WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АРОМАТИЧЕСКИЕ АМИДЫ И НИТРИЛЫ ...»

-- [ Страница 1 ] --

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Луговская Надежда Петровна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ,

ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АРОМАТИЧЕСКИЕ АМИДЫ И НИТРИЛЫ

03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Максимов А.Ю.

Пермь – 201

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1.1. Ароматические амиды и нитрилы

1.2. Биотрансформация ароматических амидов и нитрилов

1.3. Типы метаболизма ароматических соединений

1.4. Ферменты, участвующие в преобразовании нитрилов и амидов.......... 1

1.5. Биотрансформация бензамида

1.6. Биотрансформация бензонитрила

1.7. Энантиоселективная биотрансформация ароматических амидов и нитрилов

1.8. Энантиоселективный гидролиз ибупрофенамида

1.9. Энантиоселективный гидролиз N-ацетил- 3,4-дигидро-7,8-дифтор-3метил-2H-[1,4] бензоксазина

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Среды и субстраты для культивирования

2.3. Селекция штаммов-деструкторов ароматических амидов и нитрилов.. 41

2.4. Определение ростовых характеристик

2.5. Определение ферментативной активности

2.6. Изучение влияния температуры и рН на удельную активность фермента

2.7. Идентификация выделенных культур

2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция

2.9. Секвенирование ДНК

2.11. Гидролиз ибупрофенамида

2.12. Гидролиз N – aцетил-3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2H-[1,4] бензоксазина

2.13. Статистическая обработка

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ

МИКРООРГАНИЗМОВ ПОЧВ И ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ,

ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АРОМАТИЧЕСКИЕ АМИДЫ И НИТРИЛЫ..... 49

3.1. Изучение количества и соотношения гетеротротрофных аэробных бактерий почв и донных отложений

3.2. Отбор культур, активно трансформирующих ароматические амиды и нитрилы

3.3. Идентификация активных штаммов

3.4. Анализ генов метаболизма амидов и нитрилов у исследуемых бактерий.

3.5. Скрининг изолятов почвенных грибов, утилизирующих нитрилы и амиды

ГЛАВА 4. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИДОВ И

НИТРИЛОВ

4.1. Изучение влияния состава среды на рост и активность бактерий.......... 75

4.2. Изучение активности ферментов в процессе роста культуры................ 80

4.3. Определение температурной и рН-зависимости амидазной активности88

4.4. Биотрансформация бензамида

4.5. Биотрансформация амида ибупрофена

4.6. Биотрансформация N-амида: N–aцетил-3,4-дигидро-7,8-дифтор-3метил-2H-[1,4] бензоксазина

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы В последнее время одним из важных направлений микробиологических исследований является поиск активных штаммов для экологически безопасных биокаталитических процессов (Patel, 2005; Кузнецов, 2006).

Ароматические амиды и нитрилы являются сложными субстратами для микроорганизмов (Нестеров, 1991). Это разнообразные и, как правило, токсичные и устойчивые к биодеградации и биотрансформации неприродные соединения, которые используются как мономеры и полупродукты для производства полимеров и красителей, взрывчатых веществ и компонентов ракетного топлива, а также в качестве детергентов, растворителей, пестицидов, лекарственных веществ (Хоменков, 2008). Как известно, чем сложнее структура молекулы, тем меньшее число видов или даже штаммов микроорганизмов способно к ее утилизации (Карасевич, 1982; Смирнов, 2002). Источниками азотсодержащих ароматических соединений являются также нефтяная, угольная, деревообрабатывающая промышленность, выхлопы автотранспорта (Форстер, Вейз 1990).

В живом мире каждая химическая реакция катализируется своим ферментом (Quax, 2006). Вследствие универсальности и стабильности, одинаковые ферменты могут быть использованы в совершенно разных частях промышленных процессов (Brady 2006). Часто ферменты et al., демонстрируют высокий уровень энантиоселективности (Vink et al., 2006; Gao 2015), что позволяет использовать их в фармацевтической et al., промышленности для биокаталитического синтеза компонентов и предшественников лекарственных препаратов (Alcntara et al., 2000; Parshikov et al., 2014). Такие реакции протекают при нормальной температуре и давлении, что позволяет избежать более экстремальных условий, которые в свою очередь могут привести к проблемам изомеризации, рацемизации и реорганизации (Patel, 2005; Wang, 2005; Yeom et al., 2007). Биокаталитические процессы, как правило, осуществляется в водном растворе. Это позволяет избежать использования экологически вредных веществ, применяемых в химических процессах (Patel, 2000; D’Arrigo, 2000). Ещё одно важное преимущество биокатализа перед химическим синтезом заключается в том, что в результате биотрансформации рацемического субстрата можно получить оптически чистый продукт.

Арилпропионамиды и арилпропионитрилы представляют интерес тем, что могут быть использованы в качестве субстратов для стереоселективных нитрилконвертирующих ферментов, так как кислотные продукты этих соединений, известные также как профены, представляют важный класс противоспалительных препаратов с активным (S)-изомером (Sonawane et al., 1992; Snell, Colby, 1999; Graham, Williams, 2004). Также перспективным направлением использования биокатализа может быть получение интермедиатов синтеза фторхинолонов (таких, как левофлоксацин), одним из которых является (S)-3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2Н-[1,4] бензоксазин (Miyadera, Imura, 1999; Чулаков и др., 2015).

В связи с этим поиск активных культур бактерий-биотрансформантов и изучение их ферментных систем, разработка на их основе биокаталитических технологий, являются перспективными для микробиологии и биотехнологии (Parshikov et al., 2014).

Цель настоящего исследования – выделение и характеристика почвенных микроорганизмов, активно метаболизирующих ароматические амиды и нитрилы.

Основные задачи исследования:

1) Исследовать биологическое разнообразие гетеротрофных аэробных микроорганизмов почв таёжной и степной зоны России и донных отложений.

2) Выделить и идентифицировать культуры микроорганизмов, метаболизирующих ароматические амиды и нитрилы. Выявить тип метаболизма нитрилов (нитрилазный и/или нитрилгидратазно-амидазный).

3) Исследовать способность активных изолятов к метаболизму ароматических амидов и нитрилов.

4) Определить способность изолятов к энантиоселективной биотрансформации амида ибупрофена и N-ацетил-3,4-дигидро-7,8-дифтор-3метил-2H-[1,4] бензоксазина.

–  –  –

У бактерий способность к биотрансформации амидов обычно связана с метаболизмом нитрилов (Астаурова и др., 1991; Cowan et al., 1998).

Биокаталитический гидролиз нитрилов может проходить двумя различными путям: одностадийный гидролиз до соответствующих карбоновых кислот с выходом аммиака с помощью фермента нитрилазы (КФ 3.5.5.1) и двустадийный, при котором нитрил с помощью нитрилгидратазы (КФ 4.2.1.84) гидролизуется до амида и далее амидазой (КФ 3.5.1.4) до кислоты (Amarant et al., 1989; Wang, 2005).

Первые исследования нитрилконвертирующих ферментов касались нитрилазы растений, которая катализировала гидролиз индол-3-ацетонитрила до индол-3-уксусной кислоты (Thimann, Mahadevan, 1964). На сегодняшний день различные нитрил- и амидконвертирующие ферменты выделены и описаны из бактерий, грибов и растений. Производство акриламида и никотиновой кислоты в промышленных масштабах доказало коммерческую значимость этих ферментов (Chen et al., 2009).

В результате многих исследований было показано, что большинство нитрилгидролизующих микроорганизмов имеют либо нитрилазу, либо нитрилгидратазу и амидазу (Banerjee et al., 2002; Wang, 2005; Martinkova et al., 2009). Некоторые микроорганизмы, такие как Rhodococcus rhodochrous LL 100-21 и и Rhodococcus rhodochrous J1 содержат как нитрилазу, так и нитрилгидратазу и амидазу.

Нитрилгидратазы демонстрируют широкую субстратную специфичность, которая является важной характеристикой для их применения в качестве промышленных биокатализаторов. В настоящее время все больше исследований показывают стереоселективность нитрилгидратаз. Но, как правило, в двуферментном каскаде конверсии нитрилов в соответствующие кислоты амидаза имеет более высокую энантиоселективность (Trott et al., 2002; Choi et al., 2008; Chen et al., 2009; Wang et al., 2010; Shen et al., 2012).

Wieser и Nagasawa описали энантиоселективную нитрилгидратазу из Pseudomonas putida NRRL18668, амидаза была ингибирована (Wieser, Nagasawa, 2000). Также энантиоселективная нитрилгидратаза была выделена и описана из следующих видов: P. putida 5B (гидролиз 2-(4-хлорфенил)-3метилбутиронитрила) (Fallon et al., 1997), Agrobacterium tumefaciens d3 (2фенилпропионитрил, 2-фенилбутиронитрил, кетопрофен нитрил) (Bauer et al., 1998), Rhodococcus erythropolis AJ270 (2-фенилбутиронитрил (Wang, 2005), 3бензоилоксипентадинитрил (Song et al., 2007), напроксен нитрил (Van Pelt et al., 2011)), Rhodococcus equi A4 (2-(4-метоксифенил)-3-пропионитрил, 2-(4хлорфенил)-3-пропионитрил) (Pepechalov et al., 2001).

Энантиоселективные амидазы имеют широкую субстратную специфичность и вызывают значительный интерес тем, что реакции, катализируемые этими ферментами, могут быть использованы для получения фармацевтически значимых оптически чистых соединений, таких как аминокислоты или 2-арилпропионовые кислоты. Амидазы сосуществуют с нитрилгидратазами, но в реакциях с образованием оптически активных кислот большинство нитрилгидратаз проявляет низкую стереоселективность, а амидазы – очень высокую. Несмотря на универсальность амидаз, возможность их применения в больших промышленных масштабах осталось малоисследованной (Chen et al., 2009).

Клетки штамма Brevibacterium sp. R312 (в более поздних работах представленного как Rhodococcus sp. R312), культивируемые на ацетонитриле как источнике азота, имеют две амидазы: нестереоселективную амидогидролазу широкого спектра и энантиоселективную -аминоамидазу.

Эта -аминоамидаза была использована для получения оптически активной Lаминокислоты из рацемического -аминонитрила и -аминоамида (Wieser, Nagasawa, 2000). Несколько (S)-2-фенилпропионовых кислот были получены с высокой энантиомерной чистотой, выходом и продукцией (100 г/л) из рацемического нитрила при комбинированном действии неспецифической нитрилгидратазой и (S)-специфической амидазой, с использованием клеток штамма R. equi TG328, который был культивирован на 2-метилбутиронитриле как источнике азота (Gilligan et al., 1993). Comamonas acidovorans KPO 2771-4 использовал (R)-кетопрофенамид (2-(3’-бензофенил)-пропионамид) в качестве единственного источника азота, тогда как (S)-кетопрофен амид оставался в реакционной среде. (R)-специфичная мономерная амидаза показывает гомологию последовательностей с амидазами R. rhodochrous J1, Rhodococcus sp. N-774, Brevibabcterium sp. R312 и Pseudomonas chloraphis B23 (Nagasawa, Yamada, 1990). Энантиоселективная амидаза из R. erythropolis MP 50, которая характеризуется как фермент широкого спектра с необычной гомооктомерной структурой, была использована в стереоселективной трансформации рацемического 2-фенилпропионамида и напроксенамида до соответствующих кислот с энантиомерным избытком более чем 99% и 50% конверсией.

Фермент также гидролизовал различные -амино амиды, но без значительной энантиоселективности (Bauer et al., 1994). Flavobacterium aquatile ZJB-092 имеет амидазу широкого спектра и характеризуется высокой энантиоселективностью, продуцирует L-триптофан с энантиомерным избытком 99.9% (Xu et al., 2013).

Энантиоселективная нитрилаза покоящихся клеток Alcaligenes faecalis ATCC 8750 катализировала гидролиз Выход (R,S)-манделонитрила.

кислоты (предшественника полусинтетического (R)-миндальной цефалоспорина) составил 91% (Yamamoto et al., 1991). Биоконверсия рацемического манделонитрила с использованием селективной нитрилазы была использована для промышленного получения энантиомерно чистой кислоты и кислоты компанией (R)-миндальной (R)-3-хлорминдальной Mitsubishi Rayon. Исследователи этой компании описала несколько стереоселективных нитрилаз из ряда микроорганизмов (Rhodococcus, Acinetobacter, Caseobacter, Aureobacterium, Alcaligenes, Pseudomonas, Nocardia, Gordona, Brevibacterium) (Wieser, Nagasawa, 2000). (S)-ибупрофен был получен при биотрансформации амида ибупрофена покоящимися клетками Acinetobacter sp. AK 226. (S)-специфическая нитрилаза была очищена и охарактеризована как фермент с высокой молекулярной массой – 580 кДа (Yamamoto, Komatsu, 1991).

Авторами Snell D. и Colby J. было доказано, что штамм Rhodococcus AJ270 осуществляет частичный гидролиз 1,5 мМ ибупрофенамида при 30С в течение 2,5 часов. Полный гидролиз был описан при концентрации амида ибупрофена 0,25 мМ в течение 17 часов при 30С. При этом образуется S-изомер, и выход продукта составляет более 89,9% (Snell, Colby, 1999).

Miyadera А. и Imura А. сообщили об эффективном энантиоселективном микробиологическом гидролизе N-ацетил-3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метилH-[1,4] бензоксазина в присутствии микроорганизмов рода Bacillus, в результате которого был получен (интермедиат в синтезе (S)-амин левофлоксацина) с высокой энантиомерной чистотой 99% (Miyadera, Imura, 1999).

Большой интерес к стерео-, регио- и хемоселективности появился относительно недавно – в начале 1990-х гг. (Martinkova, Kren, 2002), поэтому поиск и изучение новых ферментных систем является перспективным направлением биотехнологии.

Научная новизна Впервые проведен сравнительный анализ содержания культивируемых гетеротрофных бактерий и изолятов, трансформирующих ароматические амиды и нитрилы, и установлены их соотношения в почвах таёжной и степной зоны России и в донных отложениях рек Ива и Кама, и в донных отложениях БОС г. Перми. Обнаружено, что наибольшим количеством амид- и нитрилтрансформирующих бактерий отличались пробы солончака, отобранные на территории Троицкого заказника Челябинской области и образцы из гумусового переходного горизонта дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением (Краснокамский р-н Пермкого края).

Установлено преобладание амидтрансформирующих бактерий в верхних слоях увлажненных почв, связанное с высоким содержанием в них аэробных грамотрицательных бактерий. Показано, что среди прокариот, активно трансформирующих ароматические амидосоединения, представлены актинобактерии R. erythropolis, R.rhodochrous, Arthrobecter spp., а также протеобактерии P. fluorescens, P. putida, другие представители рода Pseudomonas и бактерии родов Agrobacterium, Acinetobacter.

Установлено, что почвенные плесневые грибы, выделяемые на среде с амидами и нитрилами, проявляют высокую бензонитрилазную активность и способны к полной утилизации этих соединений. Выделен штамм Fusarium oxysporum, обладающий высокой нитрилазной активностью.

Определены оптимальные условия, обеспечивающие эффективную биотрансформацию амида ибупрофена с выходом S-энантиомера более 95%.

Установлено, что максимальный выход ибупрофена наблюдается при рН 8,3.

Впервые селекционированы культуры актинобактерий рода Rhodococcus, катализирующие реакцию биотрансформации N-ацетильных производных бензоксазина (N-ацетил-3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2Hбензоксазина) с высоким энантиомерным избытком – от 98 до 100%.

Теоретическое и практическое значение работы.

Результаты диссертационной работы расширяют представления о процессах биотрансформации ароматических амидов и нитрилов.

Исследовано биологическое разнообразие микроорганизмов естественных почв таёжной и степной зоны России (поверхностно-подзолистая супесчаная, дерново-карбонатная, дерново-луговая глеевая почвы, солодь, каштановая почва степной зоны, солончак, грунт вблизи солеотвала, донные отложения рек Ива и Кама и биологических очистных сооружений), метаболизирующих амиды и нитрилы. Селекционированы и исследованы новые культуры бактерий - трансформанты ароматических амидов и нитрилов, перспективные для синтеза практически значимых соединений – составляющих и предшественников фармакологических препаратов (ибупрофена, левофлоксацина).

Результаты исследований используются в лекционных курсах «Промышленная микробиология», «Введение в биотехнологию» для студентов Пермского государственного национального исследовательского университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Амидтрансформирующие бактерии составляют до 48% от общего числа культивируемых аэробных гетеротрофных почвенных микроорганизмов. Среди активных культур преобладают представители бактерий родов Rhodococcus, Pseudomonas, Agrobacterium, Acinetobacter и грибов рода Fusarium.

2. Культуры почвенных плесневых грибов, выделяемые на среде с амидами и нитрилами, проявляют высокую бензонитрилазную активность и способны к полной утилизации бензонитрила и структурно близких соединений.

3. Среди почвенных актинобактерий, способных к биотрансформации ароматических амидов, преобладают штаммы, содержащие гены амидаз, гомологичных последовательности R. rhodochrous N-774 и гены Fe- зависимой нитрилгидратазы.

4. Штаммы актинобактерий, активно гидролизующие ароматические амиды, обладают способностью к энантиоселективной трансформации этих соединений с высоким энантиомерным избытком.

–  –  –

участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2009" (Пермь, 2009), XIII ежегодном симпозиуме студентов-биологов Европы «Symbiose 2009» (Казань, 2009), VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2010), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2010" (Н. Новгород, 2010), VI молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2010), IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2011" (Воронеж, 2011), II Всероссийской школе-конференции «Биомика-наука XXI века» (Уфа, 2011), III международной конференции «Техническая химия.

От теории к практике» (Пермь, 2012).

Результаты проведенных исследований опубликованы в 16 научных работах: 5 статей, 3 из которых в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 11 тезисов.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 40 рисунков и 24 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 147 наименований работ, в том числе 38 отечественных и 109 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер госрегистрации 0120.0 406511), а также в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009–2011 гг.)» и гранта поддержки молодых ученых УрО РАН.

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора и исследований в сотрудничестве при личном участии автора.

Список принятых сокращений:

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГХ – газовая хроматография;

ЕД – единица активности фермента, мкмоль/мг/мин;

КОЕ - колониеобразующие единицы;

МПА – мясо-пептонный агар;

ОП - оптическая плотность;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

LB – среда Луриа-Бертани, Ac-DBF – N-ацетил-3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2H-[1,4] бензоксазин, DBF – 3,4-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-2H-[1,4] бензоксазин, ее – энантиомерный избыток.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ароматические амиды и нитрилы Амиды - класс органических соединений, которые могут рассматриваться как производные кислот или аминов (Артеменко, 2005).

Амиды могут быть получены не только из алифатических или ароматических карбоновых кислот, но также и из других типов кислот, например, содержащих серу и фосфор (Сейц, Князев, 1986). Амидосоединения широко распространены среди веществ биогенного происхождения. Разновидностью амидной связи является петидная.

Ароматические амидосоединения являются важными промежуточными звеньями при производстве красителей и лекарств (Hamme, 2003; Сейц, Князев, 1986). Большое разнообразие химического строения амидов нашло отражение в разнообразии их биологического действия (Наумова, 1985).

Несмотря на то, что собрано большое количество информации о метаболизме различных амидов, еще не удалось определить природу их токсического действия на молекулярном и клеточном уровнях (Артеменко, 2005).

Нитрилы (также называемые органическими цианидами) органические соединения, которые содержат характерную цианистую группу ( ) и имеют общую формулу RCN (Kaur et. al., 2014). Их можно рассматривать как производные углеводородов, в которых три атома водорода, присоединенных к первичному углероду, заменены нитрильной группой, или как производные карбоновых кислот (R - COOH), в которых кислородные и гидроксильные радикалы заменены нитрильной группой ( ) (Агрономов, 1990). При гидролизе во всех вариантах они образуют кислоту (Kanaly, Harayama 2000).

Нитрильные соединения широко распространены в окружающей среде (Banerjee, 2002; Song, 2007). Растения продуцируют многие нитрильные соединения, такие как цианогликозиды, цианолипиды, рицинин, фенилацетонитрил и др. (Banerjee et al., 2002; Howden, Preston, 2009; Chen et al., 2009).

Нитрилы при нагревании, разлагаясь, выделяют цианистый водород (Рабинович, Хавин, 1991). Эти чрезвычайно активные соединения широко используются как промежуточные звенья в органическом синтезе (Song et al., 2007). Они нашли широкое применение в качестве исходных материалов для синтеза различных жирных кислот, фармацевтических препаратов, витаминов, синтетических смол, пластмасс и красителей (Агрономов, 1990; Sugai et al., 1997; Banerjee et al., 2002). Являются мутагенами и канцерогенами (Song et al., 2007).

1.2. Биотрансформация ароматических амидов и нитрилов Биотрансформация - высокоспецифичная реакция, осуществляемая микроорганизмами или изолированными ферментами как с естественными для них, так и с чужеродными веществами (Lorenz, Eck, 2004). Эта реакция может заключаться в окислении субстрата, его гидрировании, гидролизе, этерификации, конденсации, метилировании, дезаминировании и др. Эти превращения стереоспецифичны, не дают побочных продуктов, протекают при нормальной температуре, давлении. Они широко используются в производстве ряда витаминов, стероидных гормонов, лекарственных средств (Stoecker, 1998). Биотрансформация веществ – одно из развивающихся направлений биотехнологии (Warhurst, Fewson, 1994).

Это широкое понятие включает три более узких процесса (Хоменков, 2008):

1. трансформацию, или незначительные изменения молекулы;

2. фрагментацию, или разложение сложной молекулы на более простые соединения;

3. минерализацию, или превращение сложного вещества в самые простые (Н2О, СО2, Н2, NH3, CH4 и т.д.).

Основными биологическими агентами, осуществляющими биотрансформацию, являются микроорганизмы (Diaz, 2001).

Огромное генетическое разнообразие микроорганизмов, их метаболическая пластичность, высокие скорости размножения позволяют им развиваться и адаптироваться к быстро меняющимся условиям внешней среды даже в экстремальных условиях, в которых не способны выжить другие живые организмы (Хоменков, 2005). Основными деструкторами органических соединений являются представители грамотрицательной микрофлоры – бактерии рода Pseudomonas (Хоменков, 2008; Diaz, 2001; Baggi et al., 1987;

McNally et al., 1999; Cheng et al., 1997; Tropel, Meer, 2004; Kanaly, Harayame 2000; Di Gioia et al., 2001; Chadhain, 2006; Stoecker, 1998), из представителей грамположительной микрофлоры наиболее значимыми являются бактерии рода Rhodococcus (Жуков, 2007; Stoecker, 1998; Martinkova et al., 2008;

Iwabuchi et al., 2002; Tropel et al., 2004; Chadhain et al., 2006). Keener W. and Arp D.J. сообщили о трансформации бензола и его производных Nitrosomonas europaea (Keener, Arp, 1994).

Чтобы использовать определенное соединение в качестве единственного источника питания, микроорганизмы должны синтезировать и поддерживать в активном состоянии специальную систему ферментов (Карасевич, 1982).

1.3. Типы метаболизма ароматических соединений Существует два типа метаболизма ароматических субстратов, аэробный и анаэробный (Johnson, 2000).

Кислород является одним из наиболее распространенных конечных акцепторов электронов в процессах дыхания у микроорганизмов. Процесс аэробного дыхания обеспечивает микробной клетке наибольшее количество энергии (Хоменков, 2008).

Утилизация ароматических соединений в аэробных условиях начинается с реакции включения кислорода в молекулу субстрата. Эти реакции катализируют ферменты оксигеназы (Карасевич, 1982; Хоменков, 2008; Martinkova et al., 2008; Kaiser et al., 1996; Hamme et al., 2003; Zhang et al., 2006). Оксигеназы делятся на две основные группы: монооксигеназы и диоксигеназы. Монооксигеназы катализируют включение в молекулу субстрата одного атома молекулярного кислорода, тогда как второй атом восстанавливается до воды. Эти ферменты называют также гидроксилазами или оксидазами. Многие монооксигеназы требуют дополнительного донора электронов, роль которого в ряде случаев выполняют НАДН или НАДФН, т.е.

несут черты дигидрогеназ (Карасевич, 1982).

Реакции, катализируемые монооксигеназами, протекают по следующей схеме (Карасевич, 1982):

Субстрат + АН2 + О2 Субстрат – ОН + А + Н2О, где АН2 – донор электронов, субстрат – ОН – окисленный субстрат.

Диоксигеназы катализируют включение в молекулу субстрата обоих атомов молекулярного кислорода.

Главными промежуточными метаболитами исходного субстрата при аэробном процессе биодеградации являются его дигидроароматические производные (катехол, протокатехолат, гидрохинон, гидроксихинон) (Хоменков, 2008; Martinkova et al., 2008). Эти соединения могут выступать в качестве субстратов ферментов, осуществляющих разрыв ароматического кольца – ключевой стадии биодеградации (Нестеров, 1991; Хоменков, 2008;

Martinkova et al., 2008).

Раскрытие ароматического кольца может происходить между двумя соседними углеродными атомами, несущими гидроксильные группы – орторасщепление. Осуществляют это расщепление ферменты – интрадиольные диоксигеназы. Если раскрытие ароматического кольца происходит в метаположении, то оно называется мета-расщепление, а соответствующие ферменты – экстрадиольными диоксигеназами. Центральные метаболические пути, включающие в себя серии реакций, приводят к образованию промежуточных соединений цикла Кребса (Рисунок 1) (Хоменков, 2008;

Нестеров, 1991; Пунтус, 2008; Карасевич, 1982; Martinkova et al., 2008; Hamme et al., 2003; Kanaly, 2000).

Рисунок 1 – Центральные пути катаболизма ароматических соединений у родококков (Martinkova et al., 2008).

Загрязнение окружающей среды нередко возникает в анаэробных биотопах, не содержащих достаточного количества кислорода, таких как водоносные горизонты, осадочные водные отложения и затопленные участки почвы. В этих условиях биодеградация веществ-загрязнителей достигается за счет работы анаэробных либо факультативно-анаэробных микроорганизмов, использующих альтернативные кислороду акцепторы электронов: нитрат (денитрифицирующие бактерии), сульфат (сульфатредукторы), Fe(III) (железоокисляющие микроорганизмы), СО2 (метаногены) или другие акцепторы, такие как хлорат, Mn, Cr, U и т.д. (Robertson, 1998; Хоменков, 2008). Rhodopseudomonas palustris использует различные ароматические соединения как в аэробных, так и в анаэробных условиях (Harwood, Gibson, 1988).

1.4. Ферменты, участвующие в преобразовании нитрилов и амидов Продолжающийся сброс нитрильных соединений в различных промышленных процессах вызвал серьезные экологические последствия загрязнения нитрилами (Zhang et al., 2013). В живом мире каждая химическая реакция катализируется своим ферментом. Ферменты проявляют высокую специфичность, так например, они способны различать разные молекулы субстратов (Torrelo et al., 2015). Более того, они преимущественно работают при умеренных температурах, давлении и pH, которая делает их привлекательными катализаторами для промышленности (Quax, 2006).

Биокаталитический гидролиз нитрилов проходит по двум различным путям: одностадийный гидролиз до соответствующих карбоновых кислот с выходом аммиака с помощью фермента нитрилазы и двустадийный, при котором нитрил с помощью нитрилгидратазы гидролизуется до амида и далее амидазой до кислоты (Wang, 2005; Kaur et al., 2014). На сегодняшний день различные нитрил-амид конвертирующие ферменты были выделены и описаны из бактерий, грибов и растений. Производство акриламида и никотиновой кислоты в промышленных масштабах доказали коммерческую значимость этих ферментов (Chen et al., 2009).

В результате множества исследований было показано, что большинство нитрилгидролизующих микроорганизмов имеют либо нитрилазу, либо нитрилгидратазу и амидазу (Banerjee et al., 2002; Wang, 2005; Martinkova et al., 2009). Некоторые микроорганизмы, такие как R. rhodochrous LL 100-21 и R. rhodochrous J1 содержат как нитрилазу, так и нитрилгидратазу/амидазу.

1.4.1. Нитрилгидратазы Нитрилгидратаза, преобразующая нитрилы в соответствующие амиды, является ключевым ферментом в двуферментном пути гидролиза нитрилов до кислот (Mascharak, 2002). Фермент имеет и субъединицы в эквимолярном количестве, но их количество изменяется для ферментов из различных микробных источников (Komeda et al., 1997) Кристаллическая структура и спектроскопические исследования показали, что почти все нитрилгидратазы в активном центре содержат либо негемовое железо, либо кобальт. Fe-нитрилгидратаза и Co-нитрилгидратаза, несмотря на разницу в происхождении и каталитических свойств, имеют очень похожие структуры (Wang, 2005; Song et al., 2007; Chen et al., 2009;

Martinkov et al., 2010). Были предложены несколько механизмов гидратации нитрила, катализируемых Fe- и Co-нитрилгидратазой. Во всех реакциях ион металла принимает участие как кислота Льюиса. В механизме А, азот нитрила координирует непосредственно ион металла и, следовательно, увеличивается электрофильность атома углерода, что способствует гидратации. В механизмах В и С, метал-связанный гидроксид действует либо в качестве нуклеофила для атаки атома углерода циано группы, либо в качестве главной основы активации молекулы воды в активном центре (Рисунок 2) (Wang, 2005).

Рисунок 2 – Механизмы Fe- и Co-нитрилгидратазой катализируемых реакций гидратации нитрила Нитрилгидратазы штаммов Rhodococcus sp. R312 (прежде известного как Brevibacterium sp. R312) и P. chlororaphis B23 - первые примеры негемовых железоферментов, содержащих ион с низкой валентностью Fe (III).

Активность нитрилгидратазы повышается на свету. Хромофор, вовлеченный в фотоактивацию, является железным комплексом в -субъединице. Поэтому эндогенная молекула NO, которая связана с негемовым железным центром в неактивной нитрилгидратазе, освобождается, приводя к восстановлению активности нитрилгидратазы (Maier-Greiner et al., 1991).

Модель предполагаемого каталитического механизма железосодержащих, а возможно, и кобальтсодержащих нитрилгидратаз включает три стадии.

Сначала нитрил взаимодействует с гидроксильным ионом (ОH-) молекулы воды, связанной с металлом. Затем гидроксильный ион, связанный с железом, или гидроксил поляризованной ионом металла молекулы воды атакует атом углерода в нитриле с образованием имида (R-C(-OH)=NH). B заключительной фазе реакции имид таутомеризуется в амид (Kobayashi, 1999).

В присутствие ионов кобальта, актиномицет R. rhodochrous J1 продуцирует две нитрилгидратазы, в зависимости от индуктора. Hнитрилгидратазы действуют предпочтительно на алифатические нитрилы, тогда как L-нитрилгидратазы проявляют более высокое сродство к ароматическим нитрилам. H- и L-нитрилгидратазы использовались для промышленного производства акриламида и никотинамида из акрилонитрила и 3-цианопиридина, соответственно. Обе выделенные нитрилгидратазы содержат кобальт как кофактор. Нитрилгидратаза с кобальтом имеет треонин в V-C-(T/S)-L-C-S-C-последовательности как активный участок, тогда как у железосодержащих нитрилгидратаз есть серин. Различие в металлических кофакторах может быть приписано различным аминокислотным остаткам в этом положении. Анализ кристаллической структуры кобальтсодержащих нитрилгидратаз Pseudonocardia thermophila JCM3095 показал, что и Со (III) и Fe (III) находятся в схожей окружающей среде. Остаток триптофана (Trp 72), который может быть вовлечен в закрепление субстрата в Со-содержащем ферменте заменяет остаток тирозина в Fe (III)-содержащем ферменте. Он, вероятно, отвечает за то, что нитрилгидратазы с кобальтом предпочитают ароматические, а не алифатические нитрилы (Kobayashi, Shimiru, 1998). Для индукции некоторых нитрилгидратаз необходимо присутствие нитрилов или амидов (Астаурова и др., 1991).

Демаковым В.А. и коллегами была выделена термостабильная нитрилгидратаза из штамма Rhodococcus ruber GT, которая применяется для биотехнологического синтеза акриламида гидратацией акрилонитрила в водных растворах (Демаков и др., 2004).

Была изучена нитрилгидратаза из Rhodococcus rhodochrous strain DAP 96253. Описано, что на активность нитрилгидратазы влияет среда культивирования, а именно, сахара, входящие в ее состав. Мальтоза или мальтодекстрин увеличивают активность фермента по отношению к пропионитрилу. Активность сохраняется при 55°С. Фермент индуцируется в присутствии кобальта и мочевины (Tucker et al., 2012).

Bauer R. с коллегами выделели энантиоселективную нитрилгидратазу из Agrobacterium tumefaciens strain d3, которая была полностью отделена от амидазы. Данная нитрилгидратаза имеет температурный оптимум 40°С и оптимум рН 7,0. Холофермент имеет молекулярную массу 69 кДа, субъединицы – 27 кДа. Фермент гидролизует 2-арилпропионитрилы и другие ароматические и гетероциклические нитрилы (2-фенилпропионитрил, 2фенилбутиронитрил, 2-(4-хлорфенил)-пропионитрил, 2-(4-метокси)пропионитрил или кетопрофен нитрил) до соответствующих S-амидов. Более высокие значения энантиомерного избытка были обнаружены при использовании очищенного фермента, чем при использовании цельноклеточного препарата в присутствии ингибитора амидазы.

Энантиоселективность реакции с использованием целых клеток была улучшена путем увеличения температуры (Bauer et al., 1998). Клетки R. erythropolis ATCC 25544 с помощью энантиоселективных нитрилгидратазы и амидазы продуцировали 45 мМ (S)-2,2-диметилциклопропанкарбоновую кислоту из рацемического 100 мМ 2,2-диметилциклопропан карбонитрила с энантиомерным избытком 81,8% после 64-часовой реакции (Yeom et al., 2007).

1.4.2. Амидазы Амидазы – ферменты, расщепляющие амиды, катализируют гидролиз амидов до карбоксилатов и аммония и присутствуют во всех царствах живого мира (Fournand, Arnaud, 2001; Лавров и др., 2010).

Амидазы являются широко распространенными ферментами в живой природе и могут быть разделены на два типа. Первый тип включает алифатические амидазы, гидролизующие только короткоцепочечные алифатические амиды. Второй тип включает алифатические амидазы, гидролизующие амидные цепочки средней величины, некоторые ариламиды,

-аминоамиды и -гидроксиамиды (Fornaud, Arnaud, 2001). Все эти амидазы проявляют ацилтрансферазную активность, ведущую к формированию гидроксамовых кислот. Некоторые из них также способны трансформировать разнообразные амиды, кислоты, сложные эфиры или нитрилы в соответствующие им карбоновые кислоты, гидроксамовые кислоты или кислотные гидразиды (Fornaud 1997). Существует два типа et al, каталитических центров: GGSS – для амидаз сигнатурного суперсемейства и E-K-C – для нитрилазного суперсемейства (Ма et al., 2014).

На сегодняшний момент роль амидаз в живом мире не определена.

Однако в течение последних лет стало много известно об эволюционных аспектах этих ферментов и катализируемых амидазой реакций in vitro.

Амидазы оказались эффективным инструментом для синтеза различных соединений (Chen et al., 2009).

Среди грибов-продуцентов амидаз наиболее изучена амидаза Aspergillus nidulans. Описано несколько амидаз: формамидаза, активность которой проявляется в присутствии формамида и глицинамида, в качестве субстрата;

ацетамидаза, гидролизующую короткоцепочечные алифатические амиды до 6 атомов углерода; амидазы, проявляющие активность с алифатическими амидами (бутирамид, валерамид, гексаноамид) и с ариламидами (амид бензойной кислоты, фенилацетамид) (Fournand, Arnaud, 2001).

Большинство известных в настоящее время амидаз было обнаружено и описано в бактериях. Эти ферменты содержат представители родов Rhodococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Brevibacterium, Nocardia, Streptomyces, Blastobacter, Arthrobacter, Alcaligenes, Helicobacter, Lactobacillus, и Methylophilus (Clarke, 1970).

Разные амидазы проявляют различную субстратную специфичность (Brady et al., 2006). Например, Kimura Т. частично очистил никотинамидазу из Mycobacterium avium, которая была абсолютно специфична к никотинамиду, тогда как Kobayashi М. и коллеги очистили и охарактеризовали амидазу R. rhodochrous J1 с очень широким спектром субстратов (Kimura, 1959;

Kobayashi et al., 1998). Отличают абсолютно специфичные амидазы от неспецифичных, алифатические амидазы от ариламидаз и амино-амид амидогидролаз. Один микроорганизм может содержать несколько амидаз.

Arnaud и коллеги обнаружили, что Rhodococcus sp. R312 содержит L-альфааминоамидазу, энантиоселективную амидазу, алифатическую амидазу (Arnaud et al., 1976). К.В. Лавровым и коллегами выделена и описана новая ациламидаза из R. erythropolis ТА37, которая использует в качестве субстрата акриламиды (изопропилакриламид, N-ацилзамещенные N,N-диметиламинопропилакриламид, аминокислот глицина, N-ацетилпроизводные аланина, лейцина), а также алифатические амиды (ацетамид, акриламид, изобутирамид), хотя и с меньшей эффективностью (Лавров и др., 2010), изучен ген этой амидазы (Lavrov et al., 2014).

Амидазы, вовлеченные с нитрилгидратазой в метаболизм нитрилов, осуществляли энантиоселективный гидролиз некоторых рацемических амидов. В 1995 Ciskanik и коллеги охарактеризовали амидазу Ps. chlororaphis B23, которая энантиоселективно гидролизует некоторые ароматические амиды, включая 2-фенилпропионамид (Ciskanik et al., 1995). Год спустя Hirrlinger В. с коллегами охарактеризовли амидазу R. erythropolis MP50, которая конвертировала рацемический 2-фенилпропионамид, напроксенамид и кетопрофенамид до соответствующих кислот с избытком 99 % и почти с 50%-ным преобразованием рацемических амидов (Hirrlinger et al., 1996).

Фермент также гидролизовал различные альфа-аминоамиды, но без значительной энантиоселективности (Fournand, Arnaud, 2001).

Активность амидаз вызывает большой интерес для настоящих и будущих биотехнологических применений. Гидролиз с участием амидазы применяют в химической промышленности для производства адипиновой, акриловой, p-аминобензойной и молочной кислот, аналогов ризобитоксина; в фармацевтической промышленности для производства S или R энантиомеров 2-фенилпропионовой кислоты, ибупрофена, напроксена, кетопрофена и некоторых других соединений. Перенос ацильной группы на гидроксиламин используется в медицине для производства аминогидроксамовых кислот или пептидов (Fournand, Arnaud, 2001; Fournand et al. 1997).

1.4.3. Нитрилазы Нитрилазы катализируют гидролиз нитрилов (R-CN) до соответствующей карбоновой кислоты и аммиака. Эти ферменты охарактеризованы и выделены из растений, бактерий и грибов, а также найдены подобные ферменты в геномах животных и дрожжей (Brady et al., 2006; Howden, Preston, 2009).

Нитрилазы – гомомультимерные тиольные ферменты (Cowan et al., 1998). Молекулярная масса субъединиц и нативная структура были определены для многих нитрилаз. Большинство состоят из одного полипептида с молекулярной массой около 40 кДа (32-45 кДа). Форма этого фермента представляет собой совокупность 6-26 субъединиц (O’Reilly, Turner, 2003).

Суперсемейство нитрилаз, также относящееся к CN-гидролазам, состоит из ферментов, которые катализируют гидролизы непептидных C-N связей.

Члены суперсемейства поделены на 13 ветвей согласно идентифицированной последовательности генов и каталитической активности. Они включают алифатическую амидазную, N- амидазную, биотинидазную, карбамилазную, нитрилазную ветви и др. (Pace, Brenner 2001; Ma et al., 2014).

Эти ферменты гидролизуют CN-группу нитрила, в результате чего получается соответствующая карбоновая кислота и аммиак (Osprian et al.

1999). Реакция катализируется нитрилазой (Рисунок 3).

Рисунок 3 – Нитрилазная реакция (Osprian et al. 1999)

Все члены суперсемейства нитрилаз имеют каталитическую триаду аминокислот – глутаминовую кислоту, лизин и цистеин (Pace, Brenner 2001).

Нитрилазы имеют тиольную группу, которая является необходимой для каталитической активности, и таким образом, нитрилазы классифицируются как тиольные ферменты. Активность ферментов может быть ингибирована тиол-связывающими компонентами, такими как AgNO3 и CuSO4, и увеличена в присутствии тиол-восстанавливающих агентов, таких как дитиотрейтол (Osprian et al. 1999; Pace, Brenner 2001).

Нитрилазы часто классифицируют по одной из 3 категорий согласно специфичности субстратов: алифатические нитрилазы, которые активны в первую очередь на алифатических нитрилах, таких как акрилонитрил, глутаронитрил и –циано-L-аланин; ароматические и гетероциклические нитрилазы, которые, активны на ароматических и гетероциклических нитрилах, таких как бензонитрил и цианопиридин, и арилацетонитрилазы, которые активны на арилацетонитрилах, таких как индол-3-ацетонитрил (ИАН), фенилацетонитрил (ФАН) и фенилпропионитрил (Robinson, Hook, 1964). У грибов описана нитрилаза из Fusarium oxysporum f. sp. melonis и Fusarium solani IMI196840, которая специфична только к ароматическим нитрилам, в частности, к бензонитрилу. (O’Reilly, Turner, 2003).

Некоторые нитрилазы являются крайне специфичными субстратами (Banerjee et al, 2002). Другие ферменты имеют широкий субстратный ряд (Brady et al., 2006). Нитрилазы с одинаковой субстратной специфичностью часто имеют похожую последовательность аминокислот и могут попадать в одинаковые категории в филогенетических анализах (Banerjee et al, 2002).

Оптически активные 2-арилпропионовые кислоты, такие как (S)напроксен, (S)-ибупрофен и (S)-кетопрофен могут быть продуцированы с помощью (S)-энантиоселективной нитрилазы. Так, при взаимодействии рацемического 2-(4’-изобутилфенил)-пропионитрила с sp.

Acinetobacter AK226 выход S-2-(4’-изобутилфенил)-пропионовой кислоты (S-ибупрофена) составил 95% (Chen et al., 2009). (S)-прегабалин и (R)-баклофен были получены с высоким энантиомерным выходом и чистотой в результате биокатализа 3-замещенных глутаронитрилов с помощью нитрилазы BjNIT6402 из Bradyrhizobium japonicum USDA 110 и нитрилазы HsNIT из Herbaspirillum sp. GW103 (YiTao et al., 2014). Qiu с коллегами была изучена высоко (R)-энантиоселективная нитрилаза из Sphingomonas wittichii RW1, которая была клонирована в Escherichia coli BL21 (DE3). В результате биокатализа целыми клетками E. coli BL21/ReSWRW1 при pH=6,0 выход (R)фенилглицина составил 46% с энантиомерным избытком 95% (Qiu et al., 2014).

1.5. Биотрансформация бензамида

Молекулярная формула: С6Н5СНNН2, молекулярная масса 121,15, бесцветные кристаллы. Тпл = 132,5°С, Ткип = 290°С. Малорастворим в воде, хорошо растворим в горячей воде (Рабинович, Хавин, 1991).

Использовать бензамид в качестве источника азота и энергии способны многие бактерии. Так, по Brady деградировать бензамид могут представители таких родов, как Alkaligenes sp., Bacillus sp., Chryseomonas sp., Microbacterium sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp (Brady et al., 2006).

1.6. Биотрансформация бензонитрила Молекулярная формула: C6H5CN, молекулярная масса 103,13;

бесцветная жидкость с миндальным запахом. Тпл = -12,8°С, Ткип = 191,1 °С.

Плохо растворим в воде. Умеренно токсичен (Химия. Большой энциклопедический словарь, 1998).

Бензонитрил, как представитель органонитрилов, является представителем класса чрезвычайно токсичных веществ, которые воздействуют на различные уровни организации жизни, включая человека, и, как известно, обладают канцерогенными и мутагенными свойствами. Широко используется в промышленности как растворитель, в фармацевтической промышленности, а также как гербицид и пестицид (например, дихлобенил, бромоксинил), и т.д. Как следствие, органонитрилы часто содержатся в сточных водах (Li et al., 2007; Vesela et al., 2012).

Использовать, в качестве источника углерода, азота и энергии, бензонитрил способны многие бактерии, о чем свидетельствуют многочисленные публикации разных авторов (Таблица 1).

–  –  –

Li и коллеги сообщают о биодеградации бензонитрила смешанной бактериальной культурой. После 314-часового культивирования утилизируется 92,1% бензонитрила (Li et al., 2007).

Ингибирующими концентрациями бензонитрила для роста культуры были ниже 2мМ и выше 25мМ. Биодеградация осуществляется с помощью ферментов нитрилаз. Путь биодеградации бензонитрила представлен на рисунке 4.

Рисунок 4 – Путь биодеградации бензонитрила смешанной культурой Высокоспецифичная нитрилаза к бромоксинилу, иоксинилу и их хлорированному аналогу хлороксинилу была описана у Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenae (Vesela et al., 2012).

1.7. Энантиоселективная биотрансформация ароматических амидов и нитрилов Известно, что ферментативный катализ демонстрирует высокий уровень энантиоселективности (Vink et al., 2006). В результате подобных реакций образуется один энантиомер из рацемической смеси.

Энантиомеры – вещества, характеризующиеся противоположными по знаку и одинаковыми по величине вращениями плоскости поляризации света при идентичности всех других физических и химических свойств (Beard, 1998; Kus, Sochanic, 2007). Когда две зеркальные формы присутствуют в равных количествах, то смесь называют рацемической. Наиболее распространенная система для описания стереогенетических и асимметрических центров - Cahn–Ingold–Prelog последовательность, использующая R- и S-номенклатуру. Белки, кодируемые нуклеиновыми кислотами, используют L--аминокислоты, которые представлены в Sконфигурации, за исключением L-цистеина, который описан как R (Beard, 1998).

Ladik J.J. и Szekeres Z. показали с помощью молекулярнодинамического моделирования, что изменение хиральности в нескольких хиральных центрах фермента полностью меняет его вторичную структуру, что в итоге приводит к исчезновению каталитической активности. Таким образом, даже незначительные изменения в структуре молекулы могут представлять серьезную опасность для жизнедеятельности живых существ (Ladik, Szekeres, 2006).

Производство энантиомерно-чистого продукта становится все более важной проблемой в фармацевтической промышленности (Patel, 2005).

На данный момент известно, что во многих случаях только один стереоизомер лекарственного вещества является эффективным, тогда как другой либо неактивен, либо показывает значительно сниженную активность (Nugent et al., 1993; Patel, 2000; Csuk, 2006), в худшем случае он может иметь нежелатьную биологическую активность (Lennard, 1991).

Разница в фармакологической активности энантиомеров была известна с начала XX века, но до конца 1980-х годов она не учитывалась для производства лекарств и агрохимикатов (Csuk, 2006).



Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Похожие работы:

«Храмов Александр Валерьевич ЮРСКИЕ СЕТЧАТОКРЫЛЫЕ (INSECTA: NEUROPTERA) ЦЕНТРАЛЬНОЙ АЗИИ 25.00.02 Палеонтология и стратиграфия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Пономаренко Александр Георгиевич Москва 2014 Оглавление ВВЕДЕНИЕ Глава 1. История изучения юрских Neuroptera Глава 2. Отряд Neuroptera 2.1. Система и биология...»

«КОНОНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НОВЫХ СОРТОВ СТЕВИИ Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley ПРИ ВВЕДЕНИИ В КУЛЬТУРУ В ЦЕНТРАЛЬНОМ ПРЕДКАВКАЗЬЕ по специальности 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«Лёвкина Ксения Викторовна Влияние сроков, норм высева и удобрений на урожайность и качество зерна озимой твердой пшеницы в подзоне светло-каштановых почв Волгоградской области Специальность: 06.01.01 – общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«АСБАГАНОВ Сергей Валентинович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТРОДУКЦИИ РЯБИНЫ (SORBUS L.) В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. А.Б. Горбунов Новосибирск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 8 Ботаническая...»

«ТРИФОНОВА Кристина Эдуардовна Особенности распределения штамма мезенхимальных стволовых клеток в условиях опухолевого роста после сингенной трансплантации мышам линии C57BL/6 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«БАРИНОВА Ирина Владимировна Патогенез и танатогенез плодовых потерь при антенатальной гипоксии 14.03.02 – Патологическая анатомия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени доктора медицинских наук Научные консультанты: Заслуженный деятель науки РФ Доктор биологических наук, доктор медицинских наук, профессор профессор САВЕЛЬЕВ...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«ЖЕСТКОВА ДАРЬЯ БОРИСОВНА СОСТАВ И СТРУКТУРА ТРАВЯНИСТОГО ПОКРОВА ПРИДОРОЖНЫХ ТЕРРИТОРИЙ АВТОМАГИСТРАЛЕЙ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА Специальность: 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ТУНЁВ ВИТАЛИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ И ПРОМЫСЕЛ ПЕЛЯДИ Coregonus peled (Gmelin, 1789) ТАЗОВСКОГО БАССЕЙНА Специальность 03.02.08 – экология (биология) 03.02.06 – ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«Злепкин Дмитрий Александрович Теоретическое и практическое обоснование повышения продуктивности свиней и птицы за счет улучшения биологической полноценности кормления 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный...»

«КОВАЛЕВА АННА ВАЛЕРЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ ФИТОСИРОПОВ И ФИТОЭКСТРАКТОВ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ Специальность 05.18.01 – Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор...»

«РАХМАТУЛЛИН Рамиль Рафаилевич БИОПЛАСТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ НА ОСНОВЕ ГИДРОКОЛЛОИДА ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ И РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ХИРУРГИИ...»

«САФИНА ЛЕЙСЭН ФАРИТОВНА Анафилактический шок на ужаления перепончатокрылыми насекомыми (частота встречаемости, иммунодиагностика, прогнозирование) 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Кузнецова Татьяна Сергеевна ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РЕФРАКЦИОННОГО РЕГРЕССА ПОСЛЕ ЭКСИМЕР-ЛАЗЕРНОЙ КОРРЕКЦИИ БЛИЗОРУКОСТИ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ПРИ МЕХАНИЧЕСКОЙ И ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ ТЕХНОЛОГИЯХ ФОРМИРОВАНИЯ ЛОСКУТА РОГОВИЦЫ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«БАДМАЕВА АЛИЯ АЗАТОВНА ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ АДАПТОГЕНОВ НА ФОНЕ ДЕБИКИРОВАНИЯ ПТИЦ Специальность: 06.02.02ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биол. наук, профессор Р.Т. Маннапова Москва 2014 Оглавление ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Влияние дебикирования на организм...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ И ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.