WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНТРАМЕДУЛЛЯРНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ СТРУКТУР ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ НИШИ И ЭЛЕМЕНТОВ ЛИМФОИДНОЙ СТРОМЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ ...»

-- [ Страница 3 ] --

3.1. Нишеобразующие структуры стромального микроокружения костного мозга в норме Структурная организация паренхимы костного мозга и образований участвующих в формировании гемопоэтической ниши контрольной группы была изучена в цельных фрагментах подвздошной кости 30 здоровых лиц (средний возраст группы 58,2±5,6 лет, медиана 58). При микроскопическом исследовании гистологических препаратов материал был представлен периостом, кортикальной пластинкой и губчатой костной тканью. Несмотря на возраст, кортикальная кость содержала хрящевую ткань. Как известно, вариант развития кости на месте хряща является обязательным условием, при котором костная ткань способна поддерживать кроветворение. Костномозговые пространства губчатого вещества были заполнены жировой и кроветворной тканью в равных соотношениях у всех лиц до 60 лет (n=22), незначительное увеличение в пределах лакун объема жировой ткани наблюдалось у лиц возрастной группы 60-70 лет (n=8) (рис. 2).

Среди адипоцитов располагались клетки трех линий миелопоэза на всех стадиях развития. Отмечался нормобластический тип эритропоэза. Клетки на стадии эритронормобластов располагались в центральных отделах костных лакун с наличием макрофагов среди скоплений указанных клеток, имелась тенденция расположения вызревающих форм вблизи сосудов. Зрелые гранулоциты были диффузно рассеяны среди адипозной ткани костномозговых лакун. Отчетливо прослеживалась топографическая взаимосвязь расположения миелобластов и промиелоцитов в субэндостальных зонах костномозговых пространств, зачастую незрелые клетки располагались на поверхности костных балок. В центральных отделах бластные формы гранулоцитопоэза обнаруживались редко. Мегакариоцитарный росток был представлен генерацией мегакариоцитов крупных и средних размеров с гиперглобулярными ядрами. Небольшое количество лимфоцитов располагалось диффузно в паренхиме костного мозга.

Следует отметить, что в костномозговых пространствах подвздошной кости здоровых лиц обнаруживались скопления лимфоцитов, формирующих образования типа лимфоидных фолликулов, преимущественно отмеченные реактивные лимфоидные структуры были выявлены у лиц в возрасте 65-70 лет. Реактивные нодулярные инфильтраты костного мозга здоровых лиц, в отличие от неопластического нодулярно-очагового поражения костного мозга при ХЛЛ, имели гистологические признаки, отличающие их от опухолевых инфильтратов.

Реактивные нодулярные скопления в костном мозге имели четкие границы; разнообразный клеточный состав, включавший малые и крупные лимфоциты, иммунобласты, гистиоциты.

А Б Рисунок 2. А) Костный мозг здорового человека, три ростка гемопоэза, 100х.

Б) Участок кортикальной кости, 200х.

Рисунок 3. Импрегнация серебром, ретикулиновый каркас костного мозга здорового человека, 100х.

Указанные структуры содержали сосуды, иногда обнаруживались центры размножения.

Отсутствовали признаки ретикулинового фиброза.

Ретикулиновый каркас костного мозга здоровых лиц при импрегнации препаратов серебром был представлен отдельными тонкими небольшими нитями ретикулиновых волокон, ориентированных в разных направлениях и не имевших пересечений. Помимо сетчатого каркаса, ретикулиновые нити образовывали утолщенные тяжи возле сосудов (рис. 3). Наряду с клеточными элементами гемопоэтической ниши нами были проведены ИГХ исследования коллагенов I, III и IV типа, так как они являются основными структурными белками экстрацеллюлярного матрикса, принимающими участие в морфогенезе. Во всех случаях костные трабекулы экспрессировали коллаген I типа, в 16 случаях наблюдалась выраженная экспрессия коллагена III типа, в основном в субэндостальных участках и рядом с крупными сосудами, коллаген IV типа экспрессировали сосуды с хорошо выраженной базальной мембраной.

Один из элементов стромального микроокружения, образующих нишу стволовых клеток

– микроциркуляторное русло (МЦР) – в костном мозге был представлен синусоидальными сосудами различного калибра и формы, а также сетью микрососудов интрамедуллярных и эндостальных зон костномозговых пространств подвздошной кости. Синусы - тонкостенные сосуды, которые на разрезе имели вытянутую, овальную или круглую форму (рис. 4). По калибру синусоидальные сосуды можно разделить на три вида: мелкие, средние, крупные.

Мелкие и средние синусоиды были преимущественно удлиненной и вытянутой формы. Более редко встречающиеся крупные синусоидальные сосуды имели округлые очертания. Их площадь в срезах подвздошной кости не превышала 5%. Как правило, просветы синусоидов заполнены преимущественно эритроцитами. Ядросодержащие клетки, в основном, зрелые гранулоциты, практически не обнаруживались или выявлялись в небольшом количестве.

При гистологическом исследовании стенка синусоида состояла из одного слоя вытянутых эндотелиальных клеток двух морфологических типов: уплощенные клетки с узкой полоской цитоплазмы и плоскими ядрами, и эндотелиоциты с крупными ядрами, выбухающие в просвет синуса. Структурные различия эндотелиальных клеток, по-видимому, определяют функциональное состояние синусов в целом. При ИГХ окраске на ламинин и коллаген IV типа выявлялась тонкая прерывистая базальная мембрана. В сравнении с другими сосудами базальная мембрана синусоидов выражена значительно слабее, а в некоторых участках синусоидальной стенки она не просматривалась.

Помимо синусов, которые играют огромное значение для регуляции гемопоэза, образуют гистогематический барьер, пропускают и секретируют функционально активные вещества,

Рисунок 4. Крупный синусоидальный сосуд в костном мозге здорового человека, 200х.

была изучена плотность сосудов МЦР, так как этот существенный маркер ангиогенеза необходим для оценки состояния кроветворной ниши при малигнизации гемолимфопоэза. При ИГХ исследованиях сосудов интрамедуллярной паренхимы использовалась панель антител (CD34 class II, CD31, vWF). В контрольной группе удельная площадь микрососудов при применении указанной панели антител была следующей: CD34 class II - 9,1±1,2 %, CD31 vWF - 6,5±0,5 % (рис. 5). Для дальнейших исследований нами были выбраны данные, полученные с использованием антитела CD34 class II. Методами статистического анализа было определено, что эти данные ближе всего к средним величинам площади МЦР у всех исследованных пациентов.

Таким образом, система микроциркуляции костного мозга существенно отличается от кровоснабжения других органов и тканей. Это, прежде всего, связано с наличием в МЦР костномозговой паренхимы синусоидальных сосудов. Указанная структурная организация определяет функцию костного мозга как кроветворного органа, регулируя трансвазальное прохождение биологически активных веществ и зрелых клеток крови, а также, что особенно важно, обеспечивает миграцию ГСК из экстравазальных пространств в циркуляцию и обратно.

Рисунок 5. Сосуды микроциркуляторного русла в паренхиме костного мозга здорового человека.

ИГХ CD34 cl.II, 100х.

Активный костный мозг подвздошной кости человека расположен в интрамедуллярных пространствах губчатого вещества, сформированного костными трабекулами. При морфологическом исследовании трепанобиоптатов контрольной группы выявлялись анастомозирующие между собой костные балки правильной формы с ровными гладкими краями. ИГХ анализ костного матрикса с использованием антител к коллагену I типа выявил равномерное распределение белка по всей поверхности срезов костных трабекул подвздошной кости. Площадь трабекул губчатого вещества подвздошной кости здоровых лиц составляла 21,0±2,4%. Поверхность костных балок была покрыта сплошным слоем эндостальных клеточных элементов, среди которых представлялось возможным выделить клетки двух типов.

Первые характеризуются резко уплощенной и вытянутой формой, с удлиненными темными ядрами и тонкой полоской базофильной цитоплазмы. Значительно реже наблюдаются клетки второго типа – полигональной формы, с более заметной базофильной цитоплазмой и с круглыми, чаще всего эксцентрично расположенными ядрами. При морфометрическом исследовании количество эндостальных клеток составило 1,4±0,2 клеток на единицу длины костных трабекул (рис. 6).

Рисунок 6. Клетки эндостальной зоны костного мозга здорового человека, 200х.

Как известно CD146+ стромальные клетки участвуют в остеогенезе, их присутствие необходимо для становления гемопоэза. В исследованной контрольной группе CD146+ клетки определялись непосредственно на эндостальной поверхности или субэндостально (слабая экспрессия) и периваскулярно (сильная экспрессия) рядом с сосудами МЦР. В процентном соотношении к площади гемопоэтической ткани количество CD146+ не превышало 2,5±0,3%, при этом важно отметить тот факт, что в большинстве наблюдений вблизи CD146+ клеток располагались CD34+ клетки и сосуды МЦР (рис.7).

У здоровых лиц чаще всего молодые кроветворные клетки преимущественно гранулоцитарного ряда (миелобласты, промиелоциты) определялись вблизи трабекулярной поверхности в тех местах, где на эндосте располагались клетки второго типа. Более зрелые клетки располагались в отдалении от эндоста и, по мере созревания, происходило смещение зрелых гранулоцитов в центральные отделы костномозговых пространств.

Также было установлено, что состояние эндостальных клеток в различных участках поверхности костных балок варьировало. Прежде всего, было выявлено, что состояние клеток эндоста зависело от присутствия в эндостальной зоне молодых гемопоэтических клеток гранулоцитарного ростка. В тех зонах, где отмечались признаки повышенной гемопоэтической активности, эндостальная зона отличалась увеличенным количеством стромальных клеток.

Преимущественно в таких зонах выявлялись CD34+ клетки.

Рисунок 7. Экспрессия CD146 клетками субэндостальной зоны костного мозга здорового человека, 200х.

Стрелками указаны Cd146+ клетки на эндостальной поверхности костной балки.

Считается, что эндостальные клетки играют роль селективно проницаемой мембраны, регулирующей ионный обмен между костным матриксом и интрамедуллярной средой.

Известно, что кость является хранилищем минеральных солей, часть из которых крайне необходима для процессов кроветворения. В частности важное значение имеет обмен кальция, ионы которого играют существенную роль в регуляции гемопоэза. Кроме этого, костные трабекулы являются хранилищем коллагена I типа, ключевого белка, определяющего клеточный морфогенез не только в эмбриональном периоде, но и у взрослых. Наконец, учитывая способность стромальных эндостальных клеток формировать экстрацеллюлярный матрикс и выделять гуморальные факторы регуляции гемопоэза, а также, то обстоятельство, что эндостальная зона хорошо васкуляризирована, становится очевидным важное значение указанных образований в поддержании жизнедеятельности и дальнейшего развития стволовых кроветворных клеток.

Таким образом, исследование подвздошной кости с применением современных гистологических методов, в том числе ИГХ, дает возможность проанализировать не только гистоархитектонику функциональной паренхимы костного мозга, но и детально оценить стромальные нишеобразующие элементы гемопоэтической ниши – систему микроциркуляциии, а также клеточные и внеклеточные образования эндостальной зоны губчатой кости.

Совершенно очевидно, что структурная организация МЦР и эндостальных зон костной ткани в сочетании с их функциональным потенциалом способны определять ключевую роль указанных элементов стромы костного мозга в поддержании жизнедеятельности ГСК.

3.2. Паренхима и формирующие нишу стволовых клеток стромальные образования костного мозга при ХЛЛ Анализ гистологических препаратов подвздошной кости 96 больных ХЛЛ (56 мужчин и 40 женщин) в возрасте от 49 до 73 лет (средний возраст группы 59,9±7,2 лет, медиана 60) свидетельствовал об изменении клеточного состава интрамедуллярной кроветворной паренхимы и указывал на структурные перестройки стромального микроокружения, включая образования, формирующие нишу для стволовых кроветворных клеток – сосуды МЦР и клеточные элементы, располагающиеся на поверхности костных трабекул, а также интрамедуллярный экстрацеллюлярный матрикс эндостальных зон.

При изучении паренхимы костного мозга была отмечена неоднородность специфической опухолевой инфильтрации интрамедуллярных пространств. На основании гистологических исследований губчатой кости больных ХЛЛ в паренхиме костного мозга было выделено три типа лимфоидной инфильтрации: нодулярный, интерстициальный, диффузный (рис. 8).

Нодулярная инфильтрация отмечалась у 18 пациентов (18,8%), интерстициальная у 26 пациентов (27%), диффузная у 52 пациентов (54,2%).

Нодулярный тип опухолевой инфильтрации характеризовался появлением в кроветворной паренхиме одного или нескольких нечетко отграниченных от миелоидной ткани скоплений лимфоидных клеток. Как правило, нодулярный инфильтрат располагался в субэндостальных зонах костномозговых лакун. Нечеткие границы нодулярных инфильтратов были обусловлены тем обстоятельством, что происходило распространение лимфоидных клеток в прилежащую миелоидную ткань, светлые центры размножения при указанной инфильтрации не обнаруживались, обнаруживалось незначительное повышение количества микрососудов нодулярных лимфоидных скоплений. Размер очагов поражения варьировал, при увеличении размеров опухолевых нодулей могли выявляться зоны соприкосновения с поверхностью костных трабекул (n=5). Клеточный состав нодулярных инфильтратов был мономорфен и представлен малыми лимфоцитами, имеющими округлые ядра с глыбчатым, комковатым хроматином, практически не контурированными ядрышками, клетки имели малозаметную узкую цитоплазму. В небольшом количестве также были представлены лимфоциты средних размеров с дисперсным хроматином, наличием мелких ядрышек. При импрегнации препаратов серебром отмечалось появление отдельных грубых нитей отложений ретикулина. Представленные особенности структуры нодулярных лимфоидных скоплений в костномозговых пространствах при ХЛЛ позволяет отчетливо дифференцировать их от А Б В Рисунок 8. Типы опухолевой инфильтрации в костном мозге при ХЛЛ: А) нодулярная, Б) интерстициальная, В) диффузная, 100х.

неопухолевых реактивных лимфоидных фолликулов костного мозга здоровых лиц, охарактеризованных в предыдущей главе.

Интерстициальный тип поражения костного мозга устанавливался в наблюдениях, когда клетки лимфоидных инфильтратов располагались в миелоидной ткани между сохранившимся объемом адипоцитов. При этом клеточный состав миелокариоцитов изменялся в зависимости от степени их замещения опухолевыми лимфоцитами. Характер клеточного состава лейкозных инфильтратов был подобен типу клеток образующих нодулярные скопления. Выявлялись преимущественно лимфоциты мелких размеров, среди которых присутствовали в небольшом количестве клетки средних размеров.

При диффузной опухолевой инфильтрации костного мозга лимфоидные клетки занимали практически все пространство костномозговых полостей. Происходило практически полное замещение опухолью жировой ткани в лакунах губчатой кости (более 70% поражения).

Обнаруживалось небольшое количество клеток деятельного костного мозга диффузно располагающихся между лимфоцитами мелких и средних размеров.

Иммунофенотип опухолевых клеток был установлен при ИГХ исследовании.

Лимфоидные инфильтраты содержали клеточную лимфоидную популяцию экспрессирующую пан-В-клеточные маркеры CD19, CD20, CD79, а также CD5 и CD23. Отсутствовала экспрессия Cyclin D1, CD10.

Распределение типов инфильтрации костного мозга по стадиями Rai показано на рисунке

9. Так, 3-4 стадии характеризовались преобладанием случаев с диффузной инфильтрацией костного мозга, в то время как 0-1 стадии с преобладанием нодулярной инфильтрации.

Интерстициальная инфильтрация отмечалась на всех стадиях Rai – в 3 случаях 0 стадии, в 7 случаях 1 стадии, 16 случаях 2 стадии, 10 случаях 3 стадии и 5 случаях 4 стадии.

Нами была определена пролиферативная активность, как количество экспрессирующих Ki-67 лимфоцитов в инфильтрации: низкая - менее 5%, умеренная 5-10%, повышенная более 10%. Пролиферативная активность была преимущественно низкая (54 случая, 56%), повышенная экспрессия Ki-67 отмечалась в 42 случаях (44%), 37 из которых имели диффузную и 5 интерстициальную инфильтрацию костного мозга (таблица 5).

–  –  –

Рисунок 9. Распределение (в % соотношении) типов инфильтрации костного мозга больных ХЛЛ по стадиям Rai.

Морфологические признаки реакции стромы костного мозга имелись при всех трех видах опухолевой инфильтрации костномозговой паренхимы. Однако были выражены неравнозначно в целом и относительно нишеобразующих элементов стромального микроокружения (таблица 5).

При выявлении в костномозговых пространствах губчатого вещества подвздошной кости нодулярных лимфоидных инфильтратов структурных перестроек элементов стромального микроокружения в кроветворной паренхиме вне зон инфильтрации обнаружено не было.

Морфология МЦР русла, а также клеточных элементов эндоста и костных балок на светооптическом уровне в гистологических препаратах, окрашенных рутинными методами, не изменялась, наблюдалось незначительное увеличение числа сосудов в пределах опухолевых инфильтратов (рис. 10). Что касается зон поражения, при импрегнации серебром можно было отметить наличие стромальной реакции на патологический процесс в форме увеличения количества ретикулиновых нитей в месте расположения нодулярных инфильтратов. При этом в некоторых случаях отмечался очаговый ретикулиновый склероз (рис. 11).

–  –  –

А Б В Рисунок 11. Ретикулиновый каркас костного мозга, импрегнация серебром: А) нодулярная, Б) интерстициальная, В) диффузная инфильтрация при ХЛЛ, 200х.

Таблица 5. Морфометрические показатели структур костного мозга подвздошной кости в зависимости от типа лимфоидной инфильтрации (М±м)

–  –  –

Гистологические исследования стромальных структур микроокружения костного мозга при интерстициальном варианте опухолевой инфильтрации не выявили статистически значимых количественных перестроек нишеобразующих структур. Однако были заметны морфологические изменения организации элементов микроокружения. Стромальная реакция заключалась в изменении ретикулинового каркаса паренхимы кроветворной ткани, в лакунах отчетливо определялось увеличение количества отдельно располагающихся фрагментов ретикулина (рис. 11). При этом в большинстве случаев (n=14) нити располагались изолировано и не образовали пересечений или сетчатого рисунка. Отмеченный факт может свидетельствовать об изменении функциональной активности ретикулярных клеток.

Увеличивается количество волокон коллагена III типа в субэндостальных пространствах.

Статистически достоверных количественных изменений клеток эндоста при данном поражении костного мозга, не выявлено, однако соотношение клеток с уплощенными и крупными ядрами изменяется в сторону увеличения количества последних. Достоверно увеличена плотность сосудов по сравнению с нормальным костным мозгом (рис. 10).

Отчетливо проявлялись изменения стромального микроокружения костного мозга, включая структуры, образующие васкулярную и остеобластную ниши стволовых клеток при исследовании трепанобиоптатов с диффузным поражением костного мозга при ХЛЛ. Наряду с изменением количества и структуры нишеобразующих элементов, происходили качественные перестройки стромального микроокружения в целом. Диффузная инфильтрация костного мозга сопровождалась редукцией адипоцитов, оставшиеся жировые клетки характеризовались снижением объема жировой вакуоли. В костномозговых пространствах происходило усиление ретикулинового рисунка вплоть до появления грубых ретикулиновых волокон, образующих пересечения с формированием ретикулинового склероза (рис. 11).

Удельная площадь сосудов МЦР определялась нами с помощью ИГХ реакций с панелью антител - маркеров клеток эндотелия - CD34 cl. II, CD31, фактор Фон Виллебранда (vWF).

Данные представлены в таблице 6.

Таблица 6. Результаты определения удельной площади сосудов по иммуногистохимическим исследованиям с маркерами эндoтелия (М±м)

–  –  –

Примечание: * - р 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем.

Полученные данные со всеми антителами показали увеличение площади сосудов при диффузной инфильтрации по сравнению с контрольной группой, при сравнении удельной площади сосудов у пациентов с нодулярной и интерстициальной типами инфильтрации значения достоверно не отличались от контрольных, но тенденция увеличения удельной площади сосудов прослеживалась при окраске со всеми антителами.

Нарастало количество микрососудов во всех отделах костномозговых пространств и, что особенно важно, в субэндостальных пространствах, также следует заметить, что в большинстве сосудов наблюдалось появление эндотелиоцитов с крупными, активными ядрами (рис.11).

По результатам ИГХ исследований для дальнейших сравнений нами были выбраны значения удельной плотности сосудов, полученные с антителами CD34 cl. II, так как этот маркер позволяет объективизировать оценку сосудов МЦР различной степени зрелости, включая популяцию незрелых эндотелиальных клеток, а также по данным статистического анализа они являются более достоверными (р 0,03). Так было показано, что площадь сосудов при диффузной инфильтрации (17,9±3,7 %) возрастает почти в 2 раза по сравнению с контролем (9,1±1,2%), при интерстициальной инфильтрации увеличивается почти в 1,5 раза (13,1±1,2%), при нодулярной инфильтрации статистически значимых изменений не обнаружено (12,3±2,5%) (рис. 12).

Рисунок 12. Изменение удельной площади сосудов МЦР (% от площади гемопоэтической ткани) в группах пациентов по типам инфильтрации костного мозга (CD34 cl.II) по сравнению с контролем.

Нами также определялась экспрессия 70-kd дзета-ассоциированного белка (Zap70) и оценивалась зависимость экспрессии этого белка от изменяющейся удельной площади сосудов МЦР костного мозга больных ХЛЛ. Экспрессия Zap70 оценивалась в опухолевых клетках и характеризовалась как отрицательная (менее 20% экспрессирующих клеток), умеренная (20и сильная (более 50%), внутренним положительным контролем служили Т-клетки (рис.

13). На рисунке 14 представлен график динамики показателей плотности микрососудов и уровня экспрессии Zap70 больных ХЛЛ, была выявлена статистически значимая корреляция между этими показателями (R=0,7, p 0,05, N=96).

А Б Рисунок 13. Экспрессия Zap70 в опухолевых клетках, инфильтрирущих паренхиму костного мозга при ХЛЛ: А) умеренная экспрессия, Б) выраженная экспрессия, 200х.

Рисунок 14. Зависимость уровня экспрессии Zap70 и площади сосудов МЦР у больных ХЛЛ. Примечание: наклонная линия тренда показывает зависимость исследуемых значений, R=0,7, p 0,05, N=96.

Полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия Zap70 коррелирует с типом инфильтрации костного мозга: во всех случаях диффузной инфильтрации костного мозга (n=52) большинство лейкозных клеток были положительны (более 65%), в то время как при нодулярной инфильтрации экспрессии в подавляющем большинстве случаев (n=18) обнаружено не было, интерстициальная инфильтрация костного мозга (n=26) отличалась переменной экспрессией Zap70. Отмечались 6 случаев интерстициальной инфильтрации с отсутствием экспрессии Zap70 (менее 15%), 4 случая с повышенной экспрессией (50-65%), 16 случаев с умеренной экспрессией (30-45%) (рис. 15).

В нашем исследовании также были проанализированы данные миелограммы и периферической крови пациентов с одновременным анализом характера поражения костного мозга на материале трепанобиоптатов. Соотношения между типами лимфоидной инфильтрации в костном мозге и параметрами периферической крови и миелограммы представлены в таблице

7. Изменения показателей выявлялись при всех типах поражения, однако в наибольшей степени были выявлены при диффузном типе, при котором в периферической крови отмечалось более высокое содержание лейкоцитов (114,9±28,2*109/л) и лимфоцитов (101,8±13,2*109/л), снижение уровня гемоглобина (87±5,7 г/л), а в миелограмме увеличено количество лимфоцитов (82,1±3,3%) и миелокариоцитов (460,3±131,2*109/л).

Таблица 7. Соотношения между типами лимфоидной инфильтрации костного мозга и лабораторными данными (М±м)

–  –  –

Таким образом, учитывая, что анемия и лимфоцитоз являются неблагоприятными прогностическими факторами заболевания можно заключить, что нодулярная и интерстициальная инфильтрация свидетельствуют о более благоприятном течении ХЛЛ в сравнении с диффузным типом поражения костного мозга.

–  –  –

Рисунок 15. Распределение уровней экспрессии Zap70 по типам инфильтрации костного мозга у больных ХЛЛ.

Исследование эндостальных зон показало статистически значимое увеличение количества клеток на эндосте при диффузной инфильтрации костного мозга - 2,3±0,4 ед/пл по сравнению с контролем 1,4±0,2 ед/пл (таблица 5). Одновременно с увеличением числа эндостальных клеток стромы, изменялась структурная организация ядер. В выстилающих поверхность костных балок клетках доля клеточных элементов с вытянутыми уплощенными формами ядер уменьшалась, наблюдалось нарастание в эндостальных и субэндостальных зонах стромальных клеток с крупными просветвленными ядрами (рис. 16). Экспрессия молекулы CD146, которая маркирует стромальные клетки эндостальных и периваскулярных зон при диффузной инфильтрации также увеличена и присутствовала практически повсеместно в субэндостальных зонах (10,2±1,3% от гемопоэтической ткани) (рис. 17).

Иммуногистохимическое определение коллагеновых волокон не показало достоверных отличий между типами инфильтрации костного мозга. Тем не менее, тенденция к изменению распределения экспрессии коллагена разных типов присутствует и можно говорить о том, что эта проблема требует более подробного рассмотрения. Так нарастает количество коллагеновых волокон III типа в экстрацеллюлярном матриксе у пациентов с ХЛЛ по сравнению с контролем, что отмечено в 28 случаях из 52 при диффузной инфильтрации, и в 9 случаях из 26 при интерстициальной инфильтрации костного мозга (рис. 18).

Нами были показаны значимые изменения структур стромы костного мозга, которые указывают на важную роль опухолевого микроокружения в прогрессии заболевания. Наиболее выраженные изменения стромы костного мозга происходят при диффузном варианте инфильтрации. При этом особенно важно отметить, что перестройки регистрируются в микроциркуляции и в стромальных элементах эндостальных зон костномозговых пространств – ключевых образований, формирующих нишу клеток предшественников гемолимфопоэза. С усилением опухолевой инфильтрации в костном мозге нами показано увеличение количества клеток на эндосте, усиление экспрессии CD146 в субэндостальной зоне, количества сосудов МЦР, увеличение количества коллагеновых и ретикулиновых волокон. Один из факторов прогноза, экспрессия молекулы Zap70, коррелирует с этими изменениями, что может свидетельствовать о доброкачественном течении ХЛЛ при нодулярном и интерстициальном типах инфильтрации, и прогрессирующем при диффузном типе поражения костного мозга.

–  –  –

Таким образом, у больных ХЛЛ в костном мозге наблюдаются различные варианты опухолевой инфильтрации нодулярный, интерстициальный, диффузный. Наряду с

– изменениями интрамедуллярной паренхимы развитие ХЛЛ сопровождается структурными перестройками стромальных образований формирующих гемопоэтическую нишу. Нарушения МЦР проявляются ростом числа микрососудов, приводящим к увеличению их плотности в миелоидной ткани. При этом рост числа сосудов также затрагивает эндостальные зоны губчатого вещества подвздошной кости. Одновременно с перестройкой МЦР происходит увеличение количества эндостальных стромальных клеток, включая CD146+, и наблюдается тенденция к изменению экстрацеллюлярного матрикса эндостальных и периваскулярных зон, что подтверждается ИГХ исследованиями коллагена III и IV типов. Очевидно, что дефекты структур формирующих гемопоэтическую нишу могут быть значимым патогенетическим фактором неопластической трансформации В-лимфоцитов и в таких условиях функция ниши может быть направлена на поддержание лейкозного клона.

Гистоморфологическая характеристика стромального компонента в 3.3.

лимфатических узлах при немалигнизированных реактивных лимфаденопатиях Подобно структурной организации костного мозга, строение лимфатических узлов также включает в себя паренхиматозный и стромальный компонент. Ранее, в обзоре литературы отмечалось, что строма лимфатических узлов формируется гетерогенной по структуре и функциям популяцией ретикулярных клеток и разветвленной системой сосудов. По аналогии с костным мозгом, в группе стромальных элементов лимфатического узла выделяются нишеобразующие элементы стромы лимфоидной ткани, которые играют ключевую роль в реализации программы пролиферации и дифференцировки лимфоидных предшественников, окончательной стадией которой являются В-лимфоциты и плазмоциты. Указанную группу элементов лимфоидной стромы представляют фолликулярные дендритные клетки и микрососуды лимфатических узлов.

В качестве группы сравнения были взяты биоптаты лимфатических узлов 20 лиц в возрасте 48-70 лет (средний возраст группы 62,7±6,2 лет, медиана 63) с неопухолевой реактивной неспецифической лимфаденопатией. Поскольку разные структуры лимфатического узла отвечают на антигенные воздействия неодинаково, границы отдельных зон были стерты или смещены вследствие гиперплазии или наоборот гипоплазии той или иной субпопуляции лимфоцитов. При гистологическом исследовании использованного материала во всех наблюдениях сохранялась структура строения лимфатических узлов. В гистологических препаратах различалась капсула, кортикальная зона, лимфоидные фолликулы в большинстве случаев с наличием светлых реактивных центров, паракортикальная зона, мозговые тяжи, лимфатические синусы, сосудистая сеть (рис. 19).

В лимфатических узлах можно выделить строму с фиксированными клетками и паренхиму с клеточной популяцией, которая претерпевает изменения. Фибробластические ретикулярные клетки составляют основную стромальную популяцию клеток и формируют ретикулярную сеть. Ретикулярная сеть выполняет несколько функций: формирование структуры лимфатического узла и обеспечение условий для пролиферации, дифференцировки и миграции клеток, а также передаче сигналов между клетками. Коллагены I и III типов отвечают за прочность ретикулярной сети, коллаген IV типа и ламинин маркируют сосудистую систему лимфатического узла.

Общая структура и клеточный состав паренхимы лимфоузлов не отличался качественным содержанием, имелись в различной степени изменения количественных соотношений. Капсула исследованных лимфатических узлов была представлена А Б Рисунок 19. Лимфатический узел с неспецифической хронической лимфаденопатией: А) общий вид, 40х, Б) фолликул лимфатического узла с ярко выраженным светлым центром и зоной мантии, 100х.

плотными коллагеновыми волокнами с наличием небольшого числа фиброцитов, гладкомышечных волокон. При ИГХ исследовании в капсуле выявлялся коллаген III, IV типов, десмин, местами определялось позитивное окрашивание на ламинин. Инфильтративные процессы отсутствовали. Внутрь паренхимы от капсулы распространялись соединительнотканные трабекулы, содержащие сосуды. При ИГХ исследованиях в трабекулах также наблюдалась экспрессия десмина, коллагена III, IV типов. Кортикальная зона в изученных препаратах была расширена, содержала различной величины лимфоидные фолликулы, чаще с центрами размножения.

Фолликулы содержали центробласты, центроциты, макрофаги, выявленные при ИГХ исследованиях ФДК (рис. 20). Имелись митозы, четкая зона мантии. Паракортикальная зона содержала лимфоциты малых и крупных размеров, гистиоциты. Синусы лимфатических узлов имели обычную структуру, признаков синусового гистиоцитоза обнаружено не было. Учитывая цель работы, объектами анализа были нишеобразующие элементы стромы – ФДК и сосуды МЦР – их характеристике было уделено основное внимание.

ФДК - крупные клетки с длинными тонкими отростками, которые охватывают прилежащие лимфоциты, и овальными ядрами с выраженными ядрышками, большинство ФДК двуядерные, но также бывают и трехъядерные клетки. ИГХ исследования с панелью антител CD21, CD23, Anti-FDC CNA.42, Anti-fascin, СD35 показали наличие ФДК в специфичных для них местах – первичных и вторичных фолликулах лимфатических узлов (рис. 20). При окраске с антителами Anti-fascin помимо ФДК в фолликулах, были выявлены интердигитальные ретикулярные клетки в Т-зависимой зоне. Морфология дендритных клеток не была изменена.

По данным морфометрии ФДК занимают около 23 % от площади лимфатических узлов.

А Б В Г Рисунок 20. Лимфатические узлы контрольной группы (левый столбец) и пациентов с ХЛЛ (правый столбец). Выявление фолликулярных дендритных клеток ИГХ методом с антителами к CD35 (А), Anti-FDC CNА.42 (Б), CD23 (В), Anti-fascin (Г), 200х.

При гистоморфологическом исследовании кровеносные сосуды были представлены сосудами МЦР, крупными сосудами, венулами с высоким эндотелием. Фолликулы были менее васкуляризированы, чем перифолликулярная область и мозговое вещество. ИГХ выявление сосудов и синусов лимфатических узлов проводилось с использованием моноклональных антител CD34 class II, CD31, vWF. Наибольшее количество сосудов определялось в паракортикальной зоне, единичные в фолликулах (рис.21, таблица 8). ИГХ исследования с антителами к коллагену IV типа и ламинину выявляли каркас синусов лимфоузлов и крупные сосуды с базальной мембраной.

Таблица 8. Результаты определения плотности сосудов в лимфатических узлах (М±м)

–  –  –

Примечание: * - р 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем.

А Б Рисунок 21. Лимфатический узел контрольной группы. Выявление сосудов ИГХ методом с антителами CD34 cl. II, А) корковое вещество с фолликулом, 100х, Б) паракортикальная зона, 200х.

Рисунок 22. Лимфатический узел контрольной группы. Выявление ретикулиновых волокон, импрегнация серебром, 100х При импрегнации препаратов лимфатических узлов серебром ретикулиновый каркас был представлен отдельными нитями ретикулиновых волокон, ориентированных в разных направлениях и не имевших пересечений. Распределение ретикулиновых волокон было разным в разных частях лимфатических узлов, в фолликулах их было меньше, чем в других частях лимфатических узлов и они были более разобщенные. Наибольшее количество волокон отмечалось в мозговом веществе и вокруг кровеносных и лимфатических сосудов. Наряду с сетчатым каркасом, ретикулиновые нити образовывали утолщенные тяжи возле сосудов (рис.

22).

Таким образом, структурная организация лимфатических узлов при реактивных лимфаденопатиях соответствует нормальной гистоархитектонике паренхиматозного и стромального компонентов и отличается незначительными изменениями – прежде всего увеличением объема кортикальной зоны и ростом числа лимфоидных фолликулов разного размера.

3.4. Особенности структурной организации стромы лимфатических узлов при ХЛЛ В исследовании были проанализированы биопсии лимфатических узлов 61 больных ХЛЛ (33 мужчины и 28 женщин) в возрасте 49-73 лет (средний возраст группы 60,8±6,8 лет, медиана 61).

При морфологическом исследовании биоптатов лимфоузлов больных ХЛЛ во всех случаях отмечались нарушение гистоархитектоники компонентов лимфоидной ткани.

Диффузная инфильтрация лимфоцитами наблюдалась во всех случаях, в 18 случаях в лимфоидной ткани определялись так называемый псевдофолликулярный тип роста – участки, которые представляли собой обычные зоны опухолевых разрастаний, окрашивающиеся в более светлые тона на более интенсивно окрашенном фоне (рис. 23).

В подавляющем большинстве случаев в ткани лимфатических узлов выявлялся диффузный рост лимфоцитов малых размеров с узким ободком цитоплазмы, наличием ядер округлой формы, глыбчатой структурой хроматина. Ядрышки либо не выявлялись, либо слабо контурировали. Наряду с малыми лимфоцитами встречались клетки средних размеров – пролимфоциты с более обильной цитоплазмой, просветленными ядрами, в которых определялись ядрышки. Наконец, в опухолевых инфильтратах обнаруживались крупные клетки с большими везикулярными ядрами, в которых центрально располагались круглые ядрышки – параиммунобласты. В большинстве случаев ХЛЛ опухолевый инфильтрат выглядел однородным, но в части наблюдений выделялись пролиферативные зоны роста псевдофолликулы. Клетки псевдофолликулов наряду с малыми лимфоцитами включали в себя параиммунобласты и пролимфоциты, также эти зоны богаты клетками, экспрессирующими маркер пролиферации Кi-67.

Импрегнация серебром гистологических препаратов лимфатических узлов показала деструктивные изменения ретикулиновой сети лимфоидной ткани, причем в двух противоположных направлениях – дезорганизация ретикулиновых волокон с уменьшением их количества относительно площади лимфоидной ткани наблюдалась в 47 случаях (77%), второй тип – образование более грубой сети с очагами ретикулинового склероза в 14 случаях (23%) (рис. 24).

Рисунок 23. Лимфатический узел при ХЛЛ. Рисунок лимфатического узла стерт, 100х.

Рисунок 24. Лимфатический узел при ХЛЛ. Выявление ретикулиновых волокон, импрегнация серебром, 100х.

При анализе гистологических препаратов, окрашенных рутинными методами гематоксилинэозином и азур-II-эозином, небольшое количество ФДК определялось в единичных случаях (n=3) в псевдофолликулах. ИГХ определение ФДК с панелью антител выявило интересные факты. Стоит отметить, что маркеры и при данном варианте CD21 CD23 лимфопролиферативного заболевания присутствуют на опухолевых клетках и являются диагностически значимыми при постановке диагноза ХЛЛ. Так при ХЛЛ CD23 экспрессируется во всех случаях более чем на 50% клеток (рис. 21, таблица 9). СD21 во многих случаях экспрессировался умеренно – в 32 случаях (53%) позитивны менее 25 % клеток, в оставшихся наблюдениях (n=29) экспрессия наблюдалась в 30-35% опухолевых клеток. Умеренная экспрессия СD35 обнаружена в 23 случаях (38%). Маркеры CNА.42 и фасцин показали незначительное количество разрозненно лежащих клеток, без образования сетчатой структуры, при этом следует отметить, что фасцин маркирует и интердигитальные ДК. В 3 случаях ХЛЛ при ИГХ исследовании были выявлены ФДК, образующие сеть, в псевдофолликулах.

Представленные результаты свидетельствуют о дезорганизации сети ФДК при ХЛЛ (таблица 9). Вероятно, происходит также и изменение их фенотипа под влиянием опухолевой прогрессии, так как маркеры ФДК, которые не экспрессируются одновременно опухолевыми клетками, практически отсутствуют.

Рисунок 25. Выраженная экспрессия Zap70 в лимфатическом узле больного ХЛЛ, 100х.

Таблица 9. Экспрессия маркеров нишеобразующих структур лимфатических узлов (М±м)

–  –  –

Примечание: * - р 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем.

Экспрессия прогностического маркера Zap70 (более 50%) определялась в 35 случаях (57%), в 10 случаях экспрессия отсутствовала (16%), в остальных наблюдениях отмечалась умеренная экспрессия (n=16, 26%) (рис. 26).

При рутинных окрасках было отмечено увеличение количества сосудов, при этом венулы с высоким эндотелием определялись значительно реже, чем в контрольной группе. ИГХ определение сосудов проводилось с использованием моноклональных антител Dako CD34 cl. II, CD 31, vWF, anti-laminin, anti-collagen IV типа. Исследования показали, что на фоне инфильтрации лимфоузлов зрелыми лимфоцитами обнаруживалось увеличение количества мелких сосудов, а также сосудов с выбухающими в просвет эндотелиоцитами с крупными ядрами, хорошо очерченными ядрышками и фибробластоподобными клетками по периферии сосудов (рис. 26). Структура эндотелиоцитов указанных сосудов была характерна для клеток с высокой функциональной активностью. Морфометрические измерения с помощью программы ВидеоТест показали, что площадь сосудов МЦР составила 12,8±0,3 % при ХЛЛ по сравнению с 6,5±0,5% в контрольной группе (таблица 8). ИГХ с антителами к ламинину и коллагену IV типа выявила прерывистую или отсутствующую базальную мембрану у большинства сосудов (таблица 9).

Экстрацеллюлярный матрикс лимфатических узлов также претерпевает изменения, но не все они являются статистически достоверными. Так отмечается незначительное сокращение десмина, коллагена III типа в трабекулах и в паренхиме лимфатического узла. Достоверно показано сокращение количества коллагена IV типа и ламинина (таблица 9).

Представленные нами данные свидетельствуют о значительных перестройках в структурной организации лимфатических узлов при ХЛЛ, которые затрагивают как паренхиматозный, так и стромальный компонент. Во всех случаях гистоархитектоника первичных и вторичных лимфоидных органов у больных ХЛЛ изменяется в связи с появлением клона лейкозных клеток, особенно это относится к нишеобразующим стромальным структурам

– ФДК, сосудам МЦР и экстрацеллюлярному матриксу.

А Б Рисунок 26. Лимфатические узлы при ХЛЛ. Выявление сосудов ИГХ методом с антителами CD34 cl. II: А) паракортикальная зона, единичные крупные сосуды, 200х, Б) корковое вещество, сосуды микроциркуляторного русла, 100х.

В группу сочетанного анализа вошли 45 пациентов (28 мужчин и 17 женщин, средний возраст группы 59,9±7,7 лет, медиана 60), от которых были получены фрагменты подвздошной кости и биоптаты лимфатических узлов. Особенности гистоморфологических характеристик нишеобразующих структур показаны в таблице 10. Нодулярный тип инфильтрации костного мозга представлен в 8 случаях (17,8%), интерстициальный тип в 18 (40%) и диффузный в 19 (42,2%) случаях поражения костного мозга. Общая тенденция такова, что при диффузной инфильтрации костного мозга и существенных изменениях нишеобразующих структур (площадь сосудов МЦР, количество клеток на эндосте, ретикулиновые отложения, изменения экспрессии коллагенов и CD146 в клетках субэндостальной зоны) в лимфатических узлах определяется увеличение экспрессии Zap70, усиление сосудистого компонента в лимфоидной паренхиме и сокращение сети ФДК (результаты по ИГХ реакциям с антителом к фасцину). Эти изменения отмечаются в подавляющем большинстве случаев (n=33). Однако были наблюдения, которые выходили за рамки этой тенденции, так в 3 случаях нодулярной инфильтрации костного мозга была показана усиленная экспрессия Zap70 (более 60 %) в лимфатических узлах, при этом таковой не наблюдалось в нодулярных скоплениях в костном мозге, также экспрессия маркера пролиферативной активности Кi-67 была невысокой (8%). В 6 случаях интерстициальной и диффузной инфильтрации костного мозга в лимфатических узлах не было отмечено значительного увеличения площади сосудов МЦР, при этом количество ФДК было снижено.

Нарушения состояния нишеобразующих элементов стромы могут приводить к изменению сигнальных путей регуляции пролиферации и дифференцировки нормальных лимфоидных предшественников. В связи с этим снижается противоопухолевый потенциал лимфоидной ткани и создаются условия для неопластической прогрессии.

–  –  –

14,7± 10,2±1,3 8,7 ±2,3 13,5±1,1 1,5±0,3 32,7±3,6 2,1±0,5 11,2±1,3 25,6±2,3 18,2±3,5* 2,8±0,5* 21,3±1,6* 1,6* Примечание: * - р 0,05, отличия достоверны в сравнении с нодулярной инфильтрацией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отличительной чертой ХЛЛ – одного из наиболее часто встречаемых вариантов гемобластозов, является сочетанное опухолевое поражение миелоидной и лимфоидной ткани, особенно ярко манифестируемое в стадии заболевания с появлением лимфаденопатии. На базе этого положения естественно полагать, что установление патогенетических механизмов лимфоидной малигнизации в такой ситуации требует анализа как кроветворной, так и лимфоидной ткани, которые тесно взаимосвязаны и по существу представляют собой единый миелолимфоидный комплекс. Дополнительно к этому, анализ указанных тканей является неполноценным без знания состояния их стромального микроокружения и, особенно, тех структур, которые формируют нишу ГСК и стволовых клеток лимфоидной направленности. На базе этих положений при изучении структуры костного мозга подвздошной кости и строения лимфатических узлов больных ХЛЛ была поставлена задача установить морфофункциональные особенности стромальных элементов кроветворного и лимфоидного микроокружения, участвующих в формировании ниши ГСК и лимфоидных клеток-предшественниц, и оценить роль изменений состояния нишеобразующих структур в патогенезе заболевания.

Полученные в ходе выполнения диссертационной работы данные отчетливо свидетельствуют о нарушении морфофункциональных свойств структур гемопоэтической ниши в костном мозге и элементов лимфоидной ниши в лимфатических узлах у больных ХЛЛ. В связи с этим представляется возможным расширить существующие представления о патогенезе ХЛЛ концептуальным положением об участии в этом процессе структурных и функциональных перестроек нишеобразующих элементов костного мозга и лимфатических узлов, непосредственно влияющих на развитие ГСК и их коммитированных в лимфоидном направлении потомков. Одновременно полученные сведения о морфофункциональных особенностях гемопоэтической и лимфоидной ниш создают предпосылки для более точного прогнозирования течения заболевания, совершенствования лечения и оценки его эффективности.

Система гемолимфопоэза стоит на первом месте среди всех тканей и органов по темпам клеточного самообновления. В таких условиях для поддержания клеточного баланса требуется прежде всего определенное количество стволовых клеток с закрепленной генетической программой их развития в кроветворном и лимфоидном направлении, а также наличие дополнительных механизмов, регулирующих реализацию пролиферативного и дифференцировочного потенциала стволовых клеток, среди которых ключевая роль принадлежит регуляторным факторам кроветворной стромы. У взрослых гемопоэз ограничивается костной тканью. В ней локальные регуляторные механизмы развития клеток-предшественниц гемолимфопоэза определяются гемопоэзиндуцирующим микроокружением, в котором ключевая инструктивная роль принадлежит стромальным клеткам. Из широкого спектра клеточных элементов микроокружения для анализа нами были выделены ключевые образования, играющие инструктивную роль в жизнедеятельности стволовых кроветворных клеток. Мы исходили из положения, что длительное самоподдержание стволовых клеток и реализация генетической программы развития возможны только при условии их пребывания в специфическом микроокружении, которое формирует для них особую нишу. Ниша является не просто локальным местопребыванием стволовых клеток, а имеет структурно-анатомические и функциональные характеристики. Вне ниши стволовые кроветворные клетки не способны выполнять свои функции. Клеточные и внеклеточные образования губчатой кости эндостальных зон, система микрососудов и экстрацеллюлярный матрикс являются структурами, формирующими нишу клеток-предшественниц гемолимфопоэза.

Коммитированные лимфоидные предшественники мигрируют из костного мозга в лимфоидные органы, где при непосредственном влиянии стромального компонента лимфоидной ткани происходит их дальнейшее развитие.

Не смотря на то, что для большинства исследователей ХЛЛ является неопластическим процессом, вопрос о том, что представляет собой ХЛЛ злокачественное заболевание крови или болезнь, обусловленную нарушением нормальной регуляции гемолимфопоэза, до сих пор остается нерешенным окончательно [55, 125]. В связи с этим любые новые сведении относительно расшифровки причины развития ХЛЛ весьма актуальны как для понимания природы заболевания, так и для целей терапии и прогноза. Важная роль в получении фактов, способствующих раскрытию патогенеза ХЛЛ, принадлежит изучению стромального микроокружения костного мозга. Согласно одной из гипотез развития ХЛЛ в основе заболевания лежит неопластическая трансформация Влимфопоэза, а ключевая роль в развитии В-лимфоцитов принадлежит интрамедуллярным стромальным клеткам, которые коммитируют направление их развития, регулируют пролиферацию и дифференцировку [31, 109]. Естественно полагать, что нарушение структуры и функции костномозговых стромальных регуляторов В-лимфопоэза могут вести к нарушению развития лимфоидных клеток-предшественниц, не исключая их малигнизацию.

Выживаемость больных ХЛЛ различна и колеблется в широких пределах (от 2-3 лет до средней продолжительности жизни), что может свидетельствовать о гетерогенности патогенеза ХЛЛ [1, 72]. Возможно, речь идет не только о различных формах одного заболевания, но и о существовании нескольких заболеваний в рамках ХЛЛ, которые формируются по разным патогенетическим механизмам, приводящим к одним последствиям – накоплению долгоживующих лимфоцитов с определенным фенотипом. Что лежит в основе патогенеза еще предстоит выяснить, но на основании известных фактов, можно уверенно утверждать, что нишеобразующие элементы костного мозга и лимфоидных органов играют существенную роль в этом процессе.

Материалом исследования послужили гистологические препараты костного мозга и лимфатических узлов 112 пациентов с ХЛЛ, из них 45 пациентов из группы сочетанного анализа, 96 пациентов с трепанобиоптатами костного мозга и 61 с биопсиями лимфатических узлов. Медиана возраста составила 60 лет. Распределение по полу составило 61/51 (м/ж) соответственно. Всем пациентам был проведен полный набор диагностических исследований и были определены стадии заболевания по Rai.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Похожие работы:

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Чикаев Антон Николаевич Пептиды-имитаторы эпитопов ВИЧ-1, узнаваемых нейтрализующими антителами широкого спектра действия 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, проф....»

«Улановская Ирина Владимировна БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HEMEROCALLIS HYBRIDA HORT. КОЛЛЕКЦИИ НИКИТСКОГО БОТАНИЧЕСКОГО САДА 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор З.К. Клименко Ялта – 2015 СОДЕРЖАНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ 1. ИСТОРИЯ...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Дулепова Наталья Алексеевна ФЛОРА И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ РАЗВЕВАЕМЫХ ПЕСКОВ ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., c.н.с., А.Ю. Королюк Новосибирск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования 1.1. Район и объект исследования 1.2....»

«МАКАРОВ Андрей Олегович Оценка экологического состояния почв некоторых железнодорожных объектов ЦАО г. Москвы специальность 03.02.13 – «почвоведение» и 03.02.08 – «экология» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук, Яковлев А.С. кандидат биологических наук Тощева Г.П. Москва 201 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О...»

«Щепитова Наталья Евгеньевна Биологические свойства фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«ГОРБУНОВА Анна Николаевна ГИДРОЛИЗ РАЦЕМИЧЕСКИХ АМИДОВ ФЕРМЕНТАМИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Максимов А. Ю. Пермь – 201 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»

«Потапова Анна Викторовна ВЛИЯНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ТРОФИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ ТЯЖЁЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ И ХЛОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ НА КАЧЕСТВО ЛОСИНОГО МОЛОКА 03.02.08 – Экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Баранов Александр Васильевич...»

«КАРПЕНКО Анна Юрьевна Изменение трансинтестинальной проницаемости и показателей врожденного иммунитета у онкологических больных в периоперационном периоде 14.03.09 – клиническая иммунология и аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук...»

«СИНЕЛЬЩИКОВА Александра Юрьевна Ночная миграция дроздов рода Turdus в юго-восточной Прибалтике Специальность 03.02.04 – Зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник К.В. Большаков Санкт-Петербург Оглавление Введение... 3 Глава 1. Особенности миграции...»

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»

«СОНИНА АНЖЕЛЛА ВАЛЕРЬЕВНА Эпилитные лишайники в экосистемах северо-запада России: видовое разнообразие, экология 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Петрозаводск СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Степень изученности эпилитных...»

«Иванова Марина Викторовна Взаимодействия вирусов с детонационными наноалмазными материалами и композитами на основе полианилина 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор медицинских наук Е.И.Бурцева Москва 201 Оглавление..2 ОБЩАЯ...»

«Егорова Жанна Геннадьевна КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ПРОДУКТИВНОСТИ И КАЧЕСТВА МЯСА, ПОЛУЧЕННОГО ОТ СВИНЕЙ ПОСЛЕ ОВАРИОЭКТОМИИ 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Гиро Татьяна Михайловна Саратов – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 1 ОБЗОР...»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«Решетникова Татьяна Валерьевна ФОРМИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА ПОЧВЫ В КУЛЬТУРАХ ОСНОВНЫХ ЛЕСООБРАЗУЮЩИХ ПОРОД СИБИРИ Специальность 03.02.08 – «Экология (биология)» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Э.Ф. Ведрова Красноярск 2015 Содержание Введение..5 Глава 1....»

«Ксыкин Иван Валерьевич ВРЕДОНОСНОСТЬ СОРНЯКОВ И МЕРЫ БОРЬБЫ С НИМИ В ПОСЕВАХ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР НА СВЕТЛО-КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ВОЛГО-ДОНСКОГО МЕЖДУРЕЧЬЯ Специальность: 06.01.01 общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор...»

«Серёгин Сергей Викторович Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.