WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АРОМАТИЧЕСКИЕ АМИДЫ И НИТРИЛЫ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Некоторые производные пропионовой кислоты, такие как кетопрофен, ибупрофен и напроксен имеют один асимметричный атом углерода в молекуле. Известно, что только S-изомер ибупрофена имеет терапевтическую значимость, в то время как кетопрофен находит применение в Rконфигурации (Ladik, Szekeres, 2006; Stock et al., 1991; Alcantara et al., 2000).

Тем не менее, только напроксен, декскетопрофен, флюноксапрофен и торадол имеются в продаже в виде активного энантиомера (Alcantara et al., 2000).

Таким образом, использование одного изомера из рацемической смеси является важным элементом разработки лекарственных средств (Lennard, 1991). Фармацевтические компании осознают, что новые препараты должны быть гомохиральными, чтобы избежать возможности возникновения побочных эффектов из-за нежелательных стереоизомеров (Patel, 2000; Csuk, 2006).

Ферменты представляют собой хиральные молекулы, и многие реакции, катализируемые ими, проходят с образованием хирально чистых продуктов.

Если выбирать между коммерчески доступными ферментами различной чистоты, сырым ферментным препаратом, выделенным из органов животных или клеток микроорганизмов, и целыми клетками, то последние имеют ряд преимуществ. Они удобны в использовании и являются стабильным источником ферментов, которые синтезируются клетками в ответ на присутствие субстрата. В случае, когда большая ферментная активность необходима для одного субстрата, такая как D-гидантоиназная и карбомилазная активность для получения D-аминокислот из соответствующих гидантоинов, использование целых клеток в качестве биокатализаторов не может быть заменено изолированными ферментами. Также, в связи с ограниченной устойчивостью изолированных ферментов и необходимостью соблюдения определенных условий и повторного использования кофактора, окислительные и восстановительные реакции проводятся цельноклеточными препаратами. Одной из особенностей, которая делает цельноклеточные биокатализаторы более привлекательным, является то, что они генерируют фермент и кофакторы вместе с катализаторами, поэтому они особенно удобны в использовании (D’Arrigo et al., 2000).

Однако применение целых клеток для разделения рацемической смеси подходит только для работы в водной среде, поскольку клетки разрушаются органическими растворителями.

Таким образом, биокатализаторы на основе клеточной биомассы могут быть использованы для разделения рацемических нитрилов, сложных эфиров или амидов в гидролитической форме, но бесполезны для этерификации и амидирования в органических растворителях, где эфиры и кислоты этих липидных соединений растворяются. Следовательно, условия эксперимента имеют решающее значение для выбора оптимального биокатализатора (Alcantara et al., 2000).

Первые патенты, касающиеся кинетического разложения рацемических 2-арилпропионитрилов покоящимися клетками или Brevibacterium Corynebacterium, были зарегистрированы в конце 1980-х годов. Большинство микроорганизмов, таких как R. butanica, R. equi A4 и R. rhodochrous NCIMB 11216, гидролизуют рацемический субстрат с выходом напроксена энантиомерной чистотой 95-98%. Для улучшения производительности использовали рекомбинантный ген нитрилазы Alcalinegens fecalis, экспрессированный в E. coli. Наличие эстераз или амидаз во многих микроорганизмах также используется для разделения рацемических смесей эфиров или амидов данных препаратов (Torrelo et al., 2015). В этом смысле, эстеразы Kluyvera oxytoca SNSM 87 и B. subtilis были успешно использованы для разделения рацемических эфиров, в то время как, R. erythopolis MP50 был применен для разделения амида (R, S-2-(6-метокси-2-нафтил)пропионовой кислоты с выходом 48% напроксена с энантиомерной чистотой 99% после 45 часов (Alcantara et al., 2000).

Большинство исследований по энантиоселективной биотрансформации нитрилов на данный момент сосредоточены на -арилпропионитрилах, потому что их легко получить, и они имеют большое значение, поскольку продуктом их гидролиза являются -арилпропионовые кислоты, производные которых являются нестероидными противовоспалительными средствами (НПВС). Амидазы почти во всех микроорганизмах, таких как R. rhodochrous IFO 15564, Rhodococcus sp. 361, R. equi TG328, Rhodococcus sp. AJ270, Rhodococcus sp. CGMCC 0497 и R. equi A4 показывают хорошую S-энантиоселективность от -арилпропиоамидных субстратов, в то время как нитрилгидратазы из различных источников показывали низкую R- или S-энантиоселективность, либо ее отсутствие вообще. Энантиоселективность нитрилгидратазы находится под сильным влиянием заместителей бензольного кольца нитрильных субстратов.

Например, нитрилгидратаза R. rhodochrous IFO 15564 показывает низкую R-энантиоселективность в отношении 2-(4'-изобутилфенил)-пропионитрила (ибупрофеннитрила),а нитрилгидратаза R. equi A4 имеет умеренную S-энантиоселективность в отношении 2-(4'-хлоро- и 4'метоксифенил)-пропионитрилов, в то время как нитрилгидратаза Rhodococcus sp. 361 показывает R-, S- и отсутствие селективности ибупрофеннитрила, 2-(4'метилфенил)-пропионтрила и 2-фенилпропионитрила, соответственно.

Исследования Rhodococcus sp. CGMCC 0497, катализирующего гидролиз

-арилпропионитрилов, показали, что полный гидролиз нитрилов идет с выходом оптически активных S-карбоновых кислот и R-карбоксамидов. Были получены энантиомерные выходы как хорошие, так и отличные, из

-арилпропионитрильных субстратов в пара- и метаположении, независимо от природы заместителя, в то время как ортозамещенные аналоги привели только к умеренной энантиоселективности (Wang, 2005; Martinkova, 2002).

Влияние заместителей на энантиоселективную биотрансформацию ароматических амидов и нитрилов.

Введение аллильной группы в -позицию арилацетонитрилов приводит к повышению скорости конверсии по сравнению с -этил- и -изопропилзамещенных аналогов. Биотрансформация -аллил-фенилацетонитрила проходит эффективно с получением S-кислоты и R-амида с энантиомерной чистотой более 99%. Rhodococcus sp. AJ270 катализирует реакцию -аллиларилацетонитрила независимо от положения заместителей бензольного кольца. В этом случае, хотя скорость реакции была ниже, чем у предшественников - -аллилфенилацетонитрила, почти со всеми субстратами были получены продукты с высоким выходом, с отличными значениями энантиомерной активности, за исключением 2-(2-метилфенил)-4-пентеннитрила с ортозамещением бензольной части (Wang, 2005). Результаты биокаталитического кинетического разделения амидов и стереохимических восстановленных нитрилов показывают комбинированный эффект высокой селективности S-амидазы и низкой селективности нитрилгидратазы, с доминирующей амидазой (Shen et al., 2012; Choi et al., 2008; Wang et al., 2010;

Trott et al., 2002; Chen et al., 2009). Применение такой энантиоселективной биотрансформации было показано для синтеза промежуточных лактонов и R-(-)-баклофена (Wang, 2005).

В биотрансформации различными нитрилгидролизующими микроорганизмами или ферментами было использовано несколько нитрилов в качестве рацемических субстратов, главным образом в -гидрокси- и

-аминозамещениях. Однако результаты энантиоселективности были плохими. Возможно, это связано с тем, что ферменты показывают низкую эффективность хирального центра по сравнению с субстратами. Только в нескольких случаях реакции дают практическую полезность энантиоконтроля.

Например, рацемический 3-бензоилоксипентаннитрил был трансформирован с помощью клеток R. rhodochrous IFO 15564 в R-3-бензоилоксипентанамид и S-3-бензоилоксипентановую кислоту с энантиомерной чистотой 96% и 55% соответственно. Энантиоселективность реакции обеспечивалась исключительно амидазой, в то время как нитрилгидратаза не была энантиоселективной (Wang, 2005; Chen et al., 2009).

Биотрансформация -гидроксинитрилов с R. rhodochrous IFO 15564 приводит к формированию -лактонов с умеренным выходом. Энантиомерная чистота продуктов была чрезвычайно мала (Wang, 2005).

1.8. Энантиоселективный гидролиз ибупрофенамида

Получение энантиомерно-чистых веществ традиционными химическими методами представляет собой трудноразрешимую задачу. Так, один из способов промышленного синтеза ибупрофена проходит в три стадии. Первая состоит в ацилировании изобутилбензола уксусным ангидридом в растворе жидкого фтористого водорода, который является растворителем и катализатором. Параллельно образуется уксусная кислота. Последующие реакции каталитического гидрирования и карбонилирования дают ибупрофен (Швец, 1997). В то же время известно, что многие ферменты обладают стереоселективностью, т.е. способны трансформировать лишь один стереоизомер в рацемической смеси.

Ибупрофен (производное арилпропионовой кислоты) - нестероидное противовоспалительное средство. Принадлежит к группе 2-арилпропионовых кислот, которые существуют в виде R- и S-энантиомеров (Рисунок 5) (Freer, 1993; Stock et al., 1991). Известно, что только S-ибупрофен имеет терапевтическую значимость, тогда как R-энантиомер неактивен (Graham, Williams, 2004).

(S)-ибупрофен (R)-ибупрофен Рисунок 5 – Структура энантиомеров ибупрофена (Freer, 1993) Субстратом для получения ибупрофена с помощью бактериальных ферментов могут служить нитрил, амид или эфир ибупрофена (Рисунок 6).

Биотрансформацию амида ибупрофена катализирует фермент амидаза (Alcntara et al., 2000; Freer, 1993).

Рисунок 6 – Пути ферментативной конверсии нитрила ибупрофена (Yamamoto et al., 1990) Авторами Snell D. и Colby J. было доказано, что штамм Rhodococcus sp.

AJ270 осуществляет частичный гидролиз 1,5 мМ ибупрофенамида при 30С в течение 2,5 часов. Полный гидролиз был описан при концентрации ибупрофенамида 0,25 мМ в течение 17 часов при 30С. При этом образуется S-изомер, и выход продукта составляет более 89.9% (Snell, Colby, 1999).

1.9. Энантиоселективный гидролиз N-ацетил- 3,4-дигидро-7,8дифтор-3-метил-2H-[1,4] бензоксазина Хиральные амины, в структуре которых аминогруппа находится вблизи асимметрического центра, являются ключевыми полупродуктами в синтезе практически важных органических соединений: антибиотиков, хиральных катализаторов, реагентов для разделения оптических изомеров в результате их дериватизации и пр. При этом стереоконфигурация и оптическая чистота имеют определяющее значение, как для избирательности протекания химических процессов, так и для проявления биологической активности.

В настоящее время большое внимание уделяется поиску и изучению стереоселективных ферментов и энантиоселективному биокаталитическому синтезу практически важных органических соединений. В частности, актуальным направлением является получение интермедиатов синтеза фторхинолонов, таких как левофлоксацин (Miyadera, Imura, 1999).

Важным интермедиатом в синтезе левофлоксацина является (S)-3,4дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2H-[1,4] бензоксазин. В присутствии микроорганизмов рода Bacillus был получен S-амин с высокой энантиомерной чистотой 99% (Miyadera, Imura, 1999).

В Институте органического синтеза УрО РАН разработан метод получения левофлоксацина, в основе которого лежит кинетическое разделение энантиомеров бензоксазина (Рисунок 7):

Рисунок 7 – Метод получения левофлоксацина на основе кинетического разделения энантиомеров бензоксазина Этот метод запатентован в Японии, Южной Корее и России. Найдены хиральные агенты, которые вступают в реакцию с одним из энантиомеров бензоксазина в 10 раз быстрее, чем с другим, что позволяет достичь их эффективного разделения. Расчёты показывают, что это связано с определённой пространственной ориентацией переходных комплексов и различиями в их энергетических характеристиках (Чарушин, Чупахин, 2007).

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования Объектом исследования являлись почвенные микроорганизмы таёжной и степной зоны России, имеющие нитрилконвертирующую ферментативную активность, выделенные из образцов почв естественной среды Пермского края, Челябинской и Саратовской областей, а также донных отложений рек Ива и Кама, и биологических очистных сооружений г. Перми. Также использовали штаммы из коллекции лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН (R. rhodochrous 1185, R. erythropolis 416, 417, B15).

Культуры почвенных плесневых грибов выделены и исследованы совместно с сотрудниками НИЛ «Бактерицид» ЕНИ ПГНИУ.

Исследовали микрофлору почв естественной среды таежной зоны Пермского края и степной зоны Челябинской и Саратовской областей. Почвы таежной зоны Пермского края:

Аллювиальная луговая почва формируется в поймах рек. Образуется под лугово-болотное растительностью и ивняками; почвообразующими породами для них служат слоистые и неяснослоистые аллювиальные отложения в основном суглинистого и глинистого механического состава.

Образцы отбирали из гумусового горизонта с глубины 10 см. Кислотность среды от слабокислой до нейтральной.

Дерново-луговые почвы сформированы под злаково-разнотравными и высокотравными лугами и белоберезовыми кустарнико-травяными лесами на высоких надпойменных террасах. Образцы отбирали из гумусового горизонта с глубины 5, 10 см и переходного горизонта, 25 см. Кислотность от слабокислой до нейтральной.

Подзолистая почва сформирована под сосновыми лесами на породах легкого гранулометрического состава, основа супесчаная. Для исследований брали образцы из гумусово-элювиального горизонта с глубины 10 см.

Каштановая почва степной зоны, Саратовская область. Сформирована на сухих степных участках в условиях недостаточного увлажнения и бедной растительности. Образцы отбирали из гумусового горизонта с глубины 10 см.

Кислотность среды от нейтральной до слабощелочной (pH 7,0—7,4).

Исследовательской группой кафедры физиологии растений и микроорганизмов ПГНИУ под руководством д.б.н. О.З. Еремченко проведено описание и анализ образцов почв с повышенным засолением (солончак, солодь, грунт в 2 м от солеотвала СКРУ-2).

Солончак болотный. Сформирован у края болота, покрыт гидрофильной солеустойчивой растительностью (тростник обыкновенный, полынь селитряная, соссюрея горькая, бескильница тончайшая). Профиль таких солончаков отличается наличием верхнего оторфованного гумусового горизонта Ат. - 0–18 см. Содержание гумуса – до 6 %. В поглощающем комплексе содержатся кальций, магний, натрий. Реакция почвенного раствора

– от слабощелочной до нейтральной. Карбонаты присутствуют с поверхности, в профиле содержится гипс. Характеризовался средней степенью засоления и хлоридно-гидрокарбонатно-сульфатный (смешанным) составом солей.

Солодь луговая формируется в облесенных западинах, под влаголюбивой травянистой растительностью. В исследованиях использовали образцы гумусового горизонта. Сумма обменных катионов – низкая, обусловлена легким гранулометрическим составом и малым содержанием гумуса. При малой сумме обменных катионов преобладают кальций и магний. Кислотность нейтральная.

Техногенные почвоподобные образования (ТПО) зоны солеотвала в окрестностях города Соликамск. Соляные породы представлены калийной солью, сильвинитами и карналлитовыми породами. В основании солеотвала залегают болотные и аллювиальные отложения. Болотные отложения представлены торфом влажным и водонасыщенным, сильно и среднеразложившимся. Аллювиальные отложения представлены переслаивающейся толщей песчано-глинистых грунтов, не имеющей закономерности в залегании. Образцы грунта отобраны в 2 м о края около солеотвала СКРУ-2. Поверхностный слой мощностью около 40 см желтоватобурого цвета, тяжелосуглинистый, глыбистый, бесструктурный, каменистость 50-70%. Отнесен к подгруппе литостратов. Кислотность почвенного раствора от нейтральной до щелочной. Исследуемые литостраты характеризуются низким содержанием гумуса. По доле обменного натрия он характеризуется как слабосолонцеватый, имеет среднесуглинистый состав с пониженным содержанием песка. Отбирали образцы гумусового горизонта с глубины 10 см.

2.2. Среды и субстраты для культивирования Для культивирования бактерий использовали минеральную солевую среду следующего состава (г/л): KH2PO4 - 1.0; K2HPO43H2O - 1.6; NaCl - 0.5;

MgSO47H2O - 0.5; CaCl2 - 0.005; CoCl26H2O – 0.01; FeSO47H2O - 0.005; рН 7.2 ± 0.2 (Максимов и др., 2003). Агаризованную среду получали добавлением бакто-агара (Sigma) до конечной концентрации 1,5 %.

Источником углерода служила глюкоза в конечной концентрации 0.1 %.

В качестве субстрата использовали 10 мМ ацетонитрил, ацетамид или пропионамид, которые служили единственными источниками азота.

Ростовые субстраты асептически добавляли до конечной концентрации в автоклавированную и охлажденную до 25°С среду.

Чистота культур контролировалась высевом на агаризованную среду LB (Луриа-Бертани), содержащей (г/л): триптон - 10.0, дрожжевой экстракт - 5.0, NaCl - 10, агар (Sigma) - 15.

2.3. Селекция штаммов-деструкторов ароматических амидов и нитрилов Штаммы выделяли методом прямого высева (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Навеску почвы (1,0 г) суспендировали в 100 мл стерильного фосфатного буфера, оставляли при температуре 28°С при постоянном перемешивании со скоростью вращения 120 об/мин на 1 час.

Полученный раствор использовали для разведений и последующего параллельного высева на чашки Петри с агаризованной средой N, содержащей селективные субстраты – ацетонитрил, ацетамид или пропионамид в концентрации 10 мМ. На 3-7 сутки роста среди образовавшихся колоний наиболее крупные, а также морфологически различающиеся переносили на чашки Петри со свежей селективной средой. Очищенную культуру пересевали в колбы с жидкой средой аналогичного состава и культивировали в течение 5-7 суток. В дальнейшем исследовали способность микроорганизмов расти на более токсичных субстратах, таких как бензамид и бензонитрил (конечная концентрация 10 мМ).

2.4. Определение ростовых характеристик Плотность культуры оценивали по изменению оптической плотности суспензии клеток при =540 нм на фотоэлектроколориметре КФК-3 с использованием кварцевой 1 см кюветы, либо на спектрофотометре Ultraspec 3300 pro с использованием кварцевой 1 см кюветы, с учетом разведения.

Одна единица оптической плотности при 540 нм соответствует 0,42 мг сухого веса клеток (Максимов и др., 2003).

2.5. Определение ферментативной активности Трансформацию амидов и нитрилов с использованием биомассы выделенных штаммов проводили в 1 мл 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, pH 7.2, при начальной концентрации субстрата 2%. Реакцию проводили параллельно при 25 и 50С в течение 10 мин и останавливали добавлением концентрированной HCl до концентрации 2%. Пробы центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 5 мин. Продукты реакции анализировали спектрофотометрически, методами газовой хроматографии и ВЭЖХ.

Нитрилгидратазную активность определяли на спектрофотометре Ultraspec 3000 по изменению оптической плотности реакционной среды при =240 нм с добавлением 15 мкл акрилонитрила на 4 мл пробы в течение одной минуты (Максимов и др. 2003, Кузнецова и др., 2004).

Амидазную активность определяли с помощью ВЭЖХ, а также кондуктометрически по повышению проводимости в течение 10 минут при добавлении 500 мкл 1М акриламида на 10 мл пробы.

Концентрации алифатических амидов определяли по разности оптической плотности реакционной среды при =240 или 260 нм в начале и в конце реакции на спектрофотометре Ultraspec 3300 pro.

Удельную активность ферментов нитрилгидратазы и амидазы выражали в мкмоль продукта реакции (амида или кислоты), образуемой за 1 мин, в пересчете на 1 мг веса сухих клеток (мкмоль/мг/мин). Единица нитрилгидратазной активности (1 ЕД) соответствует 1 мкмоль амида/мг сухих клеток/мин.

2.6. Изучение влияния температуры и рН на удельную активность фермента Для изучения влияния температуры и рН на скорость ферментативной реакции клетки культивировали в течение 2-3 сут., в зависимости от пика активности, на минеральной среде N с добавлением субстрата и промывали калий-натриевым фосфатным буфером. Реакцию проводили в термостатах «Термит» и термошейкерах TS100C BIOSAN (диапазон температур 5–80°С, шаг 5°С) с добавлением акриламида в течение 10 мин, останавливали добавлением 20 мкл концентрированной HCl, затем смесь центрифугировали 10 мин при 13 тыс. об./мин. Для изучения влияния кислотности среды на активность фермента конверсию акриламида проводили в калий-фосфатном буфере в диапазоне рН 3–12 с шагом рН=1 или 0,5. Продукты реакции анализировали с помощью газовой хроматографии.

Газовую хроматографию продуктов трансформации амида проводили на хроматографе Shimadzu GC-2014 (Япония), оснащенном пламенноионизационным детектором. Хроматографическая колонка длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм была заполнена твердым носителем полисорб-1, фракция 0,25-0,5 мм (Реахим, Россия). Газ-носитель азот подавался с см3/мин.

объемным расходом 35 Температура термостата 190±3°С, температура испарителя 220±10°С. В качестве стандартов использовали растворы чистых акриламида и акриловой кислоты.

2.7. Идентификация выделенных культур Таксономический анализ штаммов проводили на основании стандартных культурально-морфологических, биохимических и хемотаксономических характеристик по определителю бактерий Берджи (Определитель бактерий Берджи, 1997; Методы общей бактериологии, 1983), а также с использованием специализированных руководств (Нестеренко и др., 1985; Ившина и др., 1987).

Для определения группы бактерий по Граму, проводили стандартное окрашивание, а также тест с 3% КОН (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Определение аминокислот и сахаров клеточной стенки проводили стандартными методами ТСХ. Определение мезо-диаминопимелиновой кислоты (мезо-ДАПК): контролем служили 0,1 М растворы мезо-ДАПК, лизина и орнитина. Для разделения аминокислот использовали систему растворителей в соотношении 80:26:10:4 – метанол : дистиллированная вода : пиридин : 6Н HCl. Пятна мезо-ДАПК имели оливковый цвет.

Выявление сахаров: в качестве контроля использовали раствор, содержащий галактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу в концентрации 1,0 %. Для разделения сахаров использовали систему растворителей в соотношении 4:1:1 бутанол : уксусная кислота : дистиллированная вода. Пятна гексоз окрашивались в буро-коричневый цвет, пентоз - в розово-коричневый.

–  –  –

последовательностей, приведенных в базе данных GenBank. Праймеры были синтезированы в ООО «Евроген», г. Москва, а также в Лаборатории микробных и клеточных биотехнологий Биологического факультета ПГНИУ при личном участии автора (Таблица 2).

В качестве контрольных вариантов использовались штаммы R. erythropolis 7т, 17, 19, R. ruber 63, 72 и R. rhodochrous 67т из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов, предоставленные чл.-корр. РАН И.Б. Ившиной (номер Всемирной федерации коллекций культур – WFCC 768).

–  –  –

2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция При выполнении исследований использовали оптимизированные молекулярно-генетические методы (Павлова, 2012).

Выделение ДНК проводили фенольным методом (Клонирование ДНК.

Методы, 1988). В центрифужных пробирках «Эппендорф» ресуспендировали клетки в количестве одной микробиологической петли в 0,5 мл раствора SSC следующего состава: NaCl 0.15 М, цитрат натрия 0.015 М, лизоцим 5 мг.

Реакцию проводили 30 мин при 37 С. К полученному раствору добавляли 50 мкл 20% раствора SDS. Данная реакция протекала в термостате при 65 С в течение 10 мин. Затем добавляли фенол в количестве 0,5 мл, центрифугировали 10 мин. при 13000 об./мин. Водную фазу переносили в новую микропробирку. Добавляли 0,5 мл хлороформа, после перемешивания центрифугировали 3 мин. при 13000 об./мин. Супернатант снова переносили в новую микропробирку, к которому добавляли 0,5 мл изопропанола, центрифугировали 13 тыс. об./мин в течение 3 мин. Смесь охлаждали при

–18 С 1 ч. Центрифугировали 5 мин. при 13000 об./мин. Жидкость сливали, осадок высушивали, растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8.0).

ДНК грамотрицательных микроорганизмов выделяли методом кипячения (Соломенный и др., 2006). Клеточную биомассу переносили в микропробирки в количестве одной микробиологической петли.

Ресуспендировали в 100 мкл стерильной Н2О. Реакцию проводили при 95°С в течение 15 минут в термостате «Термит» (Россия).

Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной производства ООО «СибЭнзим» (Новосибирск) на Taq-полимеразы термоциклере Т3 (Biometra, Германия).

Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,2 % агарозном геле в трис-боратном буфере (ТВЕ, рН 8,0) при напряженности электрического поля 6 В/см. Агарозные гели окрашивали раствором бромистого этидия (1-2 мкг/мл) в течение 15-20 мин. Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК использовали молекулярные маркеры 1kb и 100b (ООО «СибЭнзим»). Визуализацию полос осуществляли c использованием системы гель-документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия).

2.9. Секвенирование ДНК Последовательность нуклеотидов анализировали с помощью систем секвенирования ДНК MegaBACE1000 (APBiotech) и APBisystems 3500 XL с использованием набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit.

–  –  –

нуклеотидных последовательностей проводили с применением программ ClustalW 2.0.9 и YACWGUI 1.2.

2.11. Гидролиз ибупрофенамида синтезирован сотрудниками Лаборатории R,S-ибупрофенамид асимметрического синтеза Института органического синтеза им.

И.Я. Постовского УрО РАН, г. Екатеринбург под руководством д.х.н.

В.П. Краснова.

Культуры выращивали в 100 мл среды в конических колбах общим объемом 250 мл. Клетки собирали центрифугированием при 4500 об/мин в течение 15 минут и дважды промывали в калий-натриевом фосфатном буфере (рН=7.4).

Промытые клетки ресуспендировали в фосфатном буфере с добавлением ибупрофенамида до конечных концентраций – 0.25; 0.5; 1; 1.5 и 2 мМ. Общий объем составлял 1 мл. Пробы отбирали через 30 часов. Реакцию проводили параллельно при 30 и 50С на закрытых шейкерах при скорости вращения 88 об/мин и останавливали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 5 минут.

Продукты биотрансформации ибупрофенамида анализировали методом ВЭЖХ на базе ИТХ УрО РАН с использованием колонки С18, а также колонок с хиральными неподвижными фазами двух типов: фазе Пиркла (Whelk-O1; хиральный селектор – 1-(3,5-динитробензамидо)-1,2,3,4тетрагидрофенантрен) и хиральном адсорбенте с привитым макроциклическим антибиотиком эремомицином (Diaspher-Chiralsel-E).

Также для идентификации продуктов биотрансформации использовали метод хромато-масс-спектрометрии на аппарате 689/573Т MSD (Agilent-Hewlett Packard) на базе ИЭГМ УрО РАН, при следующих условиях: экстракция проб этилацетатом; капиллярная колонка HP 5MS, температура колонки начальная

– 60° С (3 мин), нагрев до 315° со скоростью 7°/мин; температура испарителя 280°С, газ-носитель гелий.

2.12. Гидролиз N – aцетил-3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2H-[1,4] бензоксазина Синтез Ac-DBF и анализ продуктов его биотрансформации проведены на базе Лаборатории асимметрического синтеза Института органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН г. Екатеринбург под руководством д.х.н. В.П. Краснова.

Для трансформации Ac-DBF культуры выращивали на трех вариантах агаризованной среды в течение 4 суток (среда Луриа-Бертани; минеральная среда, содержащая Ac-DBF; минеральная среда с Ac-DBF и ацетатом аммония). Реакцию проводили в микропробирках с добавлением калийнатрий фосфатного буфера (10мМ), Ac-DBF (50 мг/мл), ДМСО и живых клеток, общий объем пробы составлял 1 мл, в течение 5 суток при 30С при 90 об/мин. Реакцию останавливали центрифугированием при 13 тыс. об./мин в течение 5 мин. Продукты трансформации анализировали методом ВЭЖХ.

2.13. Статистическая обработка Все эксперименты проводились не менее чем в трехкратной повторности. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение и доверительные интервалы.

Достоверность различий определяли с использованием t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

Анализ результатов проводили с помощью прикладных программ MS Office Excel и Statistica 5.0.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ

МИКРООРГАНИЗМОВ ПОЧВ И ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ,

ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АРОМАТИЧЕСКИЕ АМИДЫ И НИТРИЛЫ

3.1. Изучение количества и соотношения гетеротротрофных аэробных бактерий почв и донных отложений1 Исследовано биологическое разнообразие бактерий, способных активно метаболизировать амиды и нитрилы карбоновых кислот, в образцах почв и донных отложений. Было проанализировано 11 различных типов почв таёжной (Прикамье) и степной (Челябинская и Саратовская обл.) зоны России: поверхностно-подзолистая супесчаная, дерново-карбонатная, дерново-луговая глеевая почвы, солодь, каштановая почва степной зоны, солончак, грунт 2 м от солеотвала, донные отложения рек Ива и Кама, донные отложения биологических очистных сооружений (Таблица 3). Исследованы наиболее богатые аэробными микроорганизмами верхние слои почв: дернина, гумусовый или элювиальный горизонт, образцы ризосферной зоны растений.

Для первичного отбора микроорганизмов использовали минеральную среду N, содержащую в качестве селективного субстрата ацетонитрил, ацетамид, пропионамид или фенилацетонитрил в качестве единственного источника углерода, азота и энергии в концентрации 10 мМ. Затем произвели очистку культур на богатой среде Луриа-Бертани. Для исследования способности к трансформации ароматических соединений использовали минеральную среду N, содержащую в качестве селективных субстратов бензонитрил, бензамид или другие ароматические амиды или нитрилы в концентрации 10 мМ, в качестве источника углерода – 0,1% глюкозу.

1 Результаты получены совместно с с.н.с. ИЭГМ УрО РАН, д.б.н. Кузнецовой М.В.

–  –  –

Выделено более 300 изолятов микроорганизмов, обладающих способностью к биотрансформации нитрилов и амидов, определено их количество, а также общее число гетеротрофов. Исследования показали, что культуры бактерий, способные активно трансформировать нитрилы и амиды, представлены во всех исследованных типах почв (Рисунок 8).

Рисунок 8 – Соотношение общего количества культивируемых аэробных гетеротрофов и бактерий, утилизирующих нитрилы и амиды в почвах естественной среды и донных отложениях.

Наибольшее количество гетеротрофных микроорганизмов обнаружено в образцах, отобранных из гумусового дернового горизонта (на глубине 5 см) дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением (2,931010 КОЕ). Много гетеротрофов содержалось также в пробах солончака, отобранных в Челябинской области (2,171010 КОЕ) и в пробах грунта в 2 м от солеотвала СКРУ-2 г. Соликамск (2,68109 КОЕ).

Вероятно, высокое содержание гетеротрофных микроорганизмов в грунтах с умеренным засолением является нормальным явлением и объясняется наилучшим соотношением содержания солей и питательных веществ, аэрации и увлажнения. Согласно литературным данным, солонцы и солончаки относятся к богатым почвам по обогащенности бактериями, высеваемыми на МПА (Даденко, Репях, 2006).

Бактерии, активно трансформирующие амиды и нитрилы, обнаружены во всех исследованных почвах и донных отложениях в количестве 105-107 КОЕ/г сухой почвы, что составляет от 0,05 (гумусовый дерновый горизонт дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением, глубина отбора проб – 5 см) до 48,1% (переходный горизонт дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением, глубина отбора проб 20 см) от общего числа гетеротрофов.

Наибольшим абсолютным количеством амидтрансформирующих бактерий отличались пробы солончака, отобранные в Челябинской области (3,11107 КОЕ), образцы из гумусового переходного горизонта дерноволуговой почвы с повышенным увлажнением, г. Краснокамск (2,89107 КОЕ) и пробы грунта около солеотвала (2,32107 КОЕ), а наибольшее количество нитрилтрансформирующих бактерий обнаружено в последних двух из них (3,08107 и 7,50107 КОЕ). В большинстве образцов почв количество амид– и нитрилтрансформирующих бактерий было примерно равным или соотносимым.

Это свидетельствует в пользу координированного метаболизма нитрилов и амидов в экосистемах. Кроме того, было показано, что до 86% изолятов, трансформирующих амиды были способны к метаболизму и нитрильных соединений. Преобладание амидтрансформирующих бактерий наблюдалось в образцах гумусового горизонта дерново-луговой почвы и солончака, что может быть связано с повышенным увлажнением данных образцов почв, при котором образцы содержат большое количество грамотрицательных бактерий, среди которых распространена способность активно метаболизировать амидосоединения.

Однако в относительном выражении образцы солончака, гумусового горизонта дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением и солоди показали наиболее низкое процентное содержание нитрил- и амидтрансформирующих бактерий.

Фенилацетонитрил-утилизирующие бактерии представлены во всех типах почв. Наибольшее их количество обнаружено в образцах, отобранных на глубине 5 см дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением (3,68106), а также в пробах подзолистой супесчаной почвы (6,25105).

Высокая степень встречаемости бактерий, вероятно, связана с тем, что растения продуцируют многие нитрильные соединения, в том числе и фенилацетонитрил (Banerjee et al., 2002; Howden, Preston, 2009; Chen et al., 2009).

3.2. Отбор культур, активно трансформирующих ароматические амиды и нитрилы2 Для дальнейшей работы были отобраны 57 штаммов наиболее быстрорастущих культур аэробных микроорганизмов. Исследовали способность микроорганизмов к росту на алифатических (ацетонитрил, пропионамид) и более токсичных ароматических (бензонитрил, бензамид и фенилацетонитрил) субстратах в концентрации 10 мМ. Установлено, что наибольшее предпочтение изоляты отдавали минеральной среде с добавлением пропионамида в качестве источника азота. Наименьшее – средам с бензонитрилом, бензамидом и фенилацетонитрилом. Однако несколько штаммов (25, 26, 30ф, 31ф, 34ф, 35ф) активно росли как на алифатических, так и на ароматических субстратах (Таблица 4).

–  –  –

+ рост бактерий; ++ активный рост; – отсутствие роста; +/- слабовыраженный рост.

3.3. Идентификация активных штаммов3 По совокупности морфологических признаков, результатов теста с КОН, метода окраски по Граму, стандартных хемотаксономических и биохимических признаков, а также ПЦР-анализа установлено, что штаммы, имеющие высокую активность, представлены как грамположительными, так и грамотрицательными бактериями.

Для изучения хемотаксономических признаков культуры выращивали в аэробных условиях на среде Луриа-Бертани. Диагностические аминокислоты и сахара клеточной стенки определяли стандартными методами.

Определено соотношение различных групп бактерий, обладающих способностью трансформировать нитрилы и амиды (Рисунок 9).

–  –  –

3 Результаты получены лично.

Показано, что наибольшую часть активных изолятов составляли актинобактерии видов R. erythropolis (20%), R.rhodochrous (9%), а также рода (2%); среди грамотрицательных бактерий преобладали Arthrobecter представители P. fluorescens (7%), P. putida (8%), а также другие представители рода Pseudomonas и бактерии рода Agrobacterium – 2%, Acinetobacter – 3%.

–  –  –

Принадлежность грамотрицательных штаммов к роду Pseudomonas была подтверждена с помощью полимеразной цепной реакции с родоспецифичными праймерами к генам 16S рРНК (Рисунок 10).

–  –  –

Рисунок 10 – Продукты амплификации с праймерами к гену 16S РНК Pseudomonas sp.

Методами полифазной таксономии, а также путем секвенирования генов 16S рРНК на аппарате MegaBACE1000 и APBisystems 3500 XL изоляты грамотрицательных бактерий идентифицированы как представители рода Pseudomonas, в том числе видов Pseudomonas fluorescens и Pseudomonas putida (Рисунок 11).

Бактерии рода Agrobacterium (М1, М3) образуют выпуклые, гладкие колонии округлой формы, светло-бежевого цвета. Палочки, одиночные или в парах, спор не образуют, оксидазо- и каталазоположительные.

Определение до вида осуществлялось путем секвенирования ПЦРфрагментов ДНК, в результате которого было установлено, что нуклеотидные последовательности исследуемых штаммов гомологичны на 100% последовательностям генов 16S рРНК Agrobacterium tumefaciens из базы данных GenBank.

Рисунок 11 – Сравнение нуклеотидных последовательностей ПЦРфрагмента штамма С3кр и генов 16S рРНК Pseudomonas sp. из базы данных GenBank. FJ796428 - P. frederiksbergensis, FJ845040 - P. fluorescens, AB494443 - P. veronii, FJ845016 - P. fluorescens, FJ805446 - P. putida, FJ807483 - P. fulva, AB449026 - P. aeruginosa, FJ823152 - P. aeruginosa, FJ538211 - P. aeruginosa, DQ842018 - P. lubricans, FJ828671 - P. mendocina4 Штамм 22ио определен как представитель рода Acinetobacter: палочки, в стационарной фазе роста становятся сферическими, в парах или цепочках, спор не образуют, оксидазоположительные и каталазротрицательные.

Определение штамма 22ио до вида осуществлялось путем секвенирования последовательностей ПЦР-фрагмента ДНК, в результате которого было установлено, Установлено, нуклеотидная последовательность 16S рРНК исследуемого штамма на 100% гомологична таковой из генома A. guillouiae, JQ446439.1, GenBank (Рисунок 12).

4 Секвенирование выполнялось совместно с м.н.с. ЛММБ ИЭГМ УрО РАН к.б.н. Павловой Ю.А.

Рисунок 12 – Сравнение нуклеотидных последовательностей ПЦР-фрагмента штамма 22ио и генов 16S рРНК Acinetobacter sp. из базы данных GenBank5 5 Секвенирование выполнялось совместно с м.н.с. ЛММБ ИЭГМ УрО РАН к.б.н. Павловой Ю.А.

Культуры отнесены к роду Rhodococcus на основании следующих признаков: грамположительные клетки с выраженным клеточным циклом, формируют на плотных средах круглые, гладкие или шероховатые, кремовые (2н, 3н, 6РИ, 7РИ, 25, 26, 37, 5212, 7-1, В15), розово-красные (38, 43, 12и, М16, 155), желтые (21, М6) колонии, в гидролизатах клеток исследуемых штаммов были обнаружены мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза, галактоза (Таблица 6).

–  –  –

Путем секвенирования генов 16S рРНК было подтверждено, что грамположительные штаммы 3н, 6РИ и 7РИ на 98% соответствуют генам 16S рРНК R. erythropolis из базы данных GenBank (Рисунок 15).

Рисунок 15 – Сравнение нуклеотидных последовательностей ПЦРфрагмента штаммов 3н, 6РИ и 7РИ и генов 16S рРНК R. erythropolis В результате секвенирования ПЦР-фрагмента 16S рДНК штаммов М6 и 21и установлено, что нуклеотидные последовательности исследуемого штамма гомологичны на 100% последовательностям генов 16S рРНК R. fascians из базы данных GenBank (Рисунок 16).

____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________GAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACCCGGGGCTCAACT R.fascians_21if_____________GAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACCCGGGGCTCAACT R.fascians_21ir_____________GAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACCCGGGGCTCAACT R.fascians_DS25_EU834250.1__GAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACCCGGGGCTCAACT R.fascians_J96_JX976313.1___GAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACCCGGGGCTCAACT ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________GAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACCCGGGGCTCAACT ____________________________ 60 70 80 90 100 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________TCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTGTTTCAGGGGAGACTGG R.fascians_21if_____________TCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTGTTTCAGGGGAGACTGG R.fascians_21ir_____________TCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTGTTTCAGGGGAGACTGG R.fascians_DS25_EU834250.1__TCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTGTTTCAGGGGAGACTGG R.fascians_J96_JX976313.1___TCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTGTTTCAGGGGAGACTGG ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________TCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTGTTTCAGGGGAGACTGG ____________________________ 110 120 130 140 150 ____________________________ | | | | | R.

fascians_M6f______________AATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTG R.fascians_21if_____________AATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTG R.fascians_21ir_____________AATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTG R.fascians_DS25_EU834250.1__AATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTG R.fascians_J96_JX976313.1___AATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTG ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________AATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTG ____________________________ 160 170 180 190 200 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________GCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAACAACTGACGCTGAGGAACGAAAGCGTGG R.fascians_21if_____________GCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAACAACTGACGCTGAGGAACGAAAGCGTGG R.fascians_21ir_____________GCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAACAACTGACGCTGAGGAACGAAAGCGTGG R.fascians_DS25_EU834250.1__GCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAACAACTGACGCTGAGGAACGAAAGCGTGG R.fascians_J96_JX976313.1___GCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAACAACTGACGCTGAGGAACGAAAGCGTGG ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________GCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAACAACTGACGCTGAGGAACGAAAGCGTGG ____________________________ 210 220 230 240 250 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________GTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGC R.fascians_21if_____________GTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGC R.fascians_21ir_____________GTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGC R.fascians_DS25_EU834250.1__GTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGC R.fascians_J96_JX976313.1___GTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGC ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________GTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGC ____________________________ 260 270 280 290 300 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________GCTAGGTGTGGGTTCCTTCCACGGGATCTGTGCCGTAGCTAACGCATTAA R.fascians_21if_____________GCTAGGTGTGGGTTCCTTCCACGGGATCTGTGCCGTAGCTAACGCATTAA R.fascians_21ir_____________GCTAGGTGTGGGTTCCTTCCACGGGATCTGTGCCGTAGCTAACGCATTAA R.fascians_DS25_EU834250.1__GCTAGGTGTGGGTTCCTTCCACGGGATCTGTGCCGTAGCTAACGCATTAA R.fascians_J96_JX976313.1___GCTAGGTGTGGGTTCCTTCCACGGGATCTGTGCCGTAGCTAACGCATTAA ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________GCTAGGTGTGGGTTCCTTCCACGGGATCTGTGCCGTAGCTAACGCATTAA ____________________________ 310 320 330 340 350 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________GCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGA R.fascians_21if_____________GCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGA R.fascians_21ir_____________GCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGA R.fascians_DS25_EU834250.1__GCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGA R.fascians_J96_JX976313.1___GCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGA ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________GCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGA ____________________________ 360 370 380 390 400 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________CGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG R.fascians_21if_____________CGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG R.fascians_21ir_____________CGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG R.fascians_DS25_EU834250.1__CGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG R.fascians_J96_JX976313.1___CGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________CGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG Рисунок 16 – Сравнение нуклеотидных последовательностей ПЦР-фрагмента штаммов М6 и 21и и генов 16S рРНК R. fascians из базы данных GenBank6 6 Секвенирование выполнялось совместно с м.н.с. ЛММБ ИЭГМ УрО РАН к.б.н. Павловой Ю.А.

____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________AAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCAG-AAAGCCGTAGAGATACGG R.fascians_21if_____________AAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGG-AAAACCGTAGAGATACGG R.fascians_21ir_____________AAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGG-AAAACCGTAGAGATACGG R.fascians_DS25_EU834250.1__AAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGGAAAGCCGTAGAGATACGG R.fascians_J96_JX976313.1___AAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGG-AAAACCGTAGAGATACGG ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________AAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGGAAAACCGTAGAGATACGG ____________________________ 460 470 480 490 500 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________CCCCCCTTGTGGTTGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTG R.fascians_21if_____________TCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTG R.fascians_21ir_____________TCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTG R.fascians_DS25_EU834250.1__CCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTG R.fascians_J96_JX976313.1___TCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTG ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________TCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTG ____________________________ 510 520 530 540 550 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTATG R.fascians_21if_____________TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTATG R.fascians_21ir_____________TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTATG R.fascians_DS25_EU834250.1__TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTATG R.fascians_J96_JX976313.1___TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTATG ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTATG ____________________________ 560 570 580 590 600 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________TTGCCAGCGCGTTATGG-CGGGGACTCGTAAGAGACTGCCGGGGTCAACT R.fascians_21if_____________TTGCCAGCACGTAATGG-TGGGGACTCGTAAGAGACTGCCGGGGTCAACT R.fascians_21ir_____________TTGCCAGCACGTAATGG-TGGG-ACTCGTAAGAGACTGCCGGGGTCAACT R.fascians_DS25_EU834250.1__TTGCCAGCGCGTTATGGGCGGGGACTCGTAAGAGACTGCCGGGGTCAACT R.fascians_J96_JX976313.1___TTGCCAGCGCGTTATGG-CGGGGACTCGTAAGAGACTGCCGGGGTCAACT ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________TTGCCAGCGCGTTATGGGCGGGGACTCGTAAGAGACTGCCGGGGTCAACT ____________________________ 610 620 630 640 650 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________CGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGG R.fascians_21if_____________CGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGG R.fascians_21ir_____________CGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATNCCCCTTATGTCCAGGG R.fascians_DS25_EU834250.1__CGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGG R.fascians_J96_JX976313.1___CGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGG ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________CGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGG ____________________________ 660 670 680 690 700 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________CTTCACACATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGT R.fascians_21if_____________CTTCACACATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGT R.fascians_21ir_____________CTTCACACATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGT R.fascians_DS25_EU834250.1__CTTCACACATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGT R.fascians_J96_JX976313.1___CTTCACACATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGT ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________CTTCACACATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGT ____________________________ 710 720 730 740 750 ____________________________ | | | | | R.fascians_M6f______________GGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTC R.

fascians_21if_____________GGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTC R.fascians_21ir_____________GGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTC R.fascians_DS25_EU834250.1__GGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTC R.fascians_J96_JX976313.1___GGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTC ____________________________…………………………………………………………………………………………………………………………………… Усреднённая_________________GGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTC

Рисунок 16 – продолжение.

3.4. Анализ генов метаболизма амидов и нитрилов у исследуемых бактерий.7 С помощью ПЦР-анализа проведен скрининг последовательностей, гомологичных генам амидаз, нитрилгидратаз и нитрилаз известных типов.

Как известно, для бактерий характерны два основных пути метаболизма нитрилов: нитрилазный и нитрилгидратазный/амидазный. По результатам ПЦР-анализа обнаружены гены, кодирующие ферменты нитрилазу, нитрилгидратазу и амидазу.

Большинство исследованных геномов содержат последовательности, родственные двум из ранее известных генов амидаз. Гены других видов амидаз встречались со значительно меньшей частотой (Рисунок 17 и 18).

1 kb маркер

–  –  –



Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Похожие работы:

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«Аканина Дарья Сергеевна РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДЕТЕКЦИИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н5N 03.02.02 – вирусология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Д.б.н., профессор Гребенникова Т. В. Москва 20 ОГЛАВЛЕНИЕ Список использованных сокращений 1. Введение 2. Обзор литературы 2.1. Описание заболевания 2.2. Общая характеристика вируса гриппа 2.3. Эпидемиология вируса гриппа А...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«ЕРМОЛАЕВ Антон Игоревич ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ МЕЛКИХ СОКОЛОВ В ДОЛИНЕ МАНЫЧА 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«ЗАУЗОЛКОВА Наталья Андреевна АГАРИКОИДНЫЕ И ГАСТЕРОИДНЫЕ БАЗИДИОМИЦЕТЫ ЛЕСОСТЕПНЫХ СООБЩЕСТВ МИНУСИНСКИХ КОТЛОВИН 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – кандидат биологических наук, И. А. Горбунова Абакан – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ... ГЛАВА 1....»

«Искам Николай Юрьевич ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НОВОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ АЦИД-НИИММП НА ОСНОВЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ГОВЯДИНЫ 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства; 06.02.08 – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов. ДИССЕРТАЦИЯ на...»

«Рагимов Александр Олегович ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПОЧВ В ФОРМИРОВАНИИ УРОВНЯ БЛАГОПОЛУЧИЯ НАСЕЛЕНИЯ ВЛАДИМИРСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«CИЛИ ИВАН ИВАНОВИЧ УДК 621.341 ЭНЕРГОИНФОРМАЦИОННАЯ РАДИОИМПУЛЬСНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ И ЭЛЕКТРОННЫЕ СИСТЕМЫ УНИЧТОЖЕНИЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ КАРТОФЕЛЯ 05.11.17 – биологические и медицинские устройства и системы Диссертация на соискание научной степени кандидата технических наук Научный руководитель: Федюшко Юрий Михайлович доктор технических наук, профессор Мелитополь – 2015 СОДЕРЖАНИЕ...»

«Шатских Оксана Алексеевна МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТИМУСА В УСЛОВИЯХ ПОСТУПЛЕНИЯ МЕЛАТОНИНА Специальность 03.03.04. – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Сергеева В. Е. Чебоксары...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Кроткова Ольга Сергеевна Структурные изменения селезенки мышей при воздействии иглоукалывания и лазера во временном аспекте диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Научный руководитель – доктор медицинских наук доцент Гурьянова Е.А....»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«КОНОНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НОВЫХ СОРТОВ СТЕВИИ Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley ПРИ ВВЕДЕНИИ В КУЛЬТУРУ В ЦЕНТРАЛЬНОМ ПРЕДКАВКАЗЬЕ по специальности 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Кофиади Илья Андреевич ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ И ГЕНОДИАГНОСТИКА В БИОМЕДИЦИНЕ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ «03.03.03 – иммунология» диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва, 2013 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ 8 ВВЕДЕНИЕ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.