WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ЛЕГКИХ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ...»

-- [ Страница 2 ] --

За последнее десятилетие современный диагностический арсенал значительно расширился за счет ускоренных культуральных методов. В настоящее время для сокращения сроков выращивания МБТ и ускоренного определения ЛУ широко применяются методы с использованием жидких питательных сред и автоматизированных систем: BACTEC 460 МТВ system (Becton Dickinson), ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson), ВАСТЕС 9000 МВ (Becton Dickinson), МВ/ВасТ (Organon Teknika), ВасТ/Alert 3D (BioMerieux), VersaTREK и другие. Указанные системы осуществляют постоянный компьютерный мониторинг роста бактериальной популяции в обогащенной жидкой питательной среде Middlebrook 7H9 и сигнализируют о накоплении минимального количества микроорганизмов.

Кроме сокращения времени диагностики, системы обладают высокой воспроизводимостью и, следовательно, внедрение их в лабораторную практику позволяет повысить качество диагностики [30, 39, 227]. Применение автоматизированных систем максимально стандартизирует методику, так как реактивы для пробоподготовки и компоненты питательных сред производят в заводских условиях на контролируемом производстве. Однако широкое применение культурального метода с использованием автоматизированных систем затруднено из-за дорогостоящего оборудования и питательных сред.

ВАСТЕС 460 МТВ system - первая полуавтоматическая тест-система на жидких средах, позволяет получить результат ЛЧ МБТ в срок 18-30 дней (2-3 недели – выделение МБТ и следующие 4-7 дней - определение ЛЧ). Система использует жидкую среду Middlebrook 7H12. Рост МБТ в ней определяется путем регистрации уровня радиоактивно меченного СО 2, который образуется в процессе микробной утилизации субстрата с пальмитиновой кислотой, содержащей радиоактивный С. Степень накопления МБТ определяется с помощью индекса роста в среде с известной концентрацией ПТП. В индустриально развитых странах система BACTEC 460 получила широкое распространение и стала своеобразным референс-методом для вновь создаваемых систем бульонного культивирования [39, 129, 144, 181].

При очевидных достоинствах радиометрическая система BACTEC 460 имеет ряд недостатков – таких, как полуавтоматический мониторинг роста культуры, значительная трудоемкость операции, работа с радиоизотопами и необходимость утилизации радиоактивных отходов. Для их преодоления в середине 90-х годов прошлого столетия была предложена более совершенная технология флуоресцентной регистрации роста микроорганизмов, которая легла в основу разработки автоматической системы BACTEC MGIT 960.

BACTEC MGIT 960 работает на принципах технологии MGIT, которая содержит модифицированную среду Миддлбрук 7H9 с входящим в нее флюоресцентным индикатором роста (трис-4,7-дифенил-1,10-фенантролина рутениумхлоридпентагидрат), заключенным под силиконом на дне пробирки и погашенным высокой концентрацией кислорода, растворенного в среде. В процессе развития микробная популяция активно поглощает кислород, что приводит к высвобождению флюоресцентного компонента, который начинает светиться при ультрафиолетовом облучении. Увеличение микробной популяции сопровождается усилением свечения, интенсивность которого можно оценить при помощи трансиллюминатора или портативного светоизмерительного прибора контроль над материалом Micromgit, осуществляет встроенный в прибор компьютер. Ускоренный рост кислотоустойчивых бактерий обеспечивается дополнительным внесением жидкой обогатительной добавки (олеиновая кислота, альбумин, декстроза и каталаза). Для предотвращения контаминации добавляется смесь пяти антибиотиков, которые вносятся в индикаторную пробирку перед посевом.

Штамм считается резистентным, если рост детектируется в контрольной пробирке и в пробирке, содержащей ПТП. Детекция занимает от 3 до 14 дней, вместе с тестом на ЛЧ от 24 до 30 дней. Следует отметить, что BACTEC MGIT 960 позволяет определить ЛЧ МБТ ко всем препаратам первого ряда, в том числе и к пиразинамиду [39, 43, 147, 188].

Одна из коммерчески доступных систем МВ/ВасТ была запатентована голландской фирмой Organon Teknika в 1995 г. Она представляет полностью автоматическую систему (постоянный мониторинг сигнала роста) с быстрой неинвазивной колориметрической СО 2-детекцией. Уникальные MB/BacTфлаконы содержат придонный сенсор, изменение цвета которого наблюдается при закислении среды вследствие микробного метаболизма, что регистрируется компьютером. Положительный результат, свидетельствующий о росте МБТ, регистрируется системой в течение 2-3 недель, отрицательный – 42 дней. Время теста на определение ЛЧ занимает 9 дней. При использовании данной системы отсутствуют необходимость в радиоизотопах и риск кроссконтаминации при регистрации результатов.

Другим более совершенным представителем вышеописанного семейства является система нового поколения ВасТ Alert 3D, которую представляет компания BioMerieus [40].

Таким образом, применение бактериологических методов для определения ЛЧ МБТ имеет основной недостаток – длительность проведения анализа. Применение автоматизированных аппаратов с жидкими средами позволяет сократить время определения ЛУ МБТ, однако себестоимость анализа достаточно высока, также необходимо подтверждение специфичности роста МБТ, полученного на жидкой среде [115].

1.4.2. Молекулярно-генетические методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза Задачи МГМ определения ЛЧ или ЛУ МБТ сводятся к выявлению специфических полиморфизмов (мутаций в определенных нуклеотидных последовательностях известных генов), найденных у резистентных микобактерий и отсутствующих у чувствительных штаммов МБТ [18, 24, 95, Основные методы основаны либо на прямом прочитывании 175].

(секвенировании) этих последовательностей после амплификации, либо на гибридизации биотин-меченых фрагментов ДНК, амплифицированных в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с ДНК-зондами. Оба варианта предполагают выявление замен в нуклеотидных последовательностях, которые при использовании ДНК-зондов приводят к отсутствию или неполноценной гибридизации [18].

Методы, основанные на секвенировании Секвенирование – это «золотой стандарт» поиска альтераций в геноме организмов, который заключается в расшифровке последовательности нуклеотидов, составляющих ДНК. Метод позволяет не только точно локализовать мутацию в исследуемой последовательности нуклеотидов, но и определить ее тип [63]. В последние 5 лет происходит настоящий «бум» в развитии этой технологии – появляются «настольные» приборы для полногеномного секвенирования, позволяющие за 1 рабочий день расшифровать весь геном организма. Однако расходные реагенты для такого анализа слишком дороги. При условии снижения стоимости анализа секвенирование может стать незаменимым инструментом не только в научных исследованиях, но и в клинической лабораторной практике.

Методы, основанные на ПЦР Все методы основаны на считывании нуклеотидных последовательностей ДНК хорошо изученных генов, ответственных за ЛУ.

ПЦР в режиме реального времени (аллель-специфическая ПЦР).

Расшифровка специфических участков ДНК позволяет установить определенные точки мутаций, которые приводят к изменениям структуры рецептора лекарственного агента и потере ЛЧ МБТ [40]. Если анализируемый образец не содержит мутаций, то будет идти ПЦР с прямым и обратным праймерами, не мечеными и не содержащими мутаций, и нарастание флюоресценции будет наблюдаться только по флюорофору гибридизационного зонда. Если образец содержит мутацию, то нарастание флюоресценции будет наблюдаться по флюорофору гибридизационного зонда, и по флюорофору 5`-флюоресцентно-меченного аллель-специфичного праймера, который будет встраиваться вместо обычного праймера, не содержащего мутации.

Преимуществами данной технологии являются: значительное снижение времени проведения анализа, удешевление анализа, снижение риска контаминации, высокая чувствительность и возможность получить информацию о присутствии в образце смешанных популяций микобактерий (ЛЧ и ЛУ). На сегодняшний день метод ПЦР в реальном времени является самым быстрым методом, так как результат можно проанализировать непосредственно по окончанию реакции, не проводя электрофореза, гибридизации или еще одной стадии ПЦР. Время определения - 3часа (включая выделение ДНК) [19].

На российском рынке данная методика представлена в наборах фирмы «Синтол» (Россия), которые обеспечивают определение мутаций в генах, ответственных за возникновение устойчивости к изониазиду и рифампицину (набор «Амплитуб-МЛУ-РВ»). Готовится к регистрации набор на выявление мутаций в генах, отвечающих за ЛУ к этамбутолу, аминогликозидам, циклическим пептидам и фторхинолонам.

Сопоставление данных о ЛЧ МБТ, полученных при помощи ПЦР в реальном времени, с результатами бактериологического исследования методом абсолютных концентраций и с помощью системы Bactec выявило конкордантность методов в среднем в 94% и 90%, соответственно [18].

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод анализа конформационного полиморфизма ДНК основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности одноцепочечных ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организации молекул. Метод состоит из двух этапов: на первом этапе проводят амплификацию искомого фрагмента гена, на втором этапе полученные ампликоны разделяют при помощи вертикального электрофореза в высокоразрешающем полиакриламидном геле при пониженной температуре [82, 84, 208]. ПЦР-SSCP позволяет быстро детектировать наличие резистентности к рифампицину и изониазиду. С помощью этого метода можно выявить мутацию, но для определения ее типа необходимо проводить секвенирование или иметь контрольные штаммы МБТ с известными мутациями в исследуемых кодонах.

метод DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) денатурирующего градиентного гель-электрофореза — основан на зависимости свойств денатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т и Г-Ц-пар в исследуемых фрагментах [189]. В отличие от SSCP, он пригоден для анализа более крупных амплифицированных фрагментов ДНК. При исследовании фрагментов до 600 п.н. эффективность выявления мутаций этим методом достигает 95%.

Принцип метода ПЦР-гетеродуплексного анализа (ГДА) основан на сравнении электрофоретической подвижности гетеродуплексов, полученных при гибридизации соответствующих участков ДНК референс-штамма Н37Rv и изучаемого штамма. Электрофорез проводят в полиакриламидном геле.

Вероятность определения точечных мутаций этим способом на фрагментах ДНК менее 300 п.н. достигает 80 - 90%. Детекция мутаций осуществляется как изотопными, так и неизотопными методами [81, 82, 142].

Масс-спектрометрический метод основан на измерении соотношения масса-заряд ионов. Эти ионы образуются вследствие ионизации фрагмента гена МБТ, полученного при ПЦР, отвечающего за устойчивость к определнному ПТП. Преимуществом метода является отсутствие необходимости в мечении ДНК и применении динамического анализа. Однако метод не находит широкого применения в клинической практике из-за громоздкости методики, дороговизны оборудования и необходимости использования большого количества анализируемого образца, строгими ограничениями длины изучаемой последовательности [4, 151].

Система позволяет проводить анализ на наличие GeneXpert Mycobacterium tuberculosis и ее резистентности к рифампицину при помощи теста Xpert MTB/RIF (Cepheid, США). Тест Xpert MTB/RIF является полуколичественной гнездной ПЦР в реальном времени in vitro. GeneXpert включает автоматизированную обработку образцов, амплификацию нуклеиновых кислот и определение интересующей последовательности в простых или сложных образцах с использованием методов ПЦР в реальном времени и ПЦР с обратной транскриптазой. Система состоит из диагностического устройства, персонального компьютера, сканера штриховых кодов и программного обеспечения для проведения тестов и просмотра их результатов. Результаты обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза с одновременным определением лекарственной чувствительности к рифампицину могут быть получены в течение 2,5 часов. Еще одним достоинством данной технологии является отсутствие необходимости в полноценной ПЦР-лаборатории и специально обученном персонале. Однако пропускная способность метода небольшая: параллельно этим методом может быть исследовано от 2 до 16 образцов мокроты [109, 211, 214].

Биологические микрочипы (биочипы) представляют собой упорядоченные библиотеки олигонуклеотидных зондов, нанесенные с помощью роботов или синтезированные in situ на поверхности твердой подложки (стекло, нейлоновая мембрана, силикон или пластик) таким образом, что каждый элемент такого микрочипа содержит индивидуальный зонд с известной последовательностью [2, 17].

Оригинальный подход к созданию биочипов, разрабатываемый Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ООО «Биочип») с 1988 года, ориентирован на определение последовательности ДНК новым методом секвенирования путем гибридизации с библиотекой иммобилизованных олигонуклеотидных зондов. Сущность метода заключается в том, что олигонуклеотидные зонды иммобилизованы не на поверхности подложки, а в трехмерном объеме гидрофильного геля.

Подобный подход обладает целым рядом преимуществ. Во-первых, емкость трехмерных ячеек в отношении иммобилизованного олигонуклеотида гораздо выше, чем при двумерной иммобилизации, что значительно повышает чувствительность анализа. Во-вторых, для иммобилизации используются индивидуальные высоко очищенные олигонуклеотиды, в то время как при синтезе олигонуклеотидов in situ только 40% (при длине 10 оснований) или 15% (при длине 20) от иммобилизованных олигонуклеотидов будут полноразмерными. Таким образом, предварительная очистка олигонуклеотидов позволяет значительно улучшить надежность определения последовательности, снижает себестоимость и дает возможность интерпретировать результаты гибридизации с использованием аппаратнопрограммных комплексов, стоимость которых на порядок ниже, чем зарубежных аналогов [2]. Результаты гибридизации регистрируют на портативном анализаторе биочипов – «Чипдетекторе» с соответствующим программным обеспечением [84].

Для определения ЛЧ МБТ разработаны два варианта биочипов: «ТББиочип» - инструмент для детекции МБТ (определение генетического маркера IS6110) c одновременным определением чувствительности МБТ к рифампицину и изониазиду (выявление наиболее значимых мутаций в генах rроВ (27 типов), katG (11), inhA (5) и ahpС (5)) [33, 143] и «ТБ-БИОЧИП-2» инструмент для определения ЛЧ МБТ к фторхинолонам (выявление 9 типов значимых мутаций в гене gyrA) [3]. Время определения - 9-24 часа (2-3 рабочих дня, учитывая 6-часовой рабочий день).

Результаты определения ЛЧ МБТ к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам, полученные при помощи метода биочипов, обладают высокой степенью корреляции с результатами определения ЛЧ к ПТП традиционным методом и могут быть получены в значительно более короткие сроки. По данным литературы, детекция ЛЧ МБТ в клинических образцах при помощи гибридизации на биочипах хорошо коррелировала с результатами бактериологических тестов [2, 14, 84]. Так же был показан высокий процент совпадения результатов ЛЧ МБТ, полученных при тестировании мутаций методом биочипов и секвенирования [60].

Line probe assay (Lipa) - метод, основанный на принципе твердофазной множественной обратной гибридизации. В основе метода лежит ПЦР с биотинилированными праймерами, ограничивающими участки генов, в которых возможно возникновение искомых мутаций. После получения ампликонов проводят множественную обратную гибридизацию на стриповых мембранах-полосках, на которых иммобилизованы искусственно синтезированные нуклеотиды, содержащие или не содержащие мутации. В зависимости от того, содержит ли выделенная ДНК мутации или нет, ампликоны будут гибридизоваться с олигонуклеотидами с мутациями или без.

После гибридизации следуют процедуры отмывки от несвязавшихся продуктов и проявление гибридизационных полос, окрашенных в пурпурный или коричневый цвет. Результат считывается вручную или автоматически в специальном анализаторе. Время получения результата -1-2 дня (6 часов) [108, 214].

На российском рынке технология представлена германской фирмой Hain Lifescience (Hain-тесты). Фирма выпускает тесты на определение мутаций, ответственных за возникновение устойчивости к рифампицину и изониазиду а также этамбутолу, фторхинолонам и (GenoType®MTBDRplus), аминогликозидам (GenoType®MTBDRsl). Также данный метод используют в коммерческих наборах INNO-Lipa, производимых фирмой «INNOGENETICS»

(Бельгия).

По литературным данным результаты сравнения данных о ЛУ МБТ, полученные методом абсолютных концентраций и Наin-тестов, а также методом биочипов и Наin-тестов совпадают в большом проценте случаев [36, 44].

Метод идеально подходит для определения мутаций для большинства штаммов МБТ, но он не детектирует вставки, делеции и мутации в регионах, которые не покрываются используемыми зондами. Поэтому данный метод может быть использован как скрининговый, но отрицательный результат должен быть проверен другими методами [114].

МГМ определения ЛЧ МБТ по быстроте получения результатов стоят на первом месте. Тем не менее, полностью отказаться от микробиологических методов определения ЛЧ пока невозможно, так как не для всех ПТП найдены генетические механизмы формирования ЛУ. К тому же, высокую сходимость с результатами фенотипической ЛЧ показали молекулярные тесты на чувствительность к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам, однако, что касается этамбутола, аминогликозидов и циклических пептидов, молекулярные методы оказались менее точными, совпадения не превышают 50-80%. Также в некоторых образцах возможно присутствие нескольких штаммов МБТ, обладающих различной ЛУ к ПТП. Правильно их идентифицировать позволит только одновременное тестирование несколькими методами, одним из которых должен быть молекулярно-биологический, другим – традиционный бактериологический с использованием различных концентраций ПТП. Кроме того, результаты, полученные при одновременном применении нескольких подходов, могут оказаться полезными для изучения зависимости минимальной ингибирующей концентрации ПТП от мутации, определяющей резистентность [82].

Резюме

Анализ литературы свидетельствует о высокой частоте распространения в мире множественно лекарственно устойчивого туберкулеза. Одной из основных причин распространения микобактерий туберкулза с множественной лекарственной устойчивостью является позднее определение лекарственной устойчивости [124]. Использование ускоренных методов микробиологической диагностики туберкулеза позволяет на этапе обследования больного при поступлении в стационар выявлять устойчивость микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам и назначать адекватный режим химиотерапии в интенсивную фазу лечения, что сокращает сроки абациллирования, повышает эффективность лечения и предотвращает распространение лекарственно устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза [54].

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая характеристика материалов исследования В основу работы положены результаты когортного исследования патологического материала, полученного от генеральной совокупности 291 больного, находящегося на хирургическом этапе лечения туберкулеза в период с 01.01.2010 г. по 01.06.2011г. с диагнозами «туберкулема», «кавернозный туберкулез» и «фиброзно-кавернозный туберкулез (ФКТ)»

легких, подтвержденный гистологическими методами исследования. Отбор больных на оперативное лечение осуществлялся оперирующими фтизиохирургами по общепринятым показаниям, оперативные вмешательства выполнялись по единой методологии на базе клиники Уральского НИИ фтизиопульмонологии.

Для оценки результатов определения ЛУ МБТ, полученных из респираторного материала на терапевтическом этапе лечения больных, был проведен ретроспективный анализ первичной медицинской документации больных, прооперированных в клинике УНИИФ по поводу туберкулеза легких в 2010-2011 гг. (n=291).

В данной работе также изучены результаты проспективного исследования резецированных участков легких (n=291), мокроты (n=127) и промывных вод бронхов (ПВБ) (n=92), культуры МБТ, выделенные из респираторного материала (n=37) и резецированных участков легких (n=65) больных, оперированных по поводу туберкулеза легких в клинике УНИИФ в 2010-2011 гг.

Для исследования респираторного материала культуральными методами удалось получить 197 образцов (107 образцов мокроты и 90 образцов ПВБ) от 110 больных, молекулярно-генетическими –161 образец (75 образцов мокроты

–  –  –

Из таблицы 2.1 видно, что среди оперированных больных преобладали мужчины - 198 пациентов (68,0% (95% ДИ 62,3%-73,3%)). Более половины (50,9% (95% ДИ 45,0%-56,8%)) из числа наблюдаемых составили пациенты трудоспособного возраста - от 30 до 49 лет. В возрасте до 29 лет было 116 (39,8% (95% ДИ 34,1%-45,7%)) пациентов, в возрасте 50 лет и старше - 27 (9,3% (95% ДИ 6,2%-13,2%)). Средний возраст пациентов – 34 (26-42) года.

Соотношение мужчин и женщин по каждой возрастной группе было примерно одинаковым, различие статистически не достоверно (2=4,01; р=0,13).

–  –  –

Дизайн исследования представлен на рисунке 2.1. Культуральными и МГМ у больных исследовали двукратно мокроту или ПВБ (при возможности получения материала) непосредственно перед операцией и резецированные участки их легких.

–  –  –

Для проведения исследований мокроту и ПВБ собирали в стерильные пластиковые пробирки мкостью 50 мл с герметически завинчивающимися крышками. Респираторный материал подвергали обработке для концентрирования МБТ и деконтаминации образца в соответствии со следующей методикой. К 1 объму клинической пробы добавляли равный объм 10% трехзамещенного фосфорнокислого натрия (Na3PO4). Пробирки помещали на 10 минут на встряхиватель и оставляли на 18-20 часов в термостате при 37 °С. После этого пробирки центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали стерильной пипеткой, оставив в каждой пробирке 1,2-1,5 мл осадка. К осадку стерильно добавляли несколько капель 1% лимонной кислоты до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской. Далее проводили еще одну процедуру отмывки 10-15 мл дистиллированной воды, супернатант удаляли, оставляя 0,8-1,0 мл осадка. Отмытый таким образом осадок делили на 3 части для: 1) приготовления мазка 2) посева на плотные питательные среды 3) выделения ДНК МБТ.

Нефиксированный резецированный материал в течение одного часа после операции доставлялся в микробиологическую лабораторию, где в стерильных условиях в боксе биологической безопасности патологоанатомом осуществлялось первичное морфологическое исследование (рис. 2.2).

–  –  –

При этом из наиболее крупной туберкулемы или каверны (при наличии распада – из зоны распада) одноразовыми стерильными инструментами вырезали кусочки ткани для культуральных и молекулярно-генетических исследований (рис. 2.3).

Рисунок 2.3 Забор операционного материала для исследования культуральными и молекулярно-генетическими методами Кусочки ткани для исследования МГМ помещали в микроцентрифужные пробирки с 500 мкл транспортной среды (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия) (рис.

2.4).

–  –  –

Кусочки ткани для культуральных исследований собирали в стерильные пластиковые пробирки мкостью 50 мл с герметически завинчивающимися крышками, заливали равным объемом 10% трехзамещенного фосфорнокислого натрия (Na3PO4) (рис. 2.5), помещали на 10 минут на встряхиватель и оставляли на 18-20 часов в термостате при 37 °С. После этого операционный материал измельчали, гомогенизировали и центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали стерильной пипеткой, оставив в каждой пробирке 1,2-1,5 мл осадка. К осадку стерильно добавляли несколько капель 1% лимонной кислоты до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской. Далее проводили еще одну процедуру отмывки осадка 10-15 мл дистиллированной воды, супернатант удаляли, а осадок в объеме мл готовили к 0,8-1,0 инокулированию и приготовлению мазка.

Рисунок 2.5 Забор материала для проведения культуральных исследований

–  –  –

2.2.1. Бактериологические методы исследования Микробиологическое исследование диагностического материала включало люминесцентную микроскопию фиксированных препаратов из деконтаминированных осадков мокроты, ПВБ и гомогенизированных кусочков операционного материала, посев осадка на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена («Himedia Laboratories», Индия), с последующим определением ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций.

Микроскопическое и культуральное исследования проводились параллельно из одной и той же пробы диагностического материала.

Метод посева отличается большей чувствительностью, чем микроскопия мазков. Он позволяет обнаружить жизнеспособные особи МБТ в исследуемом материале и имеет большую диагностическую ценность. Очень важным преимуществом культурального исследования является возможность получения культуры возбудителя, которая может быть идентифицирована и изучена в отношении ЛЧ и других биологических свойств МБТ.

Для посева использовали плотную питательную среду ЛевенштейнаЙенсена, так как она недорогая, проста в приготовлении, способна подавлять рост сопутствующей микрофлоры и обеспечивать хороший рост микобактерий. Приготовление питательной среды осуществляли согласно инструкции производителя («Himedia Laboratories», Индия).

Процедура посева и инкубации (в соответствии с приказом МЗ РФ № 109 от 21.03.2003г. [71]). Стерильной мерной одноразовой пластиковой пипеткой набирали 1,0–1,2 мл подготовленного осадка, оставив приблизительно 0,1–0,2 мл для последующего приготовления мазка для микроскопии. Вносили равные объемы посевного материала (примерно по 0,5–0,6 мл) в 2 пробирки с плотной питательной средой на верхнюю третьскошенной поверхности среды.

Засеянные пробирки закрывали ватно-марлевыми пробками и помещали в вертикальном положении в штатив таким образом, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей поверхности питательной среды.

Засеянные пробирки перемещали в горизонтальные штативы и помещали в термостат при температуре 37 °С. По истечение первых 2–3 суток инкубации ватно-марлевые пробки заменяли герметичными силиконовыми пробками, а пробирки переводили в вертикальное положение. Инкубацию проводили в течение 10 недель при обязательном еженедельном просмотре засеянных пробирок.

При оценке результатов регистрировали следующие параметры:

1. Скорость роста или появление роста – дату появления роста в пробирках. Появление колоний микобактерий туберкулеза в срок до 30 дней считали быстрым ростом, от 30 до 50 дней – замедленным и свыше 50 дней – медленным ростом.

2. Массивность роста или интенсивность роста – число колоний, выросших в каждой из пробирок. При наличии одновременного роста во всех пробирках оценивали суммарное число колониеобразующих единиц (КОЕ) во всех пробирках, засеянных данным материалом. Скудным рост считали при массивности роста до 20 колоний (1+), умеренным – 21-100 колоний (2+), обильным – свыше 100 колоний (3+).

3.Загрязнение посева посторонней микрофлорой («пророст»), при наличии такового.

4. Отсутствие роста. Указанный параметр регистрировали через 10 недель культивирования.

Жизнеспособность штаммов МБТ при выделении их из диагностического материала оценивали как низкую, если массивность роста была менее 20 колоний, а длительность – более 30 дней, как высокую, если массивность роста более 100 колоний, длительность менее 30 дней, как среднюю – при других сочетаниях массивности и длительности роста.

Характеристика колоний M. Вирулентные культуры tuberculosis.

микобактерий туберкулеза обычно растут на плотных питательных средах в виде колоний R-формы различной величины и вида, имеют желтоватый или слегка кремовый оттенок (цвет слоновой кости), шероховатую поверхность, напоминающую манную крупу или цветную капусту. Колонии, как правило, сухие, морщинистые, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента некоторых сапрофитных нетуберкулезных микобактерий. После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (Sформы) [40].

Бактериологический анализ ЛЧ МБТ проводили непрямым методом абсолютных концентраций с использованием плотной яичной питательной среды Левенштейна-Йенсена (для определения ЛУ использовали штаммы МБТ, предварительно выделенные на питательных средах при посевах диагностического материала). Техника исследования соответствовала утвержденной приказом МЗ РФ № 109 от 21.03.2003г [71].

Культуры M. tuberculosis по чувствительности к основным ПТП делили на ЛЧ и ЛУ. ЛЧ МБТ определяли к четырем препаратам первого ряда изониазиду, рифампицину, этамбутолу, стрептомицину, а также к канамицину, как к наиболее часто используемому в России ПТП резервного ряда.

Критическая концентрация составляла для изониазида – 1 мкг/мл, для рифампицина – 40 мкг/мл, для этамбутола – 2 мкг/мл, для стрептомицина – 10 мкг/мл, для канамицина – 30 мкг/мл.

Культура расценивалась как устойчивая к данной концентрации ПТП только при наличии на пробирке с этой концентрацией 20 и более колоний при обильном росте в контрольной пробирке, не содержащей ПТП.

Для проведения люминесцентной микроскопии уровень рН осадка материала, приготовленного вышеописанным методом, доводили до 6,8-7,0.

Пипеткой на стекло наносили 1-2 капли осадка, которые распределяли тонким слоем в центре стекла на площади 2х1 см. Далее мазки высушивали в течение минут при комнатной температуре в биологическом шкафу 15-20 безопасности. Фиксацию мазков проводили в сухожаровом шкафу при 65-75 о С в течение 2 часов. Окраску препаратов осуществляли методом окраски аурамином ОО и родамином С [31]. Для просмотра препаратов использовали люминесцентный микроскоп Германия) с Axiostar plus (Carl Zeiss, увеличением 400 (объектив 40х, окуляр 10х/18).

При обработке препарата диагностического материала люминесцентными красителями, которые связываются с воскоподобными структурами микробной клетки и проникают в ее цитоплазму, последующее облучение препарата возбуждающим источником света вызывало оранжевое или яркожелтое свечение окрашенных клеток микобактерий на черном или темнозеленом фоне.

Для выдачи отрицательного результата исследования или выявления единичных кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) просматривали 200 полей зрения. При наличии в мазке значительного количества КУМ исследовали от 10 до 20 полей зрения.

При микроскопическом исследовании количественная оценка препаратов давалась согласно приказу № 109 от 21.03.2003г («О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», приложение №11) по следующей градации [71]:

меньше 10 КУМ в препарате – единичные КУМ;

10-99 КУМ в препарате – 1+;

1-10 КУМ в 1 поле зрения, в каждом из 10-20 просматриваемых полей зрения

– 2+;

более 10 КУМ в 1 поле зрения в каждом из 5-10 просматриваемых полей зрения – 3+.

2.2.2. Молекулярно-генетические методы исследования

Все молекулярно-генетические методы проводились в лаборатории УНИИФ, выполняющей молекулярно-биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарноэпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности».

2.2.2.1. Выделение ДНК МБТ из клинического материала и лизирование культур МБТ Обработанный, как указано выше, осадок мокроты и ПВБ в количестве 1 мл переносили в пробирку типа «Эппендорф» мкостью 1,5 мл.

Операционный материал предварительно гомогенизировали при помощи пластикового пестика. Обработку первичного материала для выделения ДНК проводили коммерческим набором «ДНК-сорб-В» («АмплиСенс», ООО «ИнтерЛабСервис», Россия) согласно инструкции производителя. На стадии выделения ДНК МБТ использовали внутренний, внесенный в тестируемый образец в самом начале анализа, и отрицательный контроли («АмплиСенс», ООО «ИнтерЛабСервис», Россия).

Хранение материала (в случае отсроченного выполнения анализа, резервирования материала для возможной перестановки, а также хранения архивных образцов) осуществляли по следующей схеме: предполагаемое хранение в течение 3 суток – температура от 2 до 8 °С; хранение не более 1 года - температура минус 18 °С; архивирование образцов на срок более 1 года

– температура минус 70 °С. Допускали двукратное замораживание-оттаивание остального клинического материала.

Культуры МБТ снимали с твердой питательной среды ЛевенштейнаЙенсена одноразовой микробиологической петлей, суспензировали в растворе, содержащем 0,9% NaCl, и оставляли в термостате при температуре плюс 95 оС на 30 минут для лизирования культур. Далее пробирки центрифугировали 1 минуту при 3 тыс. g. Супернатант использовали для постановки ПЦР при VNTR типировании.

2.2.2.2. Обнаружение ДНК M. tuberculosis complex методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ)

Обнаружение ДНК МБТ методом ПЦР-РВ включало в себя:

одновременную амплификацию фрагмента ДНК МБТ и фрагмента ДНК внутреннего контрольного образца и гибридизационно-флуоресцентную детекцию, которая производится непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени». Для амплификации специфической нуклеотидной последовательности IS6110 геномного материала M. tuberculosis complex методом ПЦР-РВ применяли коммерческую тест-систему «АмплиСенс®MTCFL» (ООО «ИнтерЛабСервис», Москва) и амплификатор iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). На стадии амплификации использовали отрицательный и положительный контроли («АмплиСенс», ООО «ИнтерЛабСервис», Россия).

Полученные данные – кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам – анализировали после окончания работы амплификатора с помощью программного обеспечения используемого прибора и рекомендаций производителя тест-систем. Гибридизационно-флуоресцентную детекцию специфической мишени проводили по каналу FAM, ВКО – по каналу HEX.

Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (устанавливали в середине линейного участка прироста флуоресценции положительного контроля в логарифмической шкале), что соответствовало наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (Ct).

Результат амплификации по каналу считали положительным, если кривая флуоресценции имеет типичную для ПЦР-РВ S-образную форму и однократно пересекается с пороговой линией в области достоверного прироста флуоресценции, отрицательным – в случае отсутствия кривой типичной формы, не пересекающейся с пороговой линией, сомнительным – во всех остальных случаях. При получении невалидного результата проводили повторную амплификацию образца, в случае повторного получения аналогичного результата повторяли анализ образца, начиная с этапа экстракции ДНК.

По данным производителя аналитическая чувствительность данной тестсистемы составляет 1-5х102 микробных тел на 1 мл, специфичность – 100%.

Хранение архивных образцов ДНК МБТ осуществляли при температуре минус 70 °С.

Высокая чувствительность, специфичность и быстрота проведения анализа чрезвычайно ценны для клинической практики, однако метод не позволяет определять степень жизнеспособности выявляемых микроорганизмов.

2.2.2.3. Определение ЛЧ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам методом биочипов Все образцы с положительными результатами на IS6110 подвергали исследованию на наличие мутаций. Для исследования мутаций ЛУ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам использовали метод гибридизации с флуоресцентным изображением на биологическом микрочипе «ТБ-Биочип®» и «ТБ-Биочип®-2» (ООО «Биочип-ИМБ», Россия). На рисунках

2.6 и 2.7 представлены схемы биочипов для выявления мутаций, приводящих к устойчивости к указанным противотуберкулезным препаратам.

Дискриминирующие олигонуклеотиды, размещенные на биочипах, способны обнаруживать мутации в генах rpoB, katG, inhA, ahpC и gyrA.

Рисунок 2.6 Схема размещения дискриминирующих олигонуклеотидов на биочипе для выявления мутаций, приводящих к устойчивости к рифампицину и изониазиду Рисунок 2.

7 Схема размещения дискриминирующих олигонуклеотидов на биочипе для выявления мутаций, приводящих к устойчивости к фторхинолонам Подготовку образцов ДНК МБТ для гибридизации осуществляли при помощи двухэтапной мультиплексной амплификации участков генов, мутации в которых приводят к возникновению ЛУ, на амплификаторе «Терцик» (ООО «ДНК-технология», Россия). Амплификационную смесь готовили согласно инструкции к пользованию наборами «ТБ-Биочип®» и «ТБ-Биочип®-2» (ООО «Биочип-ИМБ», Россия). Реакционную смесь (2 мкл) после первой стадии ПЦР использовали в качестве матрицы при проведении второй ее стадии.

Вторую стадию ПЦР проводили с праймерами, меченными флюоресцентной меткой СY-5, и получали преимущественно одноцепочечный меченный продукт.

Полученные меченые ампликоны гибридизировали с иммобилизованными на микрочипе олигонуклеотидными зондами в течение 12 часов при температуре 37 оС. По окончании гибридизации биочип трижды промывали дистиллированной водой при 37 °С, высушивали в струе воздуха до полного исчезновения капель на поверхности подложки.

Анализ результатов гибридизации детектировали с помощью аппаратнопрограммного комплекса для анализа изображений биочипов «Чипдетектор-01»

с использованием специализированного программного обеспечения «Imageware»

(ООО «Биочип-ИМБ», Россия). Инсталляцию и эксплуатацию комплекса осуществляли в соответствии с инструкцией по пользованию комплексом.

Гелевые ячейки, содержащие олигонуклеотиды, объединены в группы таким образом, что сравнение интенсивностей флуоресцентных сигналов ячеек каждой группы позволяло делать заключение о наличии или отсутствии мутаций (минорного полиморфизма), приводящей к замене одного аминокислотного остатка.

Максимальный флуоресцентный сигнал свидетельствовал об образовании совершенного гибридизационного дуплекса в ячейке, где данный сигнал был зарегистрирован. Если такой сигнал регистрировался в ячейке с иммобилизованным олигонуклеотидом, комплементарным ДНК МБТ чувствительного типа, то это говорило о том, что в исследуемом участке образец ДНК мутаций не имеет и является чувствительным к ПТП. В случае регистрации максимального сигнала в иной ячейке внутри рассматриваемой группы, считали, что изучаемый образец содержит мутацию, соответствующую комплементарному основанию, входящему в состав иммобилизованного олигонуклеотида, и является устойчивым к ПТП.

–  –  –

Методом MIRU-VNTR типирования было исследовано 18 культур МБТ, полученных от 7 больных (7 изолятов, выделенных из операционного материала, и 11 изолятов, выделенных из респираторного материала этих же больных).

Изоляты были генотипированы с использованием 7 локусов: MIRU10, MIRU26, MIRU31, Mtub21, ETRA, QUB26, QUB11b.

Для постановки ПЦР использовали реактивы производства «Интерлабсервис» (Москва). Праймеры для ПЦР были взяты из работы P.

Supply [206] и Iwamoto T. [155] и синтезированы в ООО «Синтол» (Москва).

ПЦР осуществляли в термоциклере «Терцик» (ООО «ДНК-технология», Москва). Объем реакционной смеси составил 25 мкл. ПЦР смесь1, общий объем 5 мкл: праймеры – по 1 мкл прямого и обратного (конечная концентрация 200 мкМ/л каждый), dNTPmix – 2,5 мкл (конечная концентрация 200 мкМ/л), стерильная дистиллированная вода – 0,5 мкл. ПЦРсмесь2, общий объем 18 мкл: 5ПЦР-буфер – 4 мкл, MgСl2 – 2 мкл (конечная концентрация 2,0 мМ/л), ДиаТак-полимераза – 0,2 мкл (1 ед), стерильная дистиллированная вода – до 18 мкл. ПЦР смесь1 и ПЦР смесь2 разделяли воском. В смесь вносили по 2 мкл ДНК, полученной, как указано в п. 2.2.2.1.

Условия проведения ПЦР: 15 мин – 95 оС, 40 циклов: 30 сек. – 95 оС, 30 сек. – 60 оС, 45 сек. – 72 оС, 10 мин – 72 оС.

При постановке ПЦР в качестве положительного контроля использовали штамм M. tuberculosis H37Rv, отрицательного – ТЕ-буфер.

Продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, с использованием камеры для горизонтального электрофореза Sub Cell GT System (Bio-Rad, США). Для определения длин продуктов амплификации на один гель с образцами вносили маркер молекулярной массы 1kb «Интерлабсервис»).

(DNA Ladder, Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей.

Результаты ПЦР наблюдали в геле в виде светящихся полос при ультрафиолетовом излучении с помощью системы документации гелей «GelDoc» (BioRad, США). Число повторов в MIRU-VNTR-локусах определяли по длине продукта ПЦР согласно таблице 2.2.

–  –  –

MIRU-VNTR-профиль для каждого изолята записывался в виде набора цифр, соответствующих числу повторов в локусах в следующем порядке:

MIRU10, MIRU26, MIRU31, Mtub21, ETRA, QUB26, QUB11b.

Принадлежность изолятов к генетической линии определяли путем сравнения полученных MIRU-VNTR профилей изолятов с имеющимися в базе данных «MIRU-VNTRplus» (http://www.miru-vntrplus.org).

2.2.3. Методы статистической обработки результатов исследований

Анализ результатов исследования проведен с помощью компьютерной базы данных, созданной на основе системы Access (Microsoft Office).

Результаты проведенных исследований статистически обработаны согласно общепринятым методам [66, 94] с использованием лицензионной компьютерной программы MedCalc ® V12.6.1 (MedCalc Software, Бельгия).

Для оценки характера распределения количественных признаков применялась визуальная оценка частотного распределения (по гистограмме и графику нормальности) с последующим использованием критерия Д’Агостино. Параметрические количественные признаки описаны в виде среднего значения и стандартного отклонения (в скобках). Непараметрические количественные приведены в виде медианы и границ 25% и 75% межквартильного интервала (в скобках). Для бинарных и качественных признаков приведены абсолютное количество и доля с 95%-ым доверительным интервалом (ДИ) для доли (в скобках), представлены как n% (ДИ 95% n1 – n2).

Сравнительный анализ количественных признаков выполнен с помощью дисперсионного анализа (при нормальном распределении признака; после проверки однородности дисперсии критерием Ливине) либо критерием Крускала-Уолиса. Сравнения качественных признаков проводились критерием Хи-квадрат с последующим поиском межгрупповых различий этим же критерием с помощью процедуры Холма.

Для всех статистических критериев ошибка первого рода устанавливалась равной 0,05. Нулевая гипотеза (отсутствие различий) отвергалась, если вероятность (p) не превышала ошибку первого рода [26].

Резюме

С целью изучения клинически значимых биологических свойств микобактерий туберкулеза большое внимание было обращено на исследование респираторного и операционного материала современными молекулярно-генетическими методами, а также были применены методы люминесцентной микроскопии и посева на плотные питательные среды, определена лекарственная чувствительность выросших на питательной среде M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам.

Метод биочипов позволил проанализировать мутации в генах rpoB, katG, inhA, ahpC и gyrA, ответственных за чувствительность микобактерий туберкулеза к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам.

ГЛАВА 3. РОЛЬ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ

ТУБЕРКУЛЕЗА И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ ЛЕКАРСТВЕННОЙ

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ

УЧАСТКОВ ЛЕГКИХ И РЕСПИРАТОРНОГО МАТЕРИАЛА

Одной из задач исследования являлось изучение роли культуральных и молекулярно-генетических методов выявления микобактерий туберкулеза и определения их лекарственной чувствительности при исследовании операционного и респираторного материала, полученного от больных, находящихся на хирургическом этапе лечения туберкулеза легких. Для решения этой задачи исследовали мокроту и промывные воды бронхов, полученные непосредственно перед оперативным лечением, и резецированные участки легких от 291 больного туберкулзом лгких следующими методами:

микробиологическим (бактериоскопия, посев на плотные питательные среды, метод абсолютных концентраций на плотной питательной среде ЛевенштейнаЙенсена) и молекулярно-генетическим (Real-time PCR, Биочип).

3.1. Выявляемость микобактерий туберкулеза и определение их лекарственной чувствительности культуральными методами При исследовании респираторного материала (мокроты, ПВБ), полученного непосредственно перед операцией, методом люминесцентной микроскопии кислотоустойчивые микобактерии (КУМ) были обнаружены в 27 (13,7% (95% ДИ 9,2%-19,3%)) образцах из 197 (рис. 3.1). При этом единичные КУМ были найдены в 5 (2,5% (95% ДИ 0,8%-5,8%)) образцах, КУМ в количестве 1+ - в 12 (6,1% (95% ДИ 3,2%-10,4%)) и 3+ - в 10 (5,1% (95% ДИ 2,5%-9,2%)) образцах (Табл. 3.1). КУМ в количестве 2+ обнаружены не были.

97.9 59.5 22.3 19.9 18.8 13.7 %

–  –  –

Таким образом, при исследовании операционного материала методом люминесцентной микроскопии достоверно выявляется в 4 раза больше КУМ, чем при исследовании респираторного материала, полученного непосредственно перед оперативным лечением (2=101,6; р0,01).

При посеве на плотные питательные среды были получены 37 (18,8% (95% ДИ 13,6%-25,0%)) культур из 197 образцов респираторного материала и 65 (22,3% (95% ДИ 17,6%-27,5%)) культур из 291 образца операционного материала. Выявляемость МБТ, выделенных из респираторного и операционного материала методом посева статистически не различается (2=0,89; р0,34) (рис. 3.1).

Далее было проведено исследование выросших культур МБТ на чувствительность к ПТП (H, R, E, S, K) методом абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена (Рис. 3.2). Лекарственную чувствительность МБТ удалось определить в 37 (18,8% (95% ДИ 13,6%из 197 образцов респираторного материала и в 65 (22,3% (95% ДИ 17,6%-27,5%)) из 291 образца операционного материала Установлено, что определение ЛЧ МБТ, выделенных из респираторного и операционного материала, методом абсолютных концентраций статистически не различается (2=0,89; р0,34).

95.9 22.3 18.8 7.5 %

–  –  –

Результаты оценки ЛУ МБТ, полученных из респираторного материала, приведены в таблице 3.3, из которой видно, что показатель устойчивости к стрептомицину оказался наиболее высоким и составил 89,2% (95% ДИ 74,6%Показатели устойчивости к рифампицину и изониазиду составляют 86,5% (95% ДИ 71,2%-95,5%). Более низкий показатель отмечали у этамбутола – 75,7% (95% ДИ 58,8%-88,2%) и канамицина – 59,5% (95% ДИ 42,1%-75,3%).

–  –  –

Результаты определения ЛЧ МБТ, полученных из операционного материала, методом абсолютных концентраций представлены в таблицах 3.4 и 3.5.

Как видно из таблицы 3.4, устойчивые к изониазиду, рифампицину, этамбутолу и стрептомицину МБТ, выделенные из операционного материала, составили 41,5% (95% ДИ 29,4%-54,4%) (27 из 65), устойчивые ко всем 5 препаратам – 21,5% (95% ДИ 12,3%-33,4%) (14 из 65), устойчивые к изониазиду, рифампицину и стрептомицину – 10,8% (95% ДИ 4,5%-21,0%) (7 из 65). Остальные комбинации препаратов представлены единичными случаями. Чувствительных культур МБТ, полученных из резецированных участков легких, выявлено не было. Обращает на себя внимание

–  –  –

Результаты оценки ЛЧ МБТ, выделенных из резецированных участков легких, приведены в таблице 3.5, из которой видно, что показатель устойчивости к стрептомицину и изониазиду оказался наиболее высоким и для обоих препаратов составил 92,3% (95% ДИ 82,9%-97,5%). Показатели устойчивости к рифампицину и этамбутолу также достаточно высоки и

–  –  –

Таким образом, культуральные методы позволяют выявить жизнеспособные МБТ и достоверно определить их ЛЧ с одинаковой частотой как при исследовании резектатов легких, так и респираторного материала (2=0,89; р0,34).

Однако сроки получения результатов непрямым методом абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена (2-3 месяца), обусловленные продолжительным ростом микобактериальной популяции, достаточно длительны, что не позволяет своевременно назначить пациенту адекватный режим химиотерапии с учетом характера ЛУ.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Похожие работы:

«Зотина Екатерина Николаевна КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА В АСИМПТОМАТИЧЕСКОЙ ФАЗЕ 14.01.21 – гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук,...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Леонов Вячеслав Сергеевич Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломычеловека 6/11 и 16/18 типов 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«СИМАНИВ ТАРАС ОЛЕГОВИЧ ОПТИКОМИЕЛИТ И ОПТИКОМИЕЛИТ-АССОЦИИРОВАННЫЕ СИНДРОМЫ ПРИ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ 14.01.11 – Нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук М. Н. Захарова Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Обзор литературы Оптиконевромиелит Аквапорины и их биологическая функция 13 Патогенез...»

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент И.В. КИСЕЛЕВА Санкт-Петербург – ОГЛАВЛЕНИЕ Раздел 1....»

«Сигнаевский Воладимир Дмитриевич МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОДУКТИВНОСТИ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТОВ САРАТОВСКОЙ СЕЛЕКЦИИ Специальность 03.02.01 — ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н.,...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«ГАЛИНИЧЕВ АНДРЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ ЦИКАДОВЫЕ (HEMIPTERA, CICADINA) УРАЛА: СОСТАВ ФАУНЫ, ЭКОЛОГИЯ И ХОРОЛОГИЯ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Г. А. Ануфриев...»

«ТОМОШЕВИЧ Мария Анатольевна ФОРМИРОВАНИЕ ПАТОКОМПЛЕКСОВ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» 03.02.08 – «Экология» Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: д.б.н., академик РАН Коропачинский И.Ю. Новосибирск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ: ВВЕДЕНИЕ.. 4 ГЛАВА 1. АНАЛИЗ...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ И БИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск 201...»

«Серёгин Сергей Викторович Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович...»

«ОЛЕЙНИКОВ ЕВГЕНИЙ ПЕТРОВИЧ ИССЛЕДОВАНИЕ КРАНИОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ РАЗНООБРАЗИЯ ПОПУЛЯЦИИ ТЮЛЕНЯ (PUSA CASPICA GMELIN, 1788) В КАСПИЙСКОМ МОРЕ 25.00.28 – Океанология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Мурманск – 2015 ВВЕДЕНИЕ Глава 1. УСЛОВИЯ МЕСТООБИТАНИЯ ПОПУЛЯЦИИ И БИОЛОГИЯ КАСПИЙСКОГО ТЮЛЕНЯ 1.1.1 Краткая океанологическая характеристика области обитания популяции 1.1.2. Климатические особенности 1.2 Биология вида...»

«КОВАЛЕВА АННА ВАЛЕРЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ ФИТОСИРОПОВ И ФИТОЭКСТРАКТОВ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ Специальность 05.18.01 – Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«ШИГАПОВ Иршат Сайдашович ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ МАЛЫХ ОЗЕР УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (на примере города Казани) 25.00.36 Геоэкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, зав. каф. природообустройства и водопользования, зав. лабораторией оптимизации водных экосистем КФУ МИНГАЗОВА Н.М. Научный консультант: доктор...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Васильева Ольга Валерьевна Ангиогенные факторы в коже человека в возрастном аспекте 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Доктор медицинских наук профессор Гунин А.Г. Чебоксары – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1....»

«КОПИЙ ВЕРА ГЕОРГИЕВНА УДК 574.587 (252.5) СООБЩЕСТВА МАКРОЗООБЕНТОСА ПЕСЧАНОЙ ПСЕВДОЛИТОРАЛИ У ЧЕРНОМОРСКИХ БЕРЕГОВ КРЫМА Специальность 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель Заика Виктор Евгеньевич член-корреспондент НАН Украины, доктор биологических наук, профессор Севастополь 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 РАЗДЕЛ 1. СОСТОЯНИЕ ИЗУЧЕННОСТИ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.