WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНТРАМЕДУЛЛЯРНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ СТРУКТУР ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ НИШИ И ЭЛЕМЕНТОВ ЛИМФОИДНОЙ СТРОМЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ ...»

-- [ Страница 2 ] --

1.3. Роль стромального микроокружения костного мозга в нормальном и малигнизированном гемолимфопоэзе, включая ХЛЛ Совершенно очевидно, что функциональные и структурные изменения элементов микроокружения могут быть причиной нарушений кроветворной функции костного мозга. В настоящее время установлено значение дефектов стромы костного мозга в развитии апластической анемии, миелодиспластических синдромов, острых и хронических формах лейкозов, иммунодефицитных состояний [3, 13, 14, 37, 65, 91, 111, 131, 159]. В связи с этим учет изменений стромального микроокружения необходим как для назначения оптимального лечения, так и для прогнозирования заболеваний. При этом в последние годы основной интерес сосредоточен на изучении механизмов, посредством которых дефекты микроокружения КМ приводят к гемопоэтическим нарушениям.

В исследованиях in vitro было показано, что кондиционные среды культур стромальных клеток костного мозга больных неходжкинскими лимфомами (НХЛ) без признаков поражения костного мозга обладают способностью значительно ингибировать рост лейкозных клеток и умеренно – рост нормальных кроветворных клеток. Элементы кроветворного микроокружения больных НХЛ со значительным поражением костного мозга проявляют меньшую способность ингибировать пролиферацию опухолевых клеток и более выраженную способность подавлять рост нормальных кроветворных предшественников [40, 42, 147].

Дефицит ядерных -рецепторов ретиноевой кислоты приводит к миелопролиферативному синдрому с увеличением числа (МПС) гранулоцитарных/макрофагальных предшественников и с увеличением числа гранулоцитов в периферической крови, КМ и селезенке, которое полностью зависит от костномозгового микроокружения. Этот эффект связан с повышением уровня фактора некроза опухоли альфа (TNF) в измененном микроокружении КМ [156]. Удаление белка ретинобластомы в кроветворной системе привело к МПС и потере ГСК из костномозговой ниши вследствие мобилизации. Однако эти нарушения не являются внутренними свойствами гемопоэтических клеток, а зависят от роли этого белка во взаимодействии между миелоидными клетками и микроокружением КМ [157]. Инактивация Mib1 (Notch сигнальный путь), также приводила к МПС у мышей и смерти в связи с инфильтрацией органов миелоидными клетками. МПС является зависимым от микроокружения, так как трансплантация кроветворных клеток дикого типа в Mib1-дефицитное микроокружение приводила к миелопролиферации [86]. Кроме того, повторное введение нерегулируемого активного внутриклеточного домена Notch1 у Mib1нулевых мышей привело к сокращению заболеваний. Также МДС с редкими случаями острого миелоидного лейкоза наблюдался у мышей с клетками-остеопредшественниками со специфическими нарушениями синтеза Dicer1, белка необходимого для интерференции РНК [122].

При in vivo конфокальной микроскопии микрососудов в черепе живых мышей были обнаружены прерывистые участки эндотелия с высокой экспрессией E-селектина или SDF-1, который определенно влияет на хоминг вводимых опухолевых клеточных линий. Нарушение взаимодействия с SDF-1, например, ингибирует хоминг и, в конечном итоге, приживление клеток острого лимфобластного лейкоза линии NALM-6 в этих сосудах. Это позволяет предположить, что молекулярные различия в сосудах могут быть ответственны за дифференциальное приживление опухолевых клеток в микроокружение КМ [139]. В последующих исследованиях было показано, что рост лейкозных клеток в микроокружении КМ повреждает нормальные ГСК в своей нише и уменьшает количество предшественников ГСК и мобилизацию через секрецию фактора стволовых клеток лейкозными клетками, что приводит к "захвату" ниши [57].

Многие публикации последних нескольких лет сосредоточены на защитных эффектах компонентов микроокружения КМ в поддержании жизнедеятельности лейкозных клеток.

Микроокружение КМ, как полагают, обеспечивает убежище лейкозным клеткам во время химиотерапии, терапии ингибиторами тирозинкиназы или во время эффекта «трансплантатпротив-лейкемии» после аллогенной трансплантации ГСК. Считается, что микроокружение КМ содержит минимальную остаточную болезнь и обеспечивает сигналы выживания для лейкозных клеток. Это подтверждает тот факт, что уровни транскриптов гена WT1, хорошо известного маркера минимальной остаточной болезни при лейкозе, выше в КM, чем в периферической крови у пациентов с ОМЛ и острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) [69, 169].

С помощью ксенотрансплантационных анализов ОМЛ клеток человека у NOD/SCID мышей авторы показали, что ОМЛ клетки возвращаются в богатые остеобластами области КМ, где они становятся неактивными и защищенными от апоптоза, индуцированного химиотерапией [75].

В последующих исследованиях, авторы описывают, что выход из состояния покоя ОМЛ ЛСК путем введения G-CSF делает их более чувствительными к апоптозу, индуцированному цитостатиками и приводит к устранению лейкозных стволовых клеток и увеличению выживаемости у вторичных реципиентов [129]. Точно так же, показатели полной ремиссии выше (11%) у пациентов с ОМЛ, получающих химиотерапию и G-CSF в комбинированной схеме лечения, по сравнению с пациентами, получавшими только химиотерапию. Это может быть связано с дифференциацией некоторых ОМЛ клеток или расширением функций нейтрофилов, или с отменой защитных воздействий стромы [87].

Регуляция гемопоэза - сложный многоступенчатый процесс, обеспечивающийся стромальными факторами, которые продуцируются непосредственно клеточным микроокружением, а также гормонами, витаминами и гемопоэтическими факторами, вырабатывающимися в других органах (тимус, печень, почки).

Регуляторный эффект стромального микроокружения КМ осуществляется путем прямых контактов стромальных клеток с кроветворными предшественниками, а также посредством нарабатываемых стромой гуморальных факторов стимуляции и ингибирования процессов пролиферации и дифференцировки ГСК. Сложная сеть сигнальных путей регуляции ГСК в настоящее время является предметом интенсивных исследований [64, 78, 93-96, 104, 105, 108, 114, 115, 135, 141, 148, 154, 163].

Первые исследования, описывающие ГСК нишу остеобластов, идентифицировали два регулятора их размера: PPR и BMPR1A [48, 175]. Вероятно, что существует намного больше регуляторов ГСК ниш, которые следует открыть в будущих исследованиях. Также возможно, что остеобластные и эндотелиальные ГСК ниши непосредственно влияют друг на друга.

В различных исследованиях было показано, что симпатическая нервная система также играет важную роль в регуляции ГСК ниши [26, 82, 83, 92, 107]. Анатомические исследования выявили, что КМ высоко иннервирован как миелинизированными, так и немиелинезированными нервными волокнами, большинство из которых расположены рядом с артериолами в КМ [49, 50, 170]. Результатом хирургического разрыва бедренного нерва являлось сокращение клеточности КМ, сопровождающееся значительной мобилизацией клетокпредшественников [26]. Кроме того, результатом введения мышам нейротоксина 6гидроксидопамина (который блокирует синтез нейротрансмиттера в адреноэргических и допаминэргических нервных волокнах) стало сокращение клеточности КМ [26]. Недавно было показано, что нейротрансмиттер норэпинефрин контролирует как супрессию остеобластов, так и даунрегуляцию экспрессии CXCL12 в клетках кости, которая возникает в ответ на введение G-CSF [83]. Дополнительные исследования на мышиных моделях показали, что циклическое высвобождение ГСК и экспрессия CXCL12 в микроокружении КМ регулировалась циркадной секрецией норэпинефрина посредством симпатической нервной системы [107]. Недавно установлено, что нейротрансмиттеры играют роль в мобилизации, пролиферации и дифференцировке человеческих ГСК [140]. Другие типы клеток, которые имеют возможные роли в регуляции ниши ГСК, включают хондроциты, адипоциты и CXCL12-богатые ретикулярные клетки [52, 77, 143, 156, 157]. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы объяснить, как каждая из этих типов клеток вносит вклад в ГСК нишу. Гемопоэтические клетки также играют роль в регуляции ГСК ниш. Например, было выявлено, что моноциты экспрессируют остеопонтин, который значительно сокращает Notch1 сигналинг в ГСК, совместно культивируемых с поддерживающей линией стромальных клеток КМ, экспрессирующих Jagged1 [76, 97]. Кроме того, полученные из моноцитов остеокласты играют важную роль не только в регуляции активности остеобластов и, следовательно, в потенциальном размере остеобластной ГСК ниши, но повышающаяся концентрация Ca2+, высвобождаемых в течение остеобласт-опосредованной резорбции кости может быть важной для остеобласт-содержащей ГСК ниши [25, 103]. Предполагают, что остеокласты индуцируют ГСК мобилизацию из микроокружения КМ [88].

На сегодняшний день до конца не изучен вопрос о том, существует ли перекрестное взаимодействие между остеобластами и эндотелиальными клетками в ГСК нишах, хотя существует свидетельство того, что эндотелиальные клетки и остеобласты могут регулировать друг друга [66, 144-147]. Ангиопоэтин-1, который экспрессируется линией остеобластов, взаимодействует с Tie-2, экспрессируемым эндотелиальными клетками, чтобы увеличить ангиогенез и сократить проницаемость сосудов [68, 157, 128]. Подобным образом, остеобласты секретируют сосудистый эндотелиальный фактор роста, который также модулирует васкуляризацию и проницаемость эндотелиальных клеток и имеет значение в морфогенезе кости [77, 173]. Также были серии сообщений, описывающих, что периваскулярная ниша является нишей для мезенхимальных стволовых клеток предшественников (МСК), остеобластов [127, 138]. До сих пор неизвестно, имеет ли МСК периваскулярная ниша ту же анатомическую локализацию и функцию, как и ГСК периваскулярная ниша. Определение того, участвуют ли МСК или МСК ниша в изменении ГСК ниши является областью огромного интереса, которая, как ожидается, получит значительное внимание в будущем.

Существуют, хотя и мало изучены, доказательства того, что взаимодействие между нишей и гемопоэтическими клетками взаимное. Было выявлено in vitro и in vivo, что в течение 48 часов после стресса, вызванного острым кровотечением, ГСК секретируют костные морфогенетические белки (BMP-2, ВМР-6), направляющие развитие МСК по остеобластной линии [88]. Однако этот ответ проявлялся в меньшей степени у возрастных и страдающих остеопорозом животных. Кроме того, было показано, что мегакариоциты, локализованные вблизи эндоста, стимулируют остеобласты через увеличение содержания BMP-2, BMP-4 и BMP-6. Это доказывает, что гемопоэтические элементы вовлечены в формирование кости и проявляют активность в пределах ниши.

Касательно нарушений регуляции гемопоэза при ХЛЛ стоит отметить тот факт, что на сегодняшний день известны лишь единичные работы, в которых изучается эта проблема. Если для апластической анемии, МДС, ОЛЛ, ОМЛ, иммунодефицитных состояний установлено значение дефектов стромы костного мозга в развитии этих заболеваний, то для ХЛЛ не были определены решающие события в изменениях стромального микроокружения, которые могут быть прогностическими факторами для развития заболевания. В литературных источниках встречаются единичные работы посвященные исследованиям костных морфогенетических белков, роли CXCL12-клеток, сигнальных путей в развитии ХЛЛ [5, 20, 29, 70, 80, 148, 161].

При этом особенности структурной организации стромы практически не рассматриваются.

Уделяется пристальное внимание плотности сосудов микроциркуляции при инфильтрации костного мозга, и в ряде работ показана значимость этого показателя для развития ХЛЛ [35, 47, 109, 167]. Увеличение плотности сосудов считается неблагоприятным прогностическим фактором.

Остается много открытых вопросов о роли микроокружения КМ, как у здоровых лиц, так и при злокачественных состояниях. В исследованиях нормальной ниши ГСК, усилия специалистов в настоящее время сосредоточены на секретируемых или мембраносвязанных цитокинах, рецепторах адгезии, широком спектре факторов связывания внеклеточного матрикса, которые играют роль в гомеостазе ГСК. Динамические отношения между эндостальной и сосудистой нишами и факторы, регулирующие возможность перемещения ГСК и их предшественников между этими нишами должны быть выяснены, как и вопросы о том, какие типы клеток, на самом деле напрямую связываются с ГСК и есть ли другие, возможно, неизвестные типы клеток, которые могут играть важную роль в нише ГСК. Применение этих знаний к нише ЛСК может сообщить о различиях, которые указывают на уязвимость ЛСК. Эти исследования помогут разработать новые способы терапии, которые дополнят наш текущий арсенал по борьбе с заболеваниями системы крови.

Участие стромы лимфоидной ткани в развитии лимфоидных 1.4.

предшественников в норме и ее состояние при малигнизации лимфопоэза В функциональном отношении клетки лимфоидной системы могут быть разделены на три типа: стволовые кроветворные клетки, клетки-предшественники первичных лимфоидных органов, клетки вторичных лимфоидных органов. По темпу клеточного обновления лимфоидная ткань занимает одно из первых мест в организме. Развитие лимфоидных клеток не прекращается всю жизнь - это необходимо для “подстройки” иммунитета к постоянно изменяющейся иммунологической ситуации.

Особенность всей лимфоидной системы состоит в том, что в течение всей жизни ее органы объединяют интенсивные клеточные миграции, в ходе которых осуществляется пролиферация и дифференцировка иммунокомпетентных клеток. Эти процессы происходят при условии упорядоченной миграции клеток-предшественников из одних органов кроветворной системы в другие, включая костный мозг, тимус и периферические лимфоидные органы. Стоит отметить, что дифференцировка общих предшественников в разных направлениях (например, в Т- и В-клетки) требует различных несовпадающих местных условий [48].

Основная функция лимфоузлов состоит в обеспечении взаимодействия антигена, который поступает туда по афферентным лимфатическим сосудам, с иммунокомпетентными клетками. В ходе иммунного ответа в структуре лимфоузла происходит ряд изменений, благодаря которым обеспечивается возможность для наибольшего количества лимфоцитов проконтактировать с антигеном и между собой. Структуры лимфатического узла создают условия для направленного, а не случайного взаимодействия разных субпопуляций лимфоцитов и для развития стимулированных антигеном клонов иммунокомпетентных клеток.

Группой экспертов ВОЗ предложено выделять в лимфоузле следующие функциональные зоны и структуры:

1. Кортикальный слой с залегающими в нем фолликулами.

2. Паракортикальную зону.

3. Мозговое вещество с мозговыми тяжами.

Фолликулы и мозговые тяжи являются тимуснезависимыми областями (В-зона), паракортикальная зона - тимусзависимой областью (Т-зона).

Структура и клеточный состав лимфоузлов человека исследовались многими авторами [2, 5, 173]. Непаренхиматозный компонент лимфатических узлов представлен стромальными элементами, характеризующимися структурными и функциональными особенностями. Это, прежде всего, собственно стромальные образования, выполняющие, в основном, опорную и трофическую функцию. В лимфатических уздах они представлены фибробластами, фиброцитами, миоцитами, эндотелиоцитами сосудов, нейрогенными элементами [2]. Наряду с указанными образованиями непаренхиматозные структуры лимфоидной ткани включают в себя группу ретикулярных клеток, которые совместно с выше указанными элементами стромы, а также в сочетании с экстрацеллюлярным матриксом формируют лимфоидное микроокружение, обеспечивающее развитие лимфоидных клеток [153]. При этом необходимо заметить, что ключевая роль развития лимфоидных предшественников принадлежит ретикулярным клеткам и экстрацеллюлярному матриксу. Остальные элементы стромы играют вспомогательную роль.

Термин ретикулярные клетки носит собирательный характер и включает 4 основных морфофункциональных типа: гистиоцитарные, дендритные, интердигитирующие и фибробластические ретикулярные клетки. На светооптическом уровне с использованием рутинных окрасок дифференцировать указанные типы практически невозможно, поскольку их морфологические характеристики не четки. Определение принадлежности к определенному варианту требует гистохимических и иммуногистохимических методов анализа [7].

Во всех ретикулярных клетках имеется слабо выраженный гранулярный эндоплазматический ретикулум и мелкие митохондрии. Хроматин в ядрах мелко диспергирован (исключение – фибробластические ретикулярные клетки), это придает ядрам светлый вид. Как правило, в ядрах контурированы крупные ядрышки.

Гистохимическое исследование показывает следующее распределение ферментов в ретикулярных клетках: АТФ-аза и неспецифическая эстераза (интердигитирующие); кислая фосфатаза и неспецифическая эстераза (дендритные); кислая фосфатаза и неспецифическая эстераза в большей степени, чем в дендритных клетках (гистиоцитарные); щелочная фосфатаза (фибробластические) [2, 5, 7].

Фибробластные клетки представляют собой главную популяцию стромальных клеток лимфоузла и формируют скелетную конструкцию органа. Они локализованы как в кортикальной зоне, так и в мозговом веществе лимфоузла [2, 5]. В корковом слое эти клетки проходят в непосредственной близости с дном субкапсулярного синуса, а в мозговом формируют трехмерную сеть и находятся в контакте с капиллярами и высокими эндотелиальными венулами, образуя “футляр” вокруг сосудистой стенки. Предполагается, что фибробластные клетки могут быть вовлечены в транспорт молекул из отделов синуса в высокие эндотелиальные венулы или в другие клеточные популяции лимфоидной паренхимы. Отмечено также, что фибробласты активно вырабатывают цитокины, являющиеся посредниками межклеточных взаимодействий и участвующие во многих физиологических и патологических процессах.

Гистиоцитарные ретикулярные клетки имеют вид фиксированных макрофагов, почти неотличимых от гистиоцитов и макрофагов костномозгового происхождения, особенно находящихся в лимфатических фолликулах.

Фолликулярные дендритные клетки (ФДК) преобладают в корковом веществе лимфоузлов, главным образом, в центрах первичных и вторичных лимфатических фолликулов, являясь клетками специфического микроокружения В-клеточных областей и антигенпредставляющей субпопуляцией клеточных элементов лимфатического узла [5, 8, 11].

Показано, что структура ФДК может изменяться в зависимости от их функциональной активности. Эти клетки способны длительное время удерживать антиген на своей поверхности, регулируя образование В-клеток памяти и предшественников антителоформирующих плазмоцитов.

Фолликулярные дендритные клетки имеют характерные морфологические особенности, которые и обусловили их название. Для ФДК характерно овальное ядро средних размеров, сферические митохондрии, незначительное количество пиноцитозных пузырьков и лизосом.

Они обладают длинными цитоплазматическими отростками, которые охватывают прилежащие к ФДК лимфоциты, что связывают с участием ФДК в развитии В-лимфоцитов. Рутинными методами окраски дендритные отростки не идентифицируются, но часто они хорошо визуализируются на срезах, окрашенных на IgM, маркирующий иммунные комплексы на поверхности отростков. Их отростки также выявляются окрашиванием на CD21 и CD23 [2, 11, 20]. Дендритные клетки помимо длинных отростков, которыми они соединяются между собой, имеют отчетливо различимые замыкательные комплексы – десмосомы, отличающие эти клетки от интердигитирующих ретикулярных клеток.

ФДК представляют собой акцессорные антигенпредставляющие клетки, которые активно участвуют в иммунных реакциях [8, 20, 74]. ФДК играют особую роль в локализации антигена в кортикальных фолликулах лимфоузлов и реакциях зародышевых центров, связанных с сохранением антигена. Антиген, как правило, локализуется на поверхностной мембране длинных отростков цитоплазмы ФДК, вокруг которых образуются скопления лимфоцитов.

Встреча любого покоящегося В-лимфоцита с антигеном может произойти в любом участке иммунной системы, но чаще всего это происходит в лимфоидных органах, где антиген фиксируется и длительно удерживается системой ретикулярных клеток. Представление лимфоцитам экзогенных эпитопов осуществляется специализированными антигенпредставляющими клетками, к которым относятся и дендритные клетки лимфатических узлов. Этот механизм осуществляется путем постоянного контактирования лимфоцитов с антигенпредставляющими клетками. Антигенпредставляющие клетки (моноциты/макрофаги, дендритные клетки, В-лимфоциты) захватывают антиген, своей ферментной системой расщепляют его на пептидные фрагменты и в комплексе с молекулами антигенов гистосовместимости II класса (МНС II) представляют его на своей поверхности.

Т-хелпер с помощью своего антигенраспознающего рецептора распознает микробные пептиды, располагающиеся в желобке молекулы МНС II класса антигенпредставляющей клетки. СD4рецептор Т-хелпера, расположенный рядом с антигенраспознающим рецептором, также участвует в распознавании комплекса "молекулы МНС II класса/антигенный пептид", расположенный на антигенпредставляющей клетке. Это так называемое двойное распознавание, принцип которого заключается в обеспечении специфического взаимодействия в иммунном ответе только аутологичных клеток. Следствием такого распознавания является образование комплекса из Т-хелпера и антигенпредставляющей клетки, который стабилизируется еще рядом связей между костимулирующими или кофакторными молекулами, взаимодействующими по принципу рецептор-лиганд. К наиболее существенным относятся связи между СD40 и СD80/86 на антигенпредставляющих клетках и СD154 и СD28 на Тхелперах. Следствием этого взаимодействия являются активация Т-хелперов и их пролиферация [120].

Если ФДК считаются компонентом В-зон периферических лимфоидных органов, то интердигитальные дендритные клетки описываются, как часть микроокружения в тимусзависимых областях. Показано, что предшественниками этих клеток являются промоноциты и моноциты, а сами интердигитальные клетки рассматриваются как разновидность макрофагов, потерявших способность к фагоцитозу. Однако в отличие от типичных макрофагов в цитоплазме этих клеток редко встречаются фагосомы и практически не выявляется активность кислой фосфатазы.

Интердигитальные ретикулярные клетки имеют бледно окрашивающиеся ядра овальной или удлиненной формы, иногда с инвагинациями довольно сложной конфигурации, и широкую цитоплазму. Эти клетки имеют большое сходство с клетками Лангерганса, но не содержат гранул Бирбека. При иммуноцитохимическом исследовании в них определяется белок S-100 и антиген HLA-DR. Интердигитирующие ретикулярные клетки, в отличие от дендритных, соединяются между собой и другими клеточными элементами при помощи пальцевидных отростков цитоплазмы, входящих между такими же структурами других клеток.

Интердигитальные клетки вырабатывают гликопротеиды, которые играют роль гуморальных факторов, способных запускать пролиферацию и бласттрансформацию Тлимфоцитов.

По данным Д.Э. Цыплакова иммуногистохимический анализ с использованием меченых моноклональных антител показал, что дендритные ретикулярные клетки экспрессируют протеин S100 и CD35, интердигитальные - протеин S100- и CD1-антигены, фибробластические ретикулярные клетки и макрофаги экспрессируют лизоцим, 1-антихимотрипсин, S100протеин, десмин, пан-цитокератины, виментин, ламинин и коллаген IV типа [2].

Как и в костном мозге, система кровеносных сосудов является важным компонентом лимфатического узла, поскольку из крови в его ткань и обратно осуществляется интенсивная миграция лимфоцитов [2, 5, 11, 17]. Проникшие в узел через его ворота кровеносные сосуды ветвятся в мозговом и корковом слоях. В корковом слое располагаются мелкие венулы, в которые переходят капилляры. Эндотелий посткапиллярных венул построен из высоких клеток, в их цитоплазме часто обнаруживаются лимфоциты. В ходе миграции лимфоциты проходят как между эндотелиальными клетками, так и через их цитоплазму, затем через базальную мембрану и попадают в ткань глубокого кортекса. Эмиграция лимфоцитов из лимфоузлов осуществляется через эфферентные лимфатические сосуды, по которым лимфоциты возвращаются в кровоток.

В этих взаимодействиях участвуют селектины, CD44 и интегрины, экспрессированные на лимфоцитах. Селектины (CD62L) связываются с сиалированными углеводами эндотелиоцитов, CD44 – с гиалуронатом, интегрины LFA-1 и VLA-4 с ICAM-1 и VCAM-1 соответственно.

Давно установленный факт, что стромальные клетки лимфоидных органов играют инструктивную роль в поддержании нормального лимфопоэза и иммуногенеза, а оценка состояния стромального микроокружения лимфоидной ткани при злокачественной трансформации лимфоидных предшественников имеет принципиальное значение в раскрытии механизмов развития лимфопролиферативных заболеваний, включая ХЛЛ.

Как отмечалось выше морфологические и функциональные свойства стромы костного мозга в норме и при различных гемобластозах широко изучены, но имеются лишь единичные работы, посвященные описанию свойств стромальных элементов лимфатических узлов при лимфопролиферативных заболеваниях [1, 5, 8, 19, 20].

Имеется небольшое количество работ по морфологии некоторых клеточных элементов лимфоидного микроокружения при лимфопролиферативных заболеваниях. Так, при исследовании морфологических особенностей дендритных ретикулярных клеток при неходжкинских лимфомах отмечено изменение ультраструктуры ретикулярных клеток. При этом, происходило уменьшение количества лимфоцитов, контактирующих с дендритными ретикулярными клетками, увеличение межклеточных расстояний, перестройки плазматических мембран, изменения ультрацитохимических свойств клеток, в частности, снижение или полное отсутствие реакции на кислую фосфатазу. Отмечено уменьшение количества дендритных ретикулярных клеток в зависимости от гистологического варианта лимфом. Так, лимфомы фолликулярного типа сопровождаются увеличением количества ретикулярных клеток, в то время как при диффузных лимфомах отмечено уменьшение их числа и значительные деструктивные изменения. Данные о вовлечении в патологический процесс дендритных ретикулярных клеток при неходжкинских лимфомах были подтверждены при иммуногистохимических и экспериментальных исследованиях [8, 161].

Важную роль в иммунном ответе играет микроархитектоника лимфатического узла, которая в основном поддерживается ретикулярными клетками и внеклеточным матриксом.

Хемокины, продуцируемые ретикулярными клетками, индуцируют хемотаксис и адгезию Тклеток и дендритных клеток на поверхности ретикулярных клеток. В свою очередь, сигналы от лимфоцитов индуцируют ретикулярные клетки к образованию внеклеточного матрикса, который обеспечивает движение и взаимодействие иммунных клеток в лимфатическом узле.

Одним из положений теории рака является представление о перестройке стромальных компонентов, создающей более благоприятные условия для злокачественного роста.

Известно, что строма реализует свое воздействие на гемопоэтические клетки, как путем непосредственных межклеточных контактов, так и опосредованно, с помощью гуморальных механизмов. При лимфоидных неоплазиях происходят значительные нарушения в системе межклеточных взаимодействий. Клетки микроокружения являются главным источником цитокинов – пептидов, обеспечивающих регуляцию пролиферации, дифференцировки и апоптоза гемопоэтических клеток. Отмечено, что роль цитокинов в патогенезе лимфопролиферативных заболеваний весьма значительна. К примеру, известно, что пролиферативная активность стромы лимфоузлов у больных неходжкинскими лимфомами не зависит от морфологического варианта заболевания, а связана с продукцией цитокинов, в частности ФНО- стромальными элементами лимфатических узлов. У пациентов с ХЛЛ повышена секреция стромой лимфатических узлов ИЛ-6 и ИЛ-4 in vitro [5], что отражает участие данных веществ в патогенезе данных заболеваний. Применение химиотерапии снижает продукцию ИЛ-4 in vivo, что может быть благоприятным фактором, учитывая особенность ИЛингибировать апоптоз опухолевых клеток. Также были показаны различия в экспрессии внутриклеточного ИЛ-8 клетками опухолевого клона и нормальными В-лимфоцитами, что имеет клиническое значение [23]. Методом проточной цитофлуориметрии выявлено, что у больных с доброкачественным течением заболевания уровень ИЛ-8 на клетках опухолевого клона составил 0,67 ± 0,20%. У больных с прогрессирующей формой заболевания экспрессия ИЛ-8 была выше и равнялась 16,72 ± 5,08% (р0,05). У доноров крови экспрессия ИЛ-8 Влимфоцитами составила 0,46 ± 0,20 %. Скорее всего, высокие уровни экспрессии ИЛ-8 опухолевыми клетками у больных с прогрессирующей формой заболевания подтверждают способность этого цитокина влиять на процесс аккумуляции лейкозных клеток, способствуют опухолевому росту и прогрессии заболевания [23].

При лимфоидных неоплазиях, как и при других онкологических заболеваниях, малигнизированные клетки секретируют разнообразные факторы роста и онкобелки, способные стимулировать пролиферацию фибробластов, гладкомышечных клеток и эндотелиальных клеток из их предшественников, а также усиливать синтез и секрецию зрелыми клетками компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Стромообразование в опухоли является результатом взаимодействия между опухолевыми клетками и клетками соединительной ткани гистиогенного и гематогенного происхождения. Показано, что при лимфоидных малигнизациях снижается количество ретикулярных клеток и клеток эндотелия сосудов. Вероятно лимфоидные малигнизации оказывают деструктивный эффект на некоторые стромальные элементы. Таким образом, гиперпластический рост стромы не всегда ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания, что может быть обусловлено как разнообразием непосредственного взаимного влияния опухолевых гемопоэтических и стромальных клеток, так, в некоторых случаях, и изменением выработки цитокинов, обеспечивающих ускоренную пролиферацию стромы.

Существует множество установленных и предполагаемых взаимодействий между клетками стромы и паренхимы гемопоэтической и лимфатической систем [73, 161]. Хорошо известно, что клетки стромы костного мозга играют ключевую роль в хоуминге, пролиферации и дифференцировке клеток-предшественниц гемолимфопоэза. Таким же образом, эпителиальные клетки тимуса модулируют пролиферацию и дифференцировку Т-лимфоцитов.

Что касается лимфатических узлов, значительные исследования были посвящены дендритным клеткам, которые презентируют антиген и участвуют в инициации Т - зависимых клеточных ответов.

Работы, посвященные изучению дендритных клеток (ДК) при некоторых формах опухолей, показали, что количество и иммунофенотип ДК, их распределение в опухолевой и непораженной ткани отражаются на прогнозе этих новообразований. ДК являются гетерогенной группой, в зависимости от происхождения их делят на миелоидные ДК (мДК) и плазмоцитоидные ДК, инициирующие разные типы клеточного ответа – Тх1 или Тх2 [8, 120]. В зависимости от функционального состояния ДК могут быть подразделены на незрелые и зрелые. Основной функцией незрелых ДК является захват антигенов, в том числе опухолевых, путем эндоцитоза и фагоцитоза, а также выработка цитокинов, привлекающих и активирующих клетки врожденного иммунитета, что позволяет отграничить распространение повреждающего фактора. Созревание ДК, в процессе которого они становятся наиболее активными антигенпрезентирующими клетками иммунной системы, сопровождается потерей эндоцитарных и фагоцитарных рецепторов, изменением морфологии, секрецией молекулкостимуляторов (CD40, CD80, CD86) и разнообразных хемокинов и цитокинов, варьирующих в зависимости от типа чужеродного антигена и вида клеток, которые вовлекаются в иммунный ответ.

ДК играют в норме важную роль в формировании микроокружения кроветворных клеток костного мозга и лимфоидной ткани. Иммунофенотип незрелых мДК: CD1+, низкая экспрессия CD83, CD208(DC-LAMP)-, CD209(DS-SIGN)+, цитоплазматический MHC II. Иммунофенотип зрелых мДК: CD1+-, высокая экспрессия CD83, CD208(DC-LAMP)+, CD209(DS-SIGN)-, мембранная экспрессия MHC II [2].

ДК считаются наиболее важным фактором, определяющим состав лимфоидной популяции и влияющим на регулирование функциональной активности лимфоидных клеток.

Они могут создавать не только противоопухолевые, но и проопухолевые стимулы. Так, ДК совместно с TGF способствуют дифференцировке предшественников FoxP3-клеток в зрелые CD4+ FoxP3-клетки. С другой стороны, ДК не только презентируют опухолевые антигены натуральным киллерам и цитотоксическим клеткам, которые обеспечивают противоопухолевый иммунитет, но и принимают непосредственное участие в элиминации опухолевых клеток [8].

Стоит отметить, что ХЛЛ характеризуется большим количеством CD5+ долгоживущих клеток в костном мозге, крови и вторичных лимфоидных органах [1, 125, 126]. На сегодняшний день, принято считать, что устойчивость к апоптозу и избирательное выживание опухолевых клеток не только автономная характеристика, но зависит от внешних антиапоптозных стимулов. Это подтверждается тем фактом, что, несмотря на их долгую жизнь in vivo, ХЛЛ клетки часто уходят в апоптоз в условиях in vitro. Это также позволяет предположить, что в условиях in vitro клетки не получают сигналов выживания, которые присутствуют в микроокружении in vivo. Некоторые сигналы, исходящие от стромальных и Т клеток костного мозга, как оказалось, усиливают рост и продлевают жизнь ХЛЛ клеток [31, 45, 47].

Не так давно было отмечено, что внеклеточный тиоредоксин защищает ХЛЛ клетки от апоптоза in vitro [33, 126]. Тиоредоксин является мультифункциональным белком, который повсеместно экспрессируется в небольшом количестве во всех клетках тела. Внутриклеточный тиоредоксин имеет как антиапоптотический эффект так и ростовой эффект. Некоторые клетки способны высвобождать тиоредоксин. Эта внеклеточная форма тиоредоксина имеет цитокиновую и хемокиновую активности [33, 71, 130].

Было показано, что Т-клетки в микроокружении ХЛЛ подавляют апоптоз опухолевых клеток. Также было показано, что хотя Т-клетки продуцировали интерферон гамма и ИЛ-4, экспрессия тиоредоксина в этих клетках не была повышена. Стромальные клетки лимфоидной ткани также присутствовали в центрах пролиферации ХЛЛ. Интересно, что экспрессия тиоредоксина коррелировала с присутствием как стромальных клеток, так и с пролиферирующими Ki-67-клетками опухоли, причем размер и число пролиферативных центров варьировало от пациента к пациенту. У пациентов с большим соотношением пролиферирующих клеток Ki-67+, тиоредоксинэкспрессирующие клетки были главным образом локализованы рядом с Ki-67+ и окружены ими, указывая на то, что тиоредоксин является потенциальным фактором выживания опухоли [23, 58]. Было показано, что стромальные клетки опухоли не только экспрессировали тиоредоксин, но некоторые из них секретировали его ex vivo. Интересно, что стромальные клетки костного мозга и клетки-няньки были также способны секретировать тиоредоксин, таким образом, секреция тиоредоксина стромальными клетками лимфатического узла не является тканеспецифичной.

Детальный механизм тиоредоксин-опосредованного увеличения выживаемости неопластических клеток при ХЛЛ еще предстоит изучить, хотя известно, что это белок влияет на некоторые окислительно-регуляторные функции и ассоциирован с большим количеством белков-мишеней, модулируя их трехмерную структуру и функции и катализируя тиолдисульфидные обменные реакции. Тиоредоксин является ключевым белком в индуцировании синтеза нескольких цитокинов, включая ИЛ-4, интерферон и TNF, которые, как известно, влияют на выживаемость неопластических клеток при ХЛЛ [30, 46].

Исторически, ХЛЛ был описан как аккумуляторное заболевание клеток с дефектом апоптоза. Согласно данной точке зрения, большинство ХЛЛ клеток периферической крови имеют остановку клеточного цикла в G0/G1 фазе [41, 125]. Однако недавние исследования с использованием маркера клеточного цикла Ki67 показали, что ХЛЛ пролиферация возникает в костном мозге и вторичных лимфоидных органах. Сигналы, которые контролируют клеточную пролиферацию, остаются неизвестными, так как большинство in vitro систем не способны поддержать ХЛЛ пролиферацию клеток. При культивировании in vitro, ХЛЛ клетки быстро вступают в апоптоз, если они не контактируют со стромальными клетками, или, если не добавить растворимых факторов. In vitro огромное количество различных молекул могут увеличить выживаемость ХЛЛ клеток, но на ограниченное время, что указывает на отсутствие важных факторов, которые присутствуют in vivo [47, 74].

Согласно данным Д.Э. Цыплакова и соавт., исследовавших влияние кровеносного микроциркуляторного русла на клеточный иммунный ответ в лимфатических узлах, регионарных к злокачественным опухолям, сосудистое русло лимфатических узлов играет двоякую роль.

С одной стороны, на ранних этапах развития опухоли происходит активация Тклеточных иммунных реакций с усилением рециркуляции лимфоцитов через посткапиллярные венулы и превращением их путем бласттрансформации в цитотоксические Т-киллеры, что, вероятно, сдерживает процесс метастазирования. С другой стороны, на более поздних стадиях опухолевого роста изменения сосудистой стенки и циркуляторные расстройства сопровождаются отложением внутри- и внесосудистого фибрина, затрудняя тем самым рециркуляцию лимфоцитов и, следовательно, приводят к уменьшению числа трансформированных Т-киллеров, способных уничтожать попадающие в лимфатический узел опухолевые клетки, что, по мнению авторов, предопределяет процесс метастазирования. При появлении в лимфатических узлах метастазов фибрин уже способствует их закреплению в лимфоидной ткани, а также изолирует от цитотоксического действия оставшихся в небольшом количестве Т-эффекторов [2].

На данный момент мы владеем разрозненными данными, говорящими нам о существенной роли стромального микроокружения в лимфатических узлах в норме и при становлении ХЛЛ. При этом отсутствует целостное представление о структурных особенностях лимфоидной стромы при нарушениях пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов.

Дальнейшее изучение лимфоидного микроокружения, его морфофункциональных особенностей, адгезивных взаимодействий с использованием современных методов структурного анализа, во-первых, позволит идентифицировать функциональные субпопуляции стромальных клеток, во-вторых, может способствовать поискам новых методов лечения гемобластозов и лимфопролиферативных заболеваний.

По литературным данным известны некоторые гистологические изменения костного мозга при ХЛЛ, однако, описанные изменения не отражают в полном объеме характер вовлечения нишеобразующих структур в патологический процесс. Во многих исследованиях стромы костного мозга и лимфоидных органов при патологических состояниях кроветворения акцент делается на отдельные структурные элементы микроокружения, большинство исследований проводится in vitro. Данные, касающиеся морфофункциональных изменений гемопоэтической ниши в костном мозге и нишеобразующих структур в лимфатических узлах, представлены в разобщенных исследованиях на разных группах пациентов. Нами была поставлена задача на основе комплексного исследования охарактеризовать морфофункциональные особенности стромальных элементов кроветворного и лимфоидного микроокружения, участвующих в формировании ниши ГСК и лимфоидных клетокпредшественниц, и оценить роль стромальных изменений в патогенезе ХЛЛ. Подобный анализ до настоящего времени не проводился.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая характеристика пациентов В настоящей работе проанализированы 112 пациентов с ХЛЛ, которые находились на лечении в отделении гематологии ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России с января 2000 г. по сентябрь 2014 г.

Диагноз ХЛЛ устанавливали на основании общепринятых критериев. Диагностические критерии ХЛЛ включают инфильтрацию костного мозга популяцией CD5+ В-лимфоцитов и наличие в периферической крови лимфоцитоза (не менее 5*109/л моноклональных В-клеток) на протяжении 3 мес. В аспирате костного мозга инфильтрация лимфоцитами не менее 30%.

Пациентам были определены стадии заболевания по классификации Rai (таблица 1).

–  –  –

Всем больным было проведено общеклиническое обследование, включающее современные общепринятые методы диагностики онкогематологических заболеваний:

- гемограмма с определением содержания гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов с подсчетом лейкоформулы и тромбоцитов (окраска по стандартной методике по РомановскомуЛейшману);

- биохимический анализ крови;

- цитогенетические исследования костного мозга и периферической крови;

- FISH-исследование костного мозга и периферической крови TP53, LSI ATM (11q22), LSI (13q14), CEP12;

- иммуноглобулины сыворотки, 2-микроглобулин;

- миелограмма, выполненная по общепринятой методике;

- иммунофенотипирование лимфоцитов (периферическая кровь и костный мозг) на проточном цитофлуориметре с использованием моноклональных антител CD5, CD19, CD20, CD23, CD43, CD81, HLA-DR, IGD, CD11c;

- рентгенография органов грудной полости;

- УЗИ и компьютерная томография органов грудной полости, брюшной полости и забрюшинного пространства, малого таза.

Морфологическая диагностика ХЛЛ проиводилась в отделении патологической анатомии ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России по результатам гистологического и иммуногистохимического исследований опухолевой ткани в соответствии с критериями классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей Всемирной Организации Здравоохранения 2008 года. Характеристика пациентов представлена в таблице 2.

–  –  –

3-4 56 Материалом исследований послужили полученные до начала терапии трепанобиоптаты подвздошной кости 96 больных ХЛЛ (56 мужчин и 40 женщин) в возрасте от 49 до 73 лет (средний возраст группы 59,9±7,2 лет, медиана 60) и биопсии лимфатических узлов 61 больного (33 мужчины и 28 женщин) той же возрастной группы (средний возраст группы 60,8±6,8 лет, медиана Группу сочетанного анализа составили трепанобиоптаты и биопсии 61).

лимфатических узлов от 45 пациентов (28 мужчин и 17 женщин, средний возраст группы 59,9±7,7 лет, медиана 60). Контрольную группу при изучении костного мозга составили фрагменты подвздошной кости 30 здоровых лиц 50-70 лет (средний возраст группы 58,2±5,6 лет, медиана 58). Группой сравнения при анализе стромы лимфатических узлов служили биоптаты лимфатических узлов 20 лиц в возрасте 48-70 лет (средний возраст группы 62,7±6,2 лет, медиана 63) с неопухолевой реактивной неспецифической лимфаденопатией.

Контрольная группа пациентов сопоставима по полу, возрасту и национальности с основной группой. Материал от пациентов, сформировавшие контрольную группу для анализа лимфатических узлов, был предоставлен из ФГБУ «СПб НИИФ» МЗ РФ, «НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина» СЗГМУ им. И.И.Мечникова, ФГБУЗ «СПб клиническая больница РАН». При проведении диагностических исследований, во всех случаях было установлено, что лимфатические узлы являются реактивными, без признаков опухолевого роста, метастазов, вирусного поражения. Пациенты контрольной группы для анализа костного мозга составили доноры костного мозга ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России 2000-2014 гг.

2.2. Методы исследований При проведении трепанобиопсии забор губчатого вещества костной ткани осуществлялся иглой Jamshidi или Islam из задней ости подвздошной кости. Для исследования получали столбик костной ткани не менее 2 см длиной, поскольку субкортикальные лакуны не отражают состояние кроветворения.

Фиксация и декальцинация трепанобиоптатов осуществлялась с использованием набора Mielodec (BioOptics, Италия). В состав набора входил фиксатор (формалин с хлоридом ртути) и декальцинатор на основе ЭДТА в кислотном буфере. Трепанобиоптат помещали в фиксатор на 90 минут, затем промывали 70 этанолом 30 минут с последующим помещением в декальцинирующую жидкость на 90-120 минут.

Биоптаты лимфатических узлов фиксировались в 10% нейтральном забуференном формалине. Объем фиксирующей жидкости в 20 раз превышал объем фиксируемого объекта.

Общее время фиксации при комнатной температуре (около 20С) было не менее 24 часов.

Трепанобиоптаты и лимфатические узлы обезвоживались и пропитывались парафином по общепринятой стандартной методике. Гистологическая проводка осуществлялась с помощью автоматического вакуумного процессора Tissue-Tek Vip 5Jr (Sakura, Япония).

Обезвоживание осуществлялось с помощью готового раствора IsoPREP (БиоВитрум, Россия) абсолютизированный изопропанол концентрации с добавкой 99,7%-ной оксилфеноксиполиэтоксиэтанола (Тритон Х15) в соотношении 1:10000. Для пропитывания обезвоженной ткани и приготовления блоков применяли среду НISTOMIX.

Использовали следующий протокол гистологической проводки:

- 4 смены раствора IsoPREP, время экспозиции в каждой смене 1 час;

- 2 смены раствора IsoPREP, время экспозиции в каждой смене 1 час 30 мин;

- 2 смены HISTOMIX, время экспозиции в каждой смене 1 час;

- 2 смены HISTOMIX, время экспозиции в каждой смене 2 часа.

Длительность обработки на каждом этапе, указанные выше, одинаковы как для проводки лимфатических узлов, так и для трепанобиоптатов костного мозга.

С использованием ротационного микротома Accu-cut SRM (Sakura, Япония) изготовляли срезы толщиной не более 4 мкм, которые в дальнейшем депарафинировали, гидратировали, окрашивали гистологическими, гистохимическими и иммуногистохимическими методами по общепринятым стандартным методикам.

При анализе трепанобиоптатов применялись окраски гематоксилин-эозин, азур-II-эозин, импрегнация серебром, по Массону.

При анализе лимфатических узлов применялись следующие окраски - гематоксилинэозин, азур-II-эозин, импрегнация серебром.

Иммунногистохимические реакции проводили по стандартной методике, основываясь на рекомендациях фирмы-производителя первичных антител. В ходе работы был подобран оптимальный протокол. Срезы помещали на стекло с полилизиновым покрытием, высушивали в термостате в течение 18 часов при 37°С, депарафинировали, гидратировали и производили демаскировку антигена в цитратном буфере рН 6,0 на водяной бане при 97°С 30 минут, для некоторых антител демаскировка в буфере рН 9,0 97°С 20 минут. Эндогенную пероксидазную активность ликвидировали инкубацией в течение 6 минут в растворе, блокирующем пероксидазу Дания). Панель первичных антител, используемая в (EnVision, Dako, исследованиях, представлена в таблице 3. Для визуализации использовали полимерную систему EnVision (Dako, Дания) с диаминобензидином (DAB), инкубация с системой 30 минут при комнатной температуре, с DAB 5 минут при комнатной температуре. Препараты докрашивали гематоксилином, дегидратировали в спиртах, просветляли в ксилоле и заключали в БиоМаунт (Bio-Optica, Италия). Проводили общепринятые отрицательные и положительные контрольные процедуры при обработке параллельных срезов. Отрицательный контроль проводился с заменой первичных антител на ТBS-буфер.

Все полученные препараты оценивались визуально с помощью микроскопа Nikon Eclipse E200 со встроенной фотокамерой с окуляром х10, при объективах х20, х40.

Морфометрические исследования паренхиматозных и стромальных элементов кроветворной и лимфоидной ткани трепанобиопсий костного мозга и биоптатов лимфатических узлов осуществлялись с использованием пакета программ «ВидеоТесТ-Морфология 5.2»

(Россия). Анализ гистологических препаратов проводился в 20 полях зрения при увеличении 20х для каждого образца.

Уровень экспрессии Ki-67 определяли, как процент клеток имеющих специфическое окрашивание.

Для оценки экспрессии Zap70 применяли балльную систему. Визуально оценивали интенсивность окраски клеток в баллах от 0 до 2 (отрицательная, слабая, сильная).

Количество эндостальных клеток определяли, как количество клеток на единицу длины костной трабекулы.

Удельная плотность микрососудов определяли путем вычисления процента площади занимаемой сосудами (имеющей специфическое окрашивание) к общей площади ткани в поле зрения.

Таблица 3. Маркеры, использованные в иммуноморфологическом исследовании

–  –  –

2.3. Методы статистической обработки Статистическая обработка полученных данных проводилась методом вариационной статистики с определением средней величины М, ее средней ошибки m, стандартного отклонения SD. Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стьюдента (t), критерия Манна-Уитни. Различие между сравниваемыми показателями считалось статистически значимым при р 0,05. Для выяснения зависимости между показателями применялся корреляционный анализ.

Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием программ Statistica v.6.0, MedCalc, Microsoft Excel для Windows ХР.

2.4. Объем проведенных исследований В ходе исследования произведена оценка 3658 гистологических препаратов.

Таблица 4. Количество проведенных исследований

–  –  –

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Похожие работы:

«ХАФИЗОВ ТОИР ДАДАДЖАНОВИЧ ОСОБЕННОСТИ РОСТА, РАЗВИТИЯ И ПРОДУКТИВНОСТИ ЧАЙОТА (SECHIUM EDULE L. – CHAYOTE) В УСЛОВИЯХ ГИССАРСКОЙ ДОЛИНЫ ТАДЖИКИСТАНА Специальность: 06.01.01. – общее земледелие, растениеводство ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор, Гулов С.М. Душанбе – 201 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«» Кравченко Виктор Михайлович Дирофиляриоз плотоядных в северо-западном регионе Кавказа (эпизоотическая ситуация, патогенез, патоморфологическая характеристика) 03.02.11 – паразитология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: Карташев Владимир Васильевич доктор медицинских наук,...»

«ДЯТЛОВА ВАРВАРА ИВАНОВНА ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Специальность: 03.02.03 – микробиология. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ И ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«ЯКОВЛЕВ Роман Викторович Древоточцы (Ьер1^р1ега, Cossidae) Старого Света 03.02.05 энтомология диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2014 Оглавление Оглавление Введение Глава 1. История изучения древоточцев (Lepidoptera, Cossidae) Старого Света 1.1. Периоды изучения древоточцев Старого Света 1.1.1. Начальный этап 1.1.2. Этап первых...»

«Черногаев Виталий Геннадьевич ВОЗДЕЙСТВИЕ ТЕХНОГЕННЫХ НАРУШЕНИЙ НА ДИНАМИКУ ПОЧВЕННО-РАСТИТЕЛЬНОГО ПОКРОВА МЕЩЕРСКОЙ НИЗМЕННОСТИ Специальность 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«КАДЕРМАС ИРИНА ГЕННАДЬЕВНА ФОРМИРОВАНИЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО И СИМБИОТИЧЕСКОГО АППАРАТОВ РАСТЕНИЙ И ИХ ВКЛАД В ПОВЫШЕНИЕ ПРОДУКТИВНОСТИ АГРОЦЕНОЗОВ ГОРОХА ПОСЕВНОГО (Pisum sativum L.) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор с. – х. наук,...»

«ПЛОТНИКОВ ВАДИМ АЛЕКСЕЕВИЧ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ПТИЦ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 03.02.02 вирусология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководительдоктор биологических наук, профессор Алипер Т. И. Москва-20 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«КУРБАТОВА Ольга Леонидовна ДЕМОГРАФИЧЕСКАЯ ГЕНЕТИКА ГОРОДСКОГО НАСЕЛЕНИЯ 03.02.07 – генетика 03.03.02 – антропология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. Материалы и методы ГЛАВА 2. Влияние процессов миграции на генофонды городских популяций 2.1. Теоретические предпосылки 12 2.2....»

«Миронов Андрей Викторович КОРРЕКЦИЯ АККОМОДАЦИОННЫХ НАРУШЕНИЙ У ПАЦИЕНТОВ ЗРИТЕЛЬНО-НАПРЯЖЕННОГО ТРУДА МЕТОДАМИ ФИЗИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ 14.01.07 – глазные болезни 14.03.11 восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура, курортология и физиотерапия Диссертация на...»

«АСБАГАНОВ Сергей Валентинович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТРОДУКЦИИ РЯБИНЫ (SORBUS L.) В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. А.Б. Горбунов Новосибирск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 8 Ботаническая...»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«Гилёв Андрей Николаевич ЛАТЕРАЛИЗАЦИЯ ФУНКЦИЙ ПЕРЕДНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ У СУМЧАТЫХ (MAMMALIA: MARSUPIALIA) 03.02.04 – Зоология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Е. Б. Малашичев Санкт-Петербург – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»

«Серёгин Сергей Викторович Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович...»

«Чикаев Антон Николаевич Пептиды-имитаторы эпитопов ВИЧ-1, узнаваемых нейтрализующими антителами широкого спектра действия 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, проф....»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.