WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АРОМАТИЧЕСКИЕ АМИДЫ И НИТРИЛЫ ...»

-- [ Страница 3 ] --

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что количество бактерий, трансформирующих амиды и нитрилы, в исследуемых почвах сопоставимо, их доля составляет от 0,05 (гумусовый дерновый горизонт дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением, глубина отбора проб – 5 см) до 48,1% (переходный горизонт дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением, глубина отбора проб 20 см).

Преобладание амидтрансформирующих бактерий наблюдается только в верхних слоях увлажненных почв, что, вероятно, связано с увеличением количества аэробных грамотрицательных бактерий, для которых свойственна активная утилизация амидосоединений.

3.5. Скрининг изолятов почвенных грибов, утилизирующих нитрилы и амиды.8 У выделенных плесневых грибов исследована способность к росту на жидкой минеральной среде с добавлением ацетамида, ацетонитрила, бензамида или бензонитрила в концентрации 10 мМ в качестве единственного источника углерода и азота (Таблица 8). Время инкубации составляло 144 ч.

–  –  –

8 Результаты получены в соавторстве с доцентом кафедры физиологии растений и микроорганизмов ПГНИУ к.б.н. Четиной О.А. и опубликованы в статье Четина О.А. Нитрилгидратазная активность почвенных микромицетов в процессе биотрансформации производных карбоновых кислот / О.А.Четина, И.О. Крылова, И.Н. Кирьянова, А.Ю. Максимов., Н.П. Долгих (Луговская) // Вестник Уральской медицинской академической науки. –2011 – №4/1 – С.205-206.

Установлено, что три штамма Blastomyces spp., Humicola grisea, Scopulariopsis spp. не способны утилизировать нитрилы и амидосоединия.

Большинство исследуемых штаммов активно метаболизировали как нитрилы, так и амиды. Штаммы Cladosporium herbarum, Arthrinium phaeospermum, Aspergillus fumigatus утилизировали только амид (Четина и др., 2011).

У культур плесневых грибов, способных расти на среде с ацетамидом (Рисунок 23) или ацетонитрилом (Рисунок 24), была определена нитрилгидратазная активность по отношению к акриламиду и нитрилазная активность по отношению к бензонитрилу.

мкмоль/мг/мин 5

–  –  –

Рисунок 23 – Нитрилгидратазная (А) и нитрилазная активности по отношению к бензонитрилу (Б) и акрилонитрилу (В) почвенных плесневых грибов, выращенных на ацетамиде: 1 – Aphanocladium album;

2 – Cladosporium cladosporioides; 3 – Fusarium oxysporum; 4 – Aspergillus fumigatus; 5 – Cladosporium herbarum; 6 – Penicillium solitum

–  –  –

1,8 1,6 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2

–  –  –

Рисунок 24 – Нитрилгидратазная (А) и нитрилазная активности по отношению к бензонитрилу (Б) и акрилонитрилу (В) почвенных плесневых грибов, выращенных на ацетонитриле: 1 – Aphanocladium album; 2 – Cladosporium cladosporioides; 3 – Fusarium oxysporum; 4 – Aspergillus fumigatus; 5 – Cladosporium herbarum; 6 – Penicillium solitum Культуры, трансформирующие нитрилы, проявляли выраженную нитрилазную активность. При этом активность по отношению к акрилонитрилу составляла лишь 32% от таковой по отношению к бензонитрилу, что согласуется с литературными данными по нитрилазам мицелиальных грибов (O’Reilly, Turner, 2003).

Лишь часть культур плесневых грибов, способных к утилизации нитрилов и амидов, показали высокую нитрилгидратазную и нитрилазную активности. Это может быть связано с тем, что невысокая активность фермента достаточна для питания клетки.

–  –  –

Таким образом, исследуемые культуры плесневых грибов обладали выраженной способностью к гидролизу ароматических и алифатических амидов и нитрилов. Однако установлено, что при длительной инкубации они не накапливают в среде продукты трансформации нитрилов и амидов и могут быть использованы для полной биодеградации этих соединений.

ГЛАВА 4. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИДОВ И

НИТРИЛОВ

4.1. Изучение влияния состава среды на рост и активность бактерий9 Был исследован рост изолятов на синтетической минеральной среде N, содержащей в качестве источника азота бензамид (10 мМ), в качестве источника углерода 0.1% раствор глюкозы (Рисунок 25, 26).

–  –  –

9 Результаты получены лично.

Рисунок 26 – Зависимость оптической плотности (ОП) от времени культивирования исследуемых грамотрицательных штаммов на среде с бензамидом и глюкозой Установлено, что наиболее активно используют бензамид в качестве источника азота культуры R. erythropolis 6РИ и R. erythropolis 7РИ среди грамположительных бактерий и у P. fluorescens 9нх и P. putida 10нх среди грамотрицательных. Штаммы 21и, 12и, R. fascians R. rhodochrous R. erythropolis 25ио, A. guillouiae 22ио показали очень низкий прирост биомассы.

Был исследован рост изолятов на синтетической минеральной среде N, содержащей в качестве источника азота бензонитрил (10 мМ), в качестве источника углерода 0.1% раствор глюкозы (Рисунок 27,28).

Рисунок 27 – Зависимость оптической плотности (ОП) от времени культивирования исследуемых грамположительных штаммов на среде с бензонитрилом и глюкозой Наиболее активное использование бензонитрила в качестве источника азота наблюдалось у R. erythropolis 3н среди грамположительных бактерий и у P. рutida 10нх среди грамотрицательных. Остальные штаммы не показали высоких значений оптической плотности.

Рисунок 28 – Зависимость оптической плотности (ОП) от времени культивирования исследуемых грамотрицательных штаммов на среде с бензонитрилом и глюкозой Высокий прирост биомассы на среде с бензамидом наблюдался у штаммов грамположительных бактерий. На среде с бензонитрилом разные группы бактерий достигали близких значений оптической плотности культуры.

Установлено, что культивирование всех исследуемых штаммов родококков на среде с бензонитрилом или бензамидом в качестве ростового субстрата приводит к резкому падению нитрилгидратазной активности до уровня, близкого к пределу чувствительности метода анализа, что согласуется с ранее полученными данными для других штаммов (Демаков и др., 2008).

При росте с использованными субстратами наблюдалось также координированное снижение активности амидазы до уровня ниже 1 мкмоль/мг/мин. При этом активность культур, выращенных в других условиях, а также активность ферментных препаратов не снижалась или подавлялась в меньшей степени. Полученные данные свидетельствуют в пользу механизма репрессии оперона или регулона, контролирующего гены нитрилгидратазы и амидазы на уровне транскрипции. Остаточного уровня активности достаточно для трансформации бензамида и бнзонитрила, использования их в качестве источника азота.

Таким образом, исследуемые штаммы могут быть использованы для утилизации бензонитрила и бензамида, однако их детектируемая активность при этом низка.

–  –  –

У штаммов R. erythropolis 5212 и 7-1 не обнаруживалось детектируемой нитрилгидратазной активности, что, возможно, связано с наличием нитрилазы. Штаммы R. rhodochrous 1185 (Рисунок 29), Pseudomonas sp. 35ф (Рисунок 30), R. erythropolis 13 (Рисунок 31), R. erythropolis 26 (Рисунок 32) проявили высокую нитрилгидратазную активность, которая была максимальна после 24 часов роста. После входа культуры в стационарную фазу наблюдается резкое снижение каталитической активности.

10 Результаты получены лично.

0,08 0,07

–  –  –

0,05 ОП-540 0,04 0,03 0,02 20 0,01 10

–  –  –

0,1 40 0,09 35 0,08

–  –  –

ОП-540 0,06 0,05 20 0,04 15 0,03 0,02 0,01

–  –  –

0,06 50 0,05 40

–  –  –

0,04 ОП-540 0,03 0,02 15 0,01

–  –  –

0,25 0,2 0,15 10 0,1 0,05

–  –  –

0,08 16 0,07 14 0,06 12

–  –  –

0,4 4 0,3 3 0,2 2 0,1

–  –  –

ОП-540 0,2 0,15 0,1 4 0,05 2

–  –  –

Методом газовой хроматографии была изучена амидазная активность по отношению к акриламиду, а также влияние на нее температуры (Таблица 12).

Таблица 12 – Влияние температуры на амидазную активность

–  –  –

4.3. Определение температурной и рН-зависимости амидазной активности11 Проведены эксперименты по исследованию влияния температуры и кислотности реакционной среды на удельную активность фермента при конверсии акриламида целыми клетками. Трансформацию проводили в течение 10 мин.

Установлено, что амидаза характеризуется достаточно высокой термостабильностью, не характерной для большинства ферментов мезофильных организмов. Высокая амидазная активность сохранялась в интервале температуры от 50° до 65°. Этот результат согласуется с данными об известных ферментах такого типа в других штаммах актинобактерий (Перцович и др., 2005).

Максимум активности в условиях проводимого анализа проявлялся у штамма R. erythropolis 25 при 55°С (Рисунок 36). Подобный профиль сохранялся у большинства исследованных штаммов, имеющих амидазную активность.

–  –  –

При проведении биотрансформации в разных условиях кислотности среды установлено, что амидазная активность максимальна при рН 7. В то же время максимальная скорость гидролиза ибупрофенамида наблюдалась при pH 8,3, что, вероятно, связано со значительным увеличением его растворимости в щелочной среде. Таким образом, если фермент способен работать в слабощелочных условиях, биокаталитическую реакцию рациональнее проводить в слабощелочной среде. (Рисунок 37). Ферменты других штаммов проявляли сходные профили рН зависимости активности.

Для реакций со всеми ферментами наблюдался подобный сдвиг активности в отношении ибупрофена, что также свидетельствует в пользу влияния на процесс его трансформации от большей растворимости.

мкмоль/мг/мин 12,00

–  –  –

Рисунок 37 – Влияние pH на амидазную активность при биотрансформации акриламида и ибупрофенамида в 10 мМ калий-натрий фосфатном буфере, катализируемой целыми клетками R. erythropolis 25, выращенными на минеральной среде N.

90 Таким образом, биокаталитическая реакция наиболее активно проходит в интервале температур 55-65°С. Так как термостабильность фермента обычно связана с технологической стабильностью (Cowan et al., 1998; Kotlova et al., 1999; Fournand, Arnaud, 2001; Максимов и др., 2003; Павлова, 2012; Bhatia et al., 2013; Mehta et al., 2013), это качество свидетельствует о перспективности изучаемых штаммов для промышленного применения.

4.4. Биотрансформация бензамида12 Проведены исследования биотрансформации бензамида активными культурами бактерий. Показано, что большинство изолятов быстро накапливают биомассу на среде с бензамидом и глюкозой. Проведена биотрансформация бензамида предварительно выращенными клетками исследуемых культур.

Abundance

–  –  –

Установлено, что штамм R. erythropolis 7РИ наиболее эффективно трансформирует бензамид с образованием бензойной кислоты (Рисунок 38) и проявляет наиболее высокую удельную активность (Рисунок 39).

12 Результаты получены лично.

1,4

–  –  –

Рисунок 39 – Активность культур по отношению к бензамиду 1 – R. erythropolis 6РИ; 2 – R. erythropolis 7РИ; 3 – P. putida 10нх;

4 – R. erythropolis 2н; 5 – P. fluorescens 2нх; 6 – R. erythropolis 3н;

–  –  –

Активно трансформировали бензамид также культуры R. erythropolis 6РИ, 2н, 3н и P. putida 10нх. Штаммы P. fluorescens 2нх, 3нх, 9нх не проявляли детектируемой амидазной активности по отношению к бензамиду.

–  –  –

Проведен скрининг ранее выделенных микроорганизмов, трансформирующих фенилацетонитрил и нитрил миндальной кислоты, обладающих высокой активностью по отношению к акрилонитрилу, для 13 Результаты получены лично и опубликованы в статье Долгих (Луговская) Н.П. Биотрансформация ибупрофенамида штаммом Rhodococcus rhodochrous / Н.П. Долгих (Луговская), К.С. Фролкова, А.Ю.

Максимов, В.А. Демаков // Вестник Уральсктй медицинской академической науки. – 2011 – №4/1 – С.193отбора штаммов, способных к эффективной трансформации синтетических предшественников НПВС.

Проведены опыты по биотрансформации 2-(4-изобутилфенил)пропионамида или ибупрофенамида штаммами лабораторной коллекции, трансформирующими бензонитрил и цианопиридины (Таблица 13).

Инкубацию проводили в течение 30, 60 и 120-мунут. Продукты трансформации анализировали методами ВЭЖХ и хромато-массспектрометрии (Долгих (Луговская), 2011).

Таблица 13 – Биотрансформация амида ибупрофена штаммами бактерий

–  –  –

Реакцию проводили в ряде буферных растворов в интервале рН от 5,5 до 9 (в котором ферменты исследуемых штаммов имеют высокий уровень активности) и в интервале температур от 25 до 60° с шагом в 5°С. При подборе среды для проведения реакции установлено, что наиболее эффективная трансформация проходит в 1 мМ фосфатном буфере, pH 8-8,2 при 30-35 °С на орбитальном шейкере с частотой вращения 140 об/мин.

Высокая активность по отношению к ибупрофенамиду обнаружена для штаммов A. tumefaciens M 1 и R. erythropolis F8, F18. Установлено, что продуктом реакции биотрансформации соответствующего амидосоединения является В течение 2-часовой трансформации S-(+)-ибупрофен.

конвертировалось до 38% амида (Таблица 13). Другой энантиомер амида количественно оставался в растворе. При дальнейшей инкубации наблюдалась частичная его трансформация с образованием R-энантиомера.

В результате исследований (трансформация 2 мМ амида ибупрофена при 30°С) было выяснено, что только несколько штаммов способны трансформировать ибупрофенамид до ибупрофена (2-(4-изобутилфенил)пропионовой кислоты): A. tumefaciens M 1 R. erythropolis F8, F18; 416, 5212 B15; R. rhodochrous 1185, 38, 43. Дальнейшие исследования показали, что наиболее активно реакция трансформации ибупрофенамида при участии клеток R. rhodochrous 1185 и R. erythropolis 416 проходит при температуре 50°С.

Для определения оптимального состава среды с максимальным сохранением амидазной активности использовали следующие варианты:

1. Питательный бульон LB;

2. Питательный бульон LB и 10 мМ ацетонитрил (АцН);

3. Питательный бульон LB и 10 мМ пропионамид (ПА);

4. Питательный бульон LB и 10 мМ ацетамид (АцА);

5. Синтетическая среда N, 0.1% раствор глюкозы в качестве источника углерода и 10 мМ АцН в качестве источника азота;

6. Синтетическая среда N, 0.1% раствор глюкозы в качестве источника углерода и 10 мМ ПА в качестве источника азота;

7. Синтетическая среда N, 0.1% раствор глюкозы в качестве источника углерода и 10 мМ АцА в качестве источника азота;

8. Синтетическая среда N и 10 мМ АцН в качестве источника азота и углерода;

9. Синтетическая среда N и 10 мМ ПА в качестве источника азота и углерода;

10. Синтетическая среда N и 10 мМ АцА в качестве источника азота и углерода;

Критерием отбора сред служили прирост биомассы и величина амидазной активности. В результате были отобраны питательный бульон LB с 10 мМ ацетонитрилом в качестве индуктора амидазы и минеральная среда N с добавлением 0.1% раствора глюкозы и 10 мМ ацетонитрила.

Исследовано влияние среды, на которой выращивалась культура, на процесс трансформации амида ибупрофена. Проведены трансформации различных концентраций субстрата при температуре 30 и 50°С (Таблица 14).

Установлено, что штамм R. rhodochrous 1185 наиболее активно трансформирует 2 мМ ибупрофенамид с образованием ибупрофена при повышенной температуре (50С). Небольшое содержание продукта реакции при низких концентрациях субстрата обусловлено его связыванием клетками.

При экстракции продукта с клетками и анализе убыли субстрата показано, что конверсия последнего при низких концентрациях проходила максимально полно.

Обнаружено также, что штамм 416 эффективно R. erythropolis трансформирует субстрат с высоким выходом продукта при начальной концентрации субстрата 1.5 мМ и при температуре 30С.

Таблица 14 – Количество вещества, образующегося при трансформации ибупрофенамида клетками R. rhodochrous 1185, мкмоль/мл

–  –  –

Snell D. и Colby J. описали полный гидролиз ибупрофенамида в концентрации 0,25 мМ в течение 17 часов при 30С (Snell, Colby, 1999). В сравнении с этим, при оптимальных условиях селекционированные нами штаммы трансформируют большую часть доступного субстрата в течение первых 6 часов биотрансформации.

Особенностью в процессах биотрансформации ароматических соединений в водной фазе, в частности, производных арилпропионовых кислот, является низкая растворимость как субстрата - нитрила или амида, так и продуктов биокатализа – целевого продукта. Вследствие этого скорость биотрансформации невелика по сравнению с процессами, не ограниченными растворимостью и массопереносом. В этом случае ограничение растворимости субстрата также не является существенной проблемой, т.к.

небольших растворённых концентраций достаточно для биокаталитической реакции, и в процессе синтеза по мере расходования происходит дорастворение субстрата, находящегося в реакционной среде в другой фазе – в виде суспензии или эмульсии, кристаллов или несмешивающейся жидкости.

Намного больше скорость гидролиза субстрата ограничивается растворимостью конечного продукта, являющегося слабой кислотой (у ибупрофена, например, рКа = 4,4).

Вследствие того, что растворимость кислот в воде в большой степени зависит от pH, этот показатель можно существенно увеличить. Так, растворимость ибупрофена при значении рН 1,2 составляет 0,038 мг/мл, при рН 4,5 - 0,084, рН 6,8 - 3,4, а при 8 – 14,8 мг/мл. Таким образом, если фермент способен работать в слабощелочных условиях, биокаталитическую реакцию рациональнее проводить в слабощелочной среде.

Исследовано влияние кислотности среды на протекание реакции биотрансформации ибупрофена. Трансформацию амидов арилпропионовых кислот проводили в водной среде (дистиллированная или деионизованная вода), либо калий-фосфатном буфере pH 7,9-8,6. Амид как субстрат вносили до концентрации 1-20 мг/мл. По мере трансформации добавляли новые порции субстрата. Так, начальная концентрация ибупрофенамида составляла 1 мг/мл. Клетки, как биокатализатор, добавляли в реакционную среду из расчёта 1 г сухого веса на 100 мл среды. Трансформацию проводили при температуре 30°С и перемешивании 100 об/мин.

При необходимости оценки активности биокатализатора реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 6 н HCl. Концентрацию продукта в надосадочной жидкости анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате получали раствор ибупрофена с концентрацией до 4.5 мг/мл.

В данных условиях проверена возможность использования в биокаталитическом процессе 6 штаммов, трансформирующих производные арилпропионовых кислот (Таблица 15).

Данная биотрансформация может быть использована для получения энантиомерно-чистых производных арилпропионовой кислоты.

Нетрансформированный R- энантиомер после рацемизации может быть повторно использован в процессе биотрансформации.

–  –  –

Показано, что клетки штамма R. erythropolis 25, выделенного из образцов грунта в 2 м от солеотвала и клетки штамма R. erythropolis 416 из лабораторной коллекции обладают более высокой конвертирующей способностью по сравнению с ранее известными штаммами. Возможно, это связано с оптимизацией условий реакции трансформации: более щелочная среда, способствующая повышению растворимости субстрата, что приводит к увеличению скорости реакции. Также важно отметить то, что наиболее активной группой бактерий в реакциях трансформации ибупрофенамида являются представители рода Rhodococcus, что согласуется с данными зарубежных коллег в опубликованных ранее работах (Snell, Colby, 1999;

Wieser, Nagasawa, 2000; Lievano et al., 2012).

–  –  –

14 Результаты получены совместно с сотрудниками Лаборатории Асимметрического Синтеза Института Органического Синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН под руководством д.х.м. Краснова В.П., г.

Екатеринбург и опубликованы в статье Чулаков Е. Н., Левит Г. Л., Тумашов А. А. Луговская, Н. П., Ремезовская Н. Б., Максимов А. Ю., Демаков В. А., Краснов В. П. Энантиоселективный микробиологический синтез (S)-3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина / Известия Академии наук. Серия химическая. – 2015 – № 5 – С. 1097-1099.

Количество продуктов реакции определяли с помощью методов ВЭЖХ и ГХМС.

Показано, что гидролитическая активность в отношении Ac-DBF у ряда родококков выражается в значительной степени конститутивно: клетки, выращенные на полноценной среде LB при отсутствии субстрата или его структурных аналогов, достаточно активно его трансформировали. Однако при инкубации в присутствии субстрата выход продукта повышался в ряде случаев в 10 раз и более, что свидетельствует об индукции активности.

В экспериментах по трансформации рацемической смеси Ac-DBF получен препарат S-энантиомера 3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2H-[1,4] бензоксазина с энантиомерным избытком 98% (Таблица 18).

–  –  –

Установлено, что при повышении концентрации Ac-DBF выход продуктов биотрансформации для штаммов R.erythropolis 25 и 417 уменьшался в 2 и более раза. При дальнейшем увеличении концентрации (2000 мкг/мл) выход продукта падал, что, вероятно, связано с уменьшением растворимости субстрата и продукта реакции. Таким образом, оптимальной для трансформации концентрацией Ac-DBF является 100 мкг/мл.

Исследовано влияние среды культивирования на последующую трансформацию субстрата. При росте бактерий на минеральной среде с AcDBF в качестве ростового субстрата – источника углерода и энергии, активность культуры была сопоставима с таковой на варианте среды LB+ AcDBF.

Штаммы A. tumefaciens M1 и М3 не проявили высокой активности биоконверсии субстрата, содержание продукта не превышало 4,5% (Таблица 20).

–  –  –

Исследования показали, что наиболее стабильно трансформировал Ac-DBF штамм R. erythropolis 25 (Чулаков и др., 2015).

Изучено влияние среды культивирования на активность биотрансформации. Показано, что наибольшей активностью обладали клетки R. erythropolis 25, выращенные на минеральной среде N (Таблица 21).

–  –  –

Далее был проанализирован выход продукта биотрансформации субстрата клетками R. erythropolis 25, выращенными на среде N, в течение 5 суток с шагом в 24 ч. (Таблица 22).

–  –  –

24 100 12,4 11 48 100 44,6 30,8 72 99,0 69,2 40,9 96 99,2 77,8 43,7 120 98,8 76,4 43,7 Показано, что в течение 24-48 часов клетки штамма R. erythropolis 25 стереоселективно осуществляют гидролиз (S)-N-ацетил-3,4-дигидро-7,8дифтор-3-метил-2H-[1,4]бензоксазина, далее происходит незначительная трансформация (R)-энантиомера субстрата, максимальная конверсия субстрата наблюдалась через 96 часов.

Проведена сравнительная трансформация N-амидов фторированного и нефторированного производных дигидрометилбензоксазина (Таблица 23).

–  –  –

Показано, что при одинаковых условиях скорость биотрансформации нефторированного производного была в 2,35- 30 раз ниже, чем для Ac-DBF.

Проведен сравнительный анализ, полученных результатов по трансформации Ac-DBF с опубликованными ранее данными в литературе (Таблица 24).

Таблица 24 – Сравнение полученных данных по трансформации Ac-DBF с опубликованными ранее в литературе

–  –  –

(Miyadera, Imura, 1999) Обнаружено, что энантиомерный избыток в результате биотрансформации, катализируемой клетками штаммов R. erythropolis 7-1 и 25, выделенных из образцов почв Соликамского района, и клетками штаммов R. erythropolis 417 и В15 из лабораторной коллекции, был выше, чем у штаммов Bacillus sp. DSC 1012, Dabaryomyces sp. IAM 1637 и IFO 3330, ранее описанных А. Miyadera и А. Imura (Miyadera, Imura, 1999).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследовано биологическое разнообразие бактерий, способных активно метаболизировать амиды и нитрилы карбоновых кислот, содержащихся в образцах почв таёжной и степной зоны России: поверхностно-подзолистая супесчаная, дерново-карбонатная, дерново-луговая глеевая почвы, солодь, каштановая почва степной зоны, солончак, грунт 2 м от солеотвала, а также донные отложения рек Ива и Кама и донные отложения БОС г. Перми.

Исследованы наиболее богатые аэробными микроорганизмами верхние слои почв: дернина, гумусовый или элювиальный горизонт, образцы ризосферной зоны растений. Наибольшее количество гетеротрофных микроорганизмов обнаружено в образцах, отобранных из гумусового дернового горизонта (на глубине 5 см) дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением (2,931010 КОЕ). Много гетеротрофов содержалось также в пробах солончака, отобранных в Троицком заказнике Челябинской области (2,171010 КОЕ) и в пробах грунта в 2 м от солеотвала СКРУ-2 г. Соликамск (2,68109 КОЕ).

Вероятно, высокое содержание гетеротрофных микроорганизмов в грунтах с умеренным засолением, является нормальным явлением. Согласно литературным данным, солонцы и солончаки относятся к богатым почвам по обогащенности бактериями, высеваемыми на МПА (Даденко, Репях, 2006).

Большим количеством амид- и нитрилтрансформирующих бактерий (до 107 КОЕ/г сухой почвы) отличались пробы солончака, отобранные на территории Троицкого заказника Челябинской области, образцы из гумусового переходного горизонта дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением, Краснокамский р-н, а также пробы грунта отобранные в 2 м от солеотвала. Очевидно, что это соответствует образцам с наилучшим соотношением питательных веществ, солей, аэрации и увлажнения. Наличие большого количества амид- и нитрилгидролизующих бактерий в ассоциации с корневой системой растений может быть объяснено тем, что растения синтезируют и выделяют во внешнюю среду широкий спектр нитрильных соединений, в частности, которые являются промежуточными соединениями биосинтеза ауксина и аспаргиновой кислоты. (Howden, Preston, 2009;

O’Reilly, Turner, 2003; Pace, Brenner, 2001).

Доля бактерий, трансформирующих амиды и нитрилы, составляла от 0,05% (гумусовый дерновый горизонт дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением, глубина отбора проб – 5 см) до 48,1% (переходный горизонт дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением, глубина отбора проб 10 см) от общего числа гетеротрофов. Количество бактерий, трансформирующих амиды и нитрилы, в исследуемых почвах было сопоставимо. Преобладание амидтрансформирующих бактерий наблюдалось только в верхних слоях увлажненных почв (дерново-луговая, болотный солончак), что связано с увеличением количества аэробных грамотрицательных бактерий, для которых свойственна активная утилизация амидосоединений.

Фенилацетонитрил–утилизирующие бактерии представлены во всех типах почв. Наибольшее их количество обнаружено в образцах дерноволуговой почвы с повышенным увлажнением (3,68106), отобранных на глубине 5 см, а также в пробах подзолистой супесчаной почвы (6,25105).

Высокая степень встречаемости бактерий, вероятно, связана с тем, что растения продуцируют многие нитрильные соединения, в том числе и фенилацетонитрил (Banerjee et al., 2002; Howden, Preston, 2009; Chen et al., 2009).

Исследовали способность микроорганизмов к росту на алифатических (ацетонитрил, пропионамид) и более токсичных ароматических (бензонитрил, бензамид и фенилацетонитрил) субстратах в концентрации 10 мМ.

Установлено, что наиболее активно изоляты росли на минеральной среде с добавлением пропионамида в качестве источника азота. Наименьшей плотности исследуемые культуры достигали на средах с бензонитрилом, бензамидом и фенилацетонитрилом. Однако несколько штаммов (R. erythropolis 25, 26, Pseudomonas sp. 30ф, 31ф, 34ф, 35ф) активно росли как на средах с алифатическими, так и с ароматическими субстратами.

По совокупности морфологических признаков, результатов теста с КОН, метода окраски по Граму, стандартных хемотаксономических и биохимических тестов, ПЦР-анализа и секвенирования генов 16S РНК, установлено, что наибольшую часть активных изолятов составляли актинобактерии видов R. erythropolis (20%), R.rhodochrous (9%), а также рода (2%); среди грамотрицательных бактерий преобладали Arthrobecter представители P. fluorescens (7%), P. putida (8%), а также другие представители рода Pseudomonas и бактерии родов Agrobacterium – 2% и Acinetobacter – 3%.

Полученные данные подтверждают сообщения о том, что представители данных родов являются наиболее активными в отношении биотрансформации и биодеградации ароматических соединений (Демаков и др., 2007; Хоменков, 2008; Brandao et al., 2002; Cheng et al., 1997).

Показано, что культуры R. erythropolis 6РИ, R. erythropolis 7РИ, P. fluorescens 9нх и P. putida 10нх эффективно используют бензамид в качестве источника азота. Наиболее активное использование бензонитрила наблюдалось у R. erythropolis 3н и P. рutida 10нх.

Исследовано проявление нитрилгидратазной активности по отношению к акрилонитрилу в процессе роста изолятов на 10 мМ ацетонитриле. У штаммов R. erythropolis 5212 и 7-1 не обнаружено детектируемой нитрилгидратазной активности, что, возможно, связано с метаболизмом субстрата посредством нитрилазы. Штаммы R. rhodochrous 1185, sp. 35ф, 13, 26 проявили высокую Pseudomonas R. erythropolis нитрилгидратазную активность, которая была максимальна после 24 часов роста. После выхода культуры в стационарную фазу наблюдалось резкое снижение каталитической активности.

Изучена зависимость амидазной активности по отношению к акриламиду от стадии роста культур на 10 мМ ацетонитриле. Высокая амидазная активность была выявлена у штаммов R. rhodochrous 1185, R. erythropolis 416, 6РИ, P. fluorescens 9нх. Для данных культур характерно совместное действие нитрилгидратазы и амидазы в первые сутки культивирования и снижение активностей при выходе в стационарную фазу роста. Штаммы R. rhodochrous 38, R. erythropolis 37, 25 проявляли активность на 3 сутки роста. Незначительную амидазную активность проявляли R. erythropolis 13, В15, 26, R. rhodochrous 12и и R. fascians 21и.

Показано, что штаммы R. rhodochrous 1185, 43, R. erythropolis 416, 43 и A. guillouiae 22ио имеют высокие значения амидазной активности. Для этих штаммов бактерий было характерно повышение амидазной активности при 50°C, что говорит о термостабильности фермента. Также обнаружено снижение активности при выходе культур в стационарную фазу роста.

Как известно, для бактерий характерны два основных пути метаболизма нитрилов: нитрилазный и нитрилгидратазный/амидазный. По результатам ПЦР-анализа обнаружены гены, кодирующие ферменты нитрилгидратазу и амидазу. Установлено, что гены субъединиц Fe-зависимой нитрилгидратазы присутствуют в геноме всех активных штаммов родококков. У всех представителей видов R. rhodochrous и R. erythropolis обнаружены последовательности энантиоселективных амидаз, гомологичные ферменту из R. rhodochrous N-774, а у штамма R. erythropolis B15 детектированы последовательности, гомологичные генам амидазы и нитрилазы из штамма R. rhodochrous J1. У культур R. erythropolis 25 и 26 обнаружена нитрилаза, родственная ферменту из R. rhodochrous К22.

Гены кобальтсодержащих ферментов не обнаружены ни у одной из исследуемых культур. Полученные данные сопоставимы с литературой в том, что данный фермент встречается значительно реже, чем нитрилгидратаза, содержащая железо (Астаурова и др, 1991; Brandao et al., 2002; Максимов и др., 2003; Перцович и др., 2005; Демаков и др., 2007).

При изучении культур почвенных плесневых грибов, трансформирующих нитрилы, было обнаружено, что они проявляют выраженную нитрилазную активность. При этом активность по отношению к акрилонитрилу составляла лишь 32% от таковой по отношению к бензонитрилу, о чем ранее сообщалось в литературе по нитрилазам мицелиальных грибов (O’Reilly, Turner, 2003). Лишь часть культур плесневых грибов, способных к утилизации нитрилов и амидов, показали высокую нитрилгидратазную и нитрилазную активности. Это может быть связано с тем, что невысокая активность фермента достаточна для питания клетки.

Культура F. oxysporum проявляла высокую нитрилазную активность по отношению к бензонитрилу, достигающую 5,1 мкмоль/мг/мин, что превышает активность ранее известных культур плесневых грибов (Yusuf et al., 2013).

Показано, что в процессе роста исследуемые культуры плесневых грибов проявляют выраженную способность к гидролизу ароматических и алифатических амидов и нитрилов. Однако при длительной инкубации они не накапливают в среде продукты трансформации нитрилов и амидов и могут быть использованы для полной биодеградации этих соединений.

Установлено, что культивирование всех исследуемых штаммов родококков на среде с бензонитрилом или бензамидом в качестве ростового субстрата приводит к резкому падению нитрилгидратазной активности до уровня, близкого к пределу чувствительности метода анализа, что также было отмечено ранее для других штаммов (Демаков и др., 2008). Наблюдалось координированное подавление активности как нитрилгидратазы, так и амидазы использованными субстратами до уровня ниже 1 мкмоль/мг/мин.

При этом активность культур, выращенных в других условиях, а также активность ферментных препаратов не снижалась или подавлялась в меньшей степени. Полученные данные свидетельствуют в пользу механизма репрессии оперона или регулона, контролирующего гены нитрилгидратазы и амидазы на уровне транскрипции. Остаточного уровня активности достаточно для трансформации бензамида и бензонитрила, использования их в качестве источника азота. Наиболее активное использование бензонитрила в качестве источника азота наблюдалось у R. erythropolis 3н среди грамположительных бактерий и у P. рutida 10нх среди грамотрицательных. Таким образом, исследуемые штаммы могут быть использованы для утилизации бензонитрила и бензамида, однако их детектируемая активность при этом низка.

Установлено, что амидаза характеризуется достаточно высокой термостабильностью, не характерной для большинства ферментов мезофильных организмов. Высокая активность сохранялась в интервале температуры от 55° до 65°, подобные закономерности были описаны рядом авторов (Cowan et al., 1998; Kotlova et al., 1999; Fournand, Arnaud, 2001;

Максимов и др., 2003; Павлова, 2012; Bhatia et al., 2013; Mehta et al., 2013).

При изучении влияния кислотности среды нами установлено, что амидазная активность максимальна при рН=7. В то же время максимальная скорость гидролиза ибупрофенамида наблюдалась при pH 8,3, что, вероятно, связано со значительным увеличением его растворимости в щелочной среде. Таким образом, если фермент способен работать в слабощелочных условиях, биокаталитическую реакцию рациональнее проводить в слабощелочной среде.

Проведены эксперименты по биотрансформации 2-(4-изобутилфенил)пропионамида или ибупрофенамида. Наиболее активно трансформируют амид ибупрофена штаммы A. tumefaciens M1, R. erythropolis 25, 416, R. rhodochrous

1185. Выход продукта составлял более 46% за 6 часов биокаталитической реакции в слабощелочных условиях при 30°С.

Snell D. и Colby J. описали полный гидролиз ибупрофенамида при концентрации 0,25 мМ в течение 17 часов при 30С (Snell, Colby, 1999). Нами была проведена серия опытов с различными концентрациями субстрата и температурами. Установлено, что штаммы родококков более активно трансформировали амид при 50°С: в результате трансформации 2 мМ ибупрофенамида выход S-энантиомера ибупрофена составлял более 95%.

Обнаружено, что клетки штамма R. erythropolis 25, выделенного из образцов грунта с солеотвала, и клетки штамма R. erythropolis 416 из лабораторной коллекции обладают более высокой конвертирующей способностью (48%) по сравнению с известными штаммами (до 47%) (Snell, Colby, 1999; Wieser, Nagasawa, 2000; Bauer et al., 1994; Yamamoto, Komatsu, 1991; Beard et al., 1993). Возможно, это связано с более щелочными условиями реакции трансформации, в которых растворимость субстрата становится выше. Также важно отметить то, что наиболее активной группой бактерий в реакциях трансформации ибупрофенамида являются представители рода что подтверждает сообщения зарубежных коллег в Rhodococcus, опубликованных ранее работах.

Известно, что некоторые ациламидазы родококков способны гидролизовать также N-амиды (Лавров и др., 2010). В проведенных нами экспериментах по трансформации N-амида – рацемической смеси N-ацетилдигидро-7,8-дифтор-3-метил-2H-[1,4] бензоксазина (Ac-DBF) получен препарат 3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2HS-энантиомера [1,4] бензоксазина с энантиомерным избытком 98%. Высокую активность проявили штаммы R. erythropolis 25, 7-1, 417, B15, R. rhodochrous 43.

Наибольшей активностью обладали клетки R. erythropolis 25, выращенные на минеральной среде N.

В результате сравнительной трансформации N-амидов фторированного и нефторированного производных дигидрометилбензоксазина обнаружено, что при одинаковых условиях скорость биотрансформации нефторированного производного была в 2,35- 30 раз ниже, чем для Ac-DBF.

Обнаружено, что энантиомерный избыток в результате биотрансформации Ac-DBF клетками штаммов R. erythropolis 7-1 и 25, выделенных из образцов почв Соликамского района и клетками штаммов R. erythropolis 417 и В15 из лабораторной коллекции, был выше, чем у известных штаммов Bacillus sp. и Dabaryomyces sp., описанных ранее А. Miyadera и А. Imura (Miyadera, Imura, 1999).

Таким образом, в результате проведенного скрининга выделены высокоактивные штаммы, обладающие способностью к биокаталитической трансформации ароматических амидов и N-амидов. Определены оптимальные условия реакции биотрансформации амида ибупрофена и Ac-DBF, которые могут быть применены для синтеза фармацевтических препаратов, таких как (S)-ибупрофен и предшественников левофлаксацина.

ВЫВОДЫ

1. Бактерии, трансформирующие амиды и нитрилы, обнаружены во всех исследованных образцах почв и донных отложений в количестве 105-107 КОЕ/г сухого вещества, что составляет до 48% от общего числа гетеротрофов.

Большую часть активных изолятов составляли представители родов бактерий Rhodococcus, Pseudomonas Agrobacterium, Acinetobacter и грибов – Fusarium.

2. Нитрилтрансформирующие культуры почвенных плесневых грибов проявляли выраженную нитрилазную активность, специфичную к бензонитрилу и при длительной инкубации были способны к полной утилизации ароматических и алифатических нитрилов и амидов. Выделен штамм Fusarium oxysporum, обладающий высокой нитрилазной активностью (5,1 мкмоль/мг/мин), что превышает активность ранее известных культур плесневых грибов.

3. Показано, что в геноме всех активных штаммов Rhodococcus присутствуют гены Fe-зависимой нитрилгидратазы и энантиоселективных амидаз, в 4 штаммах R. erythropolis обнаружены последовательности, гомологичные генам нитрилаз.

4. Селекционированы высокоактивные штаммы 416, 25, R. erythropolis энантиоселективно трансформирующие амид ибупрофена, и определены оптимальные условия реакции (рН 8,3, Т=30°С), при которых выход S-энантиомера ибупрофена составляет более 95%.

5. Селекционированы штаммы бактерий R. erythropolis В15, 7-1, 25, 417, способные к энантиоселективной конверсии рацемического N-ацетил-3,4дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2H-[1,4] бензоксазина с образованием S-энантиомера cо значением конверсии – до 50% и энантиомерным выходом более 99%.

Показана эффективность их использования в качестве биокатализаторов для синтеза предшественника левофлоксацина.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Агрономов А.Е. Избранные главы органической химии: учеб. для вузов / А.Е. Агрономов // Москва: Химия, 1990. – 560 с.

2. Артеменко А.И. Органическая химия: учебн. пособие для студентов нехим. спец. вузов / А.И. Артеменко // Москва: Высшая школа, 2005.

– 605 с.

3. Астаурова О.Б. Регуляция биосинтеза ферментов биодеградации нитрилов у М0 / О.Б. Астаурова, Rhodococcus rhodochrous Т.Е. Погорелова, О.Р. Фомина и др. // Биотехнология. – 1991. – Вып.

5. – C. 10-14.

4. Жуков Д.М. Закономерности функционирования углеводородокисляющих микроорганизмов при биоремедиации нефтяных загрязнений: автореферат дисс. канд. хим. наук: 03.00.23, / Д.М. Жуков // Москва, 2007. – 24 c.

5. Даденко Е.В. Биологическая активность почв юга России [Электронный ресурс] / Е.В. Даденко, М.А. Репях // Степи Северной Евразии: Матер.

IV Междунар. Симпоз. – 2006. URL: http://oren-icn.ru/index.php/enzoren/ stepene/129-steppenecat/792-2012-01-25-07-58-20 (дата обращения 10.06.2014)

6. Демаков В.А. Биологическое разнообразие нитрилметаболизирующих бактерий антропогенно-измененных почв Пермского края / В.А.

Демаков, А.Ю. Максимов, М.В. Кузнецова и др. // Экология. – 2007. – № 3. – С. 1-6

7. Демаков В.А. Утилизация нитрилов и амидов штаммом Rhodococcus erythropolis Е84 / В.А. Демаков, А.Ю.Максимов, М.В.Кузнецова, Г.В.

Овечкина // Вестник пермского университета. Сер. Биология. – 2008 – Вып. 9(25). – С 48-52.

8. Демаков В.А., Максимов А.Ю., Аликин В.Н. и др. Штамм бактерий Rhodococcus ruber – продуцент нитрилгидратазы // Патент на изобретение РФ №2196822. Зарегистр. 10.02.2004.

9. Долгих Н.П. Биотрансформация ибупрофенамида штаммом Rhodococcus rhodochrous / Н.П. Долгих, К.С. Фролкова, А.Ю. Максимов, В.А.

Демаков // Вестник Уральский медицинской академической науки. – 2011 – №4/1 – С.193-194

10. Ившина И.Б., Пшеничнов Р.А., Оборин А.А. Пропанокисляющие родококки / И.Б. Ившина, Р.А. Пшеничнов, А.А. Оборин // Свердловск:

УНЦ АН СССР, 1987. – 126 с.

11. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения / Ю.Н. Карасевич // Москва:

Наука, 1982. – 144 с.

12. Кузнецов А.Е. Научные основы экобиотехнологии: Учебное пособие для студентов / А.Е. Кузнецов, Н.Б. Градова // Москва: Мир, 2006. – 504 с.

13. Клонирование ДНК. Методы / под ред. Д. Гловера – Москва: Мир, 1988.

– 538 с.

14. Кузнецова М.В. Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода Rhodococcus - продуцентов нитрилгидратазы: дисс. … канд. биол.

наук: 03.00.07 / Кузнецова Марина Валентиновна. – П., 2004. – 123 с.

15. Лавров К.В. Новая ациламидаза из Rhodococcus erythropolis ТА37, способная гидролизовать N-замещенные амиды / К.В. Лавров, И.А.

Залунин, Е.К. Котлова и др. // Биохимия. – 2010. – Т.75. – вып.8. – С.

1111-1119.

16. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // Москва: Высшая шк., 1990. – 352 с.

17. Максимов А.Ю. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp. gt1 / А.Ю.

Максимов, М.В. Кузнецова, Г.В. Овечкина и др. // Прикл. биохим.

микробиол. – 2003. – Т. 39. – № 1. – С. 63-68.

18. Методы общей бактериологии / Пер. с англ.; под ред. Ф. Герхардт и др.

Москва: Мир, 1983. – Том 1, 2, 3.

19. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред.

Д.Г. Звягинцева. Москва: МГУ, 1991. – 304 с.

20. Наумова Р.П. Микробный метаболизм неприродных соединений / Р.П.

Наумова // Казань: Издат. Казанск. ун-та, 1985. – 240 с.

21. Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М.

Ногина // Киев: Наукова думка, 1985. –336 с.

22. Нестеров П.В. Итоги науки и техники. Деструкция токсичных органических соединений микроорганизмами / П.В. Нестеров // Москва:

ВИНИТИ, 1991. – 100 с.

23. Определитель бактерий Берджи / Пер. с англ.; под ред. Дж. Хоулта и др.

М.: Мир, 1997. – Т. 1, 2.

24. Павлова Ю.А. Актинобактерии рода Rhodococcus, трансформирующие амиды карбоновых кислот: дисс. … канд. биол. наук: 03.00.07 / Павлова Юлия Андреевна. Пермь, 2012. – 129 с.

25. Перцович С.И. Алифатическая амидаза Rhodococcus rhodochrous – представитель семейства нитрилаз/цианидгидратаз / С.И. Перцович, Д.Т. Гуранда, Д.А. Подчерняев и др.// Биохимия. – 2005. – Т. 70. – № 11.

– С. 1556-1565.

26. Пунтус И.Ф. Деградация фенантрена бактериями родов Pseudomonas и Burkholderia в модельных почвенных системах / И.Ф. Пунтус, А.Е.

Филонов, Л.И. Ахметов и др. // Микробиология. – 2008. – Т.77. – №1. – С. 11-20.

27. Рабинович В.А. Краткий химический справочник: справ. изд. / В.А.

Рабинович, З.Я. Хавин; под ред. А.П. Потехина, А.И. Ефимова // 3-е изд., перераб. и доп. Ленинград: Химия, 1991. – 432 с.

28. Сейц И.Ф., Князев П.Г. Молекулярная онкология: Практическое руководство / И.Ф. Сейц, П.Г. Князев. // Москва: Биология, 1986. – 236 с.

29. Смирнов В.Н. Селекция промышленных штаммов микроорганизмов для биодеградации соединений фенольного ряда в газовоздушных и водных потоках / В.Н. Смирнов, М.В. Скрябин, А.Ю. Винаров // Биотехнология.

– 2002. – Вып. 3. – С. 67-79.

30. Соломенный А.П. Генетическое разнообразие Acinetobacter baumannii в отделении ожоговой реанимации / А.П. Соломенный, Р.Х. Яфаев, А.Е.

Гончаров и др. // Микробиология. – 2006. – №1. – С. 76-79.

31. Форстер К.Ф. Экологическая биотехнология: учеб. для вузов./ К.Ф.

Форстер, Д.А. Дж. Вейз // Л.: Химия, 1990. – 382 с.

32. Химия. Большой энциклопедический словарь / под ред. И.Л. Кнунянц. // Москва: Большая Российская энциклопедия, 1998. – 792 c.

33. Хоменков В.Г. Использование методов геносистематики для изучения видового состава и метаболического потенциала микроорганизмовдеструкторов ароматических ксенобиотиков:

Автореферат дисс. канд.

биол. наук: 03.00.04 / В.Г. Хоменков // Москва, 2005. – 23 с.

34. Хоменков В.Г. Организация метаболических путей и молекулярногенетические механизмы биодеградации ксенобиотиков у микроорганизмов (обзор) / В.Г. Хоменков // Журн. прикл. биохим.

микробиол. – 2008. – Т. 44. – Вып. 8. – С. 133-152.

35. Чарушин В.Н. Новые методологии органического синтеза / В.Н.

Чарушин, О.Н. Чупахин // Вестник Российской Академии Наук. – 2007.

– Т. 77. – №5. – с. 403-408.

36. Четина О.А. Нитрилгидратазная активность почвенных микромицетов в процессе биотрансформации производных карбоновых кислот / О.А.Четина, И.О. Крылова, И.Н. Кирьянова, А.Ю. Максимов, Н.П.

Долгих // Вестник Уральской медицинской академической науки. –2011

– №4/1 – С.205-206.

37. Чулаков Е. Н. Энантиоселективный микробиологический синтез (S)-3,4дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина / Е. Н. Чулаков, Г.Л.

Левит, А.А. Тумашов, Н.П. Луговская и др. // Известия Академии наук.

Серия химическая. – 2015 – № 5 – С. 1097-1099.

38. Швец В.Ф. Совершенствование химических производств / В.Ф. Швец // Химия. – 1997. – С. 49-55.

39. Alcntara A.-R. Сhemoenzymatic preparation of enantiomerically pure S(+)Arylpropionic acids with anti-inflammatory activity / A.-R Alcntara, Snchez-Montero, J.-M. Jose-Vicente Sinisterra // Marcel Dekker. – 2000. – P. 659-702.

40. Amarant T. Substrates and inhibitors of nitrile hydratase and amidase of Corynebacterium nitrophilus / T. Amarant, Y. Vered, Z. Bohak // Biotechnol.

Appl. Biochem. – 1989. – V. 11. – P. 49-59.

41. Arnaud A. Remarques sur l'activite nitrilasique de quelques bacteries / A.

Arnaud, P. Galzy, J.-C Jallageas // Cm. Acad. Sci. – 1976. – V. 283. – P. 571Baggi G. Isolation of a Pseudomonas stutzeri strain that degrades o-xylene / G. Baggi et al. // Appl. Environ. Microbiol. – 1987. – V. 53. – P. 2129-2132.

43. Banerjee A. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects / A. Banerjee, R. Sharma, U.C. Banerjee // Appl. Microbiol.

Biotechnol. – 2002. – V. 60. – P. 33-44.

44. Bhatia R. K. Bench scale production of benzohydroxamic acid using acyl transfer activity of amidase from Alcaligenes sp. MTCC 10674 / R. K.

Bhatia, S. K. Bhatia, P. K. Mehta et. al. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2013. – V. 40. – P. 21-27.

45. Bauer R. Enantioselective hydrolysis of racemic 2-phenylpropionitrile and other (R,S) 2-arylpropionitriles by a new bacterial isolate, Agrobacterium tumefaciens strain d3 / R. Bauer, B. Hirrlinger, N. Layh et al. // Appl.

Microbiol. Biot. – 1994. – V. 42. – P. 1-7.

46. Bauer R. Enantioselective hydration of 2-arylpropionitriles by a nitrile hydratase from Agrobacterium tumefaciens strain d3 / R. Bauer, H.-J.

Knackmuss, A. Stolz // Appl. Microbiol. Biot. – 1998. – V. 49. – P. 89-95.

47. Beard T. M. Enantioselective biotransformations using rhodococci / T.M.

Beard // J. Antonie Van Leeuwenhoek. – 1998. – V. 74. – P. 99–106.

48. Brady D. Green chemistry: Highly selective biocatalytic hydrolysis of nitrile compounds / D. Brady, N. Dube, R. Petersen // S. Afri. J. Sci. – 2006. – V.



Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Похожие работы:

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Вахшех Имад Наваф Найф УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЗАЩИТЫ ЯБЛОНИ И ГРУШИ ОТ ПАРШИ Специальность 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Белошапкина Ольга Олеговна, д.с.-х.н., профессор Москва 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ПО...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«Серёгин Сергей Викторович Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович...»

«ЕГОРОВА Ангелина Иннокентьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У МУЖЧИН КОРЕННОЙ И НЕКОРЕННОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ ЯКУТИИ В РАЗНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Д.К....»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«САМБУУ Анна Доржуевна СУКЦЕССИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ В ТРАВЯНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ТУВЫ 03.02.01 – «Ботаника» 03.02.08 – «Экология» Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант – доктор биологических наук, профессор А.А. Титлянова Кызыл – 2014 СОДЕРЖАНИЕ Введение... Глава 1....»

«ШАЯХМЕТОВ МАРАТ РАХИМБЕРДЫЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ПОЧВЕННОГО ПОКРОВА ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ НА ОСНОВЕ ДИСТАНЦИОННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ ЗЕМЛИ 03.02.13 – почвоведение Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Л.В. Березин Уфа...»

«Казарина Ольга Витальевна Научное обоснование совершенствования фониатрической помощи в Российской Федерации 14.01.03 – Болезни уха, горла и носа 14.02.03 – Общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Дайхес Н.А. доктор...»

«НИКИТИНА ЕКАТЕРИНА ГЕННАДЬЕВНА ПАТТЕРН ЭКСПРЕССИИ микроРНК ПРИ ПРЕДОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И РАКЕ ГОРТАНИ 14.01.12 – онкология (биологические науки) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н. Литвяков Н.В. Томск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений Введение ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общая информация...»

«Проскурякова Лариса Александровна НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ СОХРАНЕНИЯ ЗДОРОВЬЯ...»

«Кошелева Оксана Владимировна НАЕЗДНИКИ СЕМЕЙСТВА EULOPHIDAE (HYMENOPTERA, CHALCIDOIDEA) СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ СО СПЕЦИАЛЬНЫМ ОБСУЖДЕНИЕМ ПОДСЕМЕЙСТВА TETRASTICHINAE 03.02.05 – энтомология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, С. А. Белокобыльский Санкт-Петербург...»

«МУСТАФАЕВ РОВШАН ДЖАЛАЛ ОГЛЫ «СОВРЕМЕННЫЕ ЛАЗЕРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ЛЕЧЕНИИ ПЕРИТОНИТА» (Экспериментально-клиническое исследование) Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности–14.01.17 хирургия Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Гейниц А.В. Москва 2014 СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«ТРИФОНОВА Кристина Эдуардовна Особенности распределения штамма мезенхимальных стволовых клеток в условиях опухолевого роста после сингенной трансплантации мышам линии C57BL/6 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата...»

«Миронов Андрей Викторович КОРРЕКЦИЯ АККОМОДАЦИОННЫХ НАРУШЕНИЙ У ПАЦИЕНТОВ ЗРИТЕЛЬНО-НАПРЯЖЕННОГО ТРУДА МЕТОДАМИ ФИЗИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ 14.01.07 – глазные болезни 14.03.11 восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура, курортология и физиотерапия Диссертация на...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Борисов Станислав Юрьевич Морфологические изменения во внутренних органах крыс при воздействии нано-, микрои мезоразмерных частиц цеолитовых туфов 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«Галкин Алексей Петрович ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Специальность 03.02.07 – генетика диссертация на соискание учной степени доктора биологических наук Научный консультант: Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.