«РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА ...»

Авторы отмечают, что в колонизации слизистой оболочки зева значительная роль принадлежит грамположительным коккам, преимущественно эпидермальному и золотистому стафилококкам и стрептококкам группы viridans. Отмечена частота выделения грамотрицательных кокков рода Neisseria, доля которых составила 11%, и грибов рода Candida, частота выделения которых составила 12% от общего количества изолятов.[77] Результаты проведённого исследования видового и количественного состава микрофлоры у больных с воспалительными процессами дыхательных путей в ряде других регионов Российской Федерации[62, 121] по основным показателям совпадали с данными по Московской области[80].

При обследовании 238 больных наблюдались различные дисбиотические состояния слизистых оболочек верхних дыхательных путей – от нормы с выделением стрептококков группы viridans, бактерий рода Neisseria, Stomatococcus, единичных изолятов S. epidermidis до III, тяжёлой, степени дисбиоза (обильный рост условно-патогенных бактерий в ассоциации с грибами).[62, 121] При дисбиозах слизистой оболочки носа преобладали коагулазоотрицательные стафилококки (КОС) – S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. xylosus (49,4%), доля S. aureus составляла 28,5%, в меньших количествах выделялись дифтероиды (9,5%), моракселлы (4,2%), гемофильные палочки (2,4%), -гемолитические стрептококки (1,2%), энтеробактерии (0,6%), грибы рода Candida (0,6%).[60] При дисбиозах слизистой оболочки зева преобладали S. aureus (34,3%) при значительном сокращении доли КОС – S. epidermidis (4,6%), S. haemolyticus (1,8%), возрастала роль -гемолитических стрептококков (16,2%), энтеробактерий – E. coli (2,8%), Klebsiella spp. (3,7%), E. aerogenes (1,4%), грибов рода Candida (25,5%). Значительно реже встречались дифтероиды (0,9%), моракселлы (0,9%), гемофильные палочки (0,5%), но выделялись неферментирующие глюкозу грамотрицательные бактерии - P. aeruginosa (2,3%), Acinetobacter spp. Проведённый сравнительный анализ результатов исследований микрофлоры больных с воспалительными процессами дыхательных путей позволил выявить ряд закономерностей. Наиболее часто при ГВЗ респираторного тракта выделяются грамположительные кокки.

Их этиологическая значимость в развитии воспаления по мере продвижения от верхних к нижним дыхательным путям уменьшается. Доля грамположительных кокков на слизистой оболочке носа составляет 80% всей выделенной микрофлоры, зева – 60%, в мокроте – 50%.[80, 121] В работе Миронова А.Ю.[80] отмечаются изменения видового и родового состава кокковой микрофлоры при гнойно-воспалительных заболеваниях респираторного тракта. На слизистой оболочке носа среди грамположительных кокков преобладают стафилококки (70-80%), со слизистой оболочки зева они выделяются в меньших количествах (30-40%), а в пробах мокроты составляют всего лишь 8-16%.

Среди стафилококков, как возбудителей гнойно-воспалительных заболеваниях респираторного тракта, большую роль играют коагулазоотрицательные стафилококки, частота выделения которых уменьшается от верхних к нижним дыхательным путям. При гнойно-воспалительных заболеваниях носа КОС выделяются в 47-49%, в зеве – 7-18%, в лёгких и бронхах – до 11%. Наиболее часто идентифицированным видом при гнойно-воспалительных заболеваниях респираторного тракта является S. epidermidis.[80, 121] Показано, что в настоящее время при бронхиальной астме возросла встречаемость поливалентной сенсибилизации, в том числе и к бактериальным аллергенам. 82,9% детей с данной патологией имеют сенсибилизацию к антигенам Staphylococcus aureus и 64,9% – к антигенам Esherichia coli. При этом антигены микроорганизмов могут индуцировать образование IgE антител, т. е. выступать в роли аллергенов. Автор отмечает, что особенностью инфекционной аллергии является гиперсенсибилизация, сочетающаяся с хроническим воспалением, при этом микроорганизмы оказывает двоякое действие: с одной стороны, аллергизирующее, с другой стороны, бактериальная инфекция вызывает хроническое неспецифическое воспаление.[85] В ряде работ убедительно показана антагонистическая активность нормальной микрофлоры носоглотки, которая обеспечивает защиту от носительства не только гемолитических стрептококков, но и факторов патогенности стафилококков, пневмококков, энтеробактерий.[21, 65, 204] Особенности взаимосвязи факторов иммунитета и инфекции, как динамичное противостояние живых систем подчеркиваются в работах.[7, 163, 205, 211] Показаны особенности фенотипической характеристики стафилококков и состояние местного иммунитета при бактерионосительстве в работе Карташовой О.Л.

с соавт.[52] Значение микробного антагонизма в формировании биоценозов слизистой оболочки кишечника, характерного для пробиотических препаратов, отражено в работах Бондаренко В.М.[16], Бухарина О.В.[19], Онищенко Г.Г.[92] и обзорных работах иностранных авторов.[148, 226] В основе антагонизма бактерий могут лежать различные механизмы как неспецифического характера (изменения рН и еН среды, продукция перекиси водорода, кислот, других метаболитов, а также истощение питательной среды за счёт интенсивного размножения микроба-антагониста), так и специфическая продукция антибиотических веществ.[78, 82, 161, 171] Наиболее выражен антагонизм при непосредственном контакте живых клеток в условиях микробного биоценоза (так называемый «прямой антагонизм»), когда осуществляется интенсивная продукция антибиотических веществ.[75, 119, 147, 180, 206] Среди антибиотических веществ определённое внимание исследователей уделено лизоциму, как регулятору микробного биоценоза.[11, 19, 67, 179, 238] Генетические факторы, регулирующие продукцию лизоцима, отнесены к плазмидам.[19] Из факторов экологической значимости в межмикробном взаимодействии важная роль отводится лизоциму микроорганизмов. Лизоцим относится к классу ферментов – мурамидаз. Субстратом действия лизоцима являются полисахариды клеточной стенки микроорганизмов. В настоящее время лизоцимная активность выявлена у микроорганизмов различных таксономических групп: грибов, простейших, бактерий, вирусов.[11, 18, 56] Лизоцим патогенов, участвуя в антагонизме бактерий, обеспечивает колонизацию и селекцию их в экологической нише и в частности стафилококков.[56] Доказана роль лизоцимной активности в селекции высоковирулентных штаммов стафилококка на миндалинах у больных. Установлена прямая корреляционная зависимость между лизоцимной активностью и бактериоциногенией у стафилококков и гемолитических стрептококков.[34, 56, 132] Лизоцимная активность нормальной микрофлоры, возможно, совместно с лизоцимом секрета слизистой оболочки, способствует стабилизации индигенной микрофлоры как слизистой оболочки верхних дыхательных путей, так и желудочно-кишечного тракта.[56, 211] Изучение лизоцимной активности лактобацилл, как представителей нормальной микрофлоры, показало, что лактобациллы образуют своего рода защитный биослой на слизистых оболочках.[86, 186, 227] В антагонистических механизмах межбактериальных взаимоотношений важную роль играет не только продукция членами биоценоза антагонистически активных веществ, но и умение им противодействовать. Развитие у микроорганизмов резистентности к факторам микробного антагонизма в экологической нише (антибиотикам, бактериоцинам, лизоциму, бактериофагу) рассматривается в качестве одного из показателей механизма колонизации и патогенеза бактерионосительства. [56, 129, 137, 216, 232] В первую очередь, внимание исследователей привлекает поражающая функция возбудителя. Чаще всего, она реализуется токсинами. Это обусловливает возникновение патологии определённого вида.[41, 50, 189] Как и большинство свойств поведенческого характера, токсинообразование, скорее всего, можно отнести к категории приспособлений, позволивших некоторым гетеротрофным бактериям занять новую «экологическую нишу», но одновременно сделавших эти бактерии небезопасными для эукариотических клеток.[132, 230] Механизм передачи генетической информации, детерминирующий продукцию токсинов, в одинаковой степени свойствен как патогенным, так и условно-патогенным микроорганизмам. Гены лекарственной устойчивости часто находятся на тех же мигрирующих генетических элементах (R-плазмиды), что и tox-гены.[47, 89] Распространение детерминант резистентности под давлением отбора, вызванного таким селективным фактором, как антибиотики, одновременно привело и к более широкому распространению генов токсигенности, особенно среди условно-патогенных бактерий.[12, 89, 235] Сам процесс адаптации к антибиотикам рассматривается как селекция устойчивых штаммов, которые распространяются в экологической нише.

Значение переноса устойчивости к антибиотикам, обусловленное наличием плазмиды, достаточно подробно освещено в работах, в которых подчеркивается и тот факт, что антибиотикорезистентность коррелирует с продукцией других антагонистически активных веществ, в частности лизоцима.[29, 78]Важно отметить, что наряду с токсинами, непосредственно действующими на клетки и ткани организма, бактерии могут образовывать ферменты, усиливающую общую интоксикацию. Описано патогенетическое значение протеолитических ферментов, биогенных аминов, ряда ферментов агрессии.[66, 67, 239] Как важный защитный фактор организма рассматривается кислотность кишечника.[129] В ряде работ представлена гипотеза метаболических взаимодействий между микробиоценозом различных отделов желудочно-кишечного тракта и организмом.[14, 21, 228] Характеризуя лизоцим как фактор врождённого иммунитета, авторы подчеркивают эволюционную составляющую этого фермента, поскольку лизоцим обнаружен практически у всех организмов. Выделено и изучено более 50 видов лизоцима из разных источников[18]. Все они состоят из одной полипептидной цепи и являются сильно основными белками (рН 10,5-11). Наиболее изучен лизоцим белка куриных яиц.[11, 19] Механизм действия лизоцима хорошо описан и обусловлен способностью этого фермента нарушать клеточную стенку бактерий и вызывать их лизис. Лизоцим оказывает стимулирующее воздействие на фагоцитоз, нейтрализует некоторые микробные токсины, обладает противовоспалительным действием. Лизоцим применяют как противомикробное средство в т. ч. как добавку в продукты питания для детей.[19].

В организме человека лизоцим является мощным защитным фактором слизистой оболочки полости рта, конъюнктивы глаза содержится в слезах, слюне, крови, материнском молоке, тканях различных внутренних органов. Высокая концентрация лизоцима выявляется в околоплодных оболочках и водах плода.

Основная масса лизоцима синтезируется, по-видимому, тканевыми макрофагами и нейтрофилами [19] В процессе эволюции у бактерий и грибов сформировались различные механизмы ингибирования лизоцима, определяемые как антилизоцимная активность микроорганизмов.[18] Абсолютные значения признака определяются не, только видовой принадлежностью микроорганизма, но и его нахождением в определённом биотопе.[19] В проведённых исследованиях подчеркивается, что плазмидная природа факторов лизоцимной активности, множественной устойчивости к антибиотикам, их связь с F+-плазмидой создают оптимальные условия для быстрого распространения в популяции признаков патогенности и селекции клонов с высокой колонизационной активностью в эконише.[65] Проведённые исследования содержания лизоцима в слюне показали, что с возрастом лизоцимная активность снижается.[141] При исследовании пациентов со стоматологической патологией, установлено, что у больных хроническим рецидивирующим афтозным стоматитом снижается функция неспецифической защиты слюны, что проявляется в снижении её лизоцимной активности.[56] Изучению перспектив анализа слюны в диагностических целях придаётся особое значение, что обусловлено целым рядом причин. Использование слюны может быть не только дополнительным методом в клинических исследованиях, но и имеет ряд преимуществ по сравнению с анализом крови и мочи: сбор слюны прост и удобен для случаев неклинических окружающих условий; он безболезненный; значительнее, чем при работе с кровью, снижается риск заражения медперсонала, содержание некоторых молекул (например, определённых гормонов, антител, лекарств) в слюне отражает их концентрацию в крови.[28, 56, 119, 166] Высказывается мнение, что расширение использования слюны в клиническом анализе поможет ускорить переход от диагностики заболеваний к наблюдению за здоровьем.[28, 101, 171] Относительно слабо разработан вопрос о специфических ингибиторах активности лизоцима. Гепарин ингибирует активность мурамидазы уже в концентрации 510-5.[18] Другие ингибиторы лизоцима на стадии исследования. Речь идёт о специфических ингибиторах, так как способность некоторых веществ выступать в роли антагонистов лизоцимной активности не подлежит сомнению.

К ним относятся низкомолекулярные продукты гидролиза, таким же действием обладают сахариды, близко родственные субстрату лизоцима. Предполагается существование в лизоциме трансглобулярного аллостерического перехода, вызываемого действием ингибиторов.[18, 28, 234] Проведённый обзор литературы по значению микробиоценоза и роли лизоцима в механизмах врождённого иммунитета заключается в том, что на начальном этапе колонизации патогенами экологической ниши одно из первостепенных мест занимает сочетанное действие факторов, результирующим показателем которых может служить степень «прямого антагонизма» представителей микробного биоценоза. По основным позициям данного процесса у исследователей существует единое мнение и единое направление исследований. В межмикробном взаимодействии определена важная роль обмена детерминантами генетической информации факторов колонизационной активности между членами симбиоза. В доступной литературе не представлена оценка влияния бактерионосительства на содержание лизоцима и гистамина в слюне, не проведено определение взаимосвязи их активности, что может явиться задачей исследования. Приведённые сведения определяют необходимость мониторинга региональных особенностей биологических свойств микрофлоры, что может расцениваться как одно из проявлений «искусственной эволюции» возбудителей инфекционных заболеваний в антропогенно измененной экосистеме при особых климато-географических условиях.

1.2. Биологическое значение лактобацилл Лактобациллы – микроорганизмы, широко распространённые в окружающей среде. Лактобациллы – микроаэрофильные, грамположительные бактерии, не образующие спор и не продуцирующие каталазу. Бактерии требовательны к составу питательных сред, нуждаются во внесении в них аминокислот, витаминов, жирных кислот, углеводов, производных нуклеиновых кислот. [73, 150] Разработана методика индикации и идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием полимеразной цепной реакции. Применяются нуклеотидные последовательности гена 16S рибосомной РНК молочнокислых бактерий депонированных в Gen Bank.[66, 126] Широко используется и более простая методика идентификации лактобацилл с помощью определителя Берджи по тестам сахаролитической активности, которая позволяет определить фенотипические свойства лактобацилл в условия биоценоза исследуемого организма.[42, 67] На основании продукции углекислоты из глюкозы, потребности в тиамине, ферментации фруктозы, продукции фруктозодифосфатальдолазы лактобациллы делятся на две группы: гомо- и гетероферментативные. Вопросы номенклатуры и таксономии бактерий рода Lactobacillus до настоящего времени окончательно не решены.[2, 73, 149] Лактобактерии входят в группу молочнокислых микроорганизмов, включающую представителей 11 родов: Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp., Camobacterium spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., Pediococcus spp., Tetragenococcus spp., Oenococcus spp., Vagococcus spp., Weissella spp. Род Lactobacillus объединяет 56 видов, из которых 5 подразделяют на два и более подвидов.[73] На основании результатов исследований нуклеотидных последовательностей 16S rRNA представители этого рода распределяются на три филогенетические группы: L. delbrueskii, L. casei, Leuconostoc. Представители рода рассматриваются на уровне семейства – Lactobacillaceae comb. nov. В составе семейства рассматривают три нуклеотидные группы: I (31-39% G+C), II (40-46% G+C), III (47-53% G+C). В соответствии с тремя нуклеотидными группами эти бактерии реклассифицируются на три рода: первый – с типовым видом L. acidophilus (32G+C), второй – с типовым видом L. casei (45-47% G+C), третий – с типовым видом L. delbrueskii (49-53% G+C) [21, 73].

Результаты молекулярно-генетического типирования производственных штаммов пробиотиков показывают, что молекулярно-генетическая идентификация производственных штаммов лактобацилл по гену 16S рРНК продемонстрировала полное совпадение с фенотипическим у L. plantarum 8-РА-З [2, 66]. У L.

acidophilus (NK-1, К3Ш24, 100 аш) и L. fermentum 90-ТС-4 последовательность 16S рРНК не соответствовала паспортным данным штаммов, полученным традиционными методами [2, 4]. Сравнение нуклеотидной последовательности их 16S рРНК с последовательностями в базе данных GenBank свидетельствует, что штаммы NK-1 и 100 аш, идентифицированные ранее как L. acidophillus, на самом деле относятся к L. helveticus, штамм L. acidophillus К3Ш24 – к группе L. casei/ paracasei, a L. fermentum 90-ТС-4 – к L. plantarum [2].

Поскольку ни одна из известных таксономических схем не получила общего признания [2], дифференциация видов рода Lactobacillus представляет значительные трудности и в практических лабораториях, как правило, проводится по фенотипическим признакам[42, 73], что определило в нашей работе использование феносистематики лактобацилл, изложенной в работе Левановой Г.Ф. и Ефимова Е. И.[73, 93] Молочнокислые бактерии являются важной составляющей нормальной микрофлоры пищеварительного тракта.[42] Лактобактерии, хотя и не являются доминирующими микроорганизмами кишечной микрофлоры, однако выделяются в значительном количестве из различных отделов кишечного тракта. Такие бактерии, как Lactobacillus acidophilus, L. salivarius, L. fermentum, L. plantarum, L.

casei, L. reuteri, L. gasseri, L. crispatus являются представителями лактобацилльной микрофлоры человека. В толстом кишечнике здоровых взрослых людей преобладают L. brevis (28%), L. plantarum (19%), L. acidophilus (12%), L. cellobiosus (9,5%), L. casei (9,5%).[21, 42, 73, 167] Одним из наиболее известных биологических свойств лактобацилл является выраженная способность к продукции молочной кислоты. Активность кислотообразования зависит от состава питательной среды и условий культивирования. Считают, что только L+-изомер молочной кислоты является биологически активной формой, которая быстро и целиком утилизируется организмом человека.[35, 193] Lactobacillus spp. проявляют антагонизм по отношению к грамотрицательным бактериям за счёт образования молочной кислоты, а антагонистическая активность по отношению к грамположительным бактериям связана с продукцией бактерицинов.[21, 36, 66, 192] Культуры L. casei, проявляют высокую степень антагонистической активности по отношению к S. flexnerii, B. subtilis, E. coli [116]. В отношении S. aureus и S. typhimurium выявлена вариабельность. У исследуемых L. сasei не выявлено связи между высокой степенью антагонизма и образованием молочной кислоты к грамотрицательным бактериям. Механизм действия лактобацилл к данной группе микроорганизмов определяется воздействием не только молочной кислоты, но и других факторов.[116] Наряду с описанием действия одного из бактерицидных факторов, подчеркивается необходимость оценки целого ряда биологически активных соединений, которые продуцируются лактобациллами, таких как молочная кислота, которая угнетает рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, лизоцим, бактерицидные вещества.[131, 142] При сравнительной оценке активности кислотообразования и антагонистической активности отмечено, что кислотообразующая активность, проявляемая бифидобактериями, имеет индивидуальный для каждого штамма характер, независимо от видовой принадлежности. Приведён пример, что среди представителей B. longum встречались, как выраженные (B. longum 58B), так и слабые (B.

longum 32В) кислотопродуценты. Среди лактобацилл представители видов L.

acidophilus и L. rhamnosus обладают более выраженной активностью кислотообразования, чем L. plantarum. Штаммы L. rhamnosus, являлись более сильными антагонистами, чем штаммы L. аcidophilus.[73] В механизме формирования колонизационной резистентности важная роль принадлежит кислотообразующей активности бактерий L. acidophilus 27L, которые обладают высоким кислотообразованием, но не имеют выраженной антагонистической активности. Это может означать, что продукция кислот – не единственный механизм антагонистической активности.

Антагонизм микроорганизмов обусловлен также скоростью размножения микробной популяции, конкуренцией за источник питания, выработкой других веществ, подавляющих условнопатогенные бактерии, в частности, лизоцима и перекиси водорода.[65, 73, 175] При исследовании влияния метаболитов Lactobacillus fermentum на ультраструктуру патогенных эшерихий, установлено, что бактерицидноподобные вещества лактобацилл при взаимодействии с патогенными эшерихиями вызывают у последних выраженные деструктивные процессы, приводящие к гибели клеток-мишений.[142] В ряде работ показано, что лактобациллы способны воздействовать на различные звенья иммунной системы, регулируя врождённый, а также адаптивный клеточный и гуморальный иммунитет.[8, 191, 217, 231, 237] Отмечается биологическая активность экзополисахаридов бактерий рода Lactobacillus для перспективы их использованияю.[105].

Одним из важнейших эффектов лактобацилл на иммунитет является формирование и активация Т- и В-клеточного иммунного ответа.[45] Как представителям микрофлоры желудочно-кишечного тракта лактобактериям принадлежит важная роль в поддержании местного иммунитета. Ассоциированные со слизистой оболочкой кишечника лактобациллы обладают универсальными иммуномодулирующими свойствами, которые включают как иммуностимуляцию, так и иммуносупрессию.[45, 160] Продукты метаболизма лактобацилл играют важную роль и в повышении неспецифической резистентности организма. Установлено, что стимуляция продукции цитокинов возможна не только в присутствии живых бактерий рода Lactobacillus.[90, 113] Определённое значение придается описанию видового разнообразия лактобацилл в возрастном аспекте. При изучении видового состава лактобацилл у клинически здоровых детей раннего возраста установлено, что доминирующими видами лактобацилл являются Lactobacillus acidophilus и L. rhamnosus.[104] Лактофлора у клинически здоровых детей первого года жизни представлена 7 видами: Lactobacillus acidophilus, L. rhamnosus, L. fermentum, L. plantarum, L. brevis, L. salivarius, L. delbrueckii spp. lactis. По частоте встречаемости лактобактерии распределились следующим образом. Наиболее часто (в 57,7% случаев) выделяли L. acidophilus, а L. rhamnosus выделены у 23,1% обследованных детей, L. plantarum – у 15,4%, L. fermentum – у 7,7%, L. brevis – у 3,9%, L. salivarius

– у 3,9%, L. delbrueckii spp. lactis – у 3,9% детей.[104] Лактобациллы выделены у 86,7% обследованных детей, общий их уровень в кишечнике составил 7,3±1,2 lg КОЕ/г. В 84,6% случаев лактофлора представлена одним видом лактобацилл, из которых наиболее часто автор выделяет L.

acidophilus. В 15,4% случаев отмечалось сочетание двух видов лактобацилл.[104] В исследованиях, проведенных Забировой Т.М.[42], отмечено, что представителями лактобацилльной микрофлоры человека являются такие бактерии, как Lactobacillus acidophilus, L. salivarius, L. fermentum, L. plantarum, L. casei, L.

reuteri, L. gasseri, L. crispatus. В толстой кишке здоровых взрослых людей преобладают L. brevis (28%), L. plantarum (19%), L. acidophilus (12%), L. cellobiosus (9,5%), L. casei (9,5%).[42] При изучении биологических свойств лактобацилл биотопов человека в норме и патологии установлено, что в видовом составе лактобацилл, выделенных из кишечника при дисбиозе у жителей города Оренбурга наиболее часто встречались такие виды как L. acidophilus и L. plantarum, составлявшие от 18 до 38% при отсутствии L. delbrueskii.[42] В биологическом значении лактобацилл исследователи отмечают их способность к выделению лизоцима, который является фактором врождённого иммунитета в организме, оказывает бактерицидное действие, стимулирует фагоцитоз, проявляет способность нейтрализовать некоторые микробные токсины, а так же проявляет противовоспалительное действие. Идентификация лактобацилл и количественная оценка их лизоцимной активности при дисбктериозе кишечника в условиях Севера не проводилась, что составило одну из задач исследований данной работы.

1.3. Микробный фактор образования свободного гистамина

Участие гистамина и биогенных аминов в жизнедеятельности здорового и больного организма является предметом многочисленных исследований, что отражено в работах Воропаевой Е.А.[23], Горкина В.З.[26], Гущина И.С.[31], Зарудий Ф.С.[43], Клюевой Л.А.[56], Куярова А.В. с соавт.[67, 68] Современные исследования о распределении, биосинтезе и метаболизме гистамина в различных тканях организма реализованы при диагностике ряда заболеваний.[56, 240] В отечественных работах представлены результаты при исследовании микробной экологии и состояния слизистой оболочки желудочнокишечного тракта у больных аллергическими заболеваниями[27, 77], при оценке микроэкологических нарушении и их коррекции при хроническом рецидивирующем афтозном стоматите[56], в исследованиях нейромедиаторных аминов, их предшественников и продуктов окисления в культуре Escherichia coli[91], при оценке роли факторов патогенности золотистых стафилококков в развитии атопического дерматита.[128] В ряде работ зарубежных авторов показана дифференциальная характеристика биогенных аминов бактериальной природы, участвующих в пищевых отравлениях[169, 184], значение гистамина в регуляции иммунокомпетентных клеток и антителообразовании[182, 201], содержания гистамина в ротовой жидкости при парадонтозе у лиц с вредными привычками.[156] В описании гистамина подчеркивается, что это нейромедиатор различных физиологических функций, один из центральных эндогенных медиаторов иммунитета, основной медиатор аллергии и воспаления.[31, 43, 56] Гистамин – 2,4-(2 аминоэтил)-имидазол является составным компонентом большинства органов и тканей. С точки зрения как отечественных, так и зарубежных исследователей гистамин способен быть биорегулятором своего собственного синтеза у человека.[43, 56, 202] В организме человека идентифицировано более 12 производных гистамина. Главным его источником служит аминокислота L-гистидин, подвергающаяся декарбоксилированию тканевыми и микробными ферментами. Этот процесс обеспечивается не только специфическим ферментом гистидин-декарбоксилазой, но и L-ароматической аминокислотной декарбоксилазой.[21, 43, 56, 215, 241] Наиболее высокая концентрация гистамина у здорового человека определяется в тканях, непосредственно соприкасающихся с внешней средой. Высокая концентрация гистамина обнаружена в коже век, головы, шеи, живота. Эпидермис содержит медиатора больше, чем другие слои кожи. Лишь костная и хрящевая ткани не содержат гистамина.[43, 56, 242, 243] В физиологических условиях гистамин находится преимущественно в связанном неактивном состоянии. Главным депо связанного гистамина являются мастоциты тканей (кожи, кишечника, печени, бронхов), базофилы крови. В слизистой желудка, двенадцатиперстной кишки присутствует до 80% связанного медиатора (специфическое тканевое депо) и 20% – в тучных клетках (неспецифическое тканевое депо).[43, 56] Свободный гистамин в дальнейшем может подвергаться гидролитическому дезаминированию с помощью фермента диаминооксидазы (гистаминазы), присутствующего в тканях и крови, а также инактивироваться тканевой гистамин-метилтрансферазой.[26, 56] Значение микроорганизмов в высвобождении гистамина показано на модели тучных клеток и базофилов. Установлена способность индуцировать выделение свободного гистамина гемофильными бактериями и такими представителями микрофлоры кишечника человека как, E. coli с гемолитической активностью и C. albicans. Решающую роль при этом играют бактериальные адгезины, обеспечивающие контакт с клетками-мишенями и гемолизины, вызывающие функциональную и структурную дезорганизацию плазматических мембран.[31, 43, 56, 172, 177, 229] Не только бактериальные клетки, но и их органеллы способны вызывать высвобождение гистамина из базофилов и тучных клеток. Наибольшую активность проявляют в этом плане пептидогликаны и, в меньшей степени, тейхоевые кислоты. Способность высвобождать гистамин из различных депо человека отмечена у S.

aureus, P. aeruginosa, E. Coli.[23, 43, 56, 185] Важную роль в увеличении выхода гистамина из клеточного депо организма хозяина играют эндотоксины грамотрицательных бактерий.[23, 56, 108] Тот факт, что образование свободного гистамина из эукариотических клеток под действием микробного фактора имеет место при удаление IgE и IgG c поверхности базофилов, свидетельствует о возможности неиммунного механизма взаимодействия микроорганизмов с клетками-мишенями. В его основе лежат лектинообусловленные реакции.[43, 56, 72] При взаимодействии углеводов микроорганизмов с лектинами тучных клеток, макрофагов и других клеток организма нарушается целостность мембран эукариотов и происходит высвобождение гистамина.[43, 56] Благодаря существованию лектиноопосредованных механизмов высвобождения гистамина, различные микроорганизмы могут вызывать однотипные реакции у одних и тех же индивидуумов.[43, 56, 72, 183] Возможности микроорганизмов участвовать в процессе высвобождения гистамина как за счёт иммунных, так и неиммунных механизмов представлены в следующих работах. Индуцированное микробными антигенами высвобождение гистамина тесно коррелирует с уровнем сывороточных IgE.[43, 77] В работе Матвеевой Н.И. показано, что для детей с круглогодичным аллергическим ринитом нарушение микрофлоры носа как в период обострения, так и ремиссии связано с персистентным бактерионосительством S. аureus (более 60% случаев, КОЕ 103). При сезонном аллергическом рините доминирует бактерионосительство S.

epidermidis с гемолитическими свойствами (более 54% случаев, КОЕ 103). Течение аллергического ринита характеризуется достоверным повышением общего IgЕ при сезонном аллергическом рините в 3,9 раза, при круглогодичном – в 1,5 раза.[77] Реализация реакции «антиген-антитело», наряду с высвобождением гистамина, сопровождается выделением и других веществ, участвующих в реализации иммунных реакций.[31, 43, 115] Примером участия микробного фактора одновременно в двух названных механизмах могут быть следующие данные. Базофилы больных с хроническими отитами, у которых наблюдалась гиперпродукция IgE к антигенам S. aureus, в смеси со стафилококком высвобождали гистамин при наличии на их поверхности IgE. С другой стороны, штамм S. aureus Wood-46 индуцировал высвобождение гистамина вне зависимости от присутствия на поверхности этих базофилов иммуноглобулинов. Добавление смеси бактерий к базофилам, изолированных от больных или здоровых лиц, резко увеличивало выход гистамина из клеток.[43] Предполагается, что неиммунные механизмы высвобождения гистамина в естественных условиях имеют большее значение, чем иммунные, работающие к тому же относительно короткий промежуток времени.[31, 43] Особое внимание в обзоре литературы нами уделено биологическому значению процессов декарбоксилирования у бактериальных клеток, поскольку показано, что представители родов Acinetobakter, Pseudomonas, Proteus, Cоrynebacterium, Staphylococcus, Streptococcus, присутствующие транзиторно или постоянно на коже и слизистых оболочках, могут декарбоксилировать биологически активный амин.[4, 20, 43, 56, 66] Отмечено, что количество микроорганизмов с декарбоксилирующей активностью на слизистой оболочке носоглотки больше у больных, чем у здоровых людей.[20, 26, 64, 67] У энтеробактерий, поддерживающих эубиоз и вызывающих его нарушение в кишечнике, определена сильная степень корреляционной связи частоты декарбоксилирования орнитина, лизина, аргинина, гистидина, что свидетельствует о возможной активации к декарбоксилированию одновременно разных субстратов.[67, 68] В работе Landete J. M.[188] показано выделение двух различных групп декарбоксилаз микроорганизмов – пиридоксальфосфат- и пируватзависимые. Пиридоксальфосфатзависимые гистидиндекарбоксилазы встречаются у грамотрицательных бактерий, принадлежащих к различным видам. Пируватзависимые гистидиндекарбоксилазы имеются у грамположительных бактерий и, в частности, у молочнокислых бактерий.[188] Как различные пиридоксальфосфат-, так и различные пируватзависимые гистидиндекарбоксилазы, выделенные из разных видов бактерий имеют существенные отличия в аминокислотном составе, каталитическом поведении, физических свойствах.

Eстановлена высокая степень идентичности последовательностей генов пиридоксальфосфатзависимых гистидиндекарбоксилаз бактерий, а также то, что пируватзависимые гистидиндекарбоксилазы произошли от общего родового белка и имеют сходные каталитические механизмы. Гены описанных пиридоксальфосфатзависимых гистидиндекарбоксилаз бактерий локализуются в плазмидах.[188] Локусы, кодирующие пируватзависимые гистидиндекарбоксилазы, у разных видов изученных грамположительных бактерий, в том числе лактобацилл, могут находиться в хромосомах или в плазмидах. Cпособность бактерий к образованию гистамина у разных видов бактерий может быть устойчивой (при локализации гена декарбоксилазы в хромосоме) или неустойчивой и передающейся горизонтально (при локализации данного гена в плазмиде).[188] Декарбоксилирование по биологическому значению ферментов для жизнедеятельности микроорганизмов представляет собой защитный механизм, при помощи которого клетка предотвращает сдвиг реакции в кислую сторону, неблагоприятную для развития микроорганизма.[68] Декарбоксилирование аминокислот позволяет продлить период достаточно высокого внутриклеточного рН и использовать декарбоксилирование аминокислот как источник метаболической энергии.[91, 180] Предполагается, что процесс декарбоксилирования играет определённую роль в механизмах взаимодействия бактерии-продуцента гистамина с другими микроорганизмами и организмом при поддержании плотности продуцента гистамина.[68] Возможное значение декарбоксилирования аминокислот заключается ещё и в том, что выделяющаяся при этом углекислота необходима для участия в синтезе ряда веществ, например, дикарбоновых кислот.[68, 180] Исследованием декарбоксилирующей активности бактерий при дисбактериозе кишечника установлено увеличение частоты штаммов E. сoli, декарбоксилирующих субстрат гистидин, при всех наиболее часто встречаемых вариантах дисбактериоза кишечника. Увеличение декарбоксилирующей активности среди изолятов E. сoli наблюдалось при уменьшении количества типичных E. сoli, при снижении их ферментативной активности (E. сoli lac-) и приобретении гемолитической активности (E. сoli Hly+). Выраженной способностью декарбоксилировать гистидин обладали изоляты типичной E. сoli при уменьшении их количества в кишечнике в 56,3% случаев, а E. сoli с гемолитической активностью в 68,8% случаев.[68] В исследованиях этих авторов убедительно показано, что при проявлении дисбактериоза кишечника различной степени установлено достоверное отличие содержания свободного гистамина в кале при усугублении дисбиотических нарушений. Количество гистамина повышалось от уровня нарушения биоценоза монокультурами к уровню ассоциативных изменений по трём и четырём показателям.[67, 68] Представленные выше материалы обзора литературы свидетельствуют, что микробному фактору принадлежит важная роль в механизмах регулирования содержания свободного гистамина в организме, а его увеличенное количество может обусловливать патофизиологические эффекты, связанные с особенностями состояния биоценоза.

Понимание роли гистамина в механизме развития различных аллергических заболеваний послужило основанием для исследования содержания этого медиатора в различных пищевых продуктах [56] и оценки контаминации продуктов питания бактериями с выраженной гистидиндекарбоксилирующей активностью.[67, 125] Представлено мнение о том, что аллергические заболевания могут развиваться только в результате срыва иммунорегулирующих механизмов и, прежде всего, нарушения функции иммунорегулирующих клеток.[135] В этом плане гистамин заслуживает самого пристального внимания. Гистамин активирует супрессорные функции CD8 клеток через Н2-рецепторы; ингибирует цитотоксическую и хелперную активность Т-лимфоцитов; подавляет ответ на митогены, синтез антител, продукцию фактора угнетающего миграцию макрофагов.[31, 43, 67, 135] Эти эффекты гистамина могут играть положительную роль в обратном развитии ГНТ, однако, при нарушении механизмов инактивации и деградации гистамина эти же свойства его вызывают срыв иммунорегуляторных механизмов.

[31, 135] Особое внимание привлекли работы, свидетельствующие о том, что фармакологически значимые концентрации гистамина могут создаваться в ацидофильном молоке, йогуртах, сыре, как за счёт их контаминации гистаминобразующими бактериями, так и за счёт использования стартерных культур, способных продуцировать этот и другие амины. Бактерии, применяемые для ферментации молока, получения кисломолочных продуктов и обладающие гистидиндекарбоксилирующей активностью, преимущественно принадлежат к S. faecium, S.

mitis, L. bulgaricus, L. plantarum, L. вuchneri.[67, 68] В эксперименте показано, что у большинства млекопитающих (кроме крыс) в слизистой оболочке желудка гистаминаза не определялась, тогда как, гистидиндекарбоксилаза обнаруживалась в различных отделах желудочно-кишечного тракта. Гистамин в желудочно-кишечном тракте может синтезироваться в значительном количестве, а разрушаться довольно медленно.[43] Защитные механизмы излишнего образования гистамина в кишечнике и проникновения его в организм, очевидно, самые различные.[26] Значительный синтез гистамина отмечают в желудке. Предполагается, что в патогенезе язвенной болезни существенную роль играет высвобождение больших количеств гистамина при сенсибилизации домашней пылью, плесневыми грибами, пищевыми аллергенами [107]. Внимание в этих работах привлекли результаты, которые показывают, что при обследовании больных язвенной болезнью у 64,0% из них имеются атопические аллергические заболевания.[56, 107] Участие микроорганизмов в синтезе гистамина порождает вопрос об их возможности к деструкции данного медиатора. Публикации по данному вопросу отразили, в основном, характеристику микроорганизмов, контаминирующих пищевые продукты.[56, 68, 125] Ряд обзорных работ, опубликованных в последние годы, свидетельствует о необходимости дальнейшей проработки вопроса о доминирующих механизмах образования и накопления гистамина в организме.[31, 56, 91] Выделено три основных процесса, которые могут способствовать появлению свободного гистамина. Большое внимание придаётся высвобождение медиатора из тканевого депо за счёт иммунных и неиммунных механизмов.[43, 59] Определённое значение имеет поступление гистамина с продуктами питания.[43, 68] В ряде работ представлено положение о роли микроорганизмов в образовании гистамина в организме хозяина.[43, 195, 200] Проведённый обзор литературы свидетельствуют, что микробному фактору может принадлежать роль механизма в значительной степени регулирующего количество свободного гистамина в организме. Увеличенное количество свободного гистамина, в свою очередь, может обуславливать патофизиологические эффекты, связанные с особенностями микроэкологических состояний. Из тех же приведённых работ следует, что микробный фактор, как регулирующий механизм метаболизма гистамина, остался вне поля активного внимания исследователей. Необходимы целенаправленные исследования для детализации участия микрофлоры хозяина в процессах образования и ассимиляции свободного гистамина в определённых условиях и состояниях. Это может способствовать выбору наиболее перспективного направления профилактики синдромов, патофизиологически связанных с гистамином и разработке приёмов, обеспечивающих коррекцию содержания свободного гистамина в тканях организма.

1.4. Подбор пробиотических штаммов лактобацилл Бактериотерапия использует принцип, который сформулирован Ильей Ильичем Мечниковым, в использовании живых микроорганизмов в лечебных и профилактических целях. В многочисленных современных работах пристальное внимание исследователей привлечено к определённым эффектам лечебно-профилактического действия пробиотиков-микроорганизмов представляющих нормальную микрофлору организма человека[3, 120, 122, 123, 156, 207, 208] и, в частности, кисломолочных бактерий.[2, 56, 103, 111] Выделено применение пробиотиков для профилактики и лечения кишечных инфекций, выявлены положительные эффекты от их использования при регуляции газового состава кишечника, ферментной активности, водно-солевого обмена, метаболизма желчных кислот и холестерина, в комплексе лечения хронического рецидивирующего афтозного стоматита.

[56, 76, 140, 145] Показана эффективность морфокинетического действия[99, 196], иммуногенного и противоопухолевого влияния[90, 130], продукции биологически активных соединений[142] и лизоцимной активности ротовой жидкости.[56] Ряд работ посвящен вопросам создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры организма при долговременном введении в организм пробиотиков[146], методическим приёмам конструирования микробных сообществ биопрепаратов.[35, 104, 198] Описаны механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus spp. и энтерококков[94, 123], селекции лактобацилл для разработки кисломолочных продуктов лечебно-диетического назначения.[56, 104, 152, 188] Определенное значение исследователей придаётся оценке эффективности бактерийных препаратов по совокупности биологических свойств штаммов, входящих в их состав.[2, 48, 68, 131] Учитывается расширение спектра культур, используемых в составе пробиотиков, включая в их рецептуру одновременно представителей споровых аэробных бацилл (род Bacillus), представителей энтерококков, пропионовокислых бактерий, коринебактерий, сахаромицетов.[2, 3, 27, 176, 215] Отмечено повышение биологической активности пробиотиков, в разработке которых использованы комплексы препаратов на основе специально подобранных композиций штаммов, сочетания компонентов пре- и пробиотического происхождения, а также добавки продуктов метаболизма микрофлоры и нетрадиционного сырья природного происхождения.[2, 66, 87, 98, 105, 211, 213] В плане выбора стратегии и тактики создания и применения биопрепаратов из живых микробных культур, особое значение имеет характер взаимоотношений макро- и микроорганизма.[5, 56, 234] Эти направление, в числе важных, обозначено в работе Алёшкина В.А. по проблеме становления пробиотикотерапии в России.[17] Молекулярно-клеточные механизмы иммуномодулирующего действия пробиотиков рассмотрены в обзоре Бондаренко В.М.[16] Автор подчёркивает, что основе действия указанных препаратов лежит способность поверхностных структур и ДНК применяемых симбиотических бактерий взаимодействовать с Tollподобными рецепторами. При этом большое значение имеют как живые клетки бактерий пробиотических штаммов, так и их метаболиты и антигенные комплексы, опосредующие сигнальные пути после завершения лиганд-рецептороного контакта с дендритными, эпителиальными и другими иммунокомпетентными клетками. Важно, что пробиотические свойства препарата вкупе с иммуномодулирующей активностью интродуцента в значительной мере зависят от используемого штамма пробиотика. Только клинические данные позволяют выбрать оптимальный лечебно-профилактический пробиотический препарат.[16] В обзоре Федоровой И.А. и Даниленко В.Н.[130], посвящённого иммуногенным свойствам пробиотического компонента микробиоты желудочно-кишечного тракта человека, приводятся сведения, что в поиске иммуномодулирующих молекул клеточной стенки бактерий в настоящее время полисахариды и гликолипиды считаются более адекватными мишенями. Авторы приводят сведения, что экзополисахариды, продуцируемые некоторыми штаммами лактобацилл, проявляют селективные иммуномодулирующие свойства, подавляя иммунную реакцию вопреки не только своему стимулирующему компоненту, но и другим индукторам, в частности, липополисахаридам. Липотейхоевую кислоту относят к основным иммуностимулирующим компонентам клеточных стенок грамположительных бактерий через TLR2, а также к ряду пробиотических эффекторных молекул, способных индуцировать секрецию противовоспалительного IL-10.[130] Характеризуя значение микроорганизмов, поступающей в желудочно-кишечный тракт с пищей, водой и воздухом ряд авторов отмечают, что регулярное поступление определённой микрофлоры оказывает гораздо большее воздействие на формирование нормальной микрофлоры организма человека, чем это считалось ранее. [19, 56, 76] В нормальной микрофлоре организма человека выделяют две группы микроорганизмов.[40] Эндогенная, которая обнаруживается постоянно в значительных количествах в различных отделах пищеварительного тракта и экзогенная микрофлора, регулярно поступающая в пищеварительный тракт извне, которая оказывает действие на организм преимущественно в период поступления. Она может обнаруживаться в относительно небольших количествах.[40, 56] Исходя из вышесказанного, авторы классифицируют пробиотические препараты следующим образом. Бифидобактерии относят к препаратам, включающим представителей эндогенной аутофлоры, а лактобактерии – к биопрепаратам, несущие признаки и экзо- и эндогенной нормальной микрофлоры. Примером экзогенной являются бактерии рода Bacillus spp.[54, 59, 140] Бактерии каждой из указанных групп, при воздействии на организм в каких-то звеньях носят сходный характер, а в каких-то – значительно разнятся. Экзогенная микрофлора уже в верхних отделах дыхательных путей и пищеварительного тракта проявляет антагонистическое действие на патогенные и ус-ловнопатогенные микроорганизмы.[56] Благодаря адгезивной и ферментативной активности участвует в процессе пищеварения и оказывает положительное влияние на организм, продуцируя физиологически активные вещества.[23, 120, 221] Предполагается быстрое проникновение в кровяное русло и органы поступающих извне экзогенных групп нормальной микрофлоры, что является звеном естественного механизма стимуляции неспецифических и других механизмов защиты организма от инфекции.[72, 95, 225] Предлагаемые Червинец Ю.В.[139] принципы рационального конструирования микробных препаратов во многом согласуются с предложениями других авторов и включают критерии антагонистической активности, умеренного кислотообразования, учёт адгезивности, природного синергизма.[56, 84, 98] Наряду с указанными позициями предлагается учитывать бактериоциногенные параметры, антибиотикоусточивость, иммуномодулирующую активность, моделирование на животных-гнотобионтах.[3, 19, 56] Приводится обоснование конструирования пробиотиков на основе генетически модифицированных штаммов на примере Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis[57], пропионобактерий[176], коринебактерий.[145] При отборе производственно-перспективных штаммов руководствуются системой предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов.[83] Из биологических свойств микроорганизмов авторы выделяют наиболее общие таксономические характеристики: микроаэрофилы, неподвижные, грамположительные палочки, пигмент продуцируют редко, спор не образуют, не продуцируют каталазу, не восстанавливают нитраты в нитриты, цитохромная система отсутствует, обладают хорошо выраженной сахаролитической активностью.[83, 93] В работе Алёшкина А.В.[2] отмечено, что при биохимической идентификации отобранных производственно перспективных микроорганизмов применение стандартных коммерческих тест-системы унифицирует методический подход идентификации микроорганизмов, но ограничивает диапазон исследования ряда биохимических показателей, необходимых для оценки бактерий к колонизации и персистенции.