WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 |

«РЕОРГАНИЗАЦИЯ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА, ЛЕЖАЩАЯ В ОСНОВЕ ДВИЖЕНИЯ КЛЕТОК ...»

-- [ Страница 2 ] --

Белок зиксин, ранее описанный, как компонент более зрелых ФА (Zaidel-Bar et al., 2003), демонстрирует сходную динамику включения при образовании ФА, т.е. также как и остальные белки ФА концентрируется в точке формирующейся ФА на 20-40 секунд позднее VASP. При этом оказалось, что при экстракции Тритоном Х-100, зиксин не остается в точках формирующихся ФА. Это означает, что несмотря на то, что хотя зиксин, также как и другие белки, концентрируется в VASP-положительных точках при формировании ФА, он еще не вовлечен в структуру и не закреплен.

Вероятно для закрепления зиксина требуется дополнительное условие (например, дополнительное механическая сила, обусловленная наличием локальных ретракций на ведущем краю клетки). Именно поэтому в предыдущих работах, основанных в основном на исследовании фиксированных и экстрагированных клеток, зиксин не регистрировался в ранних ФА, а встречался только в истинных фокальных контактах, образованных при созревании фокальных комплексов под действием дополнительного актомиозинового натяжения (Zaidel-Bar et al., 2003). Одним из методов исследования ФА является интерференционно-рефлекторная микроскопия (IRM), с помощью которой можно выявить участки клетки, близко прилегающие к поверхности субстрата (Izzard and Lochner, 1980). С помощью IRM Иззард и Лохнер выделили «черные контакты» - места близкого прилегания клетки к субстрату (расстояние между мембраной и поверхностью субстрата 10-15 нм),, названные ими фокальные контакты, и «серые контакты» (расстояние между клеткой и субстратом около 30 нм), названные «близкими контактами». Среднее расстояние между клеткой и субстратом вне ФА 100 нм. Как показали дальнейшие исследования, фокальные контакты, идентифицированные с помощью флуоресценции, выглядят, как черные штрихи, а фокальные комплексы, как черные точки. С помощью IRM исследовали инициальные ФА, и показали, что инициальные точки, обогащенные VASP, относились к «серым» контактам, согласно определению Иззарда и Лохнера. Эти серые точки часто входили в состав довольно широкой серой полосы, лежащей в основании ламеллиподии, и представляли собой локальные затемнения в тех местах, где VASP совпадал с интегрином. Несмотря на то, что эти точки были темно-серые, они были заметно светлее истинно «черных» контактов, удлиненных структур, расположенных в центральной части клетки и содержащих VASP и интегрин. Это означает, что клеточная мембрана в этих точках подходит довольно близко к поверхности, но не так близко, как в местах фокальных контактов. Вероятно, это происходит потому, что в точке инициальной ФА клетка присоединяется к субстрату через интегриновые рецепторы, но эта точка очень мала и не создает области "черного" контакта.

Таким образом, была показана роль белка VASP, как организатора формирования новых ФА – инициальных ФА. Было показано, что инициальные ФА – это нестабильные структуры, в быстро двигающейся клетке (например, меланоме В16) большинство из них существует только в течение нескольких минут, пока зона ламеллиподии не пройдет через это место, а далее они растворяются. Для их дальнейшего созревания требуется дополнительные факторы, например локальные ретракции края клетки. Но при этом эта стадия является необходимой, так как все более зрелые ФА (фокальные комплексы и фокальные контакты) развиваются на месте инициальных ФА. Чтобы полно охарактеризовать эту начальную стадию формирования ФА, надо было исследовать строение актиновой сети в области инициальных ФА. Из-за их нестабильности это было возможно сделать, только применив коррелятивную видео и электронную микроскопию. Этот метод позволяет последить формирование новой ФА под TIRF микроскопом, а потом, с помощью электронного микроскопа, исследовать структуру ФА с известной историей.

Было исследовано более 50 клеток и проанализировано строение VASPположительных инициальных ФА. Показано, что если новые ФА формируются в основании филоподий или на месте локальной ретракции, то на электронномикроскопическом уровне на месте VASP-положительной точки актиновые филаменты собираются в небольшие, короткие пучки, состоящие из нескольких филаментов. Если в клетку трансфицировать винкулин и зиксин, эти белки, как правило, обнаруживается в составе таких ФА. Если новые ФА формируются в ламеллиподии и не связаны с локальными ретракциями, в этих точках не удается выявить специфической структуры актиновой сети, которая отличалась бы от структуры окружающей ламеллиподии. В составе таких ФА также обнаруживается трансфицированный GFP-винкулин, но не зиксин.

Для более точного исследования трехмерной структуры ФА, находящихся на разных стадиях созревания, использовали корреляцию видеомикроскопии и электронномикроскопической томографии. На Рис. 9 дано пример анализа материала и корреляции световой и электронной микроскопии при исследовании структуры ФА.

Для дальнейшего анализа были выбраны две адгезии (показаны стрелками на Рис. 9 Б). Одна - на ведущем краю клетки, представленная точкой VASP, время жизни которой около 60 секунд; другая – более зрелая штриховая адгезия, размером 1,5 мкм, которая существовала на протяжении всего видеофильма и заметно за это время увеличилась в размере. Исследование структуры этих адгезий проводилось с помощью электронной томографии.

Рис. 9. Процедура корреляции видео и электронных изображений ФА. А – монтаж видеопоследовательности клетки 3Т3, трансфицированной GFP-VASP и стимулированной инъекцией доминантно-активного Rac. Время указано в секундах; Б

– последний кадр перед фиксацией, окраска на VASP, стрелками показаны места ФА, выбранные для дальнейших исследований. В – наложение актиновых структур, выявленных с помощью ТРИТС-фаллоидина (красный) на негативное окрашивание для точной корреляции видео и электронной микроскопии; Г – наложение окрашивания VASP на предыдущую картинку, для определения места исследуемых ФА.

Было показано, что в области инициальной ФА структура актиновой сети ничем не отличается от структуры актиновой сети окружающей ламеллиподии (Рис. 10). Отдельные филаменты были прослежены и прорисованы вручную.

Оказалось, что в районе инициальной ФА, также как и в окружающей ламеллиподии, есть довольно большое количество окончаний актиновых филаментов. Вопреки ожиданиям, эти свободные концы микрофиламентов не связаны с нижней или верхней поверхностью клетки, а равномерно распределены в толще ламеллиподии. В отдельных случаях толщина ламеллиподии в месте инициальной ФА была несколько больше, чем в окружающих районах, но это было показано не для всех исследованных инициальных ФА.

Рис. 10. Электронно-микроскопическая томограмма инициальной ФА. А – структура актинового цитоскелета ламеллиподии, место инициальной ФА обведено красным овалом. На врезке указано место исследуемой ФА. Б, В – трехмерная модель строения инициальной ФА; Б – вид сверху; В – вид сбоку. Актиновые филаменты – зеленые, концы филаментов отмечены красными точками, область инициальной ФА обведена голубой линией.

Структура более зрелой ФА представлена на Рис. 11. Эта ФА имеет размеры 1,5 мкм. На Рис. 11 Б видно, что эта ФА представлена небольшим пучком, который расположен ближе к нижней поверхности клетки и начинается сразу за густой сетью микрофиламентов, типичной для ламеллиподии, т.е. адгезия находится в основании ламеллиподии. Анализ показал, что в основном филаменты, составляющие этот пучок, начинаются у нижней поверхности клетки, но часть филаментов этого пучка являются прямым продолжением филаментов из ламеллиподии. При этом выше фокального комплекса под верхней мембраной клетки актиновые филаменты организованы в сеть (Рис. 11 А). Подмембранная сеть (А) и пучок микрофиламентов (Б) хотя и разделены пространственно, но не являются абсолютно автономными структурами, так как значительное количество микрофиламентов из верхней сети переходят в состав пучка.

На других препаратах было показано, что во всех адгезиях, которые можно отнести к фокальным комплексам, согласно их размеру и времени жизни, актиновые филаменты собраны в мелкие пучки, расположенные ближе к нижней поверхности клетки. Эти пучки в основном короткие, состоят всего из нескольких филаментов и не связаны с актиновыми пучками, идущими к центральной части

–  –  –

Рис. 11. Электронно-микроскопическая томограмма более зрелой ФА. На врезке показано расположение исследуемой ФА. А - подмембранный слой актиновых филаментов, Б - организация цитоскелета у нижней поверхности клетки.

Таким образом, было показано, что при формировании новой адгезии, существует короткоживущая стадия, которая предваряет фокальные комплексы и является совершенно обязательным этапом образования новой ФА. Эта стадия инициальные ФА - по нескольким признакам отличается от фокальных комплексов, образование которых ранее считалось первым шагом формирования ФА.

ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ, ВОЗНИКАЮЩИХ В РЕЗУЛЬТАТЕ

ТРАНСФОРМАЦИИ

Подбор клеточных систем для исследования.

Неопластическая трансформация приводит к существенному изменению формы клеток, их цитоскелета и характера движения. Изменения цитоскелета при трансформации было отмечено давно (Bershadsky and Vasiliev, 1988; Vasiliev and Gelfand, 1981; Mani et al, 2008; Polyak and Weinberg, 2009), в частности хорошо известны редукция актиновых стресс-фибрилл и нарушение созревания фокальных контактов у опухолевых клеток. Было показано также, что такая организация цитоскелета часто коррелирует с повышением локомоторной активности и/или метастатического потенциала опухолевых клеток (Pokorna et al., 1994, Sachai and Marshall, 2003), но остается неясным, каким образом эти изменения цитоскелета связаны с изменением характера клеточного движения и возникновением у клеток способности к инвазии. Нашей задачей было выявление особенностей морфологии и цитоскелета трансформированных клеток, существенных для приобретения инвазивного фенотипа.

Для этих исследований мы выбрали три разные клеточные системы, включающие в себя контрольные фибробласты и их трансформированные производные, для того, чтобы иметь возможность сравнивать клетки, находящиеся на разных стадиях опухолевой трансформации:

1). Модель моноонкогенной Ras-трансформациии: клетки 10(3), являющиеся иммортализованными мышиными фибробластами (Harvey and Levine, 1991), использовались нами как контроль, а 10(3)RAS – линия, полученные путем трансфекции исходной линии 10(3) плазмидой с геном конститутивно активного белка N-RASasp13, использовалась в качестве модели Ras-трансформации;

2). Линия клеток эмбриональных легочных фибробластов человека MRC5 и ее трансформированные аналоги, полученные в результате инфицирования исходной линии вирусом SV-40 - MRC5-V1 и MRC5-V2 (Huschtscha and Holliday, 1983). Обе производные линии обладают повышенной митотической активностью, у них появляются способность образовывать колонии в полужидком агаре, они положительны по T-антигену и являются иммортализованными. Однако MRC-5V2 способны расти в более бедной среде (с меньшим количеством глюкозы, без метионина), быстрее делятся, продуцируют большее количество свободного вируса на ранних пассажах, и среди них чаще встречаются полиплоидные клетки.

Эти свойства позволили авторам определить MRC-5V2 как клон, обладающий более трансформированным фенотипом;

3). Нормальные подкожные фибробласты человека линии 1036 в качестве контрольных клеток и клетки опухолевого происхождения - линия фибросаркомы человека НТ1080. Фибробласты 1036 демонстрировали признаки нормальных клеток и при длительном культивировании старели. Клетки фибросаркомы хорошо образуют колонии в полужидкой среде и согласно литературным данным вызывают образование опухолей у животных, т.е. являются типичными опухолевыми клетками.

Во всех этих системах контрольные клетки имели морфологию типичных фибробластов: это были хорошо распластанные, поляризованные клетки с выраженными актиновыми стресс-фибриллами, ассоциированными с крупными фокальными контактами. В результате трансформации площадь клеток уменьшалась, существенно редуцировались актиновые стресс фибриллы, а количество и размер фокальных контактов снижались. Таким образом, во всех трех системах была ярко выражена классическая морфологическая трансформация. Необходимо отметить, что степень выраженности признаков трансформации несколько отличалась среди использованных клеточных систем.

Так в мышиных фибробластах 10(3), трансформированных онкогеном Ras, описанные изменения были выражены в меньшей степени, чем у других трансформированных культур, например, наблюдалось довольно большое количество клеток с остаточными пучками микрофиламентов.

SV40трансформированные легочные фибробласты MRC-5V1 (в меньшей степени) и MRC-5V2 (в большей степени) по многим исследованным признакам приближаются к высоко-инвазивным клеткам фибросаркомы НТ1080 и могут рассматриваться, как клетки с более выраженной морфологической трансформацией.

Таким образом, в работе рассматриваются и сравниваются клетки, находящиеся на разных стадиях трансформации, что дает возможность выделить изменения, наиболее существенные для появления у клеток способностей к инвазии.

С помощью конфокального микроскопа на примере системы легочных фибробластов, показаны типичные изменения актинового цитоскелета, сопровождающие трансформацию клеток и видимые на световом уровне (Рис. 12).

Сами клетки становятся мельче, уменьшается количество пучков актиновых филаментов, однако сильно увеличивается толщина клеток. Нормальные клетки довольно плоские, толщина ламеллы составляет около 1 мкм и лишь в области раффлов может достигать 2 мкм. На Z-срезах клеток MRC-5V1 видно большое количество краевых раффлов, эти области утолщены, по сравнению с остальными частями ламеллы (2 мкм) и их толщина достигает 3мкм. На Z-срезах клеток MRCV2 видно значительное утолщение ламеллы, по сравнению с контролем.

Толщина ламеллы составляет в среднем около 2,3 мкм, а в области раффлов достигает 4,5 мкм.

Поскольку, как было показано ранее, в движении клеток определяющую роль играет формирование ведущего края, задачей данной работы было сравнительное исследование распределения и характера краевой активности у нормальных и трансформированных клеток. Краевую активность оценивали на основе видеофильмов, полученных в результате прижизненного наблюдения за одиночными интерфазными клетками исследуемых линий в течение 10 минут.

Исследование морфологических параметров клеточного края включало измерение количества и длины участков, относящихся к различным типам нестабильности (сильноактивные, слабоактивные и ретрактирующие участки). Сильноактивные – это участки, расположенные, как правило, на ведущем краю клетки, где активно образуются новые протрузии, иногда сопровождаемые локальными ретракциями;

слабоактивные участки – нет постоянного образования протрузий, но есть мелкие ламеллиподии и/или филоподии; ретрактирующие участки – там, где в течение съемки наблюдается устойчивая ретракция. Анализ показал, что у всех исследованных контрольных фибробластов стабильный край занимает примерно половину всего периметра клетки (Рис. 13). Это совпадает с результатами, полученными другими авторами (Добринских, 2007).

В результате трансформации существенно увеличивается доля активного края и существенно снижается доля стабильного. Причем, степень увеличения доли активного края (и соответственно снижения доли стабильного края) напрямую зависит от степени трансформации клеток. Так, в системе моноонкогенной трансформации онкогеном N-Ras доля активного края увеличивается с 44% до 65%, а в системах SV40-трансформированных клеток и фибробласты кожи – фибросаркома, доля активного края увеличивается до 86-87% и до 92% соответственно. При таком существенном возрастании доли активного края клетки утрачивают полярность, и наиболее трансформированные клетки, MRCV2 и фибросаркома НТ1080, не имеют выраженного ведущего края и практически не поляризованы.

–  –  –

Следует отметить, что при более длительном наблюдении (до 40 минут) у трансформированных клеток на стабильных участках наблюдалось появление активности в виде образования мелких филоподий или ламеллиподий, а иногда и развивалась сильная протрузионная активность. У контрольных клеток стабильные участки оставались «истинно стабильными» на протяжении длительного времени.

Для дополнительного исследования распределения активного края применялись методы иммунофлуоресцентного окрашивания антителами к p34 субъединице Arp2/3-комплекса.

Зонам активной Arp2/3-зависимой полимеризации актина, т.е. протрузиям соответствуют ярко окрашенные полоски по периметру клеток. В контроле наблюдалось диффузное окрашивание цитоплазмы и яркий ободок свечения Arp2/3 на самой кромке ведущей ламеллы, можно было четко выделить и стабильные (неокрашенные) участки края. У трансформированных клеток сильно возрастало количество и протяженность светящихся участков. Следует отметить, что свечение отмечалось не только на крупных участках активности, но и на концах мелких ламеллиподии и филоподий, которые классифицировались нами ранее как слабоактивные участки.

–  –  –

Таким образом, увеличение доли активного края и соответственно уменьшение доли стабильного можно считать таким же признаком трансформации, как и исчезновение в клетках стресс-фибрилл.

В настоящей работе исследовали не только изменение распределения активности по периметру клетки, но также изменение динамики образования протрузий на ведущем крае клеток при трансформации. С помощью DIC видеомикроскопии и последующего построения кимограмм было выяснено, что для контрольных фибробластов типичными являются крупные, плоские и широкие протрузии и довольно низкая активность раффлинга. Раффлы образуются из не прикрепившихся протрузий, они контрастные в DIC-микроскопе и поэтому выглядят на кимограммах, как белые линии.

На Рис. 14 видно, что раффлы двигаются от края клетки к центру со скоростью, практически равной скорости локальной ретракции протрузий и скорости обратного тока актина в ламеллиподии. В норме наблюдаются отдельные раффлы, появляющиеся вслед за крупной протрузией (Рис.14 А).

У всех трансформированных клеток частота раффлов существенно повышается (в 1,5-3,2 раза) и превышает частоту протрузий, т.е. раффлы образуются и в отсутствии видимых протрузий. У наиболее трансформированных клеток раффлы могут сливаться в единый "вал" видимый позади небольшой ламеллиподии, или располагаться в несколько рядов. Такое расположение свидетельствует о частом возникновении дорзальных раффлов, не ассоциированных с образованием протрузий, что совпадает с картиной, наблюдаемой в конфокальный микроскоп (Рис. 12 В).

Рис. 14. Кимограммы, иллюстрирующие псевдоподиальную активность на ведущем крае MRC-5 (A), MRC-5V1 (Б) и MRC-5V2 (В) клеток. А. Видны крупные плоские протрузии. Б. Наблюдается активный раффлинг, протрузии более мелкие и частые, чем в контроле. В. Наблюдаются раффлы, сросшиеся в единый «вал». Ламеллоподии довольно мелкие и частые.

Повышенное образование дорзальных раффлов трансформированными клетками отмечалось также другими авторами (Buccione et al., 2004). Анализ динамической активности на ведущем краю клеток показал, что в результате трансформации возрастает частота протрузий и ретракций, но размеры протрузий уменьшаются по сравнению с нормальными клетками.

Поскольку характер движения ведущего края должен быть связан со структурой цитоскелета, были проведены ультраструктурные исследования актинового цитоскелета нормальных и SV40-трансформированных фибробластов на электронно-микроскопическом уровне методом платиновых реплик (Svitkina and Borisy, 1998; Svitkina, 2007). Особое внимание было обращено на строение периферических районов для анализа причин различий краевой активности у нормальных и трансформированных клеток.

Электронно-микроскопическое исследование показало, что ламеллиподия на ведущем краю нормальных клеток представлена густой регулярной сетью Рис. 15. Ультраструктура актинового цитоскелета контрольного фибробласта MRC5.

А - общий вид протрузии, Б - участок ведущего края с ламеллиподией и филоподиями, В - большое увеличение, упорядоченная сеть актина в ламеллиподии;

Г - участок стабильного края, Д - большое увеличение краевого пучка.

микрофиламентов (Рис. 15, А, Б, В), на краю которой видны окончания отдельных филаментов и с очень небольшими "дырками" в сети. Вдоль стабильного края клетки идет мощный пучок актиновых филаментов и с внешней стороны от этого пучка нет ни филоподий, ни ламеллиподий.

Рис. 16. Ультраструктура актинового цитоскелета клетки MRC-5V2. А. Общий вид клетки Б. Тонкий «краевой пучок» актина (АП) в хвостовой части клетки с мелкими ламеллиподиями (Л), выходящими за его границы. В. Сильно-активный участок ведущего края, отмеченный белой рамкой на А. Видна небольшая ламеллиподия с нерегулярной актиновой сетью. Г. Слабоактивный участок края в боковой части клетки. Виден тонкий актиновый пучок (АП) и ламеллиподия (Л) с нерегулярной сетью актиновых микрофиламентов.

На Рис. 16 приведены платиновые реплики клетки MRC-5V2, как пример Ультраструктуры цитоскелета трансформированной клетки. На активном краю видны раффлы, ламеллиподия представлена гораздо менее упорядоченной сетью филаментов с большими "дырами" (Рис. 16 В). Вдоль боковой границы клетки идет тонкий и не плотный краевой пучок актина, который не ограничивает образования мелких ламеллиподий (Рис. 16 В, Г) или филоподий (Рис. 16 Г) с внешней стороны.

Таким образом, полученные данные подтверждают отсутствие «истинно стабильного края» у трансформированных клеток

ЛОКОМОТОРНОЕ ПОВЕДЕНИЕ НОРМАЛЬНЫХ И

ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ

Задачей настоящей работы было выяснение вопроса как описанные нами изменения, возникающие при трансформации, влияют на локомоторную активность клеток. Для более объективной оценки локомоторных способностей клеток мы применили несколько методов оценки эффективности миграции:

индивидуальная миграция одиночных клеток в отсутствии специфических стимулов, миграция клеток в экспериментальную рану и миграция клеток через миллипоровые фильтры, без дополнительного покрытия (3-D субстрат) или покрытые матригелем (модель инвазии). Во всех опытах были получены существенные различия в локомоторном поведении контрольных и трансформированных клеток, как на двумерном, так и на трехмерном субстрате.

Существенные различия наблюдались в количестве клеток, вышедших в экспериментальную рану за 24 часа: в зависимости от культуры число вышедших в рану трансформированных клеток превышало количество контрольных в 2-10 раз (Рис. 17).

–  –  –

Различия между нормальными и трансформированными клетками при анализе расстояния, на которое мигрировали клетки разных линий, были выражены гораздо меньше. Трансформированные клетки двигались в рану фронтом, в отличие от нормальных клеток, которые двигались поодиночке.

Необходимо отметить, что клетки фибросаркомы могли открепляться от монослоя и «высеваться» в свободную область экспериментальной раны, и таким образом оккупировали свободный субстрат гораздо скорее, чем остальные исследованные линии.

При анализе движения одиночных клеток без дополнительного стимула оказалось, что, вопреки ожиданиям, общий путь, пройденный трансформированными клетками не увеличивался по сравнению с контрольными.

Так, различия между контрольными и трансформированными клетками в Rasсистеме оказались недостоверными, а общий путь, пройденный SV40трансформированными клетками и клетками фибросаркомы, оказался в 1,8-3,1 раза меньше, чем путь, пройденный контрольными клетками.

Таким образом, скорость движения одиночных Ras-трансформированных клеток немного возросла, а скорость движения SV40-трансформированных клеток и клеток фибросаркомы даже снизилась. Стоит отметить, что скорость движения одиночных клеток наиболее морфологически трансформированных линий была более низкой, а именно 6 и 8 мкм/ч у MRC-5V2 и НТ-1080 соответственно.

Наиболее важным в изменении характера миграции было то, что движение клеток всех исследованных трансформированных линий стало более ненаправленным (Рис. 18).

Уменьшение направленности движения, которое можно выразить с помощью отношения эффективного пути к общему пройденному пути (D/T), четко коррелировало со степенью выраженности морфологической трансформации. Так, коэффициент D/T для контрольных клеток равнялся 0,71-0,77 и снижался до 0,51у трансформированных клеток.

Нужно отметить, что среди MRC-5V2 и клеток фибросаркомы наблюдалось значительное количество «стоячих» клеток. Ядра этих клеток хаотически смещались на небольшие расстояния и постоянно меняли направление движения.

Часть этих клеток готовилось к делению, чем можно объяснить остановку движения. Другие явно относилась к интерфазным клеткам, но, тем не менее, не совершали направленного движения, в отличие от большинства одиночных контрольных клеток. Это свидетельствует о том, что часть трансформированных клеток попросту не способна выбрать единое направление движения в отсутствии дополнительного стимула, вероятно из-за перераспределения краевой активности вдоль всего периметра клетки и отсутствия поляризации. Примечательно, что наименьшее расстояние проходят клетки культуры НТ-1080. Для этих клеток показана способность переходить от мезенхимального движения к амебоидному и инвазировать матригель (Wolf and Friedl, 2009; наши данные), возможно такой переход способствует продвижению клеток в трехмерном матриксе, но мешает движению клеток на двумерном субстрате.

Рис. 18. Общий путь миграции (треки) клеток контрольных (10(3), MRC-5, 1036) и трансформированных (10(3)RAS, MRC-5V1, MRC-5V2, HT-1080) культур за 8 часов.

При оценке движения клеток в трехмерном субстрате через фильтры и матригель наблюдалась иная картина. В результате Ras-трансформации клетки приобрели способность к трехмерной миграции, которая отсутствовала у контрольных 10(3) фибробластов. Контрольные человеческие фибробласты (MRCисходно обладали способностью к трехмерной миграции, но в результате SV40трансформации эта способность значительно увеличилась и была сравнима со способностью к трехмерной миграции у клеток саркомы. Кроме того, все исследуемые трансформированные линии, кроме 10(3)RAS, приобретали способность к инвазии, выраженную в проценте инвазии от 13-14% для SV40трансформированных линий до 47% для линии фибросаркомы (Рис. 19). Данные результаты согласуются со способностями данных линий расти в матригеле, описанными другими авторами (Huschtscha and Holliday, 1983; Wolf et al, 2003).

Рис. 19. Способность клеток исследуемых культур к трехмерной миграции и инвазии.

Таким образом, наиболее активными в опытах по трехмерной миграции оказались клетки «наименее приспособленные» к индивидуальному движению на двухмерном субстрате (стекле), а также, обладающие способностью отделяться и «высеваться» из клеточного монослоя. В большей степени это касается клеток НТи клеток MRC-5V2, характеризующиеся наибольшими морфологическими изменениями: крайней степенью редукции актиновых пучков и фокальных контактов, практически полным отсутствием поляризации и стабильного клеточного края, наличием активного дорзального раффлинга и «блеббообразных» утолщений в зоне ведущего края. Это может свидетельствовать о том, что перераспределение псевдоподиальной активности скорее необходимо не для увеличения скорости миграции (особенно на искусственном двумерном субстрате не характерном для биологических систем), а для облегчения поиска клеткой путей инвазии. Так, поведение исследуемых нами трансформированных клеток сходно с поведением лейкоцитов при их проникновении в кровяное русло.

(Nourshargh et al, 2010). Как показали недавние исследования, лейкоциты мыши при попытке преодолеть стенку сосуда проявляют «поисковое» поведение в ответ на множественную стимуляцию воспалительными факторами, выбирая для миграции места, свободные от перицитов (Wang et al., 2006; Voisin et al, 2010).

Скорее всего, наблюдаемое нами ненаправленное «поисковое» движение, сопровождающееся увеличением раффлинга и наличием «блеббообразных»

натеков у трансформированных клеток является аналогом подобного движения на двумерном субстрате. Тем более, что одна из используемых нами линий (НТдля которой характерны все вышеперечисленные изменения способна легко переключаться с одного типа движения на другой, за счет изменения баланса малых ГТФаз семейства Rho (Yamazaki, 2005).

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ,

ЛЕЖАЩИХ В ОСНОВЕ ПРИОБРЕТЕНИЯ КЛЕТКАМИ ИНВАЗИВНОГО

ФЕНОТИПА.

Анализ экспрессии Ras в клетках исследуемых культур.

–  –  –

С помощью иммуноблотинга было показано, что вне зависимости от способа трансформации (онкогеном Ras, вирусом SV40 или при исследовании клеток из опухоли), повышенная экспрессия Ras наблюдалась в клетках всех трансформированных линий. Многими исследованиями показано, что активация Ras приводит к увеличению активности малой ГТФ-азы Rac (Bag-Zagi and Hall, 2000; Lambert et al., 2002; Reparsky et al., 2004; Strumane et al., 2006). Повышение активности Rac в свою очередь активирует белки WAVE, обеспечивающие Arp2/3-опосредованную полимеризацию актина и образование протрузий (Ridley et al., 1992; Ridley, 2001; Burridge and Wennerberg, 2004), и таким образом приводит к усилению полимеризации актина и образования псевдоподий. Поэтому активизацию псевдоподиальной активности на ведущем краю клеток при трансформации можно, хотя бы частично объяснить повышением активности Ras.

Кроме того, показано, что усиленная экспрессия N-RAS приводит к увеличению количества дефосфорилированного кофилина (Chan et al., 2000; DesMarais et al., 2005), который в свою очередь может разрезать актиновые филаменты в составе краевых пучков, высвобождая свободные плюс-концы, стимулируя, таким образом, полимеризацию новых филаментов, приводящая к образованию новых протрузий. Этот факт хорошо объясняет ослабление и разрушение краевых пучков актиновых филаментов в результате трансформации. Разрушение краевых пучков ведет к потере истинно стабильных краев фибробластов, и, тем самым, к нарушению поляризации и перераспределению псевдоподиальной активности вдоль периметра клетки, описанной нами в настоящей работе.

Для того, чтобы выяснить, не вызвана ли выявленная разница в способности инвазировать матригель между нормальными и трансформированными клетками появлением активности металлопротеаз у исследованных трансформированных клеток, был проведен анализ активности металлопротеаз в исследуемых линиях методом зимографии.

–  –  –

Наиболее высокая активность ММР2 наблюдается у фибробластов 1036.

Активность металлопротеаз у всех линий – производных эмбриональных легочных фибробластов находится на одинаковом уровне, а у клеток фибросаркомы НТ1080 активность ММР2 даже понижена, но фиксируется активность ММР-9, что согласуется с результатами, полученными другими авторами для этих клеток ранее.

Таким образом, появление способности к инвазии в наших клеточных системах нельзя объяснить повышением активности металлопротеаз, т.е.

действительно, инвазивное поведение этих клеток связано с изменением характера и распределения краевой активности, в основе которых лежат описанные выше изменения цитоскелета.

Анализ вклада малой ГТФ-азы в формирование Rho "трансформированного" фенотипа.

На разных клеточных системах нами было показано, что нарушение актомиозиновой сократимости у фибробластов ведет не только к утрате актиновых стресс-фибрилл и нарушению созревания фокальных контактов, но и к существенному изменению формы клеток. Сравнение клеток, обработанных ингибиторами акто-миозиновой сократимости с клетками, трансформированными N-Ras, показало, что изменения цитоскелета и морфологии клеток в обоих случаях напоминают друг друга. Как трансфекция онкогена Ras, так и обработка клеток ингибиторами сократимости приводит к уменьшению площади, которую клетка занимает на субстрате. Причем совместное действие онкогена и ингибиторов этот эффект не усиливает. Так же при обоих типах обработок существенно усиливается как дисперсия, так и элонгация клеток. Ранее было показано, что обработка клеток ингибиторами сократимости не только не нарушает направленного клеточного движения, но даже ведет к увеличению скорости движения клеток (Рис 2). При сравнении подвижности клеток, трансформированных N-Ras и клеток, обработанных ингибиторами сократимости, оказалось, что в обоих случаях повышается их миграционная способность (Рис. 22).

–  –  –

Рис. 23. Влияние экспрессии онкогена Ras, перекиси водорода и антиоксиданта NAC на актиновый цитоскелет (зеленый) и строение фокальных контактов (красный) крысиных фибробластов линии REF52. А – контрольные REF52, Б – REF52, обработанные перекисью водорода (50 мкМ), В – REF52, трансформированные NRas, Г - REF52, трансформированные N-Ras и обработанные NAC (5мМ).

Таким образом, понижение активности Rho ведет к появлению у клеток некоторых морфологических признаков трансформации, а так же ведет к ускорению их движения на субстрате. Как было показано ранее (Рис. 3), клетки в присутствии ингибиторов Rho не могут формировать нормальный монослой, а формируют псевдо-многослойную культуру, довольно сильно наползая друг на друга, и этим они так же похожи на трансформированные клетки.

Исходя их полученных результатов, можно предположить, что на ранних стадиях трансформации (в нашем случае трансформация одним онкогеном Ras) первичные морфологические изменения могут быть вызваны снижением контрактильности у клеток, вероятно за счет нарушения активности Rho-киназы.

Выяснение роли уровня активных кислородных радикалов в формировании "трансформированного" фенотипа Для выяснения возможных молекулярных механизмов, лежащих в основе этих изменений, исследовали роль повышения реактивных кислородных радикалов (ROS) на морфологию, цитоскелет и подвижность клеток. Ранее в некоторых работах было показано, что повышенная экспрессия Ras может приводить к увеличению внутриклеточного содержания активных кислородных радикалов (Reactive Oxigen Species (ROS)) Мы решили проверить, как повышение активности ROS в клетке влияет на ее морфологию и способность к миграции. В этой серии экспериментов мы использовали эмбриональные фибробласты крысы REF52, а так же эти клетки, трансфицированные нерегулируемым конститутивно активным онкогеном N-Ras D13 и конститутивно активным онкогеном N-Ras под тетрациклиновым супрессором (линии REF52/tetRas и REF52/Ras соответственно).

Клетки (REF52/tetRas культивировали в присутствии 1 мг/мл тетрациклина (Sigma). Отмывка тетрациклина приводила к индукции экспрессии онкогена Ras.

Тетрациклин отмывали за 4-9 дней до эксперимента. Увеличение ROS в среде вызывали добавлением перекиси водорода, а редукцию количества ROS вызывали обработкой культуры антиоксидантом N-ацетил цистеином (NAC) в концентрации 5мМ. Было показано, что обработка клеток перекисью водорода (50мкМ в течение 4-24 часов) вызывала увеличение внутриклеточного содержания ROS на том же уровне, что и повышенная экспрессия онкогена Ras.

Контрольные клетки обеих линий имели очень сходную морфологию, и являлись хорошо распластанными фибробластами с ярко выраженными актиновыми пучками и хорошо развитыми фокальными контактами (Рис. 23 А).

Экспрессия онкогена Ras в обеих линиях приводила к статистически достоверному уменьшению площади клеток, увеличению их поляризации. При этом наблюдалась существенная редукция актиновых пучков, так же как и уменьшение числа и размера фокальных контактов (Рис. 23 В).

–  –  –

Мы показали, что обработка клеток перекисью водорода вызывается такие же изменения морфологии, актинового цитоскелета и фокальных контактов, как и повышенная экспрессия онкогена Ras, а именно значительное уменьшение площади клеток, увеличение индексов дисперсии и элонгации, появление большого числа мелких отростков, и к редукции актинового цитоскелета и фокальных контактов(Рис. 23Б). Кроме того перекись водорода, так же как и экспрессия Ras, приводит к значительному увеличению количества клеток, мигрировавших в экспериментальную рану (Рис. 24).

Также мы показали, что сходные изменения морфологии и миграционных способностей клеток были вызваны добавлением антралина. Антралин - агент, который вызывает увеличение внутриклеточных ROS по механизму, совершенно отличному от перекиси водорода (K. Muller, 1996), таким образом существенным моментов в действии обоих этих веществ на морфологию и подвижность клеток является повышение уровня внутриклеточных ROS.

Обработка клеток антиоксидантом NAC снижает уровень ROS в Rasтрансформированных клетках, что вызывает частичную реверсию Rasиндуцированных изменений и в REF52/Ras и в REF52/tet-Ras культурах. Степень поляризации трансформированных клеток снижается и становиться сравнимой с поляризацией контрольных клеток, площадь также увеличивается, хотя и не достигает контрольного уровня. Обработка контрольных REF52 клеток антиоксидантом NAC приводила к росту появлению новых актиновых пучков, а так же к увеличению количества и размеров фокальных контактов. Эти морфологические изменения, вызванные обработкой трансформированных клеток NAC, сопровождались существенным подавлением миграции клеток (Рис.24).

Было показано, что изменение уровня ROS, как в результате Ras-трансформации, так и при действии перекиси водорода, ведет к повышению активности малой ГТФазы Rac1 и изменению уровня фосфорилированного кофилина. Участие Rac1 и кофилина в регуляции миграции и морфологических реакций клеток описано ранее и воздействие ROS на эти регуляторные пути хорошо объясняют описанные нами изменения.

Таким образом, мы показали, что, по крайней мере, частично влияние онкогена Ras на морфологию, цитоскелет, адгезионные структуры и подвижность фибробластов может объясняться повышением уровня ROS в клетках.

ВЫВОДЫ

1. Наиболее важным этапом, определяющим движение клеток, является формирование активного ведущего края. Акто-миозиновая сократимость существенна для упорядочивания движения и правильного формирования клеточных слоев.

2. На ведущем краю клетки существуют две зоны – ламеллиподия и ламелла, отличающиеся по строению и динамическим характеристикам. Динамика актинового тока в ламеллиподии обеспечивается за счет полимеризации актиновой сети на краю клетки, медленный ток актина в ламелле обеспечивается за счет акто-миозинового сокращения.

3. В зоне ламеллиподии формируются инициальные фокальные адгезии (ФА), которые определяют положение границы ламеллиподия-ламелла.

Формирование новой адгезии вызывает сдвиг этой границы вперед и последующее выдвижение ламеллиподии, т.е. является инициирующим шагом в выдвижении активного края. В точках первичных ФА происходит реорганизация актинового цитоскелета из однонаправленной сети, характерной для ламеллиподии в сократимые пучки микрофиламентов, включающие в себя филаменты разной направленности и миозин II.

4. Первым шагом образования ФА является формирования инициальных ФА, в которых концентрируется белок VASP. Остальные белки контактов встраиваются в структуру инициального контакта с задержкой от 0.5 до нескольких минут. Стадия инициальных ФА является обязательной при формировании адгезионных структур, но только некоторые из инициальных ФА созревают в более крупные адгезионные структуры - фокальные комплексы и фокальные контакты. Структура актинового цитоскелета в местах инициальных ФА не отличается от структуры окружающей ламеллиподии; пучки микрофиламентов, типичные для фокальных комплексов и фокальных контактов появляются при их дальнейшем созревании.

5. При неопластической трансформации фибробластов происходит перераспределение краевой активности, существенно увеличивается доля активного края и соответственно сокращается доля стабильного края. Эти признаки нарастают по мере нарастания степени трансформации клеток и могут служит еще одним морфологическим критерием клеточной трансформации.

6. В результате трансформации меняется ультраструктура актинового цитоскелета. Актиновая сеть в ламеллиподии становится менее регулярной, появляется большое количество «дырок» в подмембранном слое микрофиламентов. Краевой актиновый пучок в боковых и хвостовой частях клетки существенно редуцирован и не обеспечивает стабильность клеточного края.

7. При трансформации клеток существенно изменяется не только распределение, но и характер псевдоподиальной активности: протрузии на переднем крае становятся более мелкими, а частота их образования и частота образования раффлов значительно возрастает. Эти изменения коррелируют с изменениями строения актиновой сети ламеллиподии, а также с отсутствием полноценных контактов клетки с субстратом.

8. По мере нарастания таких признаков трансформации, как изменения цитоскелета и перераспределение активности ведущего края, изменяется характер миграции клеток. Движение одиночных трансформированных клеток носит менее направленный характер и скорость их миграции падает, в основном в результате отсутствия поляризации активности на ведущем крае. Одновременно появляется и/или усиливается способность к 3D миграции и способность к инвазии.

9. Одним из молекулярных механизмов, лежащих в основе указанных изменений цитоскелета в результате трансформации является возрастание уровня реактивных кислородных радикалов (ROS) в результате оверэкспрессии онкогена N-Ras, приводящих к повышению активности малой ГТФазы и заметному увеличению активного Rac (дефосфорилированного) кофилина. Обработка таких клеток антиоксидантом NAC (N-ацетил цистеином) приводит к нормализации фенотипа и подвижности клеток.

10. Перераспределение псевдоподиальной активности, вызванное изменениями структуры актинового цитоскелета, в результате которого трансформированные клетки легко меняют направление движения, является определяющим в проявлении способности опухолевых клеток к инвазии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК

1. Alexandrova A., Dugina V.B., Paterson H., Bershadsky A.D. Motility of intracellular particles in rat fibroblasts is greatly enhanced by phorbol ester and by over-expression of normal N-ras product // Cell Motility and Cytoskel., 1993, Vol.25, P. 254 – 266

2. Dugina V.B., A.Alexandrova, K.Lane, E.Bulanova, Vasiliev J. The role of the microtubular system in response to HGF/SF // J.Cell Sci., 1995, Vol.108, P.1659- 1667

3. Alexandrova A.Y., Dugina V.B., Ivanova O.J., Kaverina I.N., Vasiliev J.M Scatter factor induces segregation of multinuclear cells into several discrete motile domains // Cell Motil.Cytoskel., 1998, Vol.39, P.147- 158

4. Александрова А.Ю., Иванов А.А., Чумаков П.М., Копнин Б.П., Васильев Ю.М., Changes in p53 Expression Can Modify Motility of Mouse Fibroblasts and Extracellular Matrix Organization //Oncogene, 2000, Vol.19, P. 5826-5830

5. Дугина В.Б., Александрова А.Ю., Габбиани Д., Васильев Ю.М. Влияние актомиозиновой сократимости на фокальные контакты миофибробластов и структуру стресс-фибрилл // Цитология, 2002, Т. 44, С. 48-55

6. Минина С. А., Александрова А.Ю., Васильев Ю. М. Изменение формы клеток и актинового цитоскелета при трансформации, вызванной онкогеном RAS;

возможная роль RHO-киназы // Доклады Академии Наук, 2003, Т.388, С. 1–3

7. Alexandrova A.Y., Kopnin P.B., Vasiliev J.M., Kopnin B.P. ROS Up-Regulation Mediates Ras-Induced Changes of Cell Morphology and Motility // Experimental Cell Research, 2006, Vol. 312, P. 2066-2073

8. Bershadsky A.D, Ballestrem C, Carramusa L, Zilberman Y, Gilquin B, Khochbin S, Alexandrova A.Y., Verkhovsky A.B., Shemesh T, Kozlov M.M. Assembly and mechanosensory function of focal adhesions: experiments and models // European Journal of Cell Biology, 2006, Vol. 85, P. 165-173

9. Александрова А.Ю. Эволюция взаимодействий клеток с внеклеточным матриксом в канцерогенезе // Биохимия, 2008, Т.73, С. 915-924

10. Shutova M. S., Alexandrova A. Y., and Vasiliev J. M. Regulation of Polarity in Cells Devoid of Actin Bundle System After Treatment With Inhibitors of Myosin II Activity // Cell Motility and Cytoskeleton, 2008; Vol.65, Р. 734-46.

11. Alexandrova AY, Arnold K, Schaub S, Vasiliev JM, Meister J-J. Comparative Dynamics of Retrograde Actin Flow and Focal Adhesions: Formation of Nascent Adhesions Triggers Transition from Fast to Slow Flow // PLoS ONE, 2008, Vol 3, e3234

12. Александрова А.Ю. Механизмы миграции культивируемых клеток // Сборник “Методы культивирования клеток” Изд-во Политехнического университета, г.

Санкт-Петербург, 2008, С. 40 – 55.

13. Ломакина М.Е., Александрова А.Ю. Анализ изменений, вызываемых экспрессией онкогена N-RAS в характере и распределении псевдоподиальной активности фибробластов // Онтогенез, 2009, Т. 40, С.282-293 13а. Lomakina M. E. and Alexandrova A. Y. Analysis of Changes Induced by Oncogene N-RAS Expression in Pattern and Distribution of Pseudopodial Activity of Fibroblasts // Russian Journal of Developmental Biology (ISSN 1062-3604), 2009, Vol. 40, P. 222– 231.

14. Шутова М.С. Александрова А.Ю. Сравнительное исследование распластывания нормальных и трансформированных фибробластов: роль полимеризации микрофиламентов и актин-миозинового сокращения // Цитология, 2010, Т.52, С.

41-51 14а. Shutova M. S. and Alexandrova A. Y. Normal and Transformed Fibroblast Spreading: Role of Microfilament Polymerization and Actin–Myosin Contractility //Cell and Tissue Biology (ISSN 1990_519X), 2010, Vol. 4, P. 25–35.

Тезисы докладов на конференциях:

15. Александрова А., Дугина В.Б., Бершадский А.Д., Васильев Ю. Регуляция скорости движения внутриклеточных частиц // Цитология, 1992, Т.34, N9, С. 46-47

16. Александрова А., Дугина В.Б. Роль движения внутрикле-точных частиц в процессе формирования ламеллярной цитоплазмы // Сборник тезисов Межд.симп.

,,Биол.подвижн., Пущино, 1994, С. 207-208

17. Дугина В.Б., Александрова А. Участие микротрубочек в процессе морфологических изменений эпителиальных клеток под действием рассеивающего фактора (HGF/SF) // Сборник тезисов Межд.симп. Биол.подвижн.,, Пущино, 1994, С. 213- 214

18. Alexandrova A.. Role of the motility of intracellular particles during lamella formation // Asia Pac.J.Molec. Biol. Biothec., 1994, V.2, N3, Р. 273

19. Alexandrova A., Dugina V.B. The significance of the microtubular system in response of the epithelial cells to HGF/SF // The Cytoskel. and Cell Function Meet. Cold Spring Harbor NY, 1995, Р. 20

20. Dugina V., Alexandrova A., Vasiliev J.M. The effect of microtubular drugs on the cytoskeletal reorganization of polynuclear MDCK cells induced by HGF/SF // Int.Congr."Cytoskeleton and Cancer", Les Embiez(Var), France, 1995, Р. 78

21. Дугина В.Б., Александрова А.Ю., Каверина И.Н. Сегрегация цитоплазмы многоядерных клеток на независимо движущиеся фрагменты под действием скеттер-фактора // Цитология, 1996, Т.38, С. 198

22. Alexandrova A.Y., Dugina V.B., Kaverina I.N. Segregation of polynyclear epithelial cells induced by scatter factor (HGF/SF) // Molecular Biol.Cell., 1996, V.7, 142a

23. Александрова А., Дугина В., Иванова О., Каверина И., Васильев Ю. Сегрегация многоядерных эпителиальных клеток на несколько подвижных доменов //Тез.

Докл. на 2-ом Съезде биофизиков России, С.37

24. Alexandrova A., Chumakov P., Kopnin B., Vasiliev J. Cell morphology and extracellular matrix organization are controlled by p53 expression // Molecular Biology of the Cell, 1999, Vol.10, Р. 143a

25. Александрова А.Ю, Иванов А.А.,Чумаков П.М., Копнин Б.П., Васильев Ю.М.

Влияние экспрессии р53 на морфологию клетки, структуру цитоскелета и образование внеклеточного матрикса // Сборник тезисов конференции «Цитокелет и клеточная регуляция». Пущино, 11 – 12 мая, 2000, С.5

26. Alexandrova A.Y., Verkhovsky A.B., Arnold E., StutmanM., Schaub S., Meister J-J., Geiger B., BershadskyA. Dynamic coupling between actin flow and focal adhesion sites //Journal of molecular cell biology, 2001, P. 215a

27. Копнин Б.П., Саблина А.А., Александрова А.Ю., Чумаков П. Новая функция опухолевого супрессора р53: контроль архитектуры, адгезии и миграции клеток // Тезисы конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза», Москва, 2001, С. 19-20

28. Alexandrova A.Y., Verkhovsky A.B., Arnold E., Stutman M., Schaub S., Meister J-J., Geiger B., BershadskyA. Dynamic coupling between actin cytoskeleton and focal contacts //Program and abstracts of 17th European Cytoskeleton Forum, Nyon-Geneva, Switzerland, 2002, Р.72

29. Александрова А., Верховский А.. Динамика активного края распластывающихся фибробластов // Цитология, 2003, Т. 45, №9, С.841-842

30. Resch G.P.; Alexandrova A., Small J.V. Correlating ultrastructure and dynamics in the

actin cytoskeleton //

Abstract

book of FEBS special Meeting on Cytoskeletal Dynamics:

From Cell Biology to Development and Disease, June 12-14, 2004, Helsinki, Finland, Р.70



Pages:     | 1 || 3 |

Похожие работы:

«Гармаева Татьяна Цыреновна ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ В И С У БОЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ СИСТЕМЫ КРОВИ 14.01.21 – Гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва 2012 Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научный консультант: д.м.н., профессор, академик РАМН Савченко Валерий Григорьевич...»

«ЧИКАЕВ Антон Николаевич Пептиды-имитаторы эпитопов ВИЧ-1, узнаваемых нейтрализующими антителами широкого спектра действия 03.01.03 Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Кольцово Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Ильичев Александр Алексеевич, доктор Научный руководитель: биологических наук, профессор, ФБУН Государственный...»

«Красная Юлия Владимировна ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТОГЕННОСТИ ЕNTEROCOCCUS FAECALIS В УСЛОВИЯХ ДИСБАЛАНСА РЕДОКС-СИСТЕМЫ У ЖЕНЩИН С УРОГЕНИТАЛЬНЫМ ХЛАМИДИОЗОМ 03.02.03 – Микробиология 14.01.10 – Кожные и венерические болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск – 2015 Работа выполнена на кафедре общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии и на кафедре инфекционных и кожно-венерических заболеваний Федерального...»

«ТРЕТЬЯКОВ СЕРГЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ ДИНАМИКА ФОРМИРОВАНИЯ И ПРОДУКТИВНОСТЬ СМЕШАННЫХ СОСНОВЫХ ДРЕВОСТОЕВ СРЕДНЕЙ ПОДЗОНЫ ТАЙГИ ЕВРОПЕЙСКОГО СЕВЕРА РОССИИ 06.03.02 лесоведение, лесоводство, лесоустройство и лесная таксация АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Архангельск 2011 Работа выполнена в Ф Г А О У В П О «Северный (Арктический) федеральный уни­ верситет» Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Черных...»

«ВЕДЕНИНА Варвара Юрьевна РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИ ДЕТЕРМИНИРОВАННЫХ АКУСТИЧЕСКИХ СИГНАЛОВ В МИКРОЭВОЛЮЦИИ САРАНЧОВЫХ (INSECTA, ACRIDIDAE, GOMPHOCERINAE) 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2014 Работа выполнена в лаборатории обработки сенсорной информации федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем передачи информации им. А.А. Харкевича Российской академии наук Официальные оппоненты:...»

«КУЗЬМИНА ОЛЬГА ИЛЬИНИЧНА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИСАХАРИД-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА ПЕРОКСИДАЗЫ ПШЕНИЦЫ Специальность 03.01.03 молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук УФА 2010 Работа выполнена в лаборатории биохимии иммунитета растений Учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН доктор биологических наук, старший научный Научный руководитель: сотрудник...»

«РУБИНА КСЕНИЯ АНДРЕЕВНА Т-КАДГЕРИН В ПРОЦЕССАХ РОСТА, РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ И ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ Специальность 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Москва 2015 Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории постгеномных технологий в медицине Факультета фундаментальной медицины Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего...»

«НЕЧАЕВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИМЕРНЫХ И ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК НА МИКРООРГАНИЗМЫ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ СОЗДАНИЯ НА ИХ ОСНОВЕ ИННОВАЦИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Саратов 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский...»

«ИТИН Геннадий Семенович ОСОБЕННОСТИ ГЕЛЬМИНТОЦЕНОЗОВ ДИКИХ ХИЩНЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ЛАНДШАФТНО-ГЕОГРАФИЧЕСКИХ ЗОНАХ СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО КАВКАЗА 03.02.08 — Экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Краснодар — 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный аграрный университет» руководитель: доктор...»

«ШАРЛАИМОВА Наталья Сергеевна КЛЕТКИ ЦЕЛОМИЧЕСКОГО ЭПИТЕЛИЯ МОРСКОЙ ЗВЕЗДЫ ASTERIAS RUBENS L., ОБЛАДАЮЩИЕ СВОЙСТВАМИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 03.03.04. – Клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2011 г. Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург кандидат биологических наук Научный руководитель: Петухова Ольга Александровна Институт...»

«ДЕДЕГКАЕВ Александр Тазаретович БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ КАЧЕСТВА СВЕТЛОГО ПИВА Специальность 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики» Научный консультант: Меледина Татьяна Викторовна, доктор...»

«ВОЛЬХИН ИВАН АЛЕКСАНДРОВИЧ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КОРРЕКЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ ПИРАЦЕТАМА 06.02.01 – Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Казань-2015 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ижевская государственная...»

«СТОЛПОВСКАЯ Елена Владимировна СИНТЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА – ПРОДУКТА ГЛУБОКОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ДРЕВЕСИНЫ ЛИСТВЕННИЦЫ 05.21.03 технология и оборудование химической переработки биомассы дерева; химия древесины АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Иркутск Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского Сибирского...»

«БЕРЕЗИНА Елена Сергеевна ПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА, ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ И ПОВЕДЕНИЯ И РОЛЬ ДОМАШНИХ СОБАК И КОШЕК В РАСПРОСТРАНЕНИИ ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫХ ИНФЕКЦИЙ В РОССИИ 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Омск – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омский государственный педагогический университет» и ФБУН «Омский НИИ...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2015 Работа выполнена в Балашовском институте (филиале) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г....»

«ЧИТАНАВА САВЕЛИЙ МИХАЙЛОВИЧ ФЛОРА КОЛХИДЫ 00.03.05 – «Ботаника» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в Институте ботаники Академии наук Абхазии Научный руководитель – доктор биологических наук Дорофеев Владимир Иванович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Яковлев Геннадий Павлович кандидат биологических наук Сытин Андрей Кириллович Ведущая организация: Всероссийский...»

«СЕЛИФОНОВА Жанна Павловна СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКОСИСТЕМ ЗАЛИВОВ И БУХТ ЧЕРНОГО И АЗОВСКОГО МОРЕЙ (РОССИЙСКИЙ СЕКТОР) Специальность 25.00.28 – Океанология Д 002.140.01 Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Мурманск, 2015 Работа выполнена в ФГБУН Мурманском морском биологическом институте КНЦ РАН и ФГБОУ...»

«САПРЫКИНА ТАТЬЯНА ВИТАЛЬЕВНА ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ МАЛЫХ ДОЗ ХЕЛАТОВ МЕТАЛЛОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЯЧМЕНЯ И ФИТОЭКСТРАКЦИЮ КСЕНОБИОТИКОВ 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владимир 201 Работа выполнена на кафедре ботаники естественно-географического факультета Курского Государственного Университета Научный руководитель Доктор сельскохозяйственных наук, профессор Проценко Елена...»

«СТЕПАНОВА СВЕТЛАНА КИМОВНА ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ЛОКУСА МИОТОНИНПРОТЕИНКИНАЗЫ В ЯКУТСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем» и в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научноисследовательский институт медицинской генетики» (г.Томск)...»

«Гордеев Юрий Анатольевич МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ И АГРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРЕДПОСЕВНОЙ БИОАКТИВАЦИИ СЕМЯН СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР ПОТОКОМ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ПЛАЗМЫ Специальность 06.01.03 агрофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Смоленск 2012 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Смоленская государственная сельскохозяйственная академия» (ФГБОУ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.