким образом, получение МКА направленной специфичности является достаточно сложным, длительным и трудоемким процессом, эффективность которого зависит от ряда факторов. В каждом случае необходим индивидуальный подход к решению поставленных задач [89, 98, 102, 108]. На сегодняшний день далеко не все теоретические и технические проблемы создания гибридом решены.

Гибридомная технология, ставшая основой получения МКА, буквально пропитала теоретическую и прикладную иммунологию, проникла во многие разделы микробиологии, вирусологии и медицины. Можно сказать, создана гибридомная промышленность, и на рынок поступают сотни вариантов МКА. Она является не только примером быстрого внедрения науки в практику, но и примером продолжающегося одновременного развития фундаментальных научных исследований на качественно новом уровне, так как гибридомы – наиболее эффективный и мощный инструмент современной биологической науки.

Так, МКА являются уникальной моделью в изучении биологии рецепции.

Исследование природы рецепторов с помощью антител не является новым, такие работы проводились и до создания МКА. Однако достаточно часто сталкивались с тем, что не могли получать сведения об их природе. Обходной путь в решении этого вопроса сводится к следующему: на первом этапе получают МКА к лиганду, связывающемуся с искомым рецептором, на втором этапе получают МКА к антигенсвязывающей области первых антител. Эти вторые МКА и будут антителами к неизвестному рецептору. По такой же схеме были получены антитела к Р-адренергическому рецептору. Можно изучать и функции рецепторов с помощью МКА, которые, обладая «мимикрирующим» действием, способны запускать те же реакции в клетке, что и лиганд, связывающийся с рецептором.

Вместе с тем, существуют и такие МКА, которые, связываясь с рецептором, не изменяют его функции, что позволяет изучить механизмы регуляции функциональной активности рецепторов [53]. Интересным направлением является исследование эпитопов ВИЧ-1 с использованием МКА и фаговых пептидных библиотек. J.R. Mascola и D.C. Montefiori (2010 г.) обнаружили у ВИЧинфицированных долгожителей особые антитела, которые назвали нейтрализующими антителами широкого спектра действия [140]. Среди них особый интерес представляют МКА: Z13E1, VRC03 и VRC01 (нейтрализуют 91 % штаммов ВИЧ-1), которые Ильичев с соавторами (2013 г.) использовали для получения пептидов-имитаторов эпитопов ВИЧ-1 [49]. Секвенирование и последующий компьютерный анализ позволили исследователям выявить уникальные аминокислотные последовательности специфичных к МКА пептидов, что очередной раз доказывает необходимость применения достижений гибридомной технологии, позволяющей ответить на вопросы, которые не всегда удается решить с помощью других методов.

С появлением МКА в биологии и медицине начата эпоха современных исследований высочайшей точности. Специфичность антител делает их мощными диагностическими инструментами, которые позволяют определить наличие минимального количества искомых субстанций. Область возможного применения

МКА весьма широка [23]. В настоящее время МКА используют для:

1) обнаружения загрязнений окружающей среды;

2) проверки пищевых продуктов на наличие опасных микроорганизмов [35, 80];

3) распознавания злокачественных клеток среди нормальных [1, 56];

4) аналитических целей – как «иммунологический микроскоп» с чрезвычайно высоким разрешением [34];

5) диагностики заболеваний человека, животных и растений, а также в биотехнологии в качестве лигандов для аффинной хроматографии [32, 69, 115].

Следует отметить, что современная диагностика злокачественных новообразований не мыслима без МКА, их применяют [25]:

1) для определения иммунного статуса пациентов;

2) для диагностики и контроля эффективности лечения онкологических заболеваний [55];

3) для исследования локализации злокачественного новообразования и степени метастазирования (вводят МКА, связанные с радиоактивными изотопами);

4) для избирательной доставки химиотерапевтических агентов, противоопухолевых лекарств к клеткам опухоли, не затрагивая при этом здоровые клетки [51].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Похожие работы:

«Леонов Вячеслав Сергеевич Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломычеловека 6/11 и 16/18 типов 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«Гегерь Эмилия Владимировна ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ТЕХНОГЕННЫХ НАГРУЗОК ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ФОРМИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ И МЕДИЦИНСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические...»

«ГАБЫШЕВ Виктор Александрович ФИТОПЛАНКТОН КРУПНЫХ РЕК ЯКУТИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ТЕРРИТОРИЙ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ 03.02.10 – Гидробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант Доктор биологических наук Доцент Л.Г. Корнева Якутск 2015 Оглавление ВВЕДЕНИЕ Глава 1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 2. ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНА И ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ...»

«Мухачева Татьяна Александровна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Ковалев Сергей Юрьевич,...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«ЗАКЛЮЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА Д 501.001.94, СОЗДАННОГО НА БАЗЕ МОСКОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА ПО ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА НАУК аттестационное дело №_ решение диссертационного совета от 10.06.2015, протокол № 10 О присуждении Марине Кареновне Карапетян ученой степени кандидата биологических наук. Диссертация «Антропологические аспекты морфологической изменчивости костного позвоночника (по метрическим и остеоскопическим данным)», в...»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических...»

«ДАНИЛЕНКО Дарья Михайловна АНАЛИЗ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ ПАНДЕМИЧЕСКОГО ГРИППА A(H1N1) pdm09, ЦИРКУЛИРОВАВШИХ В РОССИИ В ПЕРИОД С 2009 ПО 2013 ГГ. 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук М.Ю. Еропкин САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..5...»

«Галкин Алексей Петрович ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Специальность 03.02.07 – генетика диссертация на соискание учной степени доктора биологических наук Научный консультант: Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«Кузнецов Виталий Викторович ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ 1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА АБЕРРАНТНОЕ ГИПЕРМЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК В РАКОВЫХ КЛЕТКАХ 03.01.03 – молекулярная биология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«ГОРБУНОВА Анна Николаевна ГИДРОЛИЗ РАЦЕМИЧЕСКИХ АМИДОВ ФЕРМЕНТАМИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Максимов А. Ю. Пермь – 201 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.