WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 |

«КЛЕТКИ ВОЛОСЯНОГО ФОЛЛИКУЛА IN VITRO ...»

-- [ Страница 1 ] --

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

Институт Биологии Развития им. Н. К. Кольцова РАН

На правах рукописи

Чермных Элина Сергеевна

КЛЕТКИ ВОЛОСЯНОГО ФОЛЛИКУЛА IN VITRO

Специальность 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2008

Работа выполнена в лаборатории проблем клеточной пролиферации Учреждения

Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук Воротеляк Екатерина Андреевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Григорян Элеонора Норайровна доктор биологических наук Романов Юрий Аскольдович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится 1 октября 2008 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им Н.К.

Кольцова РАН по адресу:

119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, ул.

Вавилова, 26).

Автореферат разослан « 28 » августа 2008 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Волосяной фолликул представляет собой структуру, сформированную из клеток эпителиальной и мезенхимной ткани.

Волосяной фолликул формируется в эмбриогенезе в результате сложных морфогенетических процессов, важнейшими из которых являются взаимные обмены сигналами между эпителием и мезенхимой. Факторы роста, продуцируемые клетками дермальной папиллы (ДП) играют ключевую роль в морфогенезе волосяного фолликула (Schmidt-Ullrich & Paus, 2005).

Существует несколько экспериментальных моделей изучения эпителиального морфогенеза. Большая их часть основана на использовании коллагенового геля, который по сравнению с пластиком является более физиологичным субстратом для клеток, что позволяет изучать их поведение в условиях, близких к таковым in vivo (Assouline et al., 1992; Mourra et al., 1998). Репрезентативной моделью служит модель морфогенеза эпидермальных клеток человека в коллагеновом геле (Шинин и др., 2002). Однако используемые в данной модели эмбриональные фибробласты (ФЭЧ) не являются естественным индуктором морфогенеза волосяного фолликула. Использование в исследованиях in vitro популяции клеток ДП позволит создать условия, более приближенные к ситуации in vivo.

В морфогенезе эпидермиса главную роль играют стволовые эпидермальные клетки. Несмотря на большое число исследований в области биологии эпидермальных стволовых клеток, строгих маркеров для их выявления до сих пор не обнаружено. В частности, многое остается неясным и в отношении экспрессии предполагаемого маркера эпидермальных стволовых клеток – кератина 19.

Мезенхимными клетками, обладающими высоким морфогенетическим потенциалом являются клетки ДП. Исследование индукционной способности этих клеток, а также их практическое применение ограничены сложностью их выделения.

Научное направление по исследованию межклеточных взаимодействий эпителиальных и мезенхимных клеток волосяного фолликула при их совместном культивировании в трехмерном матриксе является весьма перспективным. С использованием описанных клеточных систем возможно изучение фундаментальных морфогенетических процессов, протекающих в эпидермисе человека на разных этапах онтогенеза.

Цели и задачи исследования. Целью нашего исследования явилось изучение морфо-функционального состояния клеток волосяного фолликула при разных условиях их культивирования.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать кератин 19-положительные клетки эпидермиса человека в культуре;

2. Выделить и охарактеризовать клетки ДП;

3. Разработать модель формирования волосяного фолликула в культуре;

4. Изучить клеточные механизмы формирования тубулярных структур в культуре эпидермальных кератиноцитов человека;

5. Изучить способность клеток встраиваться в трехмерные структуры кожи in vivo;

6. Исследовать способность кератиноцитов к самоорганизации.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые продемонстрирована способность эпидермальных клеток человека взрослого организма сохранять морфогенетические потенции, которые проявляются под воздействием клеток ДП. Совместное культивирование в составе эпителиомезенхимного эквивалента клеток ДП и кератиноцитов позволяет моделировать процессы межклеточного взаимодействия на начальных этапах формирования волосяных фолликулов. Моделирование процессов эпителиального морфогенеза в культуре является актуальным направлением современной клеточной биологии, которое пока слабо развито. Данная модель in vitro отражает основные этапы морфогенеза in vivo. Показано, что структура тубулярных выростов и характер их роста во многом схожи со структурой и морфогенезом волосяного фолликула живого организма. Разработанные модели могут использоваться для изучения молекулярных механизмов морфогенеза волосяного фолликула.

Показано, что морфогенетический потенциал кератиноцитов может быть поразному реализован в зависимости от типа кокультивируемых мезенхимных клеток. Это означает, что взрослый эпидермис при соответствующем сигнале может формировать волосяные фолликулы. Данное направление чрезвычайно перспективно в плане определения клеточных механизмов развития алопеции и разработки подходов к ее коррекции с использованием клеточных технологий.

Изучена популяция кератин 19-положительных клеток в культуре, представляющая стволовые клетки волосяного фолликула. Показано, что в процессе культивирования происходит дополнительная индукция синтеза кератина 19 в клетках, где ранее этот белок не экспрессировался.

Предложен оригинальный способ выделения клеток ДП человека, позволивший повысить эффективность выделения клеток.

Изучена популяция мезенхимных клеток волосяного фолликула, располагающихся в ДП. Подтверждена полипотентность клеток ДП в исследованиях по культивированию клеток в индукционных средах. Исследована способность клеток ДП встраиваться в трехмерные структуры кожи в системе in vivo. Показано, что эти клетки мигрируют в волосяной фолликул – естественную для них нишу. Впервые показано, что клетки ДП вызывают усиленный ангиогенез.

Эти данные могут быть полезны для разработки технологии реконструкции волосяного фолликула с применением клеток ДП в клинической практике.

Модификация живых тканевых эквивалентов с использованием клеток ДП может разрешить проблему восстановления роста волос в местах трансплантаций.

Кроме того, модель морфогенеза волосяного фолликула может служить тестсистемой для изучения фармакологического действия лекарственных препаратов.

Исследована структурно-функциональная организация кератиноцитов при культивировании их в различных условиях. Показано, что кератиноциты в культуре сохраняют присущую им in vivo способность к формированию структурно-функциональных единиц. Результаты данной работы вносят существенный вклад в развитие представлений о структурно-функциональной организации кератиноцитов в культуре и о их морфогенетических способностях в трехмерном матриксе.

По результатам исследований, в которых было выявлено ангиогенное свойство клеток дермальной папиллы, была подана заявка на международный патент.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XIV школе-конференции «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Звенигород, 2005г.); 66th Meeting of Society for Investigating Dermatology (Boston, 2005); международной конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2005г.); симпозиуме «Клеточные технологии в медицине» (Москва, 2007г.); симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза»

(Москва, 2007г.); II Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (С-Петербург, 2007г.); на конференциях молодых ученых Института биологии развития им.

Н.К.Кольцова (Москва, 2005, 2006, 2007гг.) и на V конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2008г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Из них статей – 5, тезисов докладов и материалов конференций - 10.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 169 страницах, содержит 52 рисунка, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 254 цитируемых источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование кератиноцитов человека. Кератиноциты человека получали из фрагментов кожи лица, полученных в ходе хирургических операций, с помощью ферментативной обработки. Суспензию кератиноцитов высевали в концентрации 300 тыс. клеток/мл на пластик в смеси сред DMEM:F12 (1:1) с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 4мM L-глутамина, 5мкг/мл инсулина, 10-6 М изопротеренола и 10нг/мл EGF, и культивировали при 370С и 5% СО2.

Смену среды проводили через каждые 3-4 дня.

Выделение клеток ДП человека. Биоптаты кожи человека волосистой части головы, полученные в ходе хирургических операций, помещали в 0,2%-ный раствор диспазы в среде DMEM на 14-16 ч при +4°С. После инкубации в диспазе отделяли подкожный жир, содержащий волосяные фолликулы, измельчали с помощью глазных ножниц и помещали в 0,1% - раствор коллагеназы I типа на 37°С. Через 1 ч, после того как волосяные фолликулы откреплялись от жировой ткани и опускались на дно флакона, жир отбирали с поверхности жидкости, раствор коллагеназы с волосяными фолликулами центрифугировали и производили замену раствора коллагеназы на свежий. В новом растворе коллагеназы инкубировали в течение 5-6 ч при 37°С, после чего волосяные фолликулы пипетировали до открепления свободных ДП и отмывали раствором Хенкса от коллагеназы повторным центрифугированием при 1000 об/мин (200g) в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали средой DMEM с содержанием 10% сыворотки и проводили 3 повтора центрифугирования при 200 об/мин (8g) для удаления клеток соединительнотканной оболочки волоса. Конечный осадок, содержащий ДП, ресуспендировали в среде DMEM с содержанием сыворотки 10% и помещали в 6-луночное плато. ДП инкубировали в течение 5-6 дней, после чего замену среды проводили каждые 3-4 дня.

Получение среды, кондиционированной клетками ДП. Для получения кондиционированной среды конфлуентные культуры клеток ДП до 3 пассажа инкубировали в течение 3 суток в 7мл среды DMEM:F12 (1:1) с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 4mML-глутамина, 5мкг/мл инсулина, 10-6М изопротеренола и 10нг/мл EGF при 37С в СО2-инкубаторе. Кондиционированную среду центрифугировали с целью удаления клеточного детрита в течение 10 мин при 1500 об/мин (440g), расфасовывали в стерильные флаконы, замораживали и хранили при -20С.

Индукция и детекция остео- и адипогенной дифференцировок. Для индукции остеогенной дифференцировки клетки ДП культивировали в течение 21 дня в среде следующего состава: среда ДМЕМ/F-12, 10% сыворотки плода коровы, 0.01 мкМ 1,25-дигидрокси витамина Д3, 50 мкМ аскорбат-2-фосфата, 10 мМ -глицерофосфата. Кальцификацию внеклеточного матрикса определяли с помощью окраски ализариновым красным. Кроме этого для детекции остеогенной дифференцировки клетки окрашивали щелочной фосфатазой и исследовали экспрессию маркеров костной ткани – остеонектина и остепонтина.

Для выявления потенции клеток ДП дифференцироваться в адипоциты клетки культивировали в индукционной среде следующего состава: среда DMEM/F-12, 10% сыворотки плода коровы, 0.5 мМ изобутил-метилксантина, 1 мкМ дексаметазона, 10 мкМ инсулина, 200 мкМ индометацина. Адипогенную дифференцировку выявляли с помощью маркера зрелых адипоцитов – лептина и красителя Oil red O.

Приготовление коллагенового геля. Стерильный 0,34М раствор NaOH объединяли с концентрированной (х10) питательной средой Игла или 199 в соотношении 1:2 и на каждые 100 мл смеси добавляли 100 мг глутамина и 9 мл 7,5% бикарбоната натрия. Полученную смесь соединяли с охлажденным раствором коллагена в уксусной кислоте в соотношении 1:4, после чего помещали на лед для предотвращения быстрой желатинизации.

Иммуногистохимическое исследование. Для иммуногистохимических исследований с использованием флуоресцентной метки клетки фиксировали 4% ПФА в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки пермеабилизировали в 0,5%-ном растворе Triton X-100. Затем промывали PBS и наносили сыворотку животных, из которых были получены вторые антитела, для уменьшения неспецифического связывания антител, либо БСА и инкубировали с первыми антителами в течение 18 ч при 4С. После промывки в PBS наносили вторые антитела, конъюгированные с флуорохромом (FITC, Alexa), и изучали препараты с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии (Конфокальный микроскоп Leica TCS SP с программным обеспечением Leica LCS, флуоресцентный микроскоп Leica DM RXA2). Для окрашивания ядер использовали Hoechst 33342, DAPI или PI. При использовании PI, клетки предварительно обрабатывали РНКазой. В качестве отрицательного контроля использовали антитела, выработанные у неиммунизированных животных.

Проводили также контроль вторых антител в отсутствие первых.

Культивирование кератиноцитов в коллагеновом геле. Для культивирования кератиноцитов в коллагеновом геле, первичные кератиноциты в высокой концентрации помещали в подготовленные в геле «колодцы» объёмом 100 мкл. После прикрепления клеток (через 20-30 мин) пластиковое кольцо удаляли и добавляли среду DMEM:F12 (1:1), с содержанием 10% сыворотки плода коровы, L-глутамина, инсулина, изопротеренола и EGF, и инкубировали при 37С в СО2-инкубаторе.

Трансплантация клеток иммунодефицитным мышам. Фрагменты кожи человека инкубировали в 2%-растворе EDTA на PBS (pH=8.0) в течение 2 ч при 37оС, затем промывали в среде. С помощью иглы размером 30G локально отделяли эпидермис от дермы, формируя небольшой карман. Донорские клетки человека (клетки ДП, базальные кератиноциты или их смесь) в объеме 50 мкл (10 млн/мл) инъецировали в образованный карман и инкубировали в течение 12 ч при 37оС. На следующий день фрагменты кожи имплантировали под кожу в области лопаток бестимусным мышам, полученным в питомнике ФИБХ РАН г. Пущино.

Гистологический и иммуногистохимический анализ проводили через 4 и 8 недель после имплантации. Фрагменты кожи фиксировали в 4%-растворе ПФА в течение 1 ч. После трехкратной промывки в PBS кусочки кожи пропитывали 20%раствором сахарозы в течение 12 ч, затем замораживали в парах азота. Срезы толщиной 10 мкн получали на криостате.

Статистическая обработка результатов. При обработке результатов оценивали значение средней величины, стандартное отклонение от значения средней величины. Построение графиков проводили в программе Excel (Microsoft). Различие считали статистически достоверным, если уровень значимости был p0.05, что является мерой достаточной надежности результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение популяции кератин 19 – положительных клеток в культуре В настоящей работе мы исследовали клеточные популяции волосяного фолликула и их взаимодействия между собой. Выявление стволовых эпидермальных клеток волосяного фолликула осложнено отсутствием специфических иммуногистохимических маркеров. В настоящее время наиболее достоверным способом обнаружения стволовых клеток является изучение способности клеток длительно сохранять метку. Кератин 19 может служить альтернативой для выявления стволовых клеток волосяного фолликула (Stasiak et al.
, 1989; Savtchenko et al., 1988; Bartek et al., 1985), потому и был использован в нашем исследовании. Данные литературы по выявлению экспрессии кератина 19 в волосяном фолликуле противоречивы. В некоторых исследованиях экспрессия кератина 19 была обнаружена только в области bulge (Narisawa et al., 1994; Michel et al., 1996; Stasiak et al., 1989). Другие исследования обнаруживают две области экспрессии кератина 19: в верхней и нижней трети волосяного фолликула. В нашей работе мы обнаружили экспрессию кератина 19 в двух областях волосяного фолликула на стадии анаген: в области bulge и в матриксе волосяного фолликула (рис. 1А, цветная вкладка). Мы придерживаемся гипотезы активации bulge (Cotsarelis et al., 1990; Lavker et al., 1991) и полагаем, что в раннем анагене стволовые клетки из области bulge (К19+-клетки) мигрируют в матрикс волоса, где пролиферируют и дают начало транзиторным клеткам, которые формируют волосяной фолликул. При этом К19+-клетки матрикса, являющиеся потомками стволовых из области bulge, уже вступают на путь дифференцировки, а тот факт, что они продолжают экспрессировать кератин 19 может свидетельствовать об их способности к пролиферирации. Исследование поперечного среза области bulge показало, что К19+-клетки располагаются в базальном слое наружного корневого влагалища (рис. 1Б, цветная вкладка), что соответствует данным и других исследований (Narisawa et al., 1994; Michel et al., 1996).

Мы изучили распределение К19+-клеток в первичной культуре. После ферментативной обработки эпидермиса в состав полученной суспензии клеток входят как кератиноциты интерфолликулярного эпидермиса, так и волосяного фолликула. Волосяные фолликулы являются основным источником К19+-клеток при инициации первичной культуры. Исследование первичной культуры на ранних сроках культивирования в среде с физиологичным содержанием Са2+ (2мМ) выявило единичные в составе агрегатов или располагающиеся поодиночке К19+-клетки. Одиночные К19+-клетки характеризовались малым диаметром (10±2мкм) и высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. Количество таких клеток составляло менее 1% от общего числа клеток. Диаметр К19+-клеток, входящих в состав клеточных агрегатов, был несколько больше и составлял 12±3мкм. Встречались также агрегаты, полностью сформированные из К19+клеток. При культивировании эпидермальных клеток в течение 6 дней доля К19+bulge – утолщение волосяного фолликула в месте прикрепления мышцы, поднимающей волос.

клеток в культуре возрастала до 20%. Следует также отметить, что размер К19+клеток увеличивался и достигал 30-50 мкм.

Увеличение доли К19+-клеток могло происходить в результате нескольких событий: во-первых, за счет их пролиферации, во-вторых, за счет их преимущественного выживания и, в-третьих, за счет инициации экспрессии кератина 19 К19--клетками.

Исследование пролиферативного статуса К19+-клеток с помощью антител к Ki67 показало, что через 24 часа культивирования, в то время, когда К19--клетки пролиферировали (1% Ki-67-положительных клеток), К19+-кератиноциты находились в пролиферативном покое (рис. 2А, цветная вкладка). Однако на 6-е сутки в культуре 15% К19+-кератиноцитов одновременно были позитивны по антигену Ki-67, что в среднем соответствовало доле пролиферирующих клеток среди К19--клетки (рис. 2Б, цветная вкладка). Это указывает на то, что пролиферативная активность К19+-клеток в культуре возрастает, что, возможно, приводит к увеличению их доли в популяции кератиноцитов.

При исследовании популяции базальных кератиноцитов, полученных в результате открепления супрабазальных слоев, мы обнаружили группы К19+клеток. Изучение способности базальных кератиноцитов включать метку BrdU показало, что увеличение доли К19+-клеток происходило не за счет пролиферации клеток. Поэтому мы предположили, что увеличение доли К19+-клеток могло происходить в результате индукции экспрессии кератина 19 в К19--клетках. Для проверки этого предположения, мы исследовали динамику изменения количества К19+-клеток при обработке культуры митомицином С, блокирующим пролиферацию.

В культуре, где клетки не пролиферировали, наблюдалось увеличение доли К19+-клеток, что может свидетельствовать об индукции синтеза кератина 19 в К19--клетках. Однако результаты данного эксперимента не исключают возможности преимущественной гибели К19--клеток. Исследование динамики экспрессии кератина 19 в культуре клеток интерфолликулярного эпидермиса подтвердило наше предположение об индукции синтеза кератина 19 в ранее негативных по этому маркеру клетках. Согласно данным литературы в культивируемых эпидермальных кератиноцитах экспрессия кератинов простого эпителия может индуцироваться, а экспрессия специфических для дифференциации кератиноцитов – подавляться (Gazel et al., 2003). Можно предположить, что часть К19+-кератиноцитов в культуре является потомками клеток волосяного фолликула, а в процессе культивирования происходит дополнительная индукция синтеза кератина 19.

Характеристика клеток ДП, изучение их индуктивных свойств Клетки ДП индуцируют морфогенез волосяных фолликулов in vivo.

Использование клеток ДП в культуре позволяет создать модель, отражающую процессы формирования волосяных фолликулов в эмбриогенезе и процессы реорганизации волосяного фолликула в цикле роста волоса во взрослом организме. Небольшой размер ДП, а также расположение в середине волосяной луковицы создает некоторые трудности при выделении этих клеток и их изучении.

Разработанный нами метод выделения клеток ДП позволяет упростить выделение клеток, а также повысить его эффективность. В нашем способе выделения используются ферменты диспаза, позволяющая разобщить эпителий и соединительнотканную капсулу волосяного фолликула, и коллагеназа, способствующая перевариванию соединительнотканной капсулы и выявлению ДП. Методика основывается на том, что ДП волосяных фолликулов человека (кожи лица) располагаются в жировой ткани, поэтому, отрезая жировую ткань с помощью скальпеля от примыкающей дермы и инкубируя в растворе коллагеназы, мы легко отделяем волосяные луковицы от жировой ткани: волосяные луковицы оказываются на дне культурального флакона, в то время как весь жир всплывает на поверхность жидкости. В процессе ферментативной обработки коллагеназой в течение 6 ч происходит полное переваривание соединительнотканной оболочки волосяного фолликула, тогда как ДП все еще сохраняет свою целостность (рис. 3).

Использование коллагеназы приводит к разрушению внеклеточного матрикса ДП, что многократно увеличивает способность клеток прикрепляться к пластику, а также увеличивает скорость их роста (Wu et al., 2005). Время расщепления легко контролировать с помощью инвертированного микроскопа.

Когда коллагеназа начинает расщеплять ДП, процесс должен быть остановлен.

Повторное центрифугирование на низкой скорости позволяет отделить разобщенные мезенхимные клетки соединительнотканной оболочки от ДП.

нами Рис. 3. Дермальная папилла при Сопоставляя полученные результаты с опубликованными ранее ферментативной обработке.

(Warren et al, 1992; Chiu et al., 1993; Wu et al., 2005), мы полагаем, что разработанный нами метод выделения клеток ДП человека позволяет выделять большое количество ДП, не требуя микрохирургических манипуляций.

ДП волосяного фолликула человека образована фибробластоподобными клетками, имеющими ряд морфологических и функциональных отличий от фибробластов дермы. Специфические свойства клеток ДП можно выявить с использованием гистохимических маркеров. Например, специфические компоненты внеклеточного матрикса, синтезируемые клетками ДП, такие как кислые и нейтральные мукополисахариды, могут быть выявлены красителями толуидиновым синим и альциановым синим. С помощью них мы окрасили клетки ДП in situ и in vitro. При обработке альциановым синим (pH=2.5) срезов кожи человека мы обнаружили голубое окрашивание как ДП, так и соединительнотканной оболочки волосяного фолликула (рис.

4А, цветная вкладка). Культура клеток ДП также окрашивалась в голубой цвет (рис. 4Б, цветная вкладка). При использовании толуидинового синего (pH=2.0) ДП окрашивались в сиреневый цвет, проявляя, таким образом, метахроматические свойства (рис. 4В, цветная вкладка). Культивируемые клетки ДП также имели сиреневую окраску (рис. 4Г, цветная вкладка). Дермальные фибробласты этими красителями не окрашивались. Данные результаты свидетельствуют о том, что клетки ДП в культуре все еще сохраняют способность синтезировать специфические компоненты внеклеточного матрикса. Эти данные соответствуют результатам других исследований (Wu et al., 2005) и подтверждают истинную принадлежность выделенных нами клеток ДП.

Еще одним маркером может служить активность щелочной фосфатазы. В настоящем исследовании активность щелочной фосфатазы была обнаружена в культивируемых клетках ДП, при этом активность сохранялась при пассировании культуры до 7 пассажа, однако по мере пассирования она ослаблялась. В литературе существуют различные данные по выявлению активности щелочной фосфатазы в культуре клеток ДП. Так в работе Рэндл и соавторов активность щелочной фосфатазы в клетках ДП снижалась ко второму пассажу (количество клеток, проявляющих высокую активность щелочной фосфатазы, составляло менее 5%) (Rendl et al., 2008). В других исследованиях активность щелочной фосфатазы снижалась после 3 пассажа (McElwee et al., 2003). Культивируемые клетки ДП (преимущественно клетки волосяных фолликулов шерстяного покрова мыши) теряют способность индуцировать рост волосяных фолликулов после прохождения 4 пассажей, в то время как культивируемые клетки вибриссы крысы теряют эту способность уже после нескольких пассажей (Weinberg et al., 1993).

Сохранение активности щелочной фосфатазы в процессе культивирования до 7 пассажа в нашем экперименте можно объяснить другими условиями культивирования, либо использованием более чувствительного метода детекции активности щелочной фосфатазы (NBT/BCIP).

Волосяной фолликул является источником мезенхимных стволовых клеток, которые участвуют в восстановлении дермы при ее повреждении (Jahoda & Reynolds, 2001). Есть данные, что стволовые клетки ДП вибриссы крысы имеют пролиферативные характеристики и профиль экспрессии поверхностных маркеров, подобные стволовым клеткам из костного мозга крысы. Клетки волосяного фолликула и стромальные клетки из костного мозга крысы обладают одинаковыми потенциями к адипо- и остеогенной дифференцировкам, но некоторые различия обнаруживаютя в случае хондро- и миогенеза (Hoogduijn et al., 2006). Эти данные позволяют предполагать, что клетки ДП волосяного фолликула человека также могут обладать дифференцировочными потенциями.

Проведенное нами исследование поверхностных маркеров клеток ДП выявило маркеры мезенхимных стволовых клеток жировой ткани: СD49d, CD105 и STROCD105 и STRO-1 также являются маркерами мезенхимных стволовых клеток костного мозга, однако СD49d в этих клетках не выявляется (Zuk et al., 2002).

Клетки ДП экспрессировали CD49d на том же уровне, что и клетки стромы жировой ткани, однако синтез маркеров CD105 и STRO-1 был менее выражен (рис. 5, цветная вкладка). Постнатальные фибробласты дермы имели низкий уровень экспрессии CD49d, единичные клетки в популяции экспрессировали STRO-1 и не экспрессировали CD105. Таким образом, можно сказать, что клетки стромы жировой ткани и клетки ДП обладают сходным поверхностным фенотипом, значительно отличающимся от фенотипа популяции дермальных фибробластов.

Мы исследовали потенции клеток ДП человека дифференцироваться в клетки костной и жировой ткани при культивировании в индукционных средах.

Адипогенную дифференцировку выявляли с помощью окраски на нейтральные жиры красителем Oil Red O и исследовали экспрессию маркера зрелых адипоцитов – лептина. В качестве положительного контроля использовали индуцированные в адипогенез клетки стромы жировой ткани, которые обладают сходными характеристиками со стволовыми клетками костного мозга и вступают в адипо- и остеогенез (Zuk et al., 2001), в качестве негативного контроля использовали постнатальные фибробласты дермы и клетки ДП, культивируемые в стандартной среде DMEM, не содержащей индукторов дифференцировки. На 14 сутки среди клеток ДП, подвергнутых дифференцировке, были обнаружены клетки с цитоплазматическими включениями, которые окрашивались Oil Red O.

Отложение липидных капель в цитоплазме и экпрессию лептина наблюдали только в 20-30% клеток ДП. Сравнительный анализ окраски различных клеточных популяций показал, что адипогенная дифференцировка клеток ДП, как и постнатальных фибробластов дермы была менее выражена по сравнению с клетками стромы жировой ткани. Спонтанную дифференцировку клеток ДП не наблюдали.

Для определения способности клеток ДП дифференцироваться в клетки костной ткани при культивировании в индукционной среде исследовали уровень экспрессии молекулярных маркеров остеогенеза: остеонектина и остеопонтина. На 21 сутки в клетках ДП обнаруживали экспрессию этих маркеров на уровне, сопоставимом с клетками стромы жировой ткани. Постнатальные фибробласты не обладали такими свойствами. В контрольной среде небольшое количество клеток ДП спонтанно дифференцировались в клетки костной ткани. Остеогенная дифференцировка подтверждалась окраской клеток ализариновым красным и гистохимической реакцией на щелочную фосфатазу.

Таким образом, исследование адипогенной и остеогенной дифференцировки показало, что клетки ДП больше склонны к остеогенной дифференцировке, чем к адипогенной.

Для изучения процессов регенерации волосяного фолликула клетки ДП трансплантируют иммунодефицитным мышам. Для этого используют несколько подходов: клетки ДП имплантируют под капсулу почки или непосредственно под эпидермис. В результате помещения клеток в инактивированные волосяные фолликулы с последующей трансплантацией под капсулу почки происходит реорганизация волосяных фолликулов. При трансплантации клеток под кожу происходит стимуляция роста и развития волосяных фолликулов.

–  –  –

А Б

Рис. 2. Экспрессия К19 и Ki67 в первичной культуре кератиноцитов (ув. ок.:

х 10, об.: х 40). А) Через 1 сутки культивирования. К19+-клетки (помечены короткими стрелками) не окрашиваются антителами против Ki-67, т.е.

находятся в пролиферативном покое, в то время как К19--клетки пролиферируют (помечены длинными стрелками). Б) Через 6 суток культивирования. Часть К19+-клеток окрашиваются антителами против Ki67 (помечены стрелками), т.е. пролиферируют.

Рис. 4. Характеристика клеток дермальной папиллы в условиях in situ (А, В) (ув. ок.: х 10, об.: х 4) и in vitro (Б, Г).

Окраска альциановым синим (А, Б) и толуидиновым синим (В, Г).

Рис. 5. Сравнение фенотипических параметров клеток ДП, клеток стромы жировой ткани и фибробластов дермы с помощью исследования эспрессии поверхностных маркеров клеток стромы жировой ткани CD49d, CD105 и STRO-1 (зеленое свечение). Ядра клеток окрашены DAPI.

–  –  –

Рис. 11. Пролиферация краевых Рис. 12. Тубулярный вырост, клеток эпидермального выроста. окрашенный антителами к Окраска антителами к Ki67 кератину 19 (зеленое свечение).

(зеленое свечение). Ядра клеток Ядра клеток окрашены Hoechst окрашены PI (ув. ок.: х 10, об.: х 33342.

20).

–  –  –

А Б Рис. 17. Мечение клеток с помощью лентивирусной конструкции. А) Клетки ДП экспрессируют cop GFP. Б) Базальные кератиноциты экспрессируют DsRed.

–  –  –

Для формирования волосяных фолликулов de novo необходимо создание трехмерной модели и трансплантация клеток ДП в сочетании с эпителиальными стволовыми клетками (Kishimoto et al., 1999). В нашей работе мы показали, что in vitro способность эпидермальных клеток человека формировать трехмерные структуры с участием миграции и пролиферации клеток сохраняется.

Индуктивные способности клеток ДП человека в культуре нами были выявлены впервые. Использование системы in vitro позволяет проводить исследования с клетками человека. Это является важным преимуществом, поскольку существуют многочисленные различия между клетками животных и человека, и результаты, получаемые на животных, могут быть неадекватными по отношению к человеку.

Разработанная нами модель морфогенеза кератиноцитов человека в коллагеновом геле обладает преимуществом по сравнению с ранее разработанными (Шинин, 2001), поскольку содержит естественный индуктор тубулогенеза – клетки ДП или выделяемые ими факторы. Использование в качестве индуктора этой клеточной популяции, а не ФЭЧ, позволяет исключить неспецифические сигналы эмбриональной дермы и, следовательно, получать результаты, приближенные к ситуации in vivo. Наша модель имеет и дополнительные преимущества, поскольку мы используем первичные эпидермальные кератиноциты и клетки ДП 1-3 пассажей. Использование первичных клеток более предпочтительно, так как применение опухолевых или трансформированных линий в биологических исследованиях непременно накладывает ограничения в интерпретации результатов.

Использование в эксперименте среды, кондиционированной клетками ДП, показало, что для индукции тубулогенеза достаточно веществ, секретируемых клетками ДП в среду, а присутствие самих клеток необязательно. То же самое было обнаружено и для ФЭЧ (Шинин, 2001). При сравнении индукционной способности клеток ДП и ФЭЧ были обнаружены различия в морфологии тубул (рис. 6А, 6Б).

Рис. 6. Формирование тубулярных структур при культивировании кератиноцитов в среде, кондиционированной клетками А)ДП, Б) ФЭЧ. Фазовый А Б контраст.

Эпидермальные тубулы, сформированные при культивировании кератиноцитов в среде, кондиционированной ДП, как правило, имели расширенный ведущий край.

Таким образом, можно предположить, что морфогенетический потенциал кератиноцитов может быть по-разному реализован в зависимости от типа мезенхимных клеток.

В связи с исчезновением индуктивных свойств клеток ДП в процессе культивирования (Weinberg et al., 1993) представляет интерес разработка новых подходов, позволяющих наращивать большое количество клеток ДП без потери их индуктивной способности. Одним из возможных способов является иммортализация клеток. Мы исследовали способность иммортализованных клеток ДП индуцировать эпителиальный морфогенез в культуре и показали, что иммортализованные клетки ДП могут индуцировать тубулогенез даже на 40 пассаже. Те же результаты были получены и при использовании среды, кондиционированной такими клетками.

Согласно литературным источникам индуктором инвазии эпителиальных клеток является фактор роста гепатоцитов (HGF), или scatter factor (SF) (Montesano et al., 1991 b). В ряде работ было показано, что клетки ДП, как и ФЭЧ, способны синтезировать этот фактор in vivo и in vitro (Defrances et al., 1992; Harrison & Farzaneh, 2000). Мы изучили способность этого морфогена индуцировать тубулогенез в нашей системе. Оказалось, что эффект SF/HGF по сравнению с кондиционированной клетками ДП средой, менее выражен (рис. 7). Таким образом, индукционная способность клеток ДП не может быть обусловлена только синтезом SF/HGF.

–  –  –

Структуры, сформированные в нашей модели в течение 10 дней, достигали в длину 1-2 мм и представляли собой тубулы, заполненные клетками. Такие образования варьировали по форме, но, главным образом, имели утолщенный ведущий край. Клетки наиболее выступающего в гель дистального отдела тубулы характеризовались малым размером и плотным расположением относительно друг друга (рис. 8А). Внутренняя часть тубулы содержала мало клеток, между которыми просматривались полости (рис. 8Б). Морфологическое разнообразие отделов тубулярного выроста, а также наличие полостей указывают на динамический характер тубулогенеза. Однако в сравнении с полыми тубулами, формируемыми клетками почки собаки MDCK или клетками молочной железы, полости тубулярных структур, получаемые на культуре кератиноцитов, заполнены клетками. Возможно, такое строение тубул обусловлено способностью кератиноцитов к формированию стратифицированного эпидермиса. В то же время следует отметить, что при формировании волосяного фолликула in vivo образования полости также не происходит. В эмбриогенезе примитивный эпидермис врастает в дерму в виде многоклеточного тяжа, не имеющего полости.

При достижении его проксимальным концом ДП, которая на данном этапе развития представлена в виде скопления мезенхимных клеток, происходит инициация роста волоса (Blanpain & Fuchs, 2006). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при культивировании в коллагеновом геле кератиноциты способны к реализации программы, свойственной им in vivo.

А Б Рис. 8. Структура эпидермальных тубул. Окраска: гематоксилин – эозин. А) дистальный конец тубулы; Б) срезы тубул.

С помощью электронно-микроскопического исследования мы обнаружили, что эпидермальные тубулы состоят из клеток различной степени дифференцировки. На срезе одного уровня можно найти молодые клетки, зрелые, содержащие кератогиалиновые зёрна в цитоплазме, и отмирающие, с разрушающимися ядром и клеточными мембранами. При этом наблюдалась закономерность распределения клеток, имеющих разную степень дифференцировки. Ближе к центру располагались молодые кератиноциты, а зрелые и отмирающие – на периферии.

При панорамной реконструкции одного из срезов было отмечено необычное расположение клеток относительно друг друга:

они наползали друг на друга длинными отростками по спирали (рис. 9). Наши результаты соотносятся с данными других исследований, согласно которым кератиноциты склонны двигаться в гелеобразном субстрате по спирали (Ronfard et al., 2000). Электронно-микроскопическое исследование подтвердило отсутствие внутренней полости в некоторых частях тубулы. В местах касания таких ворсинок или просто мембран соседних клеток формировались многочисленные контакты.

При изучении этих контактов при больших увеличениях было выяснено, что это десмосомы (рис. 10). По крупным межклеточным пространствам и наличию многочисленных ворсинок можно судить о том, что клетки находятся в движении.

Этот факт подтверждает и большое количество формирующихся десмосом. Были обнаружены морфологические структуры полудесмосом в местах контакта клеток с внеклеточным матриксом.

–  –  –

Иммуногистохимические исследование тубулярных выростов с помощью антител к Ki67 и кератинам 10, 14 и 19 позволило выявить пролиферирующие клетки и клетки различной степени дифференцировки. Изучение маркера Ki67 показало, что при формировании тубул имеет место пролиферация краевых клеток (рис. 11, цветная вкладка). Однако количества пролиферирующих клеток недостаточно для формирования таких многоклеточных структур, поэтому, скорее всего, формирование тубул происходит в результате не столько пролиферации, сколько миграции эпидермальных клеток. О миграции клеток может говорить их вытянутая форма и наличие длинных отростков, направленных в гель.

По литературным данным процесс формирования тубулярных структур, индуцированных в культуре ФЭЧ, можно разделить на несколько стадий:

формирование эпителиальных отростков, эпителиальных цепочек, формирование тяжа и последущая стратификация кератиноцитов с образованием многоклеточного тяжа (Шинин, 2001). Пролиферация играет важную роль на стадии формирования эпителиального тяжа, миграция же преобладает на этапе формирования эпителиального отростка и цепочки. Согласно литературным данным потенциями к тубулогенезу обладает только небольшая часть суспензии кератиноцитов, клетки которой при культивировании на пластике дают начало большим эпителиальным колониям (Шинин, 2001). Формирование таких колоний предположительно происходит из стволовых клеток. Исследование потенциального маркёра стволовых клеток волосяных фолликулов – кератина 19 (К19) – не выявило закономерности в распределении К19+- клеток (рис.

12, цветная вкладка). Эпидермальные тубулы не гомогенны по объему. Так, например, экспрессия кератина 14 (К14) была выявлена в клетках ведущего края тубулы (рис. 14, цветная вкладка). По-видимому, эти клетки обладают повышенной миграционной способностью. Изучение экспрессии кератина 10 показало, что дифференцированные кератиноциты располагаются в средней части тубулы по периферии (рис. 13, цветная вкладка), в растущем крае доля К10+клеток мала. Полученные данные иммуногистохимического исследования подтверждают данные электронной микроскопии. Они демонстрируют закономерное распределение кератиноцитов разной степени дифференцировки внутри этих клеточных образований.

Распределение клеток по степени дифференцировки в тубулярных выростах схоже с таковым в мигрирующем пласте на плоском субстрате (Васильев и др., 1993; Воротеляк и др., 1996). В растущем крае таких колоний располагаются низкодифференцированные клетки, окрашивающиеся антителами к кератину 14.

Молодые клетки находятся и в центре колонии в базальном слое, в супрабазальном слое – дифференцированные (по неопубликованным данным Воротеляк). Расположение клеток по степени дифференцировки большинства эпителиальных тканей типична и в ситуации in vivo и обеспечивается механизмами, координирующими миграцию и пролиферацию клеток (Lavker & Sun, 2000; Watt, 2001; Potten & Loeffler, 1987; Borthwick et al., 2001).

Способность кератиноцитов к самоорганизации При изучении самоорганизации клеток нас интересовало, как данные процессы будут реализовываться при разобщении клеток трипсином: будут ли клетки контактировать между собой. Для исследования этой проблемы была разработана следующая модельная система: трипсинизированные базальные кератиноциты в концентрации 300 тыс. клеток/мл высевали на стекла, предварительно обработанные коллагеном I типа и полилизином, и культивировали в полной питательной среде с факторами роста и митогенными добавками. При внесении дезагрегированных клеток на плоский субстрат мы наблюдали первичные события морфогенеза: базальные кератиноциты начинали формировать клеточные агрегаты. Сформированные агрегаты включали от пяти до нескольких десятков клеток, располагающихся с различной плотностью.

Скопления были образованы клетками разного размера и разного пролиферативного статуса. В процессе развития культуры отдельные агрегаты соединялись между собой длинными ламеллиподиями в единую сеть (рис. 15). В культуре существовали и одиночные клетки, которые прикреплялись к субстрату и поддерживали жизнеспособность в течение некоторого времени, однако если такие клетки не присоединялись к колонии в результате миграции или не контактировали с другими клетками при помощи ламеллиподий, они погибали.

Формирование агрегатов и длинных ламеллиподий можно рассматривать как начальные стадии морфогенеза. Эти события напоминают процесс образования длинных ламеллиподий при регенерации эпидермиса после повреждения. Можно заключить, что дезагрегированные эпидермальные кератиноциты сохраняют способность к формированию правильной трехмерной структуры. Мы полагаем, что в условиях культивирования на плоском субстрате такие агрегаты являются зачатками структурно-функциональных единиц.

При помещении дезагрегированных базальных кератиноцитов в коллагеновый гель, наблюдали объединение клеток в единые тубулярные структуры (рис. 16). Однако формирование таких структур происходило иначе, по сравнению с тубулами, полученными с использованием первичных кератиноцитов. Феномен сборки тубулярных структур из одиночных клеток нами обнаружен впервые. Основным процессом при формировании таких тубул очевидно является миграция.

–  –  –

Таким образом, базальные кератиноциты сохраняют способность к формированию трехмерной структуры, как на плоском субстрате, так и в коллагеновом матриксе.

Это свидетельствует о сохранении способности кератиноцитов к самоорганизации. Мы полагаем, что способность кератиноцитов использовать различные механизмы для формирования эпидермальных тубул свидетельствует об общей программе тубулогенеза, которая может быть осуществлена различными путями.

Способность клеток встраиваться в трехмерные структуры кожи in vivo Для того чтобы выяснить, способны ли выращенные в культуре эпидермальные и мезенхимные клетки правильно встраиваться в структуры кожи и сохранять свой морфогенетический потенциал в системе in vivo, мы инъецировали клеточные популяции волосяного фолликула под эпидермис кожи человека с последующей трансплантацией бестимусным мышам. Для идентификации инъецированных клеток использовали лентивирусную метку.

Мечение клеток с помощью лентивирусной конструкции было очень эффективным: доля зараженных клеток составила более 95% от общего количества (рис. 17 А, Б, цветная вкладка). Результаты эксперимента показали, что инъецированные клетки выживали и обнаруживались в соответствующих структурах кожи. Эпидермальные кератиноциты были, главным образом, найдены в составе волосяных фолликулов и, частично, в зоне межфолликулярного эпидермиса, а клетки ДП – в папиллярной дерме (рис. 18, цветная вкладка). Таким образом, культивированные клетки полностью сохраняют способность встраиваться в структуру кожи, находя там свою нишу. Это явление получило название хоминга (от англ. home – дом). Впервые оно было описано для способности трансплантированных гематопоэтических стволовых клеток восстанавливать функцию костного мозга (Springer, 1990). Проведенные нами опыты показывают, что выращенные эпидермальные и мезенхимные клетки могут быть использованы для реконструкции волосяных фолликулов.

В ходе эксперимента было замечено, что инъецированные клетки ДП стимулировали ангиогенез (рис. 19, цветная вкладка). Известно, что ДП содержит кровеносные сосуды, которые обеспечивают ее питанием, необходимым для деления эпителиальных клеток и роста волоса. По всей видимости, клетки ДП синтезируют факторы, способствующие прорастанию сосудов.

Заключение Волосяной фолликул – уникальный объект, позволяющий исследовать различные биологические процессы. Его эпителиальный и мезенхимный компоненты служат источником стволовых клеток. В культуре эпидермальные стволовые клетки участвуют в регенерации культивируемого эпителиального пласта и в тубулогенезе кератиноцитов в коллагеновом геле.

В настоящее время наиболее достоверным маркером стволовых клеток волосяного фолликула является кератин 19. Мы изучили поведение популяции кератин 19+-клеток в культуре. Результаты нашего исследования показывают, что популяция кератин 19+-клеток гетерогенна. Среди К19+-клеток встречаются очень мелкие клетки, соответствующие по размерам стволовым, и крупные, которые могут соответствовать дифференцированным клеткам. Доля К19+-клеток в культуре возрастает. Мы показали, что в процессе культивирования происходит дополнительная индукция синтеза кератина 19 в клетках, где ранее этот белок не экспрессировался.

Стволовые мезенхимные клетки волосяного фолликула располагаются в ДП.

Мы подтвердили их полипотентность в исследованиях по культивированию клеток в индукционных средах. Часть клеток ДП дифференцировалась в адипогенном и остеогенном направлениях. Однако этот процесс был менее выражен при сравнении с дифференцировкой клеток стромы жировой ткани.

Практическое применение клеток ДП ограничено сложностью их выделения.

Разработанная нами методика оказалась очень эффективной и позволила упростить процедуру выделения клеток, поскольку была полностью лишена микрохирургических манипуляций.

Исследование клеток ДП в системе in vivo показало, что эти клетки остаются жизнеспособными по крайней мере в течение 2 месяцев. При этом они обнаруживаются в волосяном фолликуле – естественной нише. Мы также отметили, что клетки ДП вызывают усиленный ангиогенез.

В проведенном нами исследовании было впервые показано, что эпидермальные кератиноциты взрослого человека полностью сохраняют потенции к морфогенезу, в норме проходящему на раннем этапе эмбриогенеза при формировании волосяного фолликула, и проявляют их под воздействием клеток ДП. Кроме того, мы показали, что морфогенетический потенциал может быть поразному реализован в зависимости от типа кокультивируемых мезенхимных клеток.

Структура тубул и характер их роста во многом схожи со структурой и морфогенезом волосяного фолликула живого организма. Это доказывает адекватность предложенной нами модели.

Учитывая данные литературы и полученные результаты, можно предположить, что модель морфогенеза волосяного фолликула отражает основные механизмы начальных этапов морфогенеза придатков кожи. Предложенные нами модели оказались удобными для изучения индукционной способности клеток ДП, а также исследования характера роста тубул и их структурной организации.

Разработанные модели могут использоваться для изучения молекулярных механизмов морфогенеза волосяного фолликула.

Работа поддержана Министерством образования и науки РФ (госконтракт №02512.11.2096) и грантом РФФИ (проект 08-04-00611-а).

Выводы В культуре популяция К19+-кератиноцитов человека является обособленной 1.



Pages:   || 2 |

Похожие работы:

«УДК 572 СИНЕВА Ирина Михайловна ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ В ПАЛЕОАНТРОПОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ КОСТЕЙ ВЕРХНЕЙ И НИЖНЕЙ КОНЕЧНОСТИ 03.03.02 – «антропология» по биологическим наукам АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре антропологии биологического факультета Московского государственного университета...»

«Гаганов Леонид Евгеньевич Морфо-функциональные и молекулярно-биологические факторы прогноза рака желудка 14.03.02 – патологическая анатомия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2014 Работа выполнена в государственном бюджетном учреждении здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского»Научный консультант: Казанцева Ирина Александровна доктор...»

«ГЛУЩЕНКО ЛАРИСА АЛЕКСАНДРОВНА СТРУКТУРА ФИТОПЕРИФИТОНА В ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА ВОДЫ РАЗНОТИПНЫХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ БАССЕЙНА РЕКИ ЕНИСЕЙ Специальность 03.02.10 гидробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск 2010 Работа выполнена в ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет» на кафедре водных и наземных экосистем Института фундаментальной биологии и биотехнологии Научный руководитель: кандидат биологических наук, профессор...»

«ГАБДУЛЛИН ФАИЛЬ ХАРИСОВИЧ ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА МЯСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В РАЦИОНЕ АЭПК «БИОГУММИКС» 06.02.05 Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарносанитарная экспертиза 03.03.01 Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2015 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования...»

«САПРЫКИНА ТАТЬЯНА ВИТАЛЬЕВНА ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ МАЛЫХ ДОЗ ХЕЛАТОВ МЕТАЛЛОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЯЧМЕНЯ И ФИТОЭКСТРАКЦИЮ КСЕНОБИОТИКОВ 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владимир 201 Работа выполнена на кафедре ботаники естественно-географического факультета Курского Государственного Университета Научный руководитель Доктор сельскохозяйственных наук, профессор Проценко Елена...»

«ШУМЕЕВ Александр Николаевич ПРЕСНОВОДНЫЕ И НАЗЕМНЫЕ ПЛАНАРИИ СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО КАВКАЗА Специальность: 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в Лаборатории эволюционной морфологии Зоологического института Российской Академии наук. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.В. Мамкаев Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А.И. Гранович кандидат...»

«ТОПТЫГИНА АННА ПАВЛОВНА КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ПРОЦЕССОВ ФОРМИРОВАНИЯ И ПОДДЕРЖАНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ПАМЯТИ НА ПРИМЕРЕ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ КОРИ, КРАСНУХИ И ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПАРОТИТА. 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук МОСКВА-2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского»...»

«Чичерина Екатерина Александровна БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА 06.02.02. «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир 2015 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир) Ирза Виктор Николаевич, доктор ветеринарных...»

«РАХМАТУЛЛИН РАМИЛЬ РАФАИЛЕВИЧ Биопластический материал на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для восстановительной и реконструктивной хирургии 14.01.24 Трансплантология и искусственные органы Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет» и ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И....»

«Бабушкина Инна Викторовна ВлИянИе модИфИцИроВанного клеточного ксенотрансплантата на ИндукцИю защИтных БелкоВ В поВрежденном мИокарде (экспериментальное исследование) 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Благовещенск – 2011 Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» (г. Иркутск) и Учреждении...»

«ДОБРЕНЬКОВ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЦЕНОТИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ ПОЛОСТИ РТА И МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИНЦИПОВ БИОКОРРЕКЦИИ 03.02.03 – Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения...»

«Исаев Аркадий Петрович ТЕТЕРЕВИНЫЕ ПТИЦЫ ЯКУТИИ: РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЧИСЛЕННОСТЬ, ЭКОЛОГИЯ 03.02.04 – Зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Новосибирск 2014 Работа выполнена в лаборатории горных и субарктических экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологических проблем криолитозоны Сибирского отделения Российской академии наук. Научный консультант: член-корреспондент РАН, доктор...»

«ГАЛИНИЧЕВ АНДРЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ ЦИКАДОВЫЕ (HEMIPTERA, CICADINA) УРАЛА: СОСТАВ ФАУНЫ, ЭКОЛОГИЯ И ХОРОЛОГИЯ 03.02.08 – экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород Работа выполнена на кафедре зоологии федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского» Научный руководитель: доктор биологических...»

«НАУМОВА ЭВЕЛИН АРВИДОВНА РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРЕСЕРВОВ ИЗ КИЛЬКИ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ, ОБОГАЩЕННЫХ КОМПОНЕНТАМИ С ГИПОТЕНЗИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ 05.18.04 Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Калининград – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении...»

«ФЕДОРЕЦ ЮРИЙ АЛЕКСЕЕВИЧ КОМАНДОРСКИЙ КАЛЬМАР BERRYTEUTHIS MAGISTER (BERRY, 1913) БЕРИНГОВА И ОХОТСКОГО МОРЕЙ (РАСПРЕДЕЛЕНИЕ, БИОЛОГИЯ, ПРОМЫСЕЛ) 03.00.18 гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток Работа выполнена в Лаборатории сырьевых исследований дальневосточных морей Федерального государственного унитарного предприятия «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный Центр» (ФГУП ТИНРО-Центр) Научные...»

«БОЛГОВА Светлана Борисовна РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Воронеж – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Воронежский государственный университет инженерных технологий». Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор...»

«Вайсвалавичене Валентина Юрьевна СТРУКТУРА СРЕДСТВ, МЕТОДОВ И УСЛОВИЙ РАЗВИТИЯ ДВИГАТЕЛЬНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ У ДЕТЕЙ СТАРШЕГО ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА 5-7 ЛЕТ 13.00.04 – теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Москва – 2015 Диссертационная работа выполнена на кафедре теории и методики базовых видов физического воспитания...»

«ВАНГЕЛИ СЕРГЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ СРАВНИТЕЛЬНАЯ УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР КЛЕТОК, ХРОНИЧЕСКИ ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва – 201 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении научно-исследовательский институт...»

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тольятти – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт экологии Волжского бассейна Российской академии наук в лаборатории герпетологии и токсинологии Научный руководитель: Андрей...»

«АНДРЕЕВА НАДЕЖДА МИХАЙЛОВНА МЕТОДИКА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДОРОЖНЫХ КАРТ ПРИ ЭЛЕКТРОННОМ ОБУЧЕНИИ СТУДЕНТОВ ИНФОРМАТИКЕ (на примере экономических и биологических направлений подготовки) 13.00.02 – Теория и методика обучения и воспитания (информатика, уровень профессионального образования) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Красноярск – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.