WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ЛЕГКИХ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ...»

-- [ Страница 1 ] --

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

УРАЛЬСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ФТИЗИОПУЛЬМОНОЛОГИИ

На правах рукописи

БЕЛОУСОВА КСЕНИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ

РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ЛЕГКИХ БОЛЬНЫХ

ТУБЕРКУЛЕЗОМ

03.02.03 – микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

д.м.н. Скорняков Сергей Николаевич к.б.н. Кравченко Марионелла Анатольевна Екатеринбург – 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ

ТУБЕРКУЛЕЗА (обзор литературы)

1.1. История формирования представлений о лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза

1.2. Классификация лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза

1.3. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам

1.4. Методы диагностики лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза

1.4.1. Культуральные методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза

1.4.2. Молекулярно-генетические методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза

Резюме

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая характеристика материалов исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Бактериологические методы исследования

2.2.2. Молекулярно-генетические методы исследования

2.2.2.1. Выделение ДНК микобактерий туберкулеза из клинического материала и лизирование культур микобактерий туберкулеза

2.2.2.2. Обнаружение ДНК M. tuberculosis complex методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ)

2.2.2.3. Определение ЛЧ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам методом биочипов

2.2.2.4. Типирование культур M. tuberculosis методом MIRU-VNTR......... 56 2.2.3. Методы статистической обработки результатов исследований........ 59 Резюме

Глава 3. РОЛЬ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ

ТУБЕРКУЛЕЗА И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ ЛЕКАРСТВЕННОЙ

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ

УЧАСТКОВ ЛЕГКИХ И РЕСПИРАТОРНОГО МАТЕРИАЛА.............. 61 Выявляемость микобактерий туберкулеза и определение их 3.1.

лекарственной чувствительности культуральными методами

Выявляемость микобактерий туберкулеза и определение их 3.2.

лекарственной чувствительности молекулярно-генетическими методами. 69

3.3. Сравнительная оценка бактериологических и молекулярно-генетических методов исследования

3.4. Алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких

Резюме

Глава 4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ

РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ЛЕГКИХ И РЕСПИРАТОРНОГО

МАТЕРИАЛА

4.1. Сравнительный анализ скорости и массивности роста микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения больных

4.2. Сравнительный анализ лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения больных

Генотипирование микобактерий туберкулеза, выделенных из 4.3.

операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения больных

4.4. Сравнительный анализ лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученного на терапевтическом этапе лечения больных

Резюме

Глава 5. АНАЛИЗ ВАРИАНТОВ МУТАЦИЙ, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА

ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ

ТУБЕРКУЛЕЗА, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ

ЛЕГКИХ

Резюме

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы В настоящее время эффективность химиотерапии, которая является главным средством лечения туберкулеза, остается невысокой. Одной из основных причин этого является лекарственная устойчивость (ЛУ) микобактерий туберкулеза (МБТ). Проблема ЛУ возбудителя туберкулза приобрела в последнее время глобальное значение [10, 73, 104, 218].

Клиническое излечение у впервые выявленных больных с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) МБТ остается низким и составляет в Российской Федерации 16,2%, что в 3,1 раза ниже уровня клинического излечения туберкулеза у больных с лекарственно чувствительным (ЛЧ) возбудителем туберкулеза [104]. В то же время, у значительного числа пациентов на этапах терапевтического лечения получить сведения о ЛЧ возбудителя к противотуберкулзным препаратам (ПТП) невозможно в силу ограниченности и олигобактериальности процесса.

При туберкулмах обнаружение МБТ в мокроте и промывных водах бронхов (ПВБ) составляет около 10,0% [75]. При посеве резецированного участка легкого выявление МБТ достигает 24,2% - 57,9% [32, 74]. При бактериологическом исследовании резецированных участков легких выявляется от 16,0% до 49,0% МБТ с ЛУ [27, 32]. Свойства возбудителя непосредственно в очагах туберкулезного поражения остаются малоизученными. Важность исследования ЛЧ МБТ заключается в необходимости назначения больным адекватной химиотерапии.

В связи с тем, что классические бактериологические методы обнаружения, идентификации и определения ЛЧ МБТ требуют длительного времени (до 3-х месяцев), а также весьма ресурсоемки, в последние годы активно применяются молекулярно-генетические методы, лишенные перечисленных недостатков [5, 20, 21, 150].

Изучение резецированного участка легкого дает наиболее полные сведения об особенностях процесса, возбудителе заболевания, его видовой принадлежности, чувствительности к ПТП и эффективности лечения.

Значение бактериологических и молекулярно-генетических методов исследования резецированного участка легкого определяется необходимостью проведения послеоперационного курса химиотерапии с учетом данных о возбудителе и его чувствительности к ПТП.

Все это определяет актуальность обсуждаемой проблемы, цель и задачи данной работы.

Цель работы. Изучение клинически значимых биологических свойств возбудителя туберкулеза, выделенного из резецированных участков лгких.

Основные задачи

исследования

1. Оценить роль культуральных и молекулярно-генетических методов выявления микобактерий туберкулеза и определения их лекарственной чувствительности при исследовании резецированных участков легких и респираторного материала (мокроты, промывных вод бронхов), полученных от больных, находящихся на хирургическом этапе лечения туберкулеза.

2. Провести сравнительный анализ клинически значимых биологических свойств (лекарственная чувствительность, массивность и скорость роста) возбудителя туберкулза, выделенного из резецированных участков легких и респираторного материала, полученного на терапевтическом и хирургическом этапах лечения больных.

3. Провести анализ вариантов мутаций, ответственных за лекарственную устойчивость, у микобактерий туберкулеза, выделенных из резецированных участков легких.

4. Разработать алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких больных, перенесших хирургический этап лечения по поводу туберкулза легких.

Личный вклад автора Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, осуществлялось на всех этапах работы и выразилось в проведении научно-информационного поиска, анализе и обобщении данных специальной литературы, в разработке дизайна исследования, в сборе и подготовке диагностического материала для проведения комплекса бактериологических и молекулярно-генетических исследований, в проведении лично автором всех молекулярно-генетических исследований, статистической обработке и систематизации результатов работы. Автором разработан алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких, сформулированы основные положения и выводы диссертационной работы. Автор принимал непосредственное участие во внедрении в практику ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» алгоритма бактериологического исследования резецированных участков легких как обязательного этапа диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза.

Научная новизна Установлена высокая диагностическая значимость исследования операционного материала больных туберкулезом легких молекулярногенетическими методами. Показана возможность исследования операционного материала методом биочипов, а также установлена высокая частота совпадений результатов определения лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду и рифампицину методом биочипов и методом абсолютных концентраций при исследовании резецированных тканей легких. Впервые представлен анализ вариантов мутаций, обуславливающих лекарственную устойчивость МБТ, полученных из операционного материала, в результате которого показана частота встречаемости выявленных мутаций. Выявлена идентичность генотипов изолятов МБТ, выделенных из различного биологического материала.

Научная новизна исследований подтверждается получением патента РФ на промышленный образец «Схема проведения исследования резецированных участков легких» № 82727 от 16 августа 2012 г.

Практическая и теоретическая значимость Результаты исследований, выполненных в рамках данной диссертационной работы, позволили обосновать необходимость бактериологического исследования резецированных участков легких как обязательного этапа диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза и внедрить исследование операционного материала в клинико-лабораторную практику ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» г. Екатеринбурга, ГБУЗ Свердловской области «Противотуберкулезный диспансер» г.

Екатеринбурга и ГБУЗ «Челябинский областной клинический противотуберкулезный диспансер» г. Челябинска.

Полученные данные позволили оценить роль бактериологических и молекулярно-генетических методов выявления МБТ и определения их ЛЧ при исследовании резецированных участков легких и респираторного материала и включить материалы исследования в программы последипломной подготовки врачей-фтизиатров и бактериологов в ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» г. Екатеринбурга и в учебные курсы кафедры фтизиатрии, пульмонологии и торакальной хирургии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России г.

Екатеринбурга.

Кроме того, результаты исследования вошли в проект концепции по химиотерапии туберкулеза в Российской Федерации (приложение №4) [45].

–  –  –

Материалом исследования служили:

1. Результаты ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, прооперированных в клинике Уральского НИИ фтизиопульмонологии по поводу туберкулеза легких в 2010-2011 гг. (n=291).

2. Результаты проспективного исследования резецированных участков легких (n=291), мокроты и промывных вод бронхов (n=219) от оперированных больных по поводу туберкулеза легких; культуры МБТ (n=102), выделенные из мокроты и резецированных участков легких оперированных больных по поводу туберкулеза легких.

Всего было исследовано 510 образцов биологического материала и 102 культуры МБТ, полученных от 291 больного различными формами туберкулеза легких. У 259 (89,0% (95% ДИ 84,8%-92,4%)) больных туберкулезом легких был установлен диагноз «туберкулема легкого», у остальных 32 (11,0% (95% ДИ 7,7%-15,2%)) – «кавернозный и фибрознокавернозный туберкулез легких».

Среди оперированных больных было 198 (68,0% (95% ДИ 62,3%-73,3%)) мужчин и 93 (32,0% (95% ДИ 26,7%-37,7%)) женщины в возрасте от 16 до 61 года. Средний возраст пациентов составил 34 (26-42) года.

Методы исследования. Дизайн исследования представлен на рис. 1.

Культуральными и молекулярно-генетическими методами у больных исследовали двукратно мокроту или промывные воды бронхов (при возможности получения материала) непосредственно перед операцией и резецированные участки легкого.

Бактериологические методы исследования. Бактериологическое исследование включало люминесцентную микроскопию фиксированных препаратов из деконтаминированных осадков мокроты, промывных вод бронхов и гомогенизированных кусочков операционного материала и посев осадка на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена («Himedia Laboratories», Индия).

Рисунок 1 Дизайн исследования

При микроскопическом исследовании количественную оценку препаратов проводили согласно приказу № 109 от 21.03.2003г. («О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», приложение №11) [71].

Анализ ЛЧ МБТ проводили методом абсолютных концентраций с использованием плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена. Культуры M. tuberculosis по чувствительности к основным ПТП делили на ЛЧ и ЛУ в соответствии с приказом МЗ РФ № 109 от 21.03.2003г (концентрация изониазида (H) – 1 мкг/мл, рифампицина (R) – 40 мкг/мл, этамбутола – 2 мкг/мл, стрептомицина – 10 мкг/мл, канамицина – 30 мкг/мл) [71].

Молекулярно-генетические методы исследования. Обработку первичного материала для выделения ДНК проводили коммерческим набором «ДНК-сорб-В» («Амплисенс», Россия). Операционный материал предварительно гомогенизировали. Для амплификации специфической нуклеотидной последовательности IS6110 геномного материала методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в «режиме реального времени»

использовали тест-систему «АмплиСенс®MTC-FL» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) и амплификатор iCycler iQ5 (BioRad, США).

Для молекулярно-генетического исследования мутаций ЛУ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам (FQ) был использован метод гибридизации с флуоресцентным изображением на биологическом микрочипе «ТБ-БИОЧИП®» и «ТБ-БИОЧИП®-2» (ООО «Биочип-ИМБ», Москва).

Доминирующие олигонуклеотиды, размещенные на биочипах, способны обнаруживать мутации в генах rpoB, katG, inhA, ahpC и gyrA. Анализ результатов гибридизации проводили на приборе «Чипдетектор-01» с использованием специализированного программного обеспечения «Imageware» (ООО «Биочип-ИМБ», Москва).

Методом MIRU-VNTR типирования было исследовано 18 культур МБТ, полученных от 7 больных (7 изолятов, выделенных из операционного материала, и 11 изолятов, выделенных из респираторного материала этих же больных). Изоляты были генотипированы с использованием 7 локусов:

MIRU10, MIRU26, MIRU31, Mtub21, ETRA, QUB26, QUB11b. Для постановки ПЦР использовали реактивы производства «Интерлабсервис» (Москва) и праймеры для ПЦР ООО «Синтол» (Москва). ПЦР осуществляли в термоциклере «Терцик» (ООО «ДНК-технология», Москва). Продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле с использованием камеры для горизонтального электрофореза Sub Cell GT System (Bio-Rad, США).

Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» (BioRad, США). Принадлежность к генетической линии определяли путем сравнения полученных MIRU-VNTR профилей изолятов с имеющимися в базе данных «MIRU-VNTRplus» (http://www.miru-vntrplus.org).

Статистическая обработка результатов исследований. Результаты проведенных исследований статистически обработаны с использованием MedCalc ® лицензионной компьютерной программы V12.6.1 (MedCalc Software, Бельгия). Для всех статистических критериев ошибка первого рода устанавливалась равной 0,05.

Положения диссертации, выносимые на защиту Молекулярно-генетические методы исследования имеют большую 1.

разрешающую способность и сокращают сроки выявления микобактерий туберкулеза из резецированных участков легких и определения их лекарственной чувствительности по сравнению с культуральными методами.

Результаты определения лекарственной чувствительности возбудителя 2.

туберкулеза методом биочипов совпадают с результатами определения лекарственной чувствительности методом абсолютных концентраций.

Резецированные участки легких являются информативным материалом, 3.

позволяющим получить достоверные сведения о возбудителе туберкулеза непосредственно из очага туберкулезного поражения.

Алгоритм бактериологического исследования резецированных участков 4.

легких от больных, оперированных по поводу туберкулеза, позволяет повысить диагностическую значимость и сократить время данного исследования.

Степень достоверности результатов Достоверность результатов и обоснованность научных положений, рекомендаций и выводов, сформулированных в диссертации, подтверждается достаточным объемом исследований с применением широкой панели современных микробиологических и молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза, корректным статистическим анализом полученных результатов, а также высоким методологическим уровнем работы.

Апробация диссертации Основные результаты работы доложены на Всероссийской научнопрактической конференции «Модернизация фтизиатрии. Современные технологии оказания противотуберкулезной помощи населения» (г.

Екатеринбург, 2011 г.); Юбилейной сессии, посвященной 90-летию ЦНИИТ РАМН «Актуальные вопросы борьбы с туберкулезом» (г. Москва, 2011 г.);

Всероссийской научно-практической конференции «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом» (Санкт-Петербург, 2011 г.);

конференции молодых ученых с международным участием «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» (г. Москва, 2012 г.); научно-практической конференции «Инновационные медицинские и образовательные технологии в обеспечении качества и доступности противотуберкулезной помощи населению» (г.

Екатеринбург, 2012 г.); I Конгрессе Национальной ассоциации фтизиатров «Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации» (г. Санкт-Петербург, 2012 г.); Региональной научно-практической конференции с международным участием «Пути повышения качества и эффективности деятельности противотуберкулезных учреждений» (г. Екатеринбург, 2013 г.); Научной сессии Уральского НИИ фтизиопульмонологии с международным участием «Фундаментальные исследования - практический фтизиатрии» (г. Екатеринбург, 2013 г.).

Публикации По теме диссертации опубликовано 12 работ, 4 из них – в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Объем диссертации – 148 страниц печатного текста. Диссертация содержит 24 таблицы и 15 рисунков. Список литературы включает 230 источника, в том числе 105 отечественных и 125 иностранных источников.

Связь диссертационной работы с планами НИР, участием в грантах Разработанная автором тема выполнялась в рамках комплексного исследования Уральского НИИ фтизиопульмонологии «Лечебнодиагностические и организационные технологии повышения медикосоциальной эффективности специализированной и высокотехнологичной медицинской помощи больным туберкулезом основных локализаций» (номер государственной регистрации 01200953414). Ее результаты вошли в отчеты учреждения о выполнении государственного задания по фундаментальным НИР.

ГЛАВА 1. ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ

МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. История формирования представлений о лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза Термин «лекарственная устойчивость» (ЛУ) впервые был использован Паулем Эрлихом в 1907 году [77]. Основоположник отечественной микробиологии И.И. Мечников одним из первых исследователей обратил внимание на феномен развития ЛУ у микроорганизмов и связал это явление с изменчивостью микробов [51]. Появление первых ЛУ штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ) связывают с открытием в 1943 г. стрептомицина (S) и его широким применением в качестве эффективного противотуберкулезного препарата (ПТП) в виде монотерапии [25, 183].

В 1948 году Британским научным медицинским советом (British Medical Research Council) был опубликован отчет о результатах рандомизированного клинического исследования лечения туберкулеза легких стрептомицином. В нем приводились показатели смертности больных, получавших и не получавших лечение стрептомицином. Большинство больных с рецидивом туберкулза, получавших стрептомицин, и больных, умерших от туберкулеза, выделяли штамм МБТ, устойчивый к стрептомицину [167].

В 40-х годах ХХ века начали использовать для лечения туберкулеза парааминосалициловую кислоту (ПАСК). Позднее было установлено, что развитие ЛУ к ПАСК при лечении больных развивается также закономерно, как и при лечении другими препаратами [76].

В 1952 г. в Советском Союзе появился новый ПТП – фтивазид [105], а за рубежом был синтезирован изониазид (Н) (гидразид изоникотиновой кислоты (ГИНК)), известный в СССР под названием тубазид; в то же время были синтезированы пиразинамид [163, 200] и циклосерин [197]. В 1956 г. был открыт этионамид [187], в 1957 г. – канамицин (К). Однако внедрение в практику высокоэффективных веществ – изониазида и его производных – так же повлекло за собой появление случаев резистентности МБТ, причем было установлено, что к препаратам данной группы резистентность развивается еще быстрее, чем к стрептомицину [77].

Рядом авторов было показано, что при комбинированном применении ПТП наблюдается более значительный бактериостатический эффект и более медленное развитие ЛУ МБТ [15, 126]. Признание данного феномена легло в основу создания нового терапевтического режима, состоявшего из нескольких ПТП [139, 176]. Впервые режим лечения туберкулза комбинациями препаратов был применн в Эдинбурге (Великобритания) в 1959 году.

Использование новых ПТП в схемах химиотерапии больных туберкулезом всегда приводило к возникновению ЛУ МБТ к этим лекарствам.

На заре антимикробной терапии туберкулеза предполагалось обозначать штамм устойчивым, если он был выделен у больного, у которого лечение не давало улучшения. Такой подход стал нереальным после полного отказа от монотерапии [95]. Международные группы экспертов предложили называть штамм устойчивым, если он существенно отличается по степени чувствительности к данному антибиотику от диких штаммов, выделенных у больных, ранее не получавших ПТП [117, 118]. Для дифференциации между чувствительными и устойчивыми штаммами были разработаны критические концентрации различных ПТП, вначале применительно к среде ЛевенштейнаЙенсена [173], а позже – и для других питательных сред [160].

Вместе с тем, в 1949 году операции резекционного типа (лобэктомии, билобэктомии, пульмонэктомии) по поводу туберкулеза легких как в России, так и в мире вошли в обычную фтизиатрическую практику [48, 179]. При изучении резектатов легких было установлено, что частота обнаружения МБТ в операционном материале больных туберкулезом очень разнообразна и зависит, в первую очередь, от проведенной до операции антибактериальной терапии [89]. Также было выявлено, что определение резистентности МБТ к ПТП нередко дает парадоксальные результаты у одного и того же больного.

Авторы объясняют это обстоятельство тем, что в различных отделах легкого МБТ имеют различную лекарственную чувствительность (ЛЧ) к ПТП. В зависимости от этого в разных порциях мокроты могут находиться МБТ с различной степенью ЛУ. Также у 45%-59% больных имеет место скрытая ЛУ, при которой ЛУ МБТ, выделенных из мокроты, в дальнейшем не подтверждается, тогда как по результатам исследования резецированных участков легких культура устойчива к применяемым ПТП [90, 96]. Авербах М.М., изучая посевы из 100 резецированных казеом, наблюдал рост МБТ в 72,0%, а при определении ЛУ у выделенных штаммов была отмечена слабая устойчивость ко всем основным ПТП [1]. При определении ЛЧ МБТ, выделенных из 140 резектатов легких, А.Е. Суходольская обнаружила чувствительные штаммы МБТ в 55,7% случаев, устойчивые в 44,3% [88].

Таким образом, на основании бактериологического исследования резецированных легких у туберкулезных больных, можно более точно судить о биологических свойствах МБТ, так как показано, что свойства микобактерий, выделенных из мокроты и очагов поражения легких, различны [58].

В 1959 г. был разработан капреомицин, нашедший свое применение во фтизиатрии спустя несколько десятилетий. В 60-х годах появился рифампицин (R) и этамбутол (E) – препараты, обладающие выраженным бактерицидным и бактериостатическим действием на МБТ [194]. И наконец, в конце 80-х годов ХХ века были синтезированы антибиотики группы фторхинолонов (FQ), часть из которых была активна в отношении МБТ [171].

Усовершенствование хирургических технологий и введение в практику новых режимов химиотерапии, включающих несколько ПТП, позволило временно преодолеть проблему ЛУ и значительно повысить эффективность лечения в начале 60-х годов XX века [8, 166]. На протяжении тридцати последующих лет распространение ЛУ штаммов МБТ считалось незначительным. Только в начале 90-х годов проблема получила международное признание, когда вспышки туберкулеза, вызванного МБТ с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), были зарегистрированы в Соединенных Штатах Америки (США) и странах Европы среди ВИЧ – инфицированных больных [119, 120, 121, 122, 140, 157, 198].

Доля ЛУ штаммов среди общего количества штаммов МБТ, выделенных от больных, колеблется в широких пределах: от 10% в Японии до 83% на Филиппинах. В литературе имеются самые различные показатели частоты ЛУ МБТ к отдельным ПТП, однако, несмотря на большой разброс цифр, все авторы единодушны в том, что наиболее часто встречаются штаммы, устойчивые к стрептомицину и изониазиду, реже к рифампицину и этамбутолу [86]. Самый низкий уровень ЛУ наблюдается к ПАСК [68].

Данные исследований хорошо согласуются с тем, что стрептомицин и изониазид, имеющие самые высокие показатели ЛУ, имеют наиболее длительную историю применения, а ПАСК не входил в стандартные схемы химиотерапии. Устойчивость к 4 препаратам первого ряда чаще встречается у пациентов, ранее получавших лечение, чем у пациентов с новыми случаями туберкулеза.

В России до конца 80-х годов также суммарные показатели ЛУ сохранялись на относительно невысоком уровне [34]. Но уже с конца 90-х годов отмечено увеличение удельного веса показателя первичной ЛУ от 18 до 61% по разным регионам России, показатели же вторичной ЛУ практически повсеместно превышают 50-70%, достигая в отдельных областях до 80-86% [16, 50, 78, 100, 101, 102]. Сведения о МЛУ МБТ впервые были включены в официальную государственную статистику России в 1999 г.

По данным ГУЗ ГПТД г. Санкт-Петербурга за период 2000-2004 гг., частота ЛУ МБТ возросла в 1,7 раза, причем у впервые выявленных больных туберкулзом за указанный срок ЛУ МБТ возросла с 24,3% до 32,9%, среди контингента диспансерного наблюдения - с 36,6% до 69,9% [41]. С 2002 по 2006 гг. в РФ доля пациентов с МЛУ среди всех больных туберкулезом органов дыхания с бактериовыделением возросла с 14,5 до 20,3% [7].

Анализ сложившийся эпидемической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулезом в России носит характер эпидемии [9, 38, 103].

Очевидно, что существует острая необходимость в принятии мер по предотвращению дальнейшего распространения ЛУ туберкулеза [224]. В общем комплексе мероприятий по борьбе с ЛУ туберкулезом важное место занимает хирургическое лечение, оказывающее значительное влияние на уменьшение резервуара туберкулезной инфекции с ЛУ МБТ [37; 64]. Являясь основной причиной низкой эффективности послеоперационного курса антибактериальной терапии у больных туберкулезом легких, ЛУ МБТ повышает частоту реактивации туберкулеза и значительно снижает отдаленную эффективность хирургического лечения. При наличии полирезистентности и МЛУ МБТ эффективность использования хирургических методов лечения ниже соответственно на 13,6% и 15,8%, чем среди больных с сохраненной ЛЧ МБТ [22]. Таким образом, возрастает необходимость назначения адекватной послеоперационной химиотерапии, основанной на результатах достоверной и быстрой диагностики ЛЧ МБТ, полученных из резецированного материала.

1.2. Классификация лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза

Согласно современной классификации различают два вида ЛУ:

первичную и вторичную (или приобретенную) [11, 49].

Первичная ЛУ, по определению экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), является устойчивостью, обнаруженной у МБТ, выделенных от пациента, никогда не принимавшего ПТП или принимавшего их не более 4-х недель [222, 223]. В данном случае подразумевают, что больной заразился ЛУ штаммом МБТ. При невозможности уточнения факта применения ПТП используют термин «начальная устойчивость» [69, 97]. Частота первичной ЛУ характеризует эпидемиологическое состояние популяции возбудителя туберкулеза [69].

Вторичная (приобретенная) ЛУ МБТ к ПТП определяется как устойчивость, развившаяся в процессе лечения; она является косвенным показателем неэффективной химиотерапии, связанной с неверным подбором ПТП, несоблюдением режима прима препаратов, снижением дозировки препаратов, непостоянным снабжением и плохим кач еством препаратов [52, 112, 212, 221, 223].

По выраженности ЛУ МБТ к ПТП выделяют:

Монорезистентность – ЛУ МБТ к одному из ПТП, чувствительность к другим препаратам сохраняется [56].

В случае наличия ЛУ к двум или более препаратам данный штамм МБТ определяют как полирезистентный [56]. Особое место занимают МБТ, у которых обнаруживают ЛУ к двум основным ПТП – изониазиду и рифампицину. Независимо от наличия ЛУ к другим препаратам их обозначают как штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) или multidrug-resistance (MDR). Этим штаммам уделяют особое внимание, так как лечение пациентов, у которых заболевание вызвано такими штаммами, представляет большие трудности [12, 23, 28, 56, 59, 62, 79, 80, 97, 154, 162, 190, 196, 215]. Оно является длительным, дорогостоящим и требует использования ПТП резервного ряда, многие из которых дорогостоящие и могут вызывать тяжелые побочные реакции [12, 55, 85, 87, 93, 97, 135, 174].

В 2006 г. эксперты ВОЗ обратили внимание на рост частоты случаев ЛУ МБТ к основным ПТП (стрептомицин, изониазид, рифампицин) в сочетании с резервными препаратами (этионамид, канамицин, каприомицин, циклосерин, фторхинолоны) и выделили больных с так называемой extensively drugresistance (XDR) - суперустойчивостью или широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ). Это МЛУ в сочетании с ЛУ к фторхинолонам и одному из инъекционных препаратов (канамицин, амикацин, капреомицин) [169]. Туберкулез, вызванный штаммами с ШЛУ, представляет прямую угрозу для жизни пациентов, так как остальные ПТП второго ряда не имеют выраженного антибактериального действия [69].

Еще один вид ЛУ перекрестная устойчивость – когда возникновение устойчивости к одному ПТП влечет за собой устойчивость к другим препаратам. Развитие перекрестной устойчивости обусловлено сходством химической структуры некоторых ПТП. Особенно часто перекрестную ЛУ выявляют внутри одной группы препаратов [69].

Выделяют так же понятия «истинной», «ложной», «скрытой» и «полной» ЛУ. При истинной ЛУ одна МБТ устойчива к нескольким ПТП.

Истинная резистентность чаще выявляется у постоянных бактериовыделителей. Чаще наблюдается ложная резистентность, когда одни МБТ устойчивы к одним препаратам, другие – к другим. Скрытая ЛУ обусловлена разными видами микробной популяции в мокроте и патологических очагах легких больных туберкулезом [96]. Достоверная идентификация скрытой ЛУ возможна лишь при микробиологическом исследовании операционного материала, так как при бактериологическом исследовании мокроты у данных больных зачастую обнаруживают ЛЧ МБТ [61, 98]. Полная ЛУ встречается довольно редко [47].

1.3. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам ЛУ, то есть способность возбудителя заболевания сохранять жизнеспособность при воздействии на него лекарственных препаратов, является одним из основных биологических свойств. Механизмы, обуславливающие ЛУ, можно условно разделить на три группы: барьерный механизм (изменение проницаемости клеточной стенки и мембран), разложение или инактивация препарата ферментами и модификация мишени антибактериального средства, происходящая благодаря применению нуклеотидной последовательности соответствующих генов и, как следствие, изменение метаболизма [156].

МБТ обладают первоначальной, естественной лекарственной устойчивостью ко многим антибиотикам [199] – -лактамам, макролидам и тетрациклинам, что является результатом высокой липофильности их клеточной стенки, обеспечивающей эффективный барьер [113, 128]. В то же время, многие потенциальные детерминанты устойчивости кодированы в самом геноме микобактерий [128].

Проявление ЛУ МБТ является следствием накопления хромосомных мутаций, в отличие от других бактерий, у которых ЛУ чаще всего обусловлена плазмидами или мобильными генетическими элементами.

Основными механизмами развития ЛУ МБТ к ПТП являются мутации в гене, ответственном за синтез белка-мишени действия препарата, или гиперпродукция метаболитов, инактивирующих препарат [138, 153, 170, 185, 199]. Скорость развития резистентности соответствует частоте возникновения мутаций в ДНК МБТ. Подобные мутации могут встречаться и у природных, «диких» штаммов МБТ еще до их контакта с ПТП [132, 134, 138, 199].

Природные штаммы МБТ, имеющие мутации в хромосомах, равномерно распределены по земному шару [138]. Примером природноустойчивых штаммов могут быть M. bovis, устойчивые к пиразинамиду, и М. аfricanum, устойчивые к тиоацетазону. Частота возникновения спонтанных мутаций, влекущих за собой развитие ЛУ, достаточно низкая и составляет 10 -4 для этамбутола и пиразинамида, 10-6 для изониазида и стрептомицина, 10 -7 и 10-12 для фторхинолонов [13, 92, 141, 216].

для рифампицина Вероятность одновременных спонтанных мутаций к изониазиду и рифампицину составляет 2,56·10-10 [95], что находится за пределами числа бактерий, обнаруживаемых в каверне. Важно отметить, что МЛУ МБТ как результат спонтанных мутаций практически невозможна, поскольку нет единого гена, кодирующего МЛУ, а мутации, приводящие к развитию устойчивости к различным препаратам, генетически не связаны [152].

Устойчивость к тому или иному ПТП не представляет каких-либо селективных преимуществ МБТ до тех пор, пока данный микроорганизм не будет подвержен воздействию препарата [175]. При лечении туберкулеза одним ПТП происходит уничтожение МБТ, чувствительных к данному препарату. В то же время, МБТ, устойчивые к данному препарату, продолжают размножаться. При смене препарата произойдет селекция МБТ, устойчивых как к первому так и ко второму препарату. Накопление мутаций в микобактериальной популяции под воздействием неадекватной химиотерапии или монотерапии является основной причиной развития ЛУ МБТ к нескольким ПТП [123, 137, 172, 184, 185, 203].

Развитие молекулярной генетики открыло возможности для изучения генов МБТ, контролирующих ЛУ, и механизмов ее развития [65, 91, 116, 156, 156, 213]. Геном M. tuberculosis расшифрован на примере лабораторного штамма H37Rv [127] и составляет 4 411 529 пар нуклеотидов (п. н.). Геном представлен 4056 генами (91% общей емкости генома), на сегодняшний день определены функции 52% генов [125]. Одной из примечательных черт МБТ является наличие генов, дублирующих ключевые ферментные системы.

Анализ клинических изолятов МБТ позволил обнаружить большое количество мутаций генов, часть из которых переводит обменные процессы микроорганизма на дублирующий путь. К концу XX века для каждого ПТП основного ряда и для многих препаратов резервного ряда был определен хотя бы один ген, специфические мутации в котором приводят к развитию ЛУ МБТ [42, 184, 219].

Рифампицин нарушает процесс транскрипции и тормозит жизнедеятельность МБТ, взаимодействуя с -субъединицей РНК-полимеразы [184]. Устойчивость к рифампицину у МБТ в 96% случаев обусловлена точечными мутациями или короткими инсерциями или делециями в последовательности фрагмента rpoB гена длиной 81 п. н., обозначаемого в англоязычной литературе как RRDR (Rifampicin Resistance Determining Region) [209]. На настоящий момент в данном регионе описано свыше сорока мутаций [111, 184, 199]. Мутации, обнаруженные в кодонах 531, 526 и 513, приводят к рифампицинрезистентности высокого уровня. В таких случаях больных, имеющих МБТ с подобными мутациями, рекомендуется лечить препаратами резервного ряда. Мутации в кодонах 522, 518, 516 и 511 сопровождаются низким уровнем устойчивости к рифампицину [111, 225].

Изолированная ЛУ к рифампицину встречается редко. Наиболее часто ЛУ к рифампицину ассоциирована с ЛУ к изониазиду, что делает рифампицин «маркером» МЛУ МБТ [185, 195, 228].

За устойчивость к изониазиду в геноме МБТ отвечают, по меньшей мере, четыре гена. Ген katG кодирует продукцию каталазы-пероксидазы, фермента, переводящего изониазид в его активный метаболит, подавляющий активность енол-кислой фосфатредуктазы, участвующей в синтезе миколовой кислоты [107, 148, 199, 229, 230]. Ген inhA МБТ отвечает за синтез енолкислой фосфатредуктазы, и мутации в нем не позволяют изониазиду вмешиваться в синтез миколовой кислоты, что влечет за собой ЛУ [199]. Ген ahpC кодирует алкил-гидропероксид-редуктазу, и ген oxyR принимает участие в регуляции окислительного стресса в микобактериальной клетке [131, 161, 180]. Активность работы генов, участвующих в метаболизме изониазида, связана между собой. Каталаза-пероксидаза, кодируемая katG геном, окисляет изониазид до активного метаболита, который ингибирует ферменты, контролируемые геном inhA, участвующие в биосинтезе клеточной стенки МБТ. Потеря активности пероксидазы может контролироваться геном ahpС [186].

Мутации в генах katG и inhA найдены в 75-85% устойчивых изолятов. В гене katG к настоящему времени описано около 60 точечных мутаций, инсерций и делеций, приводящих к устойчивости M. tuberculosis. Наиболее часты замены в кадонах 315, 328, 335 гена katG [152]. Картирование мутаций в полирезистентных штаммах M. tuberculosis показало, что в 50-95% случаев имеет место замена Ser на Thr в кодоне 315 гена katG [29, 35, 145, 230].

Нуклеотидная замена С (-15) на Т относительно сайта инициации трансляции в промоторной области inhA приводит к устойчивости в 50-70% случаев [130]. Помимо генов katG и inhA, около 20 точечных нуклеотидных замен, приводящих к устойчивости к изониазиду, описаны в межгенной регуляторной области генов oxyR и ahpC (приблезительно 10-20%) [184].

Большинство штаммов МБТ, содержащих мутации в гене inhA и не содержащих мутации в гене katG, имеют сравнительно низкий уровень ЛУ к изониазиду. В то же время, у штаммов с полной делецией гена katG, уровень ЛУ к изониазиду значительно выше [229].

Недавно было показано, что мутации в гене mshA, кодирующем фермент, участвующий в биосинтезе микотиновой кислоты, также вызывают ЛУ к изониазиду у штаммов МБТ in vitro, однако его роль в клинической ЛУ еще предстоит выяснить [217].

ЛУ к стрептомицину возникает в результате мутаций в генах, кодирующих строение субъединиц рибосом, причем преобладают мутации в rpsL-гене, кодирующем рибосомальный белок S12 (кодон 43 или реже 88). Менее значимой мишенью является ген rrs, кодирующий 16Sкомпонент рибосомальной РНК (нуклеотиды 491, 513, 516 или 903) [133, 136, 199]. Мутации в названных структурах определены у 50 и 20% клинических стрептомицинустойчивых изолятов, соответственно. Замена лизина на аргинин в 43 кодоне – наиболее распространенная мутация в гене rpsL, вызывающая ЛУ к стрептомицину высокого уровня [136, 149, 177].

Недавно было установлено, что мутации в гене gidB, кодирующем метилтрансферазу, специфичную для 16S рРНК, являются причиной ЛУ к стрептомицину низкого уровня в 33% изолятов МБТ [178].

Этамбутол действует на ферменты, вовлеченные в биосинтез арабиногалактана и липоарабиноманнана – основных структурных компонентов клеточной стенки МБТ [168, 226]. У 60% штаммов МБТ с ЛУ к этамбутолу наблюдается изменение в аминокислотном составе в положении 306 гена который кодирует фермент embВ, арабинозилтрансферазу [184]. У МБТ был также идентифицирован ген embCAB, отвечающий за развитие ЛУ к этамбутолу [210].

Фторхинолоны угнетают синтез ДНК в результате связывания с бактериальной топоизомеразой II У штаммов МБТ, (ДНК-гиразой).

устойчивых к фторхинолонам, выявлены мутации в генах gyrA (320 пар оснований) и gyrB (375 пар оснований), которые кодируют две А и две В субъединицы второго типа ДНК-топоизомеразы [110, 204, 207]. Мутации гена gyrA, в основном, группируются в 90, 91 и 94 кодонах [106, 164, 207], реже в кодонах 74, 83 и 87 [106, 205]. Мутации кодона 95 являются естественным полиморфизмом и не участвуют в образовании ЛУ к фторхинолонам [201]. В гене gyrB мутации возникают значительно реже [164, 220]. В последнее время у МБТ был обнаружен еще один механизм фторхинолоновой устойчивости, связанный с мутациями в гене MfpA [146].

Наименее всего изучены молекулярные механизмы развития ЛУ к пиразинамиду, которая в основном обусловлена разнообразными мутациями в гене pncА, приводящими к недостаточности фермента никотинамидазы (пиразимидазы) и нарушениям превращения пиразинамида в действующее вещество [191, 192, 202]. Мутации в гене pncА весьма разнообразны и разбросаны вдоль гена, тем не менее есть некоторая степень кластеризации в трех регионах в положениях 3-17, 61-85 и 132-142 [165, 193].

72-97% пиразинамидустойчивых штаммов МБТ имеют мутации в гене pncА, у остальных механизм ЛУ не известен [158, 165, 182, 193].

Несмотря на большой прогресс в знаниях, многие аспекты развития ЛУ остаются неясными и требуют дальнейшего изучения [91]. Однако можно заключить, что ЛУ является фундаментальным биологическим свойством возбудителя туберкулеза, реализация которого зависит во многом от неадекватно проводимой химиотерапии больных туберкулезом.

–  –  –

В настоящее время нет единого универсального метода определения ЛЧ

МБТ. Все методы определения ЛЧ можно разделить на две группы:

фенотипические (культуральные методы с использованием плотных и жидких питательных сред) и генотипические (молекулярно-генетические методы (МГМ). Различие между ними состоит в выявлении ЛУ К ПТП на основе генетической природы такой устойчивости либо независимо от нее.

1.4.1. Культуральные методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза Для определения ЛЧ МБТ в лабораторной практике обычно применяют широко апробированные стандартные методы, наиболее распространенными из которых являются метод пропорций и метод абсолютных концентраций.

Метод пропорций. В микробиологических лабораториях большинства стран мира используется метод пропорций, предложенный в 1963 г. Канетти и детализированный в 1985 г.

Миддлбруком. Данный метод основан на сравнении количества выросших колоний на среде с препаратом и на среде без препарата с различными концентрациями бактериальной суспензии. Для этого суспензию микобактерий, содержащую 1 мг/мл полувлажного веса микобактерий, разводят до концентрации 1х104 и 1х106. Оба разведения суспензии засевают на питательную среду без препарата и на набор сред с разными препаратами. Штамм считается устойчивым в том случае, если число выросших колоний на среде с препаратом составляет более 1%. Это дает возможность вычислить процент жизнеспособной популяции при определенной концентрации препарата и определить соотношение устойчивых и чувствительных особей МБТ в исследуемой культуре. Для метода пропорций используется международная питательная среда Левенштейна-Йенсена. Результаты теста учитывают на 28-й день (для устойчивых штаммов) и на 40-й день (для чувствительных штаммов) после посева микобактериальной суспензии [39].

Метод пропорций более трудозатратный по сравнению с методом абсолютных концентраций. Кроме того, манипуляции с разведением микобактериальной суспензии повышают риск внутрилабораторного инфицирования персонала.

Метод абсолютных концентраций. В лабораториях России и некоторых других стран для определения ЛЧ МБТ широкое применение нашел метод абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена, который официально утвержден Приказом МЗ РФ № Принцип метода состоит в определении концентрации ПТП, 109.

ингибирующих рост культуры МБТ при выращивании их на плотных питательных средах с различным содержанием ПТП [39, 71].

Для различных препаратов установлена определенная концентрация, при которой наблюдают размножение критической доли микобактериальной популяции. Эти концентрации носят название «критические». В качестве критерия ЛУ используют величину роста популяции МБТ на питательной среде с препаратом в критической концентрации [70].

В большинстве случаев этот метод применяется для непрямого определения ЛЧ и позволяет исследовать любое количество МБТ в диагностическом материале, поскольку для определения ЛУ используются штаммы МБТ, предварительно выделенные на питательных средах. Так как сроки выделения возбудителя на питательных средах составляют не менее 1 – 1,5 месяцев, результаты определения ЛУ указанным методом обычно получают не ранее, чем через 2 - 3 месяца после посева материала. Культура считается чувствительной к той концентрации ПТП, которая содержится в среде, если число колоний микобактерий, выросших на пробирке с препаратом, не превышает 20, а посевная доза соответствует 10 миллионам микробных тел. Культура расценивается как устойчивая к данной концентрации ПТП только при наличии на пробирке с этой концентрацией 20 и более колоний при обильном росте в контрольной пробирке, не содержащей ПТП. [71].

К разновидности метода абсолютных концентраций относится ускоренный нитратредуктазный метод, разработанный в ЦНИИТ РАМН.

Метод позволяет сократить сроки тестирования ЛЧ МБТ к ПТП до 8 - 12 суток за счет использования биохимической реакции, выявляющей ферментативную активность жизнеспособных микобактерий при отсутствии видимого роста культуры. Принцип метода заключается в известной способности МБТ восстанавливать нитраты в нитриты. При добавлении реактива Грисса в пробирку, где имеется рост МБТ, происходит нитратредуктазная реакция, приводящая к изменению цвета реактива Грисса и питательной среды с конденсатом [30, 40, 67]. Совпадение результатов при использовании традиционного и ускоренного методов определения ЛЧ МБТ составляет 96,6% [30]. Таким образом, нитратредуктазный метод определения ЛЧ МБТ является достаточно точным и не уступает по чувствительности традиционному методу абсолютных концентраций, обеспечивая полноценное определение спектра ЛУ.

Метод коэффициента устойчивости. Сущность метода заключается в определении минимальной ингибирующей концентрации ПТП для клинических штаммов МБТ и соотношения минимальной ингибирующей концентрации тех же препаратов для заведомо чувствительного лабораторного штамма микобактерий (как правило, H37Rv). Это самый трудозатратный и дорогостоящий метод, так как требует использования большого количества пробирок с питательной средой, поэтому он применяется в основном в научных исследованиях [40].

В настоящее время традиционная микробиологическая диагностика ЛУ МБТ к ПТП на плотных питательных средах требует длительного времени и больших трудозатрат, что существенно удорожает метод и делает невозможным стандартизировать методологию приготовления яичных сред.

Частично это связано с тем, что в зависимости от условий содержания и питания кур в птицеводческих хозяйствах яйца для питательных сред могут отличаться как по размерам, так и по содержанию и качеству желтка, который, в свою очередь, может оказать существенное влияние на скорость роста МБТ на питательной среде [57].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Похожие работы:

«СОНИНА АНЖЕЛЛА ВАЛЕРЬЕВНА Эпилитные лишайники в экосистемах северо-запада России: видовое разнообразие, экология 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Петрозаводск СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Степень изученности эпилитных...»

«Кофиади Илья Андреевич ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ И ГЕНОДИАГНОСТИКА В БИОМЕДИЦИНЕ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ «03.03.03 – иммунология» диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва, 2013 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ 8 ВВЕДЕНИЕ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ...»

«ДЕМИНА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА РОЛЬ КУЛИКОМОРФНЫХ НАСЕКОМЫХ (DIPTERA, NEMATOCERA) В ФОРМИРОВАНИИ ПОТОКОВ ВЕЩЕСТВА И ЭНЕРГИИ ЧЕРЕЗ ГРАНИЦУ «ВОДА – ВОЗДУХ» ПОЙМЕННЫХ ОЗЁР р. ВОЛГА (САРАТОВСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.02.05 – энтомология 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: кандидат биологических наук,...»

«ЗАКЛЮЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА Д 501.001.94, СОЗДАННОГО НА БАЗЕ МОСКОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА ПО ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА НАУК аттестационное дело №_ решение диссертационного совета от 24.12.2014, протокол № 7 О присуждении Лапшиной Наталье Евгеньевне ученой степени кандидата биологических наук. Диссертация «Темпы старения мужчин и женщин старше 60 лет в связи с морфофункциональными и некоторыми генетическими особенностями», в виде...»

«СЕРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА МИКОБИОТА ДЕРЕВЯННЫХ КОНСТРУКЦИЙ ИСТОРИЧЕСКИХ ЗДАНИЙ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА Специальность: 03.02.12 – микология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Титова Ю. А. кандидат биологических наук Санкт-Петербург Стр. Оглавление ВВЕДЕНИЕ.. 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 11...»

«ВУДС ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА Фармакогенетические аспекты антиангиогенной терапии экссудативной формы возрастной макулярной дегенерации» 14.01.07 – Глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Будзинская Мария Викторовна кандидат биологических наук Погода Татьяна Викторовна Москва – 2015...»

«Лёвкина Ксения Викторовна Влияние сроков, норм высева и удобрений на урожайность и качество зерна озимой твердой пшеницы в подзоне светло-каштановых почв Волгоградской области Специальность: 06.01.01 – общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Приложения Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ПРИЛОЖЕНИЕ А...»

«Сигнаевский Воладимир Дмитриевич МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОДУКТИВНОСТИ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТОВ САРАТОВСКОЙ СЕЛЕКЦИИ Специальность 03.02.01 — ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н.,...»

«Попцов Александр Леонидович ЗНАЧЕНИЕ ИНДИКАЦИИ ДНК ПАРВОВИРУСА В19 В ОБЕСПЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ 14.01.21 – Гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель кандидат медицинских наук И.В....»

«Шубенков Александр Николаевич Эффекты модифицированных наночастиц кремния на культивируемые иммунокомпетентные и мезенхимальные стромальные клетки человека 03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор...»

«Гуськов Валентин Юрьевич МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БУРОГО МЕДВЕДЯ URSUS ARCTOS LINNAEUS, 1758 ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, с.н.с. А.П. Крюков Владивосток – 2015 Оглавление Введение Глава 1. Обзор...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ЖЕСТКОВА ДАРЬЯ БОРИСОВНА СОСТАВ И СТРУКТУРА ТРАВЯНИСТОГО ПОКРОВА ПРИДОРОЖНЫХ ТЕРРИТОРИЙ АВТОМАГИСТРАЛЕЙ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА Специальность: 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«БУЛГАКОВА МАРИНА ДМИТРИЕВНА КАТАЛЕПТОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ГАЛОПЕРИДОЛА У КРЫС И ЕЕ ИЗМЕНЕНИЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЯИЧНИКОВ И НАДПОЧЕЧНИКОВ 14.03.06 Фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Кузнецов Виталий Викторович ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ 1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА АБЕРРАНТНОЕ ГИПЕРМЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК В РАКОВЫХ КЛЕТКАХ 03.01.03 – молекулярная биология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«ГЕНС ГЕЛЕНА ПЕТРОВНА Роль молекулярно-биологических маркеров и многофункционального белка YB-1 в лечении и прогнозе больных раком молочной железы 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант:...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.