WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 |

«РЕОРГАНИЗАЦИЯ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА, ЛЕЖАЩАЯ В ОСНОВЕ ДВИЖЕНИЯ КЛЕТОК ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВА

Антонина Юрьевна

РЕОРГАНИЗАЦИЯ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА,

ЛЕЖАЩАЯ В ОСНОВЕ ДВИЖЕНИЯ КЛЕТОК

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук

Российском онкологическом научном центре имени Н.Н. Блохина РАМН, Отделе математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова

Научный консультант: член-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор Ю.М. Васильев

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Смирнова Елена Александровна, Кафедра клеточной биологии и гистологии Биологического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова Доктор биологических наук, профессор Ширинский Владимир Павлович НИИ экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научного комплекса Росздрава Доктор биологических наук, профессор Надеждина Елена Сергеевна Институт белка РАН

Ведущая организация: Институт цитологии РАН Зашита состоится «21» февраля 2012 г. В 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «____» _________________2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ.

Актуальность проблемы Способность к движению является одним из основных свойств животных клеток. Движение клеток и клеточных слоев лежит в основе таких процессов, как формирование различных органов в эмбриогенезе, заживление ран и развитие воспалительных процессов. Движение клеток бывает очень разнообразно, зависит от типа клеток и от условий, в которых осуществляется миграция. Например, клетки эпителиального происхождения обычно перемещаются группами или целыми слоями, сохраняя при движении межклеточные контакты. Такой тип миграции называется групповым движением клеток. Наоборот фибробласты двигаются в индивидуальном порядке и демонстрируют так называемый мезенхимальный тип клеточного движения.

При различных патологиях нарушается характер движения клеток. В частности в процессе развития злокачественных опухолей клетки приобретают способность проникать в соседние ткани и органы (инвазировать) или могут образовывать отдаленные очаги роста - метастазы. Способность клеток опухоли к инвазии и метастазированию является одной из основных причин смертности людей, страдающих от онкологических заболеваний. В процессе опухолевой прогрессии клетки претерпевают существенные морфологические изменения, что и приводит к приобретению ими несвойственных ранее способностей и изменению характера движения. В частности эпителиальные клетки при развитии опухоли претерпевают так называемый эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) при котором нарушаются межклеточные контакты, клетки приобретают фибробластоподобную форму, могут двигаться поодиночке. При этом существенно возрастает возможность их индивидуальной миграции и они могут инвазировать в близлежащие органы. В последнее время был так же описан так называемый мезенхимально - амебоидный переход (МАП), в результате которого клетки начинают двигаться на амебоидный манер, напоминающий движение лимфоцитов. При этом резко увеличивается скорость движения индивидуальных клеток в 3х-мерном матриксе и практически пропадает зависимость движения клеток от контактов с субстратом или активности ферментов, растворяющих матрикс - матриксных металлопротеаз (ММП). Картина усложняется тем, что при определенных условиях клетки могут возвращаться к прежнему способу миграции, что очень затрудняет попытки найти способы регуляции движения и ингибирования инвазии опухолевых клеток. Это свойство опухолевых клеток было описано несколько лет назад и называется пластичность опухолевых клеток (Wolf et al., 2003). Поэтому чрезвычайно важно знать, какие механизмы отвечают за тот или иной способ миграции и что регулирует движение клеток.

Давно показано, что в основе движения клеток лежат перестройки цитоскелета, в частности актинового цитоскелета. Выделяют несколько основных этапов движения - образование протрузий на ведущем краю клетки, закрепление этих протрузий с помощью адгезионных структур, подтягивание и перенос тела клетки за счет акто-миозинового сокращения. Известно, что основной механизм формирования актиновых филаментов - это полимеризация сети на краю клетки.

Однако оставалось неясным, каким образом густая равномерная сеть актина перестраивается в пучки микрофиламентов, способные к сокращению. Так же был неизвестен вклад каждой из составляющих клеточного движения - образования протрузии и акто-миозинового сокращения в эффективность клеточной миграции.

В последнее время был сделан огромный методологический скачок, появились новые методы микроскопии - фазово-контрастная микроскопия с компьютерным усилением, конфокальная микроскопия, электронная томография, открывающие новые возможности в исследовании клеточных структур. С помощью трансфекции белков, меченных флуорохромами, появилась возможность наблюдать за динамикой и активацией индивидуальных белков при движении живых клеток. В связи с этим представляется актуальным с применением этих новых методов исследовать динамику формирования и реорганизации цитоскелета при движении нормальных клеток, чтобы понимать, какие механизмы лежат в основе клеточного движения.

Как уже отмечалось выше, при прогрессии опухолей резко меняется морфология и характер движения клеток. Различия в строении актинового цитоскелета у нормальных и трансформированных клеток были описаны ранее.

Общепринят факт, что опухолевые клетки отличаются от нормальных отсутствием крупных пучков микрофиламентов - стресс-фибрилл и крупных зрелых фокальных контактов. Для трансформированных клеток характерно или полное отсутствие пучков микрофиламентов, или остаточные актиновые пучки и наличие мелких точечных фокальных комплексов. Но вопрос о том, как и почему указанные изменения приводят к возникновению у опухолевых клеток способностей к инвазии в соседние ткани, остается открытым.

Цели настоящей работы.

Исходя из сказанного выше, в настоящей работе были поставлены две основные цели: Исследовать перестройки актинового цитоскелета, лежащие в основе движения нормальных клеток, проанализировать вклад разных составляющих полимеризации актиновой сети и акто-миозиновой сократимости - для обеспечения эффективного клеточного движения, выяснить роль образования адгезионных структур в реорганизации актинового цитоскелета.

2. Исследовать изменения морфологии клеток и цитоскелета, возникающие при опухолевой трансформации и приводящие к изменению характера клеточного движения и приобретению клетками инвазивного фенотипа.

Задачи исследования:

1. Используя в качестве активаторов клеточного движения скэттер-фактор (HGF/SF) (для эпителиальных клеток) и опухолевый промотор форболовый эфир PMA (для фибробластов) исследовать изменения морфологии клеток и цитоскелета при инициации движения, определить роль системы микротрубочек и транспорта внутриклеточных частиц в миграции клеток.

2. С помощью специфических ингибиторов, исследовать роль основных составляющих клеточного движения – формирования протрузий на ведущем крае и актин-миозинового сокращения для эффективного движения клеток.

3. С примененим современных микроскопических техник (видеомикроскопии живых клеток, метода компьютерно-усиленного фазового контраста, видеонаблюдения за меченными белками, инъецированными в клетку и т.д.) исследовать структуру и динамику ведущего края клетки при движении.

4. С помощью коррелятивной видео и электронной микроскопии и с применением электронной томографии исследовать ультраструктуру и динамику актинового цитоскелета и адгезионных структур на ведущем крае при движении клеток. Исследовать на белковом уровне динамику формирования адгезионных структур с субстратом и предложить модель реорганизации актинового цитоскелета при движении клеток.

5. Исследовать роль второй составляющей – акто-миозинового сокращения для движения клеток с помощью высокоспецифичных ингибиторов актомиозинового сокращения. Для этого исследовать динамику движения клеток, регуляцию направленности движения и формирование клеточного монослоя в условиях ингибирования сократительной активности.

6. Исследовать изменения характера движения клеток, вызванного неопластической трансформацией с помощью нескольких альтернативных методов и проанализировать, какие именно морфологические изменения существенны для приобретения клетками инвазивного поведения.

7. Исследовать ультраструктуру актинового цитоскелета фибробластов с разной степенью трансформации и выявить нарушения строения цитоскелета определяющие проявление инвазивного фенотипа.

8. Для выяснения механизмов изменения клеточной морфологии при трансформации проанализировать влияние экспрессии онкогенов (N-Ras) на морфологию фибробластов. Исследовать изменения морфологии и цитоскелета фибробластов под влиянием активных кислородных радикалов (ROS).

Научная новизна и практическая ценность.

Исследованию подвижности клеток и механизмам, определяющим эту подвижность, уделяется огромный интерес в мире. Благодаря бурному техническому развитию микроскопии в последнее время появилось много новых методов и подходов, позволяющих изучать движение индивидуальных клеток. В настоящей работе было использовано уникальное сочетание современных методов

– видеомикроскопию, метод компьютерно-усиленного фазового контраста, TIRF (тотальную интерференционно-отражательную микроскопию), конфокальную микроскопию. Для осуществления коррелятивной электронной и видеомикроскопии был разработан метод, позволяющий, сочетать видеосъемки живых клеток с последующим изучением на электронномикроскопическом уровне клеточных структур с известной жизненной историей. Впервые в сочетании с корреляционной электронной микроскопией был применен метод электронной томографии, позволяющей с высоким разрешением исследовать 3х-мерное строение адгезионных структур построить модели реорганизации цитоскелета на разных стадиях формирования ФА. Полученные модели прояснили механизмы формирования адгезионных структур и перестройки цитоскелета при движении клеток. Проведенные исследования продемонстрировали важнейшую роль формирования новых адгезионных структур в процессе реорганизации актинового цитоскелета во время клеточного движения.

Исследование динамики трансфицированных в клетку белков – компонентов фокальных адгезий позволило внести существенный вклад в современное представление о строении и динамике адгезионных структур. Впервые в мире была выделена стадия инициальных фокальных адгезий, как начальная стадия формирования адгезионных структур. Ранее эта стадия не была описана исследователями из-за методических трудностей, и только использование такого широкого набора белков-маркеров и последующее исследование структуры с помощью коррелятивной электронной микроскопии позволило выделить этот этап формирования ФА. Впервые была показана роль белка VASP, как организатора сборки фокальных адгезий. Трансфекция клеток белками, меченными флуорохромами, позволила наблюдать перестройки актинового цитоскелета при движении клеток, дало возможность выяснить механизмы, регулирующие динамику цитоскелета. Были исследованы две зоны, образующиеся на активном ведущем краю - ламеллиподия и ламелла. Впервые в мире было показано, что основным процессом, определяющим быстрый ретроградный ток в ламеллиподии, является полимеризация актина, тогда как медленный ретроградный ток в ламеллиподии обеспечивается акто-миозиновым сокращением. Впервые в мире было показано, что формирование адгезионных структур de novo происходит в зоне ламеллиподии и при дальнейших перестройках именно позиция этих структур определяет положение границы между ламеллиподией и ламеллой. Эти исследования вносят весомый вклад в понимание процессов перестройки цитоскелета, лежащие в основе клеточного движения.

Изменение характера клеточного движения приводит к проявлению таких свойств опухолевых клеток, как способность к инвазии. Важность исследования механизмов, приводящих к подобным изменениям, сомнению не подлежит. В работе была сделана комплексная оценка изменений, вызываемых неопластической трансформацией, с применением большого набора различных методов (иммуноморфологии, электронной микроскопии, видеомикроскопии живых клеток, разнообразных тестов на эффективность миграции, биохимических исследований регуляции подвижности) на нескольких клеточных системах, включающих в себя контрольные (нетрансформированные) фибробласты и те же клетки с разной степенью трансформации, полученные в результате трансформации разными агентами.

Впервые проведен сравнительный компьютерный анализ динамики активного края нормальных и трансформированных клеток и в результате показано, что характерным признаком трансформации фибробластов является значительное перераспределение псевдоподиальной активности. У трансформированных клеток существенно возрастает доля активного клеточного края и соответственно уменьшается стабильный край.

При трансформации клеток изменяется не только распределение, но и характер псевдоподиальной активности:

протрузии на переднем крае становятся более мелкими, а частота их образования и частота образования раффлов значительно возрастает. Эти изменения коррелируют с изменениями строения актиновой сети в ламеллиподии, а также с отсутствием полноценных контактов клетки с субстратом. С помощью метода платиновых реплик (электронная микроскопия) выявлена ультраструктурная основа такого перераспределения: нарушение регулярности актиновой сети, появление большого количества «дыр» в подмембранном слое актина на ведущем краю клетки и разрушение краевого актинового пучка, в норме стабилизирующего боковые края клеток. В результате исследования клеточных линий, находящихся на разных стадия опухолевой трансформации, показано, что по мере нарастания таких признаков трансформации, как изменение ультраструктуры цитоскелета и перераспределения активности ведущего края, изменяется характер миграции клеток. Движение одиночных трансформированных клеток носит менее направленный характер и скорость их миграции падает, в основном в результате отсутствия поляризации активности на ведущем крае. Одновременно появляется и/или усиливается способность к трехмерной миграции через поры камеры Бойдена и способность к инвазии. Проведенная работа дает основание предположить, что именно перераспределение псевдоподиальной активности, вызванное изменениями структуры актинового цитоскелета, в результате которого, трансформированные клетки легко меняют направление движения, является определяющим в проявлении способности опухолевых клеток к инвазии.

Впервые показано, что, по крайней мере одним из механизмов, лежащих в основе изменения морфологии и подвижности клеток является накопление активных кислородных радикалов (ROS) под действием гиперэкспрессии онкогена N-Ras, и одним из путей возвращения нормального фенотипа может быть обработка клеток антиоксидантами (в нашем случае N-ацетил цистеином).

Полученные результаты имеют не только теоретическое, но и важное научнопрактическое значение, так как показывают новые подходы к нормализации морфологии и движения опухолевых клеток и открывают новые направления исследований в области клеточной биологии и антиопухолевой терапии.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Наиболее важным этапом, определяющим движение клеток, является формирование активного ведущего края. Акто-миозиновая сократимость существенна для упорядочивания движения и правильного формирования клеточных слоев.

2. Две зоны ведущего клеточного края - ламеллиподия и ламелла- отличаются по структуре, динамическим характеристикам и по механизмам, обеспечивающим динамику актиновой сети. Положение границы ламеллиподия-ламелла и дальнейшая реорганизация актинового цитоскелета при движении клеток определяется образованием ФА.

3. Образование ФА начинается в ламеллиподии с формирования инициальной фокальной адгезии. Белком-организатором сборки ФА является VASP, который первым появляется в точке ФА. Инициальные ФА являются необходимой стадией формирования ФА, хотя еще не сопряжены с выраженной структурной организацией актиновой сети.

4. Характерным признаком неопластической трансформации фибробластов является перераспределение краевой активности. При этом существенно увеличивается доля активного и, соответственно, сокращается доля стабильного края, а также изменяется характер псевдоподиальной активности на ведущем крае клетки. Эти признаки нарастают по мере нарастания степени трансформации клеток.

5. Изменение характера и распределения краевой активности у трансформированных клеток связано с нарушениями структуры цитоскелета, видимыми при электронно-микроскопических исследованиях.

Это приводит к изменению характера клеточной миграции и появлению у опухолевых клеток способностей к инвазии.

6. По крайней мере одним из молекулярных механизмов, лежащих в основе указанных изменений цитоскелета в результате трансформации является возрастание уровня реактивных кислородных радикалов (ROS) в результате оверэкспрессии онкогена N-Ras. Обработка таких клеток антиоксидантом NAC (N-ацетил цистеином) приводит к нормализации фенотипа и подвижности клеток.

Конкретное участие автора заключалось в планировании исследования, разработке методологии, выборе моделей, составлении программы. Проведение экспериментов, получение научных результатов, анализ этих результатов, формулировка научных положений и выводов проводились диссертантом самостоятельно.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены на Международном симпозиуме,,Биологическая подвижность,, Пущино, 1994; The Cytoskeletal and Cell Function Meeting, Cold Spring Harbor, NY, 1995; International Congress"Cyto-skeleton and Cancer", Les Embiez(Var), France, 1995; конференции «Цитокелет и клето чная регуляция». Пущино, 11 – 12 мая, 2000 года; 17th European Cytoskeleton Forum, Nyon-Geneva, Switzerland,2002; FEBS special Meeting on Cytoskeletal Dynamics: From Cell Biology to Development and Disease, 2004, Helsinki, Finland ; Adhesion meeting 2005. Podosomes-invalopodia-focal adhesions. Munich, Germany; Advanced workshop on Integrated approaches in Cytoskeleton Research, 2005, Luxembourg ; 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2008», С.-Петербург, 2008; ХII Российском онкологическом конгрессе, Москва, 2008 г.; на школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток», С-Петербург, 2008 г.;

The American Society for Cell Biology, 49th Annual Meeting, San Diego, CA,2009 and 50th Annual Meeting, Philadelphia, PA, 2010; 13 международной пущинской школыконференции молодых ученых "Биология - наука ХХI века", 2009; of International symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", Pushchino, 2010.

Первичная экспертиза диссертации произведена на совместной научной конференции лабораторий механизмов канцерогенеза, иммунохимии опухолей, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ канцерогенеза РОНЦ им.

Н.Н. Блохина РАМН и лаборатории математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова в НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 12 мая 2011 года.

Публикации По теме диссертации опубликовано 47 печатных работ: 13 журнальных статей (из которых 8 в зарубежных журналах), одна статья в специализированном сборнике, а так же тезисы докладов в материалах Российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 250 страницах машинописного текста и состоит из Введения, Обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание Материалов и Методов исследования, Результатов исследования, состоящих из двух частей: «Исследование реорганизации цитоскелета, лежащей в основе движения нормальных клеток» и «Исследование изменений, возникающих в результате трансформации», Обсуждения полученных результатов, Выводов и Списка литературы. Работа иллюстрирована 87 рисунками и 29 таблицами.

Библиография включает 393 публикаций.

Работа выполнена в отделе математических методов в биологии, Научноисследовательском институте им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова;

в лаборатории механизмов канцерогенеза, Института канцерогенеза Российского Онкологического научного Центра им. Н.Н. Блохина; ряд экспериментов проводили в Политехнической школе г. Лозанны, Швейцария, совместно с А.В.

Верховским, и в институте молекулярной биотехнологии г. Вена, Австрия, совместно с группой проф. Д.В. Смолла.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Клеточные культуры.

Подбору клеточных линий для наших исследований мы уделяли особое внимание. В работе было использовано 16 различных клеточных линий эпителиальных клеток и фибробластов мыши, крысы, собаки и человека.

Культивирование клеток проводилось при обычных условиях – 37оС и 5% СО2.

Методы световой микроскопии, использованные в работе:

Фазовый контраст с компьютерным усилением. Фазовоконтрастная микроскопия с компьютерным усилением была предложена и описана ранее А.

Верховским (Verkhovsky et al., 2003). Метод основан на том, что после компьютерного вычитания фона из фазово-контрастного изображения, получаемого с видеокамеры, можно повысить контрастность видеокадров и в результате существенно улучшить качество итогового изображения.

Флуоресцентная микроскопия. Для флуоресцентного окрашивания актиновых филаментов, фокальных контактов, миозина II, ДНК и p34 субъединицы Arp2/3комплекса применяли фиксацию параформальдегидом (PFA). Покровные стекла, предварительно промытые теплой средой без сыворотки, фиксировали теплым 3,7% раствором PFA на бессывороточной среде DMEM 15 минут. Затем отмывали фосфатным буфером (PBS) 3 раза по 5 минут и обрабатывали 0,1% раствором Triton X100, разведенным на PBS, в течение 3 минут, после снова проводили отмывку PBS три раза по 5 минут. Для окрашивания микротрубочек применялась фиксация клеток холодным метанолом в (-20оС) в течение 20 минут. В работе были использованы следующие антитела и красители: hVIN-1 (Sigma, США); antizyxin 164D (Transduction Lab); anti-myosin (non-muscle) BT561 (Biomedical Technologies Inc); anti-p34-Arc/ARPC2 (Upstate, США) DM1A (Sigma, США);

TRITC-anti-rabbit IgG (H+L) (Jackson Immuno Research); TRITC-goat-anti-mouse (Sigma, США); Аlexa 488 goat anti-mouse, Аlexa 488 goat anti-rabbit, Alexa Fluor 488 phalloidin (Molecular Probes); DAPI (Sigma, США). При окрашивании антитела использовали в разведении, рекомендованном производителем. Препараты заключали в раствор эльванола на PBS и затем исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan (Zeiss, Германия) c масляными объективами Plan-Neofluolar 100 и 40. Микрофотосъемку препаратов осуществляли с использованием цифровой камеры Olympus DP70 с программным обеспечением (DP Controller).

Конфокальная микроскопия. Для более подробного исследования строения актинового цитоскелета часть иммунофлуоресцентно окрашенных препаратов снимали на конфокальном микроскопе (Zeiss, Германия) с увеличением объектива Plan-Neofluar 100. Полученные Z-серии обрабатывались при помощи программы Image Examiner, в результате чего были получены Z-сечения клеток и измерена средняя толщина ламеллы и средняя толщина раффла.

Видеомикроскопия. Видеосъемку осуществляли в специальных камерах для прижизненной съемки, при температуре 37оС, на микроскопах Axioplan (Zeiss, Германия) с объективами Plan-Neofluar x25 и x40, и Nikon Eclipse-Ti с объективом Plan-Neofluar х40. Использовались техники DIC микроскопии, фазово-контрастной микроскопии с компьютерным усилением (Alexandrova et al, 2008), TIRFмикроскопии, для съемки применяли цифровые камеры с охлаждением Hamamatsu (Mode C8484-05G) и Orca-ER Hamamatsu с программным обеспечением Wasabi (Hamamatsu, Япония) и Metamorph. Продолжительность съемки и межкадровые интервалы выбирались в зависимости от задачи эксперимента.

Трансфекция живых клеток.

Для исследования динамики формирования фокальных адгезий и реорганизации цитоскелета мы использовали метод трансфекции в клетку ДНК белков, меченых флуорохромами (GFP, RFP, mCherry) и с помощью флуоресцентной микроскопии непосредственно следили за перераспределением окрашенных структур в процессе клеточного движения. Трансфекцию проводили с помощью липофектамина (Helicon, USA) и Superfect (Qiagen), согласно инструкциям производителей.

Анализ динамики формирования и подвижности клеточных структур.

Для анализа динамических преобразований на активном крае клетки (скорости ретроградного движения актина, подвижности адгезионных структур, псевдоподиальной активности и т.д.) мы анализировали отснятые видеопоследовательности, используя режим "Кимограф" в програмных обеспечениях Metamorph и ImageJ. В этом режиме были построены кимограммы (диаграмма, показывающая смещение отдельной точки вдоль заданной линии в течение заданного времени) (Hinz et al, 1999; Bear et al, 2002). Для этого выбирается узкий участок изображения (линия) и на кимограмме выстраивается последовательность этих линий во временной развертке. Смещение каждой точки вдоль выбранного участка видно по образующимся наклонным линиям на кимограмме, а угол наклона показывает скорость смещений.

Анализ миграционных способностей клеток.

Исследование способностей клеток к миграции мы проводили а) методом длительного наблюдения за миграциями индивидуальных клеток (Ломакина, Александрова, 2009); б) исследованием миграции клеток в экспериментальную рану (Alexandrova et al., 2006) и в) исследованию миграции через миллипоровые фильтры, покрытые и нет матригелем, согласно протоколу производителя (BD Falcon).

Использованные ингибиторы и модуляторы движения В экспериментах использовали следующие ингибиторы: Y27632 – ингибитор Rho-киназы, 45 мкМ (Calbiochem); блеббистатин – ингибитор АТФ-азной активности немышечного миозина II, 45, 75 и 100 мкМ (Toronto Research Chemicals Inc.) (10 мМ раствор в DMSO); ингибиторы полимеризации актина – латрункулин А, 0.5, 1, 2 мкМ (Calbiochem) и цитохалазин D 0.2 мкг/мл (Sigma);

колцемид (Sigma), – агент, деполимеризующий микротрубочки,0,2 - 0.5 мкг/мл в зависимости от постановки опыта и типа клеток; таксол (пакситаксель, Sigma, 0,2 мкм)– агент стабилизирующий микротрубочки; ингибитор Rho-киназы НА1077 в дозе 30мкМ; ингибитор протеинкиназ Н7 (30мкМ). Форболовый эфир PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) (Sigma Chemical Co., Louis. MO) – активатор протеин киназы С, добавляли к клеткам в концентрации 50 нг/мл за 5 – 6 часов перед началом съемки; D-сфингозин, ингибитор протеин киназы С, в концентрации 5мкМ.

Выявление экспрессии белка Ras и определение активности металлопротеаз проводили после электрофоретического разделения белков в 15% полиакриламидном геле с помощью иммуноблотинга и зимографии по стандартным методикам.

Электронная микроскопия.

Электронная микроскопия применялась для исследования ультраструктуры цитоскелета и ФА.

Были использованы два подхода:

Метод платиновых реплик. Исследование цитоскелета на фиксированных препаратах, высушенных методом перехода критической точки и напыленных углеродом и платиной по методу, разработанному Т. Свиткиной (Svitkina and Borisy, 1998; Svitkina, 2007). Платиновые реплики исследовали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 1200EX (JEOL, Япония) и CCD камеры ORIUS 835.10W (Gatan) с програмным обеспечением Gatan Digital Micrograph. Изображения представляли в инвертированном виде.

Электронная томография. Были исследованы серии снимков, сделанных при повороте негативно окрашенных препаратов с помощью FEI Tecnai F30 Helium (Polara) микроскопа при 300kV и охлаждении примерно до 80оК. Автоматическое сканирование и поворот осуществлялся с помощью программного обеспечения SerialEM версия 2.7.х или 2.8.х. Угол поворота был от -60о до + 60о. Для построения каждой томограммы были использованы серии двух поворотов, полученных при вращении вдоль ортогональных осей. Изображения фиксировали с помощью CCD- камеры Gatan UltraScan 4000. Томограммы на основании полученных серий были получены с помощью программного обеспечения IMOD (the Boulder Laboratory) для трехмерной электронной микроскопии клеток (Kremer et al., 1996; Frangakis and Hegerl, 2005). Для построения моделей использовали полученные Z-стеки, состоящие, как правило, из 90 – 120 секций, каждая около

0.75 нм толщиной. Каждый филамент мы прослеживали и рисовали по всей длине вручную в программе IMOD.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕОРГАНИЗАЦИИ ЦИТОСКЕЛЕТА, ЛЕЖАЩЕЙ В

ОСНОВЕ ДВИЖЕНИЯ НОРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК

Исследование инициальных процессов движения клеток и выяснение роли полимеризации актина и акто-миозиновой сократимости в движении клеток.

Начальным этапом работы было исследование процессов инициации клеточного движения.

В настоящей работе для исследований инициальных процессов клеточного движения было использовано две системы:

1) активация подвижности эпителиальных клеток с помощью HGF/SF (скэттер-фактора) и

2) активация движения крысиных фибробластов линии Rat 2/5 с помощью форбологвого эфира PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate).

На этих системах было показано, что активация клеточного движения сопряжена с поляризацией клеток и формированием выраженного ведущего края.

Необходимым условием для такой поляризации было наличие интактной системы микротрубочек. Так действие HGF/SF на формирование ведущего края и сопутствующие перестройки актинового цитоскелета полностью ингибируются при разрушении микротрубочек с помощью колцемида (2 мкг/мл) или при нарушении динамики их кругооборота с помощью таксола (0.2 мкМ). В литературе существовало мнение, что "разбегание" эпителиальных клеток под действием HGF/SF в первую очередь обусловлено нарушением межклеточных контактов. Для проверки этой гипотезы исследовали действие HGF/SF на многоядерные клетки MDCK, полученные в результате обработки исходных эпителиальных клеток цитохалазином Д (0.2 мкг/мл). Многоядерные клетки содержали 2-8 ядер, были по размеру равны небольшому островку эпителиальных клеток и по периметру демонстрировали псевдоподиальную активность. В работе было показано, что обработка таких клеток HGF/SF приводит к перераспределению псевдоподиальной активности и "разбеганию" многоядерных клеток на отдельные фрагменты, которые остаются связанными между собой узкими длинными участками цитоплазмы. Такое разбегание совершенно аналогично разбеганию отдельных клеток из эпителиального островка под действием HGF/SF. Таким образом, было продемонстрировано, что именно поляризация и формирование ведущего края является наиболее существенным процессом для инициации клеточного движения.

Принято считать, что направленное клеточное движение обеспечивается двумя основными процессами:

полимеризацией актиновой сети на ведущем краю клетки и подтягиванием тела клетки за счет акто-миозинового сокращения. Задачей этой работы было выявить вклад каждой из этих составляющих в эффективное клеточное движение.

Для этого были проанализированы действие ингибиторов полимеризации актина (латрункулина и цитохалазина Д) и действие ингибиторов акто-миозиновой сократимости (блеббистатина и Y27632) на два основных процесса, демонстрирующих клеточную подвижность: а) распластывание клеток на субстрате и б) миграция клеток в экспериментальную рану. В процессе распластывания площадь клеток увеличивается, и, кроме того фибробласты поляризуются, т.е. эффективность распластывания клеток можно оценить по увеличению площади распластывания и степени поляризации. В опытах были использованы крысиные фибробласты REF52.

Показано, что обработка клеток ингибиторами сократимости не тормозит распластывания клеток, а наоборот площадь клеток несколько увеличивается, а степень поляризации возрастает очень сильно по сравнению с контролем (Рис.1).

Обработка клеток низкими дозами цитохалазина Д и латрункулина А сильно ингибирует распластывание фибробластов. Таким образом для распластывания клеток наиболее критичным является полимеризация актиновой сети на краю клетки. Данные, полученные при ислледовании действия ингибиторов на миграционные способности клеток представлены на Рис. 2.

Рис. 1. Действие ингибиторов полимеризации актина (латрункулина А и цитохалазина Д) и ингибиторов акто-миозиновой сократимости (блеббистатина и Y27632) на распластывание фибробластов REF52.

–  –  –

Рис. 3. Густая культура фибробластов REF52, окраска актина ФИТЦ-фаллоидином.

А- контроль; Б – клетки в присутствии ингибитора Y27632. Стрелки указывают места, где клетки перекрываются друг с другом ламеллиподиями.

Была исследована способность фибробластов к формированию монослоя у контрольных клеток и в присутствии ингибиторов сократимости (Рис. 3).

Нормальные фибробласты в густой культуре формируют монослой, плотно соприкасаясь с соседними клетками, но не залезая на них. Обработка клеток Y27632 приводит к тому, что фибробласты образуют многослойные культуры.

Длинные хвостовые участки налегают на соседние клетки. Кроме этого видно, что клетки могут пересекаться и за счет широких ламелл (Рис. 3Б, отмечено стрелками).

Полученные результаты означают, что акто-миозиновая сократимость не играет существенной роли в осуществлении клеточного движения, а скорее важна для «правильного» формирования клеточных слоев и соответственно для формирования органной структуры. Таким образом, наиболее существенным процессом для движения клеток является именно образование новых протрузий на ведущем краю клеток.

Исследование динамических преобразований на ведущем активном крае в процессе распластывания и движения клеток.

Поскольку, как было показано, формирование ведущего края является наиболее существенным этапом клеточного движения, дальнейшей задачей стало исследование структуры и динамики ведущего края. С помощью флуоресцентной видеомикроскопии и метода компьютерно-усиленной фазово-конрастной микроскопии, предложенного А. Верховским (Verkhovsky et al., 2003) исследовали динамические преобразования на ведущем крае клетки при движении. Было показано, что на ведущем краю можно выделить две четко выраженных зоны, отличающихся по динамике актина и между ними видна ясная граница (Рис. 4).

Рис. 4. Фибробласт REF52 через 5 часов после посадки на стекло. В клетку инъецировали актин, меченный родамином, и исследовали ее с помощью техники фазового контраста (А) и флуоресцентной микроскопии (Б). Головками стрелок (А) обозначено зона быстрого актинового тока (ламеллиподия), пунктирными линиями (А) указан район, использованный для построения кимограмм (В, Г), стрелки на кимограмме (В) указывают наклон линий интенсивности, отражающие скорость актинового тока. Масштаб 5мкм, на кимограммах вертикальный масштаб 2 мкм, горизонтальный - 2 мин.

Крайняя зона – ламеллиподия - обозначена стрелками на Рис. 4 А. Видно, что ламеллиподия отличается от ламеллы, расположенной ближе к центру клетки, более высокой концентрацией актина (Рис. 4 Б) и различиями структуры, видимыми как на фазовом контрасте, так и на флуоресценции.

Кимограммы, построенные на флуоресцентном изображении и на фазовом контрасте показывают одинаковую скорость актинового тока (0,8 мкм/мин в ламеллиподии и 0,6 мкм/мин в ламелле).

Было показано, что скорости обратного актинового тока могут различаться в разных клетках, в зависимости от их состояния и фазы движения. Так скорости тока в ламеллиподии могут быть от 0.5 до 7 мкм/мин, а скорости тока в ламелле – от 0.05 до 2.5 мкм/мин соответственно, но, в одной и той же клетке всегда скорость тока в ламеллиподии много выше, чем в ламелле и между ними существует четкая динамическая граница.

Таким образом, было показано, что на активном ведущем краю имеются две зоны, различающиеся по строению и динамике, и между этими зонами существует четко выраженная граница. Эти зоны соответствуют описанным ранее ламеллиподии и ламелле (Salmon et al., 2002; Ponti et al., 2004). Ширина зоны ламеллиподии зависит от активности клетки, и так же как и фактическая скорость ретроградного тока может изменяться в зависимости от типа и от состояния клеток, но разница между быстрым током в ламеллиподии и более медленным в ламелле всегда остается существенной.

Следующей задачей данной работы было исследование молекулярных механизмов, регулирующих ретроградный ток актина в ламеллиподии и ламелле.

Для этого прямо под микроскопом были добавлены ингибиторы:

а) полимеризации актиновых филаментов (цитохалазин Д в дозе 0,2 мкМ), или

б) ингибитор сократимости НА1077 в дозе 30мкМ (Рис.5).

Добавление цитохалазина Д приводит к немедленному аресту распластывания и уменьшению скорости обратного актинового тока в ламеллиподии с 2,6 мкм/мин до 0,4 мкм/мин. Скорость актинового тока в ламеллиподии становится равной скорости тока в ламелле, исчезает граница между этими двумя зонами, т.е. фактически ламеллиподия исчезает и остается только ламелла. Пунктирная линия на кимограмме Е показывает время добавления 30мкМ НА1077, которое приводит к уменьшению скорости ламеллярного тока (от 1 до 0,4 мкм/мин), не вызывая изменений в динамике актинового тока в ламеллиподии (4,5 мкм/мин). Таким образом, было показано, что за существование ламеллиподии отвечает полимеризация актиновых филаментов на краю клетки, тогда как динамика актина в ламелле определяется акто-миозиновой сократимостью.

Рис. 5. Влияние ингибиторов полимеризации актина и акто-миозиновой сократимости на динамику обратного тока актина в ламеллиподии и ламелле. Распластывание клетки меланомы В16, экспрессирующей GFP-актин. Фазово-контрастная (А) и флуоресцентная микроскопия (Б), анализ кимограмм аналогичен Рис. 4. Пунктирная линия, отмеченная "CD" на кимограмме В показывает время добавления цитохалазина Д 0,2 (мкМ). (Д) Усиленный фазовый контраст и кимограммы (Е) распластывающегося фибробласта линии Swiss 3T3. Пунктирная линия на кимограмме Е показывает время добавления 30мкМ НА1077. Масштаб 5мкм, на кимограммах вертикальный масштаб 2 мкм, горизонтальный - 2 мин.

Наличие четкой границы между ламеллиподией и ламеллой предполагает, что именно в районе этой границы и происходит переключение механизмов, отвечающих за ретроградный ток актина. Эта граница была определена на основе как анализа скорости, резко меняющейся при переходе от одной зоне к другой, так и на анализе текстуры актиновой сети, видной и на флуоресцентных изображениях и на фазовом контрасте (Рис. 4, 5). Интересно, что эта граница не гладкая, а состоит из нескольких сегментов. Выступы этих сегментов соотносятся на концах с радиально расположенными пучками актиновых филаментов, т.е.

вероятно совпадают с фокальными контактами. Поэтому следующим шагом наших исследований стал детальный анализ соотношения между динамикой актинового тока и адгезионными контактами. Такой анализ приведен на Рис. 6.

Видно, что положение фокальных адгезий, меченных YFP-паксиллином, совпадает с границей ламеллиподия - ламелла.

Рис. 6. Изменение динамики актинового тока в ламеллиподии при формировании ФА.

Распластывающийся фибробласт линии REF-52, экспрессирующий YFP-паксиллин.

(A) Наложение изображений, полученных с помощью усиленного фазового контраста (серое изображение) и флуоресцентной микроскопии (красный) (слева) и кимограмма (справа). (Б) Выборочные кадры из видеопоследовательности в районе, обозначенном белым квадратом на (А), демонстрируют формирование новых ФА и соответствующего смещения границы между ламеллой и ламеллиподией, время указано в мин:сек. Белыми головками стрелок указано образование ФА. Масштаб 5 мкм, на кимограммах вертикальная черта - 2 мкм, горизонтальная - 2 мин.

Анализ кимограмм (фазовый контраст наверху, флуоресценция посередине и наложение двух изображения - внизу) показывает, что быстрый ток актина не заходит за места адгезий. В то же время зона медленного активного тока выдвигается вперед одновременно с образованием новых фокальных адгезий.

Стрелки на кимограммах нарисованы параллельно линиям с одинаковой интенсивностью и показывают скорость быстрого тока (4,5 мкм/мин), скорость медленного тока (0,5 мкм/мин) и скорость скольжения вновь образованной фокальной адгезии (0,15 мкм/мин) Новые ФА (паксиллин-позитивные точка, обозначенная головкой стрелки) формируются в зоне ламеллиподии в течение 30 сек (Б). При этом наблюдается нарушение (завихрение) тока, видимое на фазовом контрасте как усиление оптической плотности в передней части ФА. Вслед за формированием ФА следует выдвижение ламеллы (темная граница между ламеллиподией и ламеллой видна на фазовом контрасте).

Изложенные выше исследования предполагают, что формирование ФА определяет положение границы между двумя зонами активного клеточного края.

Чтобы проанализировать динамическую организацию активного края в отсутствии ФА мы посадили клетки на субстрат, покрытый поли-L-лизином в бессывороточной среде, т.е. в отсутствии сывороточных белков и белков внеклеточного матрикса.

Рис. 7. Граница ламеллиподия-ламелла не образуется в отсутствии ФА. Фибробласт REF-52 распластывался в бессывороточной среде на подложке, покрытой полилизином (poly-L-lysine). Кимограмма построена вдоль пунктирной линии, нарисованной на левом изображении. Масштаб 5 мкм, на кимограммах вертикальная черта - 2 мкм, горизонтальная - 2 мин.

В этих условиях клетки прикрепляются к субстрату и распластываются, но ФА и стресс-фибрилл не образуется. После посадки клетки начинают быстро распластываться на поли-L-лизине, но через некоторое время процесс останавливается на стадии, когда образуется довольно широкие равномерно распластанные края и выступающая центральная часть клетки (Рис. 7). Анализ динамических и структурных характеристик распластывания показал, что в этих условиях ретроградный ток на активном краю равномерный от края и до околонуклеарной части клетки, структура так же равномерная и нет деления на ламеллиподию и ламеллу. Кимограмма на рисунке показывает равномерный ретроградный актиновый ток со скоростью 1,6 мкм/мин. Скорость тока в таких клетках или одинаковая по всей ширине распластанного края, или постепенно уменьшается к центру клетки и по своим значениям промежуточная между быстрым и медленным током у клеток, распластывающихся в обычных условиях.

Таким образом, две зоны не образуются в отсутствии ФА, доказывая тот факт, что граница между ламеллиподией и ламеллой не только пространственно совпадает с ФА, но и зависит от их наличия. Так же было показано, что начало формирования всех ФА происходит в зоне ламеллиподии (подсчитано 194 события – формирования ФА в 8 распластывающихся клетках). Если ингибировать образование ламеллиподии с помощью ингибитора полимеризации актина цитохалазина Д, образования новых ФА не происходит.

Медленный ток актина, наблюдаемый позади от краевой линии ФА существует не только в зоне ламеллы, свободной от крупных пучков микрофиламентов, но так же и внутри фазово-плотных пучков, соответствующих стресс-фибриллам и оканчивающихся в местах фокальных контактов.

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ОБРАЗОВАНИЯ ИНИЦИАЛЬНЫХ

ФОКАЛЬНЫХ АДГЕЗИЙ ПРИ ДВИЖЕНИИ КЛЕТОК.

В качестве маркера инициальных ФА использовали белок VASP, так как ранее было показано, что VASP появляется на самых ранних стадиях формирования адгезионных контактов (Rottner et al., 1999). Кроме того VASP участвует в полимеризации актина на активном клеточном крае и поэтому у клеток, трансфицированных флуоресцентно-меченым VASP в момент образования протрузий внешний край ламеллиподии окрашивается. Таким образом, этот белок может одновременно четко обозначать границы клетки, выступать маркером краевой активности и маркером инициальных ФА. Для проведения исследования динамики формирования ФА исследуемые клетки, помимо VASP, были трансфицированы плазмидами, несущими ДНК других белков фокальных адгезий, слитыми с флуоресцирующими белками GFP или RFP. Во всех случаях совместной экспрессии VASP и любого другого белка ФА сначала в зоне ламеллиподии формировалась точка, положительно окрашиваемая на VASP, и позже, с задержкой в 20 -50 секунд в эту точку приходил и другой исследуемый белок ФА.

Исследована совместная динамика VASP c винкулином, паксиллином, зиксином и трансмембранным белком ФА бета-3-интегрином, который может служить маркером взаимодействия клетки с субстратом. В качестве примера обработки полученных результатов анализ динамической ко-локализации VASP c бета-3-интегрином представлен на Рис. 8. На рисунке показаны первый и последний кадр видеопоследовательности движения клетки В16, трансфицированной mCherry-VASP (красный) и EGFP-бета-3-интегрином (зеленый) (Рис. 8 А), а также монтаж из последовательности кадров одного из участков ламеллиподии с вновь образующимися ФА (обозначено белой стрелкой).

На графике интенсивности флуоресценции в точке возникновения ФА видно два пика интенсивности VASP (красная линия). Первый соответствует времени прохождения через исследуемую точку краевой линии VASP, а второй – формированию ФА. Зеленая линия показывает интенсивность бета-3-интегрина в этой же точке. Видно, что бета3-интегрин пришел в образующуюся ФА с задержкой 10 кадров (50 секунд) по сравнению с VASP и максимальная интенсивность бета-3-интегрина была достигнута на 15 кадров (75 секунд) позже, чем максимальная интенсивность VASP.

Рис. 8 Динамическая ко-локализация mCherryVASP и EGFP-бета-3-интегрина в клетке В16. A – два кадра видеопоследовательности совместной динамики mCherryVASP и EGFP-бета-3-интегрина, снятые с интервалом 40 секунд. Б – монтаж последовательности кадров участка, обозначенного рамкой, интервал между кадрами секунд. Белой стрелкой показано место возникновения ФА. В – график изменения интенсивности свечения в месте возникновения ФА во время клеточного движения.

Красный – изменение интенсивности VASP, зеленая линия – изменение интенсивности бета-3-интегрина. Общее количество кадров – 121..

Для того, чтобы исследовать степень встраивания белков ФА во вновь образующиеся структуры, проводили следующие эксперименты. Непосредственно после того, как были отсняты видеофильмы с формированием новой ФА, проводили экстракцию клеток раствором Тритона Х-100 прямо под микроскопом.

С помощью такого подхода было показано, что основные белки ФА – VASP, винкулин, паксиллин, бета-3-интегрин после экстракции остаются в точках новых ФА, т.е. они на самых ранних стадиях образования ФА структурно закреплены в этих точках.



Pages:   || 2 | 3 |

Похожие работы:

«СМАГИН АНДРЕЙ ИВАНОВИЧ ЭКОЛОГИЯ ВОДОЕМОВ ЗОНЫ ТЕХНОГЕННОЙ РАДИАЦИОННОЙ АНОМАЛИИ НА ЮЖНОМ УРАЛЕ 03. 00. 16 Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пермь – 2008 Работа выполнена на Опытной научно – исследовательской станции, Центральной заводской лаборатории «ФГУП ПО «МАЯК» Федерального агентства Росатом и в Отделе континентальной радиоэкологии Института экологии растений и животных УрО РАН Научный консультант: доктор...»

«ЯМБОРКО Алексей Владимирович ПОПУЛЯЦИОННАЯ ЭКОЛОГИЯ ЛЕСНЫХ ПОЛЕВОК (р. CLETHRIONOMYS) НА СЕВЕРО-ВОСТОКЕ АЗИИ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Хабаровск – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биологических проблем Севера Дальневосточного отделения Российской академии наук (лаборатория экологии млекопитающих) Научный...»

«Новикова Любовь Александровна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ТРАВЯНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ НА ЗАПАДНЫХ СКЛОНАХ ПРИВОЛЖСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ И ПУТИ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Саратов – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пензенский государственный педагогический университет имени В.Г. Белинского»...»

«Рабжаева Арюна Николаевна ОСОБЕННОСТИ НАКОПЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ THYMUS BAICALENSIS SERG. В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ 03.00.05 – ботаника 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2010 Работа выполнена в Байкальском институте природопользования СО РАН Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Раднаева Лариса Доржиевна кандидат биологических наук Жигжитжапова Светлана...»

«Турицин Владимир Сергеевич Экологические особенности реализации биологической активности энтомопатогенных нематод (Nematoda: Steinernematidae) для контроля численности вредных насекомых Шифр и наименование специальности 06.01.07. – Защита растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт защиты...»

«СКОРЫХ ЛАРИСА НИКОЛАЕВНА МЕТОДЫ И ПРИЕМЫ РАЦИОНАЛЬНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА БАРАНОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ И ИМПОРТНОЙ СЕЛЕКЦИИ В ТОВАРНОМ ОВЦЕВОДСТВЕ 06.02.07 – разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Ставрополь – 2013 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Ставропольский научно-исследовательский институт животноводства и...»

«ХИЖНЯК ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА БАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОБИЛИЗАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И РАДИОНУКЛИДОВ Специальность 03.02.03 микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Москва – 20 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН) Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, Кондратьева Тамара Федоровна, зав....»

«Худоногова Елена Геннадьевна БИОЛОГИЯ, ЭКОЛОГИЯ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ПОЛЕЗНЫХ РАСТЕНИЙ ПРЕДБАЙКАЛЬЯ: АНАЛИЗ, ПРОГНОЗИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Специальность 03.02.01 – ботаника (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оренбург 2015 Работа выполнена на кафедре ботаники, плодоводства и ландшафтной архитектуры в ФГБОУ ВО «Иркутский государственный аграрный университет имени А.А. Ежевского» Научный консультант:...»

«ДАВЛЕТОВА Алия Мадиевна ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ОРГАНОВ ВНУТРЕННИХ ДЕЛ ПО ПРЕДУПРЕЖДЕНИЮ ПРЕСТУПЛЕНИЙ В СФЕРЕ ОХРАНЫ ВОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ Специальности: 12.00.11 – судебная деятельность; прокурорская деятельность; правозащитная и правоохранительная деятельность; 12.00.08 – уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре уголовно-правовых и...»

«ПРИХОДЬКО Оксана Георгиевна СИСТЕМА РАННЕЙ КОМПЛЕКСНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ КОРРЕКЦИОННО-РАЗВИВАЮЩЕИ ПОМОЩИ ДЕТЯМ С ЦЕРЕБРАЛЬНЫМ ПАРАЛИЧОМ Специальность 13.00.03 — коррекциоыная педагогика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора педагогических наук МОСКВА 2009 Ci_ \J 000^ Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский городской педагогический университет» Департамента образования г. Москвы на кафедре логопедии факультета специальной педагогики НПБим КД Ушинского РАО...»

«Павлов Артем Владимирович ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СОСЦЕВИДНЫХ ТЕЛ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА В ПОСТНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ОНТОГЕНЕЗА 03.03.04– клеточная биология, цитология, гистология 14.03.01 – анатомия человека Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук МОСКВА – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских...»

«ДОРОНИН Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владимир – 2015 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»). доктор биологических наук Научный руководитель: Мудрак Наталья Станиславовна Грищенко Леонид Иванович – Официальные...»

«Сафина Лейсэн Фаритовна Анафилактический шок на ужаления перепончатокрылыми насекомыми (частота встречаемости, иммунодиагностика и прогнозирование) 14.03.09. – клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2016 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав...»

«УДК 572 СИНЕВА Ирина Михайловна ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ В ПАЛЕОАНТРОПОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ КОСТЕЙ ВЕРХНЕЙ И НИЖНЕЙ КОНЕЧНОСТИ 03.03.02 – «антропология» по биологическим наукам АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре антропологии биологического факультета Московского государственного университета...»

«СНЕГИН ЭДУАРД АНАТОЛЬЕВИЧ ПРОСТРАНСТВЕННЫЕ И ВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ ЭКОЛОГОГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ (НА ПРИМЕРЕ НАЗЕМНЫХ МОЛЛЮСКОВ И НАСЕКОМЫХ ЮГА СРЕДНЕРУССКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ) Специальность 03.02.08 экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Белгород, 2012 Работа выполнена на кафедре биоценологии и экологической генетики Белгородского государственного национального исследовательского университета Научный...»

«Богоутдинов Наиль Шамильевич БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗРАБОТКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ АКТИНОМИКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов 201 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных...»

«Чичерина Екатерина Александровна БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА 06.02.02. «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир 2015 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир) Ирза Виктор Николаевич, доктор ветеринарных...»

«Коцарь Александр Геннадьевич Математическое моделирование и алгоритмизация прогнозирования, диагностики, профилактики и лечения мочекаменной болезни специальность 03.01.09 Математическая биология, биоинформатика (медицинские науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Курск 2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Юго-Западный государственный университет» доктор медицинских наук Научный консультант: Серегин Станислав Петрович Официальные...»

«УДК 595.371.13(268.45) ИККО Наталья Викторовна ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ МАССОВЫХ ЛИТОРАЛЬНЫХ ГАММАРИД (CRUSTACEA: AMPHIPODA) В КОЛЬСКОМ ЗАЛИВЕ 25.00.28 – Океанология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Мурманск Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования...»

«ЕФИМОВ ПЕТР ГЕННАДЬЕВИЧ РОД PLATANTHERA Rich. (ORCHIDACEAE Juss.) И БЛИЗКИЕ РОДЫ ВО ФЛОРЕ РОССИИ 03.00.05. – «Ботаника» Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ Работа выполнена в Отделе Гербарий высших растений Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН. Научный руководитель: доктор биологических наук Аверьянов Леонид Владимирович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Шамров Иван Иванович, кандидат...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.