WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


«РЕГУЛЯЦИЯ ЯДЕРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ PPAR, -, - ПРИ СТИМУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В УСЛОВИЯХ ГИПЕРГЛИКЕМИИ. ...»

На правах рукописи

Чистяков Дмитрий Викторович

РЕГУЛЯЦИЯ ЯДЕРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ PPAR, -, - ПРИ

СТИМУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В

УСЛОВИЯХ ГИПЕРГЛИКЕМИИ.

03.01.03 – молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2015

Работа выполнена в лаборатории систем молекулярного клонирования Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» Российской академии наук и отделе биокинетики НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, академик Скрябин Константин Георгиевич

Официальные оппоненты:

Безуглов Владимир Виленович, доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им.

академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова» Российской академии наук, заведующий лабораторией оксилипинов.

Павлова Галина Валерьевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биологии гена» Российской академии наук, заведующая лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза.

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»

Защита диссертации состоится ___ ___________ 2015 г.

в __ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.76 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу:

119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр. 12, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте www.bio.msu.ru.

Автореферат разослан _____________ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы В последнее десятилетие значительно повысился интерес к исследованиям системы врожденного иммунитета, поскольку стало понятно, что нарушения механизмов неспецифической защиты организма имеют отношение не только к клеткам иммунной системы, но и ко всем другим клеткам организма. Активация врожденного иммунитета сопровождается развитием воспалительных процессов и, как следствие, участвует в патогенезе системных заболеваний с воспалительной компонентой. К таким заболеваниям относят диабет 2 типа, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания и другие. Более того, у пациентов с гипергликемией и гиперлипидемией наблюдаются нарушения в протекании воспалительных процессов, что указывает на взаимосвязь метаболизма, потребления энергии и системы врожденного иммунитета.

Ядерные рецепторы PPAR (дословный перевод «рецепторы активации пролиферации пероксисом») относят к факторам транскрипции, которые регулируют пересечение воспалительных процессов и энергетического метаболизма. Существует три изоформы этих рецепторов,,, которые имеют структурное сходство, ряд общих агонистов, но кодируются разными генами. Синтетические специфические агонисты PPAR и PPAR используют для лечения гипергликемии и гиперлипидемии, а также исследуются как потенциальные противовоспалительные препараты.

Агонисты PPAR считаются перспективными для лечения ожирения и нарушений механизмов восстановления и регенерации тканей.

Терапевтическая привлекательность использования агонистов привела к значительному количеству исследований PPAR на молекулярном уровне.

Однако, основное внимание уделено характеристике действия агонистов и активируемых ими рецепторов на различные клеточные ответы, в то время как регуляция самих рецепторов PPAR изучена относительно мало. В то же время, понимание молекулярных механизмов регуляции этих рецепторов может дать ключ к управлению процессами на пересечении метаболических, энергетических и воспалительных каскадов реакций.

Традиционно изучают отдельные изоформы PPAR на разных клеточных объектах. Однако в исследованиях последних лет было показано, что при разворачивании клеточных ответов на различные стимулы изоформы PPAR вступают на регуляторном уровне во взаимодействие между собой.

Поэтому в данной работе выбраны для исследования типы клеток, на которых экспрессированы все три изоформы (линии клеток человека HeLa, глиомы крысы С6, первичные астроциты крысы).

Изучение воспалительных процессов в центральной нервной системе, которая защищена от проникновения «чужеродных» стимулов представляет особый интерес. Исследования последних десятилетий показывают, что на клеточном уровне воспалительные процессы характерны для различных заболевания мозга, в том числе рассеянный склероз, вторичные травмы, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Важную роль при этом играют глиальные клетки мозга - астроциты и микроглия. Если микроглию по своим основным функциям можно отнести к клеткам иммунной системы, то основная роль астроцитов заключается в энергетическом, метаболическом и сигнальном сопровождении функций нейронов. Понимание молекулярного механизма регуляции PPAR на астроцитах при активации врожденного иммунитета является актуальной задачей современных исследований в нейробиологии.

Активация системы врожденного иммунитета происходит через рецепторы различных классов, наиболее изученным из которых являются Толл-подобные рецепторы (TLR), расположенные на плазматической и внутриклеточных мембранах большинства клеток. В данной работе фокус исследований на взаимосвязи TLR, локализованных на плазматических мембранах (типы TLR2, TLR4, TLR5) и трех изоформ PPAR – PPAR, PPAR, PPAR. Целью работы являлось установление механизмов регуляции ядерных рецепторов трех изоформ при стимуляции указанных TLR.

Исследования молекулярных процессов проводили на клеточных моделях.

Условия гипергликемии создавали адаптацией клеток к повышенному содержанию глюкозы, т.е на клеточном уровне. Такой подход позволил построить общую схему регуляции PPAR с учетом регуляции на посттранскрипционном уровне и оценить возможность направленного управления процессом с использованием ингибиторов митогенактивированных протеинкиназ (MAPK).

Цели и задачи исследования В настоящей работе была поставлена цель изучить процессы регуляции PPAR, PPAR и PPAR при активации Толл-подобных рецепторов в условиях гипергликемии и исследовать возможность модулировать активность этих изоформ для изменения характера и направления клеточного ответа в условиях гипергликемии.

Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

- Охарактеризовать взаимосвязь активации TLR и PPAR в условиях гипергликемии на линии клеток человека HeLa и оценить возможность использования этой линии для изучения TLR/PPAR сигнального пути.

- Исследовать влияние гипергликемии на экспрессию и ДНК-связывающую активность PPAR, PPAR и PPAR на первичных астроцитах крысы.

- Сравнить влияние различных лигандов Толл-подобных рецепторов (TLR1/2, TLR4, TLR5) на экспрессию PPAR, PPAR и PPAR.

- Оценить возможность регуляции на уровне деградации мРНК ядерных рецепторов PPAR.

- Исследовать возможность модулирования при активации ТЛР экспрессии и активности PPAR с помощью селективного ингибирования элементов сигнального пути врожденного иммунитета (ингибиторы MAPK, фактора транскрипции NF-kB, белкового синтеза).

Научная новизна работы В работе впервые проведен сравнительный анализ влияния агонистов ТЛР2, TLR4 и ТЛР5 на активацию трех изоформ PPAR.

Полученные данные показывают, что агонисты разных типов TLR проявляют схожие между собой этапы регуляции экспрессии PPAR, -, - в астроцитах. Сравнение кинетики экспрессии рецепторов PPAR, -, - и COX-2 при стимуляции TLR4 показало, что в экспрессии PPAR и СОХ-2 есть схожие элементы. Оба гена имеют фазу индукции и разрешения воспалительного ответа. Кинетика экспрессии PPAR и PPAR проходит через минимум, затем восстанавливается до исходного уровня. Впервые была показано, что экспрессия и активность трех изоформ PPAR при активации системы врожденного иммунитета регулируются через различные механизмы. Детально охарактеризовано участие различных ветвей сигнального каскада MAPK (p38, ERK1/2, JNK) в этой регуляции, а также зависимость процессов регуляции от времени. Изучение влияние ингибирования белкового синтеза показало наличие эффекта «супериндукции»

генов для всех 3х изоформ PPAR. Изучение этого эффекта в клетках без/с активацией системы врожденного иммунитета позволило предположить, что в системе регуляции экспрессии PPAR существует неизвестный лабильный белок

– супрессор экспрессии всех трех изоформ PPAR, при этом действие этого белка различно в необработанных и LPS-стимулированных клетках. Показано изменение времени полужизни мРНК PPAR, -, - при стимуляции TLR4, и участие p38 MAPK в регуляции этого процесса.

Практическая значимость работы Полученные результаты позволяют детализировать механизмы регуляции транскрипционных факторов PPAR при активации системы врожденного иммунитета. Поскольку известно, что данные факторы являются ключевыми компонентами в развитии целого ряда нейродегенеративных заболеваний и заболеваний с нарушением метаболических процессов (Альцгеймер, Паркинсон, диабет, ожирение и т.д.), то результаты работы могут быть применены для разработки эффективной целевой терапии этих заболеваний.

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Ломоносов» (Москва 2008, 2011), Всероссийской научной школе для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород 2009), международной конференции «Molecular Medicine Conference 2012» (2012, Бангкок, Таиланд), международной конференции «3rd European lipidomics meeting» (2013, Пардубицы, Чешская республика), международной конференции «Nuclear receptors: Linking molecules, genomes & physiology»

(2013, Италия, Неаполь), международной конференции «Nuclear receptors. From Molecular Mechanism to Health and Decease» (2011, Барселона, Испания).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых международных и отечественных журналах, входящих в перечень ВАК РФ и 10 материалов отечественных и международных конференций.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, 5 глав и списка цитируемой литературы из 220 наименований. Работы изложена на __ страницах машинописного текста и включает 33 рисунка и 2 таблицы.

Список сокращений PPAR – рецепторы активаторов пролиферации пероксисом, COX- циклооксигеназа, GAPDH – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, PGE2 - простагландин Е2; TNF – фактор некроза опухоли альфа, TLR- Толл-подобные рецепторы, PGN – пептидогликан, FGL – флагеллин LPS – липополисахарид, MAPK – митогенактивируемые протеинкиназы

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточные культуры: линия клеток человека HeLa, первичные астроциты крысы. Астроциты выделяли из мозгов новорожденных крыс и культивировали со сменой среды 14 дней перед экспериментами. Условия клеточной гипергликемии моделировали 48 часовой инкубацией клеток при повышенной концентрации глюкозы (25 мМ для HeLa, 22,5 мМ для астроцитов).

Контрольные клетки инкубировали при 5 мМ глюкозы. Экспрессию генов (PPAR, PPAR, PPAR, COX-1, COX-2, GAPDH, актин) определяли методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе iCycler Bio-Rad с использованием набора “SYBR green PCR Master Mix” (Bio-Rad).

Для определения количества белка (PPAR, PPAR, PPAR, COX-2, p38, p-p38 -тубулин) использовали метод иммуноблоттинга. Концентрацию простагландина Е2 и TNF определяли методом ИФА. ДНК-связывающая активность PPAR определялась с использованием иммуноферментного набора «PPAR, -, Complete Transcription Factor Assay Kit». Описание морфологии клеточной культуры проводили методом конфокальной микроскопии на микроскопе LSM 510 (Carl Zeiss, Jena, Germany) с использованием антител на белки GFAP (маркёр астроцитоза) и изолектин B4 (маркёр микроглии). Все измерения проводили не менее трех раз. p0,05. При работе с первичными астроцитами данные анализировались с трех независимых биологических повторностях.

Полученные данные обрабатывали с помощью метода однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Характеристика воспалительного процесса в условиях гипергликемии на клетках линии человека HeLa.

Клетки HeLa выбраны для модельных исследований, поскольку они легко культивируются, в них экспрессируются все три изотипа PPAR и охарактеризован на молекулярном уровне LPS-стимулируемый клеточный ответ. Целью этого этапа работы было показать, что 1) условия клеточной гипергликемии меняют чувствительность клеток к действию LPS, что проявляется на уровне экспрессии классического маркера воспаления – циклооксигеназы (изоформы СОХ-1 и СОХ-2); 2) ядерные рецепторы PPAR меняются в условиях гипергликемии; 3) синтетический PPAR агонист росиглитазон позволяет модулировать LPS-стимулированные ответы в различных условиях культивирования. Результаты получены совместно с С.А.

Грабеклис.

Получено, что стимуляция LPS приводит к увеличению экспрессии СОХи увеличению экспрессии PPAR, - и –. В условиях клеточной гипергликемии (25 мМ глюкозы) происходит снижение экспрессии СОХ-2, PPAR и PPAR на нестимулированных клетках и их стимуляция LPS не приводит к увеличению экспрессии СОХ-2, PPAR, - и –, уровень экспрессии СОХ-1 снижается. Результаты получены совместно с Н.В. Поповой и Л.Ю.

Агонист PPAR росиглитазон, лекарственное средство, Андреевой.

используемое как гипогликемический препарат, обладает антивоспалительными свойствами в нормальных условиях (снижает LPSстимулированное увеличение экспрессии всех исследуемых генов), но не проявляет этого эффекта в условиях клеточной гипергликемии на PPAR и PPAR.

2. Характеристика TLR-стимулированных ответов астроцитов в условиях клеточной гипергликемии Объектом исследования являлись первичные астроциты. Задачи исследования на этом этапе: 1) сравнить астроциты, культивируемыt при 22,5 мМ глюкозы (гипергликемия) и 5 мМ глюкозы (контрольные условия) морфологически, иммуноцитохимически, по способности синтезировать воспалительные маркёры при активации TLR агонистами; 2) показать изменения изучаемых генов PPAR, PPAR, PPAR и возможность модуляции их экспрессии в присутствии ингибиторов MAPK.

Показано, что морфологически и иммуноцитохимически астроциты, культивируемые в контрольных условиях и при гипергликемии, не различаются.

2.1. Влияние гипергликемии на способность LPS-стимулированных астроцитов синтезировать воспалительные маркёры PGE2 и TNF.

К началу нашей работы было известно, что в модели гипергликемии наблюдается изменения в развитии воспалительного ответа, однако как в этих условиях меняются астроциты исследовано не было. Нами показано, что базовый уровень выброса PGЕ2 увеличивается при культивировании клеток в условиях гипергликемии с 133 ± 23 нг/мл до 264 ± 37 нг/мл, а при стимуляции клеток LPS синтез PGЕ2 увеличивается с 434 ± 64 пг/мл (контрольные условия) до 786 ± 42 пг/мл (клетки культивировали в условиях гипергликемии) (Рис. 1.а).

В контрольных клетках без обработки LPS уровень выброса TNF был ниже пределов детектирования, однако стимуляция LPS вызывает выброс TNF, на уровне 140+22 пкг/мл при нормальной концентрации глюкозы и 250 ± 25 пкг/мл при гипергликемии (Рис. 1.б). Таким образом, клеточная гипергликемия приводит к увеличению выброса провоспалительных маркеров PGE2 и TNF и усиливает чувствительность клеток к действию LPS.

Рис. 1. Влияние гипергликемии на LPS-стимулированный выброс PGE2 (а) и TNF (б).

Астроциты культивировали в течении 48 ч в среде с концентрацией глюкозы 5 мМ (NG) или 22,5 мМ (HG), затем культивировали 4 ч без дополнительных обработок (C) или в присутствии LPS (100 нг/мл). Концентрацию PGE2 и TNF определяли с помощью ИФА. #p 0,05, *p 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками.

2.2. Изменение экспрессии и ДНК-связывающей активности PPAR, PPAR и PPAR при культивировании астроцитов в условиях гипергликемии Данных характеризующих изменение активности и экспрессии изоформ PPAR в клетках мозга при использовании гипергликемических моделей ранее не было описано, поэтому мы изучили, как меняется экспрессия и ДНКсвязывающая активность трех изоформ PPAR в условиях культивирования астроцитов при различных концентрациях глюкозы.

Показано, что условия гипергликемии не влияют на ДНК-связывающую активность (Рис. 2.а), однако меняют уровень экспрессии мРНК трех изоформ PPAR (Рис. 2.б). Происходит снижение экспрессии мРНК PPAR и PPAR, наблюдается увеличение экспрессии мРНК PPAR. Из литературы известно, что подобные изменения экспрессии PPAR характерны для воспалительных процессов, т.е. адаптация астроцитов при гипергликемии имеет воспалительный характер.

Рис. 2 Влияние гипергликемии на ДНК-связывающую активность (а) и уровень экспрессии мРНК PPAR, PPAR и PPAR (б). Астроциты культивировались 48 часов в среде с нормальной (5 мМ) и повышенной концентрацией глюкозы (22,5 мМ). (а) ДНКсвязывающую активность измеряли методом ИФА. (б) Уровень экспрессии мРНК PPAR, PPAR и PPAR определяли методом ПЦР в реальном времени. За 100% принят уровень мРНК соответствующего гена в клетках культивируемых при нормальной концентрации глюкозы. *p 0,05 Было известно, что астроциты на плазматической мембране имеют несколько подтипов Толл-подобных рецепторов: TLR4, 1/2 и, возможно, 5.

Поэтому мы сравнили влияние LPS, пептидогликана (PGN) и флагеллина (FGL) являющихся агонистами TLR4, TLR2 и TLR5 соответственно, на выброс PGE2 и TNF и экспрессию трех изоформ PPAR. Получено, что все три агониста вызывают выброс провоспалительных маркеров и влияют на экспрессию мРНК PPAR, PPAR и PPAR. Действие TLR5 агониста как участника системы врожденного иммунитета на астроцитах показано впервые и открывает возможности его развернутого изучения на клетках мозга. Нами также показано, что адаптация астроцитов при гипергликемии приводит к увеличению чувствительности к действию агонистов LPS и PGN, но не FGN на уровне мРНК PPAR.

2.3. Влияние ингибиторов p38, JNK, ERK MAPK на экспрессию трех изоформ PPAR в условиях активации системы врожденного иммунитета при гипергликемии Ингибиторы MAPK в настоящее время активно изучаются как противовоспалительные вещества широкого спектра действия. Мы предположили, что ингибиторы MAPK могут регулировать экспрессию мРНК PPAR, -, - в условиях гипергликемии при стимуляции TLR. Для проверки этого предположения выбрали действующие концентрации ингибиторов по их способности модулировать LPS -стимулированный выброс TNF и PGE2, затем исследовали их влияние на экспрессию PPAR (Рис. 3). Значимые различия в условиях гипергликемии получены при действии ингибитора p38 (SB203580) для PPAR (Рис. 3б) и ингибитора ERK1/2 (PD98059) для PPAR. Другие ингибиторы модулировали экспрессию PPAR не зависимо от адаптации клеток к различным концентрациям глюкозы. Это указывает на их перспективность как противовоспалительных препаратов независимо от данной адаптации.

Возможность модуляции экспрессии PPAR открывает новые возможности в использовании MAPK ингибиторов, однако встал вопрос о механизме регуляции экспрессии PPAR, который не был изучен. Поэтому в дальнейшей работе мы сосредоточились на выяснении этого механизма при гипергликемической модели культивирования астроцитов.

Рис.3. Эффект p38, MEK1/2, ERK1/2 и JNK ингибиторов на экспрессию PPAR, -, - в наивных и LPS-стимулированных клетках при культивировании астроцитов в среде с повышенной концентрацией глюкозы. Астроциты культивировали в условиях нормальной (NG, 5mM) и повышенной концентрации глюкозы (HG, 22.5mM) 48 ч, затем на 1 ч добавляли ингибиторы MAPK: p38 (SB203580, 20 µM), MEK1/2 (U0126, 10 µM), ERK1/2 (PD98059, 20 µM), JNK (SP600125, 10 µM) и стимулировали LPS (100нг/мл) на 4 ч. Контрольные клетки не стимулировали LPS. Количество мРНК PPAR (а), PPAR (б) и PPAR (с) определяли методом ПЦР в реальном времени. *p 0,05 по сравнению с необработанными клетками, # p 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками,. ^ p 0,05.

3. Исследование механизма регуляции ядерных рецепторов PPAR при активации TLR на астроцитах.

Для выяснение механизмов регуляции PPAR при стимуляции TLR рецепторов на астроцитах решали следующие задачи: 1) показать, есть ли общий механизм в действии агонистов разных TLR на экспрессию (уровень мРНК и белка) и ДНК связывающую активность PPAR, -. -; 2) меняются ли параметры деградации мРНК трех изотипов PPAR при TLR-стимуляции; 3) зависит ли экспрессия PPAR от ингибиторов синтеза белка; 4) можно ли регулировать уровень экспрессии PPAR с помощью ингибиторов МАРК. В каждой серии клеточных экспериментов параллельно изучению генов PPAR, PPAR, PPAR исследовали экспрессию СОХ-2, как классического маркера воспаления.

3.1. Агонисты TLR1/2, TLR4, TLR5- подавляют уровень экспрессии PPAR и PPAR, но увеличивают экспрессию PPAR В данной серии экспериментов использованы агонисты TLR рецепторов, которые показали свою активность в модуляции мРНК PPAR. Для PPAR, PPAR, PPAR одновременно оценили ДНК-связывающую активность PPAR (Рис. 4с), уровень экспрессии мРНК (Рис. 4д), уровень экспрессии белка (Рис.

4б) при действии агонистов TLR1/2, TLR4, TLR5. Для всех тестируемых агонистов наблюдалось подавление уровня экспрессии генов PPAR и PPAR и рост уровня экспрессии гена PPAR (Рис. 4д). Изменения на уровне мРНК коррелировали с изменениями на уровне белка и ДНК-связывающей активности. В работе впервые показано влияние агонистов ТЛР2 и ТЛР5 на активацию всех трех изоформ PPAR. Более того, впервые описаны функциональные эффекты активации TLR5 на астроцитах.

Несмотря на большое разнообразие запускаемых сигнальных ответов при активации различных TLR, для исследуемых рецепторов существует сходство в активации фактора транскрипции NF-B. Мы использовали ингибитор Bay 11и показали, что он снимает действие исследуемых агонистов (Рис. 4д), т.е.

существует сигнальный путь TLR/NF-B/PPAR.

Для доказательства, что данные агонисты действуют через рецепторы используют антагонисты, однако для изучаемых типов TLR такой антагонист, CLI-095, существует только для TLR4 рецептора. Используя его, мы показали, что в нашей экспериментальной системе все эффекты LPS на экспрессию PPAR, PPAR, PPAR и СОХ-2, осуществляются через TLR4 рецептор.

Поэтому дальнейшие исследования проводили с LPS.

Рис. 4. Сравнение влияния агонистов Толл-подобных рецепторов (TLR) и ингибирования NF-B на уровень белка (а,б), активность (в), удельную активность (г) и экспрессию (д) PPAR, -, -. Астроциты стимулировались 4 часа с агонистами Толлподобных рецепторов: липополисахаридом (LPS, 100нг/мл, TLR4); пептидогликаном (PGN, 5 мкг/мл, TLR1/2) и флагеллином (FGL, 5 мкг/мл, TLR5) и, ингибитором NF-B (Bay 11-7085, 5 мкМ). (а,б) концентрацию белка PPAR, -, - определяли методом иммуноблоттинга, данные нормализовались на -тубулин. Приведена типичная электрофореграмма и результаты денситометрии. Уровень белка в контрольных клетках принят за 1. (в) ДНКсвязывающую активность измеряли как описано в материалах и методах. За 1 принята активность соответствующей изоформы PPAR в не-стимулированных астроцитах. (г) удельная активность. Считалась как A/Б, где А это значение активности данной изоформы PPAR, а Б - концентрация белка полученное методом иммуноблоттинга. (д) уровень мРНК PPAR определяли методом ПЦР в реальном времени. *p 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками.

3.2. Кинетика экспрессии PPAR, PPAR, PPAR и СОХ2 при стимуляции астроцитов LPS За последние годы показано, что при активации системы врожденного иммунитета клеточные ответы включают процессы провоспалительные (стадия активации ответа) и антивоспалительные (стадия разрешения (resolution) ответа). Это активные процессы, которые разворачиваются во времени и от их регуляции зависит возвращение клеточной системы в исходное состояние или установление нового адаптивного состояния (возможно, характеризующего хроническое воспаление на уровне организма). Однако до нашей работы не было данных характеризующих кинетику экспрессии PPAR, PPAR, PPAR при стимуляции LPS. Мы провели это исследование в сравнении с экспрессией гена-провоспалительного маркёра СОХ-2 (Рис.5).

Рис. 5. Изменение уровня экспресии PPAR, - - и COX-2 при стимуляции астроцитов LPS. (а,б) Астроциты стимулировали LPS (100 нг/мл) и через указанные промежутки времени уровень мРНК PPAR,, и COX-2 определяли с помощью ПЦР в реальном времени.

(в,г) Концентрацию белков трех изоформ PPAR определяли с помощью иммуноблоттинга.

*p 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #p 0,05 по сравнению с LPSстимулированными клетками. Результаты получены совместно с С.Е. Алешиным.

Для изучения временной зависимости экспрессии PPAR, -, - и COX-2 от стимуляции TLR4 в астроцитах измеряли уровень экспрессии мРНК и белка для PPAR, -, - в заданные временные промежутки после стимуляции (Рис. 5) методом ПЦР в реальном времени и иммуноблоттингом, соответственно.

Значительное снижение (более чем в 3 раза) уровня мРНК для PPAR и PPAR было отмечено уже на 2х часах после стимуляции клеток LPS (Рис. 5а). Для PPAR уровень мРНК не вернулся к уровню не-стимулированных клеток даже при 24ч инкубации (Рис. 5а). Уровень мРНК PPAR к этому времени вернулся в норму. Для PPAR же наоборот происходит постепенное увеличение уровня мРНК до 2,5 раз с максимумом на 4х часах, далее уровень мРНК PPAR начинает снижаться и через 24 часа приходит к уровню экспрессии гена в необработанных клетках (Рис. 5.а). Эти изменения коррелировали с уровнем белка (Рис.5в,г). Из полученных результатов видно, что в экспрессии PPAR так же как и экспрессии СОХ-2 (Рис. 5б) есть схожие элементы. Оба гена имеют фазу индукции и разрешения воспалительного ответа.

Полученные данные показывают, что регуляция экспрессии PPARs тесно связана с системой клеточного ответа на активацию TLR4 рецептора. В дальнейшей работе мы сконцентрировались на краткосрочной стадии клеточного ответа, т.е. на точке 4ч после стимуляции LPS чтобы оценить вклад транскрипционных и пост-транскрипционных процессов в регуляцию PPAR, PPAR, PPAR.

3.3. Скорость распада мРНК PPAR, PPAR, PPAR. замедляется при активации TLR4 Полученные данные, что PPAR меняются в процессе развития ответа на LPS, позволило выдвинуть предположение, что экспрессия этих генов может регулироваться на пост-транскрипционном уровне. В последнее время посттранскрипционная регуляция генов на уровне времени жизни мРНК вызывает большой интерес, поскольку показано, что многие гены, активно вовлеченные в про-воспалительные процессы меняют скорость деградации мРНК при действии на клетки про-воспалительных агентов. Поэтому, мы провели серию экспериментов по определению изменения уровня экспрессии мРНК PPAR, PPAR PPAR в присутствии ингибитора транскрипции актиномицина Д.

Известно, что после добавления актиномицина изменяется только уровень уже существующей мРНК, что позволяет определять время полужизни мРНК.

Cравнивали стабильность мРНК в нативных и LPS-стимулированных клетках (Рис. 4.15). Для определения стабильности мРНК в LPS-стимулированных клетках мы добавляли к клеткам LPS на 1 ч, затем синтез новой мРНК блокировался с помощью актиномицина Д (5 мг/мл). Уровень мРНК PPAR, -,

- до добавления актиномицина Д был взят за 100%.

Время полужизни мРНК PPAR и PPAR в не стимулированных клетках меньше одного часа: примерно 30 мин для PPAR (Рис. 6а), 75 мин для PPAR (Рис. 6в) и 90 минут для PPAR (Рис. 6б). Для удобства отображения в астроцитах обработанных LPS уровень мРНК PPAR, -, - был взят за 100% после 1ч инкубирования клеток с этим агонистом TLR4. Мы определили, что время полужизни мРНК PPAR и PPAR в LPS-стимулированных клетках стало примерно 80 мин для PPAR, 90 мин для PPAR и 130 минут для PPAR (Рис. 6). Таким образом LPS замедляет деградацию мРНК для всех трех типов PPAR, т.е. происходит регуляция ядерных рецепторов на посттранскрипционном уровне.

Ранее было показано, что LPS вызывает активацию p38 MAPK в астроцитах. Мы так же показали, что ингибитор p38 MAPK снижает выброс воспалительных маркеров PGE2 и TNF в астроцитах и влияет на экспрессию PPAR, т.е. p38 MAPK может быть активным участником регуляции PPAR и на стадии деградации мРНК. Для проверки этого предположения мы измерили скорость деградации мРНК PPAR, -, - в присутствии специфического ингибитора p38 MAPK SB203580 (Рис. 6). Получили, что в LPSстимулированных клетках инкубирование астроцитов с SB 203580 снижает скорость деградации мРНК до скорости деградации в необработанных клетках для PPAR (Рис. 6а), PPAR (Рис. 6в) и PPAR (Рис. 6б).

Рис. 6. Влияние ингибирования p38 MAPK и добавления LPS на скорость деградации мРНК PPAR, PPAR и PPAR. (а, б, в) Астроциты культивировали без дополнительных обработок (черная сплошная линия), с добавлением LPS (100 нг/мл) на 1 час (пунктирная линия) или совместно инкубировались с ингибитором p38 MAPK SB203580 (SB, 20 мкM) и липополисахаридом (LPS, 100 нг/мл) (серая линия). Затем клетки обрабатывали актиномицином Д (5 мкг/мл). Через указанные промежутки времени образцы собирали и уровень экспрессии мРНК PPAR, -, - анализировали методом ПЦР в реальном времени. За 100% на графике принят уровень экспрессии мРНК PPAR, -, - для необработанных астроцитов, и уровень экспрессии после 1ч обработки LPS соответственно.(г) приведена электрофореграмма определения количества фосфо-p38 белка после 30 минут обработки LPS-стимулированных астроцитов ингибитором p38 MAPK *p 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #p 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками.

3.4. Роль циклогексимида в регуляции экспрессии мРНК PPAR, PPAR, PPAR.

Известно, что для ряда генов воспалительных ответов, таких как СОХ-2 или интерлейкин-6 показан эффект, называемый «супериндукция» Это явление, при котором экспрессия гена возрастает в присутствии ингибиторов белкового синтеза. Схожесть всех 3х изоформ PPAR как белков, и их взаимосвязь с COXпозволила нам предположить, что исследуемые нами гены также могут регулироваться через механизм супериндукции. Действительно, полученные данные показывают, что для всех 3х изоформ PPAR наблюдается рост их мРНК при обработке ингибитором белкового синтеза циклогексимидом (Рис. 7). Мы оценили вовлеченность p38 и JNK MAPK, а так же транскрипционного фактора NF-B в регуляцию этого эффекта (Рис. 7).

Рис. 7. Модулирование циклогексимид-стимулированной экспрессии мРНК PPAR, -,

- LPS и MAPK-ингибиторами. Астроциты обрабатывали 0,5ч ингибиторами MAPK p38 (SB 203580, 20 мкМ), JNK (SP600125, 10 мкМ) и Bay 11-7085 (5 мкМ), ингибитором NF-B или в течении 1ч LPS (100 нг/мл) и затем инкубировали 4ч с ингибитором белкового синтеза циклогексимидом (5 мкг/мл). Уровень экспрессии мРНК PPAR определяли методом ПЦР в реальном времени. *p 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, # p 0,05 по сравнению с клетками стимулированными только циклогексимидом Полученные данные позволяют предположить, что в системе регуляции экспрессии PPAR существует неизвестный лабильный белок – супрессор экспрессии всех трех изотипов PPAR, при этом, несмотря на то, что все три исследуемых белка относятся к одному суперсемейству, регуляция механизма супериндукции происходит у них по разным механизмам.

Для PPAR ключевыми факторами являются p38 MAPK и NF-B. Для PPAR - p38 MAPK, для PPAR это JNK MAPK. Дальнейшее изучение этого эффекта в клетках при активации системы врожденного иммунитета позволило предположить, что действие этих лабильных белков различно для необработанных и LPSстимулированных клеток, что указывает на новые возможные точки регуляции данной системы взаимосвязанных генов.

3.5. Общая схема регуляции PPAR, PPAR, PPAR в астроцитах Полученные данные позволили предложить обобщённую схему влияния MAPK и регуляции трех изоформ PPAR в астроцитах при стимуляции клеток LPS (Рис. 8).

Рис. 8. Схема регуляции мРНК изформ PPAR в LPS-стимулированных астроцитах.

– активирующее, - ингибирующее влияние, --- - стабилизация мРНК Схема отображает важную роль фактора транскрипции NF-B в регуляции экспрессии мРНК всех трех изоформ PPAR. Известно, что активация TLR сопровождается активацией каскада MAPK, а это, в свою очередь, влияет на активность разных изоформ PPAR. Наши результаты показывают, что MAPK участвует в регуляции экспрессии PPAR в ходе клеточного ответа при активации TLR (Рис. 8). Схема учитывает обнаруженный в ходе исследования механизм регуляции ядерных рецепторов PPAR на пост-транскрипционном уровне с участием p38 MAPK. Полученные данные позволяют предположить возможность модулирования ядерных рецепторов PPAR с помощью MAPK ингибиторов раздельно, как на уровне экспрессии, так и ДНК-связывающей активности. Используя различные MAPK ингибиторы можно изменить баланс между тремя изотипами PPAR, важной триадой рецепторов, регулирующей различные функции астроцитов.

Полученные данные указывают на новые возможности применения MAPK ингибиторов для регуляции воспалительных процессов на уровне экспрессии мРНК PPAR. Нами получено, что активность PPAR находится под негативным контролем JNK в необработанных астроцитах, так же как ингибирование p38 МАРК приводит к увеличению активности PPAR. Что примечательно, этот механизм регуляции не применяется при активации клеток LPS, так исследуемые ингибиторы MAPK не влияют на LPS-стимулированное снижение экспрессии мРНК PPAR и ДНК-связывающую активность. С другой стороны, регуляция PPAR ингибитором JNK снимает LPS-стимулированное подавление экспрессии этой изоформы PPAR. PPAR активируется при всех исследуемых обработках. Схема на (Рис. 8) показывает, что, не смотря на схожесть изотипов PPAR мРНК PPAR модулируется всеми предполагаемыми MAPK. Все три изоформы регулируются p38 на уровне деградации мРНК, а мРНК PPAR находится под контролем JNK и ERK каскадов MAPK.

Эти результаты могут представлять интерес при комбинированном применении синтетических агонистов PPAR и ингибиторов MAPK. Например, сочетание росиглитазона и JNK ингибитора может свести к минимуму снижение экспрессии PPAR и усилить противовоспалительное действие агонистов PPAR. Такие подходы позволяют снизить действующие концентрации лекарственных средств и уменьшить их токсические воздействия.

Выводы.

1. Показано, что адаптация клеток к гипергликемии приводит к увеличению выброса провоспалительных маркеров PGE2 и TNF и меняет чувствительность клеток к действию агонистов TLR на клеточной линии HeLa и первичных астроцитах крысы.

2. Выявлено, что адаптация астроцитов к гипергликемии не влияет на ДНКсвязывающую активность ядерных рецепторов PPAR, однако меняет уровень экспрессии PPAR, PPAR и PPAR на уровне мРНК и белка.

3. Впервые показано, что при стимуляции TLR4 на астроцитах происходит стабилизация мРНК PPAR, PPAR и PPAR. Установлено, что этот процесс зависит от активации p38 МАРК.

4. Показано, что экспрессия мРНК PPAR, PPAR и PPAR при стимуляции системы врожденного иммунитета увеличивается в присутствии ингибиторов белкового синтеза, т.е. регулируется через механизм «супериндукции», характерный для других генов, участвующих в воспалительных ответах.

5. Охарактеризована вовлеченность в регуляцию экспрессии PPAR, - –, ингибиторов p38, JNK, ERK и MEK1/2 MAPK, фактора транскрипции NF-B.

5. Построена обобщенная схема регуляции экспрессии PPAR, PPAR и PPAR при активации Толл-подобных рецепторов системы врожденного иммунитета на первичных астроцитах крысы в условиях клеточной гипергликемии.

Благодарности Выражаю свою искреннюю благодарность моим научным руководителям Скрябину Константину Георгиевичу и Сергеевой Марине Глебовне за помощь в постановке экспериментов и научные консультации при работе над диссертационным проектом, а также директору Института Нейробиологии университета Отто-фон-Герике г.

Магдебург, (Германия) профессору Георгу Райзеру за курирование и помощь в организации работы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ:

1. Chistyakov D.V., Aleshin S.E., Sergeeva M.G., Reiser G. Regulation of peroxisome proliferator-activated receptor / expression and activity levels by tolllike receptor agonists and MAP kinase inhibitors in rat astrocytes // Journal of Neurochemistry. 2014. V.130 (6) P. 563-74.

2. Грабеклис С.А., Чистяков Д.В., Андреева Л.Ю., Сергеева М.Г. Совместное участие агонистов ядерных рецепторов PPAR и ингибиторов циклооксигеназ в регуляции пролиферации клеток глиомы С6 // Биологические мембраны. 2012.

Т. 29. № 6. С. 429-432.

3. Чистяков Д.В., Попова Н.В., Грабеклис С.А., Алешин С.Е., Сергеева М.Г..

Росиглитазон как регулятор врожденного иммунитета в клеточной модели гипергликемии // Биологические мембраны. 2011. Т. 28. № 6. С. 515-522.

Тезисы конференций и статьи в сборниках:

4. Чистяков Д.В., Борисевич Д.И., Астахова А.А., Ивлиев А.Е., Сергеева М.Г., Скрябин К.Г. Изменение метаболизма жирных кислот при полногеномном анализе разных типов глиомы. // Международная конференция «Липидология – наука XXI века». Москва (Россия). 2013. Т.1, С. 229-233.

5. Чистяков Д.В., Гончар М.В., Сергеева М.Г. Использование ингибиторов белкового синтеза для изучения сигнальных путей в клетках эукариот:

супериндукция и действие бруфена как агониста ядерных рецепторов PPAR. // Международная конференция "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация".

Пущино (Россия). 2013. Т. 2, С. 479-484.

6. Chistyakov D.V., Astakhova A.A., Karatasso U.O., Sergeeva M.G. Comparison of LPS-stimulated and control U937 cells by shotgun lipidomics analysis to distinguish between two types of cellular response. // International сonference «3rd European lipidomics meeting». Pardubice (Czech Republic). 2013. P. 20.

7. Chistyakov Dmitry V., Georg Reiser, Sergeeva Marina G. Mechanisms of superinduction for PPARalpha, PPARgamma, PPARbeta expression in astrocytes.

// International сonference «Nuclear receptors: Linking molecules, genomes & physiology, abstract». Sorrento (Italy). 2013. P. 128.

8. Chistyakov D.V., Astakhova A.A., Sergeeva M.G. Alterations of Toll-like Receptor Signaling Pathway in Glioma. // International сonference «Alternative Strategies against Cancer and Inflammation». Bangkok (Thailand). 2012. P. 89.

9. Чистяков Д.В., Попова Н.В., Грабеклис С.А., Алешин С.Е., Сергеева М.Г.

Взаимосвязь изоформ ядерных рецепторов PPAR при регуляции экспрессии циклооксигеназы СОХ-2 в условиях повышенной концентрации глюкозы. // Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация».

Пущино (Россия). 2011. Т. 1, С. 70-74.

10. Chistyakov D., Grabeklis S., Aleshin S., Sergeeva M. Cells exposition to high glucose environment changes expression of nuclear receptors PPARs and sensitivity to LPS stimulation. // International conference «EMBO: Nuclear receptors. From Molecular Mechanism to Health and Decease». Barcelona (Spain). 2011. P. 121.

11. Чистяков Д.В. Влияние ингибитора p38 MAPK (SB203580) на экспрессию ядерного рецептора PPAR в глиальных клетках мозга при гипергликемии. // XVII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». 2010. С. 75.

12. Чистяков Д.В., Алёшин С.Е., Грабеклис С.А. Сергеева М.Г. Изменение экспрессии ядерных рецепторов PPAR и циклооксигеназы при стимуляции клеток HeLa, липополисахаридом в условиях высокой концентрации глюкозы.

// Всероссийская научная школа для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии». 2009. Звенигород (Россия) С. 32.

13. Руднева В.А., Зезина Е.А., Каратассо Ю.О., Чистяков Д.В.

Бионформатические стратегии в липидомике: применение для медицинской диагностики. // XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». 2008. С. 2-3.




Похожие работы:

«ЖАДАМБАА ДАВААБААТАР ВЛИЯНИЕ ТЕХНОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ НА ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ ДАРХАНСКОГО АЙМАКА МОНГОЛИИ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск – 2015 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» Научный руководитель: Цугленок Николай Васильевич доктор технических наук, профессор Официальные оппоненты: Первышина Галина Григорьевна доктор биологических наук,...»

«СИМАКОВА Александра Николаевна РАЗВИТИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО ПОКРОВА РУССКОЙ РАВНИНЫ И ЗАПАДНОЙ ЕВРОПЫ В ПОЗДНЕМ НЕОПЛЕЙСТОЦЕНЕ – СРЕДНЕМ ГОЛОЦЕНЕ (33-4,8 тыс. л.н.) (по палинологическим данным) Специальность 25.00.02 – Палеонтология и стратиграфия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук Москва, 2008 Работа выполнена в Геологическом институте РАН Научный руководитель доктор...»

«ВОЛОВА НАТАЛЬЯ ЛЬВОВНА ЛУЧЕВАЯ ДИАГНОСТИКА НЕЙРОЭНДОКРИННЫХ ОПУХОЛЕЙ ЛЕГКИХ И СРЕДОСТЕНИЯ 14.01.12онкология 14.01.13лучевая диагностика и лучевая терапия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 201 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» (директор – академик РАН, профессор Давыдов М.И.) Научные руководители: доктор медицинских наук...»

«Шутко Анна Петровна БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ОПТИМИЗАЦИИ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ОТ БОЛЕЗНЕЙ В СТАВРОПОЛЬСКОМ КРАЕ Шифр и наименование специальности 06.01.07 – защита растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Санкт-Петербург – Пушкин – 2013 Работа выполнена на кафедре фитопатологии и энтомологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ставропольский...»

«Шевченко Сергей Михайлович ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА CERASUS L. В УСЛОВИЯХ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Белгород – 2014 Работа выполнена в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Сорокопудов Владимир Николаевич Официальные оппоненты: доктор...»

«ТЕРНОВСКОЙ ГРИГОРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ И АССОРТИМЕНТА ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ ПОВЫШЕННОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ СТОЙКОСТИ ДЛЯ ДИЕТОТЕРАПИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ПОЧЕК Специальность 05.18.01 – Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2012 Работа выполнена в...»

«ЛЮТИКОВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ ДИКОРАСТУЩИХ ЯГОД VACCINIUM VITISIDAEA И OXYCOCCUS PALUSTRIS В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТЕПЕНИ ИХ ЗРЕЛОСТИ И УСЛОВИЙ ХРАНЕНИЯ 02.00.10 – Биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Черноголовка 2013 Работа выполнена на кафедре химии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сургутского...»

«ЕРМОШ ЛАРИСА ГЕОРГИЕВНА НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ ПОВЫШЕННОЙ ПИЩЕВОЙ ЦЕННОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛУБНЕЙ ТОПИНАМБУРА 05.18.01 – Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Красноярск – 2015 Работа выполнена в ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет» доктор биологических наук, профессор...»

«УДК 333.93+577.4 Сорокин Алексей Николаевич ЭКОЛОГИЯ И СИНТАКСОНОМИЯ ПРИМОРСКИХ СООБЩЕСТВ КЛАССОВ CAKILETEA MARITIMAE И HONCKENYO-ELYMETEA ARENARII ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ Специальность: 03.00.16 – «Экология» Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тольятти – 2007 Диссертация выполнена в группе фитоценологии Института экологии Волжского бассейна Российской академии наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Голуб...»

«Астафьева Оксана Витальевна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ GLYCYRRHIZA GLABRA L., ACHILLEA MICRANTHA WILLD. И HELICHRYSUM ARENARIUM L. ДЛЯ РАЗРАБОТКИ БИОПРЕПАРАТОВ С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ставрополь – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханский...»

«МАКСЮТОВ РУСЛАН РИНАТОВИЧ РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И ТОВАРОВЕДНАЯ ОЦЕНКА ЙОДОБОГАЩЁННЫХ КУМЫСНЫХ НАПИТКОВ С ИНУЛИНОМ Специальность 05.18.15 –Технология и товароведение пищевых продуктов и функционального и специализированного назначения и общественного питания (технические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2014 Работа выполнена на кафедре «Технологии продуктов питания и экспертизы товаров» в Федеральном Государственном...»

«ЖИГАДЛОВА Галина Геннадьевна МОРСКИЕ ВОДОРОСЛИ МАКРОФИТЫ ОСОБО ОХРАНЯЕМЫХ ПРИРОДНЫХ ТЕРРИТОРИЙ ВОСТОЧНОЙ КАМЧАТКИ (биоразнообразие, систематика, биология, рациональное использование) 03.00.18 гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петропавловск-Камчатский 2007 Работа выполнена в Лаборатории гидробиологии Камчатского филиала Тихоокеанского института географии ДВО РАН Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«ГУЛЬ ШАХ ШАХ МАХМУД БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЦИТРУСОВОЙ МИНИРУЮЩЕЙ МОЛИ (Phyllocnistis citrella Stainton) В УСЛОВИЯХ ЮГО-ВОСТОЧНОГО АФГАНИСТАНА Специальность 06.01.07 – Защита растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Душанбе – 2014 Работа выполнена на кафедре защиты растений Таджикского аграрного университета им. Шириншоха Шотемура Научный руководитель: Кахаров Кахар Хабибуллаевич доктор сельскохозяйственных наук,...»

«ВОЛЬХИН ИВАН АЛЕКСАНДРОВИЧ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КОРРЕКЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ ПИРАЦЕТАМА 06.02.01 – Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Казань-2015 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ижевская государственная...»

«КУРАНОВА Мирья Леонидовна КЛЕТОЧНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ АТАКСИИ-ТЕЛЕАНГИЭКТАЗИИ 03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Спивак Ирина Михайловна Институт цитологии РАН...»

«ГАБДУЛЛИН ФАИЛЬ ХАРИСОВИЧ ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА МЯСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В РАЦИОНЕ АЭПК «БИОГУММИКС» 06.02.05 Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарносанитарная экспертиза 03.03.01 Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2015 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования...»

«Голиков Алексей Валентинович РАСПРОСТРАНЕНИЕ И РЕПРОДУКТИВНАЯ БИОЛОГИЯ ДЕСЯТИРУКИХ ГОЛОВОНОГИХ МОЛЛЮСКОВ (SEPIOLIDA, TEUTHIDA) В БАРЕНЦЕВОМ МОРЕ И ПРИЛЕГАЮЩИХ АКВАТОРИЯХ Специальность 03.02.04 – Зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2014 Работа выполнена в ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (КФУ) и ФГУП «Полярный НИИ морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н. М. Книповича» (ПИНРО, г....»

«УДК 597.562-152.6.08(268.45) КОВАЛЕВ Юрий Александрович РАЦИОНАЛЬНАЯ ЭКСПЛУАТАЦИЯ ЗАПАСА СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ АРКТИЧЕСКОЙ ТРЕСКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЦЕЛЕВЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОРИЕНТИРОВ Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в Полярном научно-исследовательском институте морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (ФГУП «ПИНРО», г. Мурманск) Научный...»

«ТРЕТЬЯКОВ СЕРГЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ ДИНАМИКА ФОРМИРОВАНИЯ И ПРОДУКТИВНОСТЬ СМЕШАННЫХ СОСНОВЫХ ДРЕВОСТОЕВ СРЕДНЕЙ ПОДЗОНЫ ТАЙГИ ЕВРОПЕЙСКОГО СЕВЕРА РОССИИ 06.03.02 лесоведение, лесоводство, лесоустройство и лесная таксация АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Архангельск 2011 Работа выполнена в Ф Г А О У В П О «Северный (Арктический) федеральный уни­ верситет» Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Черных...»

«Мочалов Александр Сергеевич ПАПОРОТНИКИ УРАЛА Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Томск – 2010 Работа выполнена на кафедре ботаники и в Гербарии им. П.Н. Крылова ГОУ ВПО Томский государственный университет доктор биологических наук, профессор Научный руководитель: Гуреева Ирина Ивановна доктор биологических наук Официальные оппоненты: Тимошок Елена Евгеньевна кандидат биологических наук Куликов...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.