WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

«Разработка промышленной технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2b ...»

-- [ Страница 4 ] --

Хроматограмма тонкой очистки интерферона альфа-2 представлена на рисунке 35. В процессе регенерации колонны наблюдали пик, который собирали в отдельную емкость.

Анализ фракций пика целевого белка проводили методом ОФВЭЖХ и ЭФ в ПААГ. Результаты анализа методом ОФВЭЖХ показали высокую чистоту получаемого препарата, содержание белка в суммарной фракции превышает 98,5±0,5 %. Данные по анализу фракций целевого пика и пика регенерации методом ЭФ в ПААГ представлены на рисунке 36.

Рис. 35. Хроматограмма тонкой очистки интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте YMC Biopro S30 Рис. 36. Результаты анализа фракций пика целевого белка методом ЭФ в ПААГ (восстанавливающие условия) Как видно из рисунка 36, фракции целевого пика содержали незначительные количества исследуемой примеси (не более 0,05 %). Основная масса примеси сходила с колонны в процессе регенерации, что свидетельствует о высокой эффективности разработанного процесса тонкой очистки.

Выход интерферона альфа-2 со стадии составил 85±0,42 %, чистота целевого белка в суммарной фракции превысила 98,5±0,5 % по данным ОФВЭЖХ.

2.2.2.3. Стадия концентрирования интерферона альфа-2 Перед переводом белка в буфер хранения необходимо осуществить его концентрирование в 2-5 раз. Данный процесс связан с тем, что использование гельфильтрационного сорбента на последней стадии очистки сопровождается снижением концентрации белка.

Процесс концентрирования белка осуществляли методом катионообменной хроматографии. В качестве сорбента использовали CM Sepharose FF. Схема проведения процесса была аналогична схеме, используемой на с тадии предварительной очистки. Хроматограмма процесса концентрирования предс тавлена на рисунке 37.

Рис. 37. Хроматограмма концентрирования интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте CM Sepharose FF Выход со стадии составляет 95±1 %. Чистота целевого белка – более 99±0,5 % (по данным ОФ ВЭЖХ).

2.2.2.4. Стадия перевода интерферона альфа-2 в буфер хранения На завершающем этапе безметиониновый интерферон альфа-2 переводили в буфер хранения следующего состава:

буфер SE: 50 мМ AcNa; 0,5 мМ ЭДТА; pH 5,0.

Процесс проводили с помощью гель-фильтрационной хроматографии на сорбенте Superdex 75, позволяющем разделять глобулярные белки с диапазоном молекулярным весов: 15-100 кДа. В данный диапазон попадает мономер интерферона альфа-2 и его димер. Таким образом, выбранный сорбент помимо смены буферного раствора параллельно позволял удалять димерные и олигомерные формы интерферона альфа-2.

Хроматограмма очис тки на Superdex 75 представлена на рисунке 38.

Рис. 38. Хроматограмма очистки интерферона альфа-2 на гельфильтрационном сорбенте Superdex 75 Результаты анализа фракций целевого пика методом ЭФ в ПААГ представлена на рисунке 39. Из предс тавленных данных видно, что фракции левого плеча целевого пика содержат значительное количество агрегированных форм, что свидетельствует о высокой эффективности отделения высокомолекулярных примесей.

Рис. 39. Анализ фракций пика интерферона альфа-2 при проведении очистки на сорбенте Superdex 75 (невосстанавливающие условия) Потери на данной с тадии составляют не более 5 %, чистота суммарной фракции по данным ОФВЭЖХ составляет более 99% ±0,5 %.

Далее осуществляли нормирование концентрации полученной субстанции до 1 мг/мл путем разведения буфером хранения.

Таким образом, задача получения высокоочищенной субстанции интерферона альфа-2 решена путем разработки четырехстадийной схемы с использованием катионообменной и гель-фильтрационной хроматографий. Схема очистки представлена на рисунке 40.

Рис. 40. Схема хроматографической очистки интерферона альфа-2

На рисунке 41 представлена электрофореграмма суммарного образца после каждой стадии очис тки.

Разработанная схема очис тки позволяет получать субстанцию высокоочищенного интерферона альфа-2 с содержанием целевого белка более 99±0,5 % и выходом 76 ±3 мг / 1 г т.в., что характеризует ее как эффективную технологию.

Рис. 41. Результаты анализа суммарной фракции интерферона альфа-2 с промежуточных стадий методом ЭФ в ПААГ Технология ренатурации и очистки была масштабирована и перенесена на производство ООО «Фармапарк». В рамках валидации было установлено, что разработанный процесс является стабильным и воспроизводимым. Результаты выпуска трех установочных серий представлены в таблице 8.

–  –  –

Разработанная масштабированная схема ренатурации и очистки позволяет в среднем получать 11,5±0,5 г кондиционного продукта, полностью отвечающего требованиям европейской фармакопеи. Технологическая схема разработанного процесса представлена на рисунке 42.

–  –  –

На следующем этапе стояла задача разработки технологии получения пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2b. Процесс присоединения молекул ПЭГ осуществляется в ходе реакции нуклеофильной атаки, в результате образуются продукты с различным содержанием ПЭГ, из которых целевым является монопегилированная форма интерферона, которая так же отличается гетерогенностью. В случае интерферона альфа-2b модификации подвергаются три типа сайтов: N – концевая аминогруппа, остаток гистидина в положении 34, группа лизиновых изоформ. В случае интерферона альфа-2а модификации подвергаются только остатки лизина. Для проведения реакции пегилирования использовали сукцинимидилкарбонат ПЭГ с молекулярным весом 12 кДа и линейной структурой в случае интерферона альфа-2b и гидроксисукцинимидилэфир ПЭГ с молекулярным весом 40 кДа и разветвленной структурой в случае интерферона альфа-2а.

2.2.3.1. Разработка процесса пегилирования интерферона альфа-2b В процессе анализа литературы было обнаружено, что процесс пегилирования интерферона альфа-2b описан только в 1 печатной работе [122]. Условия реакции пегилирования, указанные в данной работе, были использованы в качестве исходной точки эксперимента:

состав реакционного буфера: 100 мМ NaP, pH = 6,5; соотношение белок / ПЭГ 1 к 2,6 по массе; продолжительность реакции 70 минут при комнатной температуре; исходная концентрация белка 5 мг/мл. Данные условия проведения процесса были использованы в качестве исходной точки эксперимента.

На первом этапе был проведен поиск пос тавщика активированного ПЭГ. В качестве двух основных критериев приемлемости качества ПЭГ были выбраны:

выход целевой монопегилированной формы и с табильнос ть процесса при использовании различных лотов ПЭГ. Были исследованы активированные ПЭГ производства компаний Biosolve BV (Израиль), Nof corporation (произведенный в условиях GMP) (Япония), Nof corporation (произведенный не в условиях GMP) (Япония), Nanocs (США). Процесс проводили в условиях эксперимента, описанных в литературе. Анализ продуктов реакции пегилирования осуществляли методом аналитической гель-фильтрации. Полученные результаты представлены в таблице 9.

Максимальный выход монопегилированной формы достигается при использовании активированных ПЭГ производства компаний Nof Corporation (GMP) и Biosolve BV. Однако, активированный ПЭГ Biosolve BV продемонстрировали значительный разброс выхода монопегилированной формы (от 30 до 40 %) в зависимости от используемого лота. При использовании ПЭГ Nof Corporation (GMP) разброс в 5 различных лотах составил не более 1,5 %. Таким образом, для дальнейшей работы были выбран активированный ПЭГ производства компании Nof Corporation (GMP).

–  –  –

При проведении процесса пегилирования с выбранным ПЭГ в условиях, описанных в литературе, выход целевой монопегилированной формы составлял 40 % от общего количес тва продуктов реакции пегилирования. Из 100 мг интерферона и 260 мг ПЭГ в исходных условиях реакции получали 40 мг монопегилированной формы. В составе 40 мг монопегилированной формы входит 15,5 мг ПЭГ и 24,5 мг интерферона альфа-2b. Таким образом, эффективность реакции по ПЭГ составляет 6 %, по интерферону 24,5 %. Столь низкая эффективнос ть по ПЭГ является неприемлемой по причине его высокой стоимости.

Еще одной важная проблема заключалась в несоответс твии изоформенного состава получаемого в результате реакции продукта изоформенному составу препарата Пегинтрон, что было установлено в процессе анализа изоформенного состава методом аналитической катионообменной хроматографии (данные представлены на рисунке 43).

На рисунке 43 и далее цифрами 1 – 8 обозначены следующие изоформы: 1His34; 2 –Y129; 3 – K131+K164; 4 – K121; 5 - K83; 6 – K49; 7 – K112; 8 – C1.

Как видно из рисунка 43, соотношение изоформ в образцах отличается. К примеру, относительное содержание пика 6 в исследуемом образце значительно больше по сравнению с коммерческим препаратом. Изоформенный состав является важнейшей характеристикой пегилированных препаратов, так как он способен влиять на физико-химические и биологические свойства.

Рис. 43. Анализ изоформенного состава монопегилированного интерферона альфа-2b, полученного при проведении процесса в стандартных условиях, и коммерческого препарата Пегинтрон методом аналитической катионообменной хроматографии на сорбенте TSKgel SP-5PW Низкий выход процесса пегилирования, а так же несоответс твие изоформенного состава свидетельствуют о том, что приведенные в литературе параметры проведения реакции пегилирования требуют оптимизации.

2.2.3.1.1. Оптимизация значения рН реакционного буферного раствора Первом шагом на пути оптимизации процесса пегилирования интерферона альфа-2b являлась оптимизация изоформенного состава получаемого продукта.

Известно, что изоформенный состав целевого продукта зависит от значения рН буферного рас твора. В зависимости от рН происходит депротонирование тех или иных групп аминогрупп, что является необходимым условием для проведения процесса конъюгации по данным группам.

К раствору белка с концентраций 2 мг/мл добавляли фосфат натрия до конечной концентрации 100 мМ для создания буферной емкости и доводили значение рН до 6,0 – 7,4 ед. (с шагом 0,2) Соотношение белок – ПЭГ в реакционной смеси составляло 1 к 3 по массе. Процесс проводили в течение 2 часов при комнатной температуре. Реакцию пегилирования останавливали добавлением глицина до конечной концентрации 20 мМ. Оценку изоформенного состава полученного препарата осуществляли с помощью аналитической катионообменной хроматографии. Полученные результаты представлены в таблице 10.

–  –  –

Приведенные результаты демонстрируют, что при проведении процесса пегилирования при значении рН реакционного буферного раствора 6,8 ед. изоформенный состав монопегилированного интерферона альфа-2b соответствует изоформенному составу коммерческого препарата Пегинтрон. Данное значение рН является оптимальным для проведения процесса пегилирования, получаемый при этом профиль изоформ позволяет избежать дополнительных стадий очистки. При проведении процесса при значениях рН выше 6,8 ед. значительно увеличивается относительное содержание лизиновых изоформ, при значениях рН ниже 6,8 – N – концевой изоформы.

Параллельно исследованию изоформенного состава в проведенных экспериментах так же определяли соотношению основных продуктов реакции (ДиПЭГИНФ, МоноПЭГИНФ, ИНФ) методом гель-фильтрационной хроматографии. Зависимость содержания монопегилированной формы от значения рН реакционного буфера представлена на рисунке 44.

–  –  –

44 42 38

–  –  –

Рис. 44. График зависимости относительного содержания монопегилированной формы интерферона альфа-2b от значения рН реакционного буфера Было установлено, что при повышении значения рН увеличивается выход целевой монопегилированной формы. Увеличение значения рН с 6,5 ед. (стандартные условия) до 6,8 ед. (оптимизированные условия) позволяет увеличить выход процесса пегилирования в среднем на 2±0,02%. При значении рН 6,8 ед.

содержание монопегилированной формы на момент окончания реакции пегилирования составляет 42,3±0,21 %.

2.2.3.1.2. Исследование кинетики реакции пегилирования интерферона альфа-2b, определение оптимальной температуры Далее была исследована кинетика протекания процесса пегилирования. Процесс проводили при значении рН 6,8 ед. и исходной концентрации белка 2 мг/мл в двух диапазонах температур: при комнатной температуре и температуре 2-8°С, соотношение белок – ПЭГ 1 к 3 по массе. Данные температуры были выбраны как наиболее технологичные. Исследование динамики реакции пегилирования проводили в течение 3 часов, отбирая пробы на 10, 20, 30, 60, 80, 120, 150 и 180 минуту реакции. Остановку реакции в пробах осуществляли добавлением глицина до конечной концентрации 20 мМ. Анализ содержания продуктов реакции пегилирования проводили методом гель-фильтрации. Динамика образования МоноПЭГИНФ представлена на рисунке 45.

–  –  –

Рис. 45. Динамика протекания процесса пегилирования (рН 6,8 ед., соотношение белок – ПЭГ 1 к 3 по массе, начальная концентрация белка 2 мг/мл) в двух диапазонах температур: комнатной и 2-8°С Полученные данные демонс трируют, что нарас тание МоноПЭГИНФ останавливается на 80 минуту реакции при комнатной температуре и на 120 минуту при температуре 2-8°С и достигает значения около 45±0,23 % от общего количества продуктов реакции пегилирования. Дальнейшее проведение реакции пегилирования не целесообразно, так как процесс накопления МоноПЭГИНФ прекращается, однако, накопление ДиПЭГИНФ продолжается. Содержание ДиПЭГИНФ на 80 минуту при комнатной температуре и на 120 минуту при температуре 2-8°С не отличается и составляет около 12±0,1 %.

Таким образом, в рамках проведенных исследований было установлено, что комнатная температура является оптимальной для проведения реакции, продолжительнос ть реакции – 80 минут.

2.2.3.1.3. Определение причины низкого выхода реакции пегилирования

В результате описанных выше экспериментов нам удалось решить одну из двух проблем – несоответствия изоформенного состава получаемой монопегилированной формы интерферона альфа-2b изоформенному составу коммерческого препарата ПегИнтрон. Следующим шагом оптимизации процесса стало решение второй проблемы – низкой эффективности процесса пегилирования.

Основная проблема заключалась в непонимании причин низкого выхода реакции. Анализ литературных данных показал, что возможная причина связана с высокой скоростью гидролиза активированного ПЭГ в условиях реакционного буферного раствора.

Для проверки данного утверждения был изучен процесс гидролиза активной группы (сукцинимидильной) используемого ПЭГ в условиях реакционного буферного раствора (100 мМ NaP; pH = 6,8). Анализ гидролиза активной группы проводили спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм. Активная группа, высвобождаясь в процессе гидролиза активированного ПЭГ, начинает активно поглощать излучение. В составе активированного ПЭГ поглощения не происходит по причине экранирования данного процесса основной цепью ПЭГ. Кинетика гидролиза ПЭГ представлена на рисунке 46.

Как видно из приведенных данных, активная группа продолжает отсоединяться от молекулы ПЭГ и после 80 минуты инкубации, что свидетельствует о том, что пул активного ПЭГ после 80 минут инкубации дос таточно весом. В проведенном эксперименте поглощение на 80 минуту составило 1,175±0,01 опт. ед., на 216 минуту - 1,891±0,01 опт. ед. На 216 минуту сохраняется около 50 % от активности ПЭГ на 80 минуту. Следовательно, причина низкого выхода процесса связана не только с падением активности ПЭГ за счет гидролиза активной группы ПЭГ, но и с другими параметрами.

–  –  –

Для подтверждения полученных данных был проведен опыт, в ходе которого активированный ПЭГ выдерживался в реакционном буфере в течение 80 минут, после чего вносили интерферон и продолжали инкубировать при комнатной температуре в течение еще 80 минут, по истечении которых анализировали реакционную смесь методом гель-фильтрации. Полученные данные свидетельствуют о том, что ос таточная активность ПЭГ остается на высоком уровне. Содержание монопегилированной формы через 80 минут после внесения интерферона составило 17±0,2 %, что составляет около 37 % от содержания данной формы при проведении процесса без предварительной инкубации ПЭГ в реакционном буфере.

Попытка снижения степени гидролиза активированного ПЭГ за счет варьирования таких физико – химических параметров процесса, как ионная сила раствора (процесс пегилирования проводили в диапазоне содержания фосфата натрия от 10 мМ до 250 мМ), содержание детергентов (исследовали процесс пегилирования в присутствии полисорбата 20 и полисорбата 80 в диапазоне 0,01 – 0,5 %), а так же наличия стабилизаторов (сахарозы) показала, что процесс пегилирования не зависит от данных параметров.

2.2.3.1.4. Оптимизация соотношения белок – ПЭГ в реакционном буфере Далее была проведена оптимизация процесса пегилирования за счет варьирования соотношения белок – ПЭГ в реакционном буферном растворе.

Процесс пегилирования проводили при значении рН 6,8 ед., начальной концентрации белка 2 мг/мл и массовом соотношении белок / ПЭГ: 1 к 0,1; 1 к 0,3; 1 к 0,5; 1 к 0,7; 1 к 1; 1 к 2; 1 к 3 (контрольный опыт) в течение 80 минут при комнатной температуре. Анализ результатов реакции пегилирования осуществляли методом гель-фильтрации. График зависимости содержания МоноПЭГИНФ от соотношения белок/ПЭГ представлен на рисунке 47.

–  –  –

33,2 26,4 17,8 20 11,9 4,1

–  –  –

Рис. 47. График зависимости содержания монопегилированной формы интерферона альфа-2b от соотношения белок/ПЭГ Предс тавленные данные указывают на то, что эффективность пегилирования увеличивается при уменьшении соотношения белок/ПЭГ. Однако проведение процесса пегилирования в условиях низкого соотношения белок – ПЭГ не технологично, так как значительная часть интерферона остается немодифицированной.

К примеру, при соотношении 1 к 0,3 около 85±0,42 % исходного интерферона не подвергается модификации. В качестве оптимального варианта было выбрано соотношение 1 к 0,7. При данном соотношении на 80 минуту реакции содержание МоноПЭГИНФ составляет около 26,5±0,5 %, ДиПЭГИНФ около 4,5 ±0,03 %, нативного интерферона – 69±0,35 %. Таким образом, в результате снижения соотношения белок - ПЭГ удалось увеличить эффективность процесса по ПЭГ в 2,7 раза в сравнении с опытом, описанным в литературе.

2.2.3.1.5. Определение оптимальной концентрации интерферона альфаb в реакционном буфере Еще одним параметром, влияющим на эффективность процесса пегилирования, является концентрация реагирующих компонентов.

Для реализации эксперимента предварительно проводили концентрирование раствора интерферона альфа-2b с помощью системы тангенциальной фильтрации LabScale с использованием мембраны с диаметром пор 10 кДа.

Сконцентрированный раствор интерферона альфа-2b был использован для исследования процесса пегилирования при концентрации белка 14, 12, 10, 8, 6, 4 и 2 мг/мл. Процесс осуществляли при значении рН 6,8 ед., комнатной температуре и соотношении белок – ПЭГ 1 к 0,7. В ходе эксперимента анализировали кинетику процесса, снимая пробы на 10, 30, 50 и 80 минуту реакции. Результаты анализа отобранных проб методом гель-фильтрации представлены в числовом (таблица

11) и графическом виде (рисунок 48).

Повышение концентрации исходного белка в 7 раз с 2 до 14 мг/мл увеличивает выход процесса пегилирования по целевой монопегилированной форме с 26,4±0,5 % до 45±0,5 %. Относительно исходных условий проведения процесса эффективность пегилирования по ПЭГ при концентрации 14 мг/мл и соотношении белок – ПЭГ 1 к 0,7 возросла в 4,2 раза.

Таблица 11. Динамика нарастания монопегилированного интерферона альфа-2b в зависимости от исходной концентрации белка

–  –  –

2 11,51 19,74 24,12 26,4 4 14,46 24,32 28,29 30,21 6 14,71 25,17 29,56 33,24 8 15,25 25,67 33,13 35,61 10 16,10 27,08 36,07 38,47 12 16,74 28,17 38,55 42,24 14 17,33 29,16 39,91 44,91 Как видно из приведенных данных, повышение концентрации белка приводит к значительному росту эффективнос ти пегилирования. При соотношении белок / ПЭГ 1 к 0,7 и концентрации белка 14 мг/мл содержание МоноПЭГИНФ составляет 44,9±0,5%. Дальнейшее повышение концентрации невозможно осуществить технологически.

55,0

–  –  –

33,2 30,2 35,0 26, 4 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0

–  –  –

Таким образом, в результате оптимизации процесса пегилирования были установлены следующие оптимальные условия проведения реакции:

- исходная концентрация белка 14 мг/мл;

- соотношение белок / ПЭГ 1 к 0,7 (по массе);

- оптимальное значение рН реакционного буфера - 6,8 ед.;

- продолжительность пегилирования 80 минут при комнатной температуре.

При проведении процесса содержание целевой монопегилированной формы на момент окончания реакции пегилирования составляет около 45±0,5 %. Таким образом, нам удалось повысить эффективность процесса пегилирования по ПЭГ в 4,2 раза с 5,1 % в референсных условиях до 21,4 % в оптимизированных.

2.2.3.2. Разработка технологии очистки монопегилированного безметионинового интерферона альфа-2b На следующем этапе стояла задача разработки схемы очистки монопегилированного безметионинового интерферона альфа-2b. Очистка пегилированных белков является сложной задачей, поскольку продукты реакции пегилирования интерферона альфа-2b имеют схожие физико-химические свойства, что затрудняет их сепарацию.

2.2.3.2.1. Очистка методом тангенциальной фильтрации

Известно, что присоединение ПЭГ к молекуле белка значительно увеличивает гидродинамический радиус конъюгата. За счет гидрофильности молекулы ПЭГ масса конъюгата увеличивается не на номинальную массу ПЭГ, а гораздо больше.

Теоретическая масса монопегилированного безметионинового интерферона альфа-2b составляет 31,2 кДа, фактическая масса более 150 кДа. По этой причине была исследована возможность очистки монопегилированной формы методом тангенциальной фильтрации. Исследование процесса фильтрации производили с помощью установки LabScale (США). Процесс очистки реакционной смеси проводили на фильтрах с диаметром пор 5, 10, 20 и 50 кДа. Полученные результаты представлены в таблице 12.

–  –  –

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что процесс тангенциальной фильтрации не подходит для очистки пегилированного интерферона альфа-2b. В частности, ДиПЭГИНФ форму невозможно отделить данным методом.

<

–  –  –

Еще один подход, основанный на очистке за счет разницы в гидродинамическом размере молекул заключается в разделении продуктов реакции пегилирования методом гель-фильтрации. Для очистки монопегилированного интерферона альфа-2b был использован сорбент Superdex 200. Реакционную смесь после завершения реакции пегилирования наносили на колонну XK 16/60 с различной нагрузкой: 1 %, 5 %, 7 %, 10 % от объема колонны. В качестве подвижной фазы использовали фосфатный буфер со значением pH 6,5 ед.

Основная сложность при очис тке монопегилированного интерферона состоит в удалении дипегилированной формы. Нативный интерферон по сравнению с пегилированными формами обладает значительно меньшим гидродинамическим радиусом и хорошо отделяется методом гель-фильтрации. Хроматограмма, иллюстрирующая разделение монопегилированной и дипегилированной форм интерферона альфа-2b при различном объеме внесения разделяемого препарата, представлена на рисунке 49.

Рис.49. Хроматограмма очистки пегилированного интерферона альфаb методом гель-фильтрации на сорбенте Superdex 200 (колонна XK 16/60) при различном объеме нанесения раствора, содержащего разделяемые вещества (А – 1 % от объема колонны; Б – 5 %; В – 7 %; Г – 10 %) Как видно из предс тавленных результатов, методом гель-фильтрации возможно проводит эффективную очис тку МоноПЭГИНФ от ДиПЭГИНФ только при достаточной низкой нагрузке на колонну (не более 5 % от объема колонны), при большей нагрузке резко снижается разделяющая способность сорбента. Так, при нагрузке 10 % от объема колонны МоноПЭГИНФ и ДиПЭГИНФ выходят единым пиком. Представленные данные свидетельс твуют о невозможности применения процесса гель-фильтрации для очистки монопегилированного интерферона альфа-2b по причине низкой технологичности данного процесса.

2.2.3.2.3. Очистка методом гидрофобной хроматографии На следующим этапе разработки очистки монопегилированного интерферона альфа-2b было проведено исследование очис тки методом гидрофобной хроматографии. Как уже отмечалось выше, молекула ПЭГ является гидрофильной, ее присоединение значительно увеличивает гидрофильность всего конъюгата, по этой причине очистка пегилированных белков методом гидрофобной хроматографии является перспективным методом.

Был исследован процесс гидрофобной хроматографии на сорбенте Butyl Sepharose (GE, США) и Phenyl Sepharose (GE, США). Нанесение раствора на колонну осуществляли в присутс твии 0,5 М сульфата аммония для лучшего связывания белка с колонной. Элюция белка осуществляли путем снижения содержания сульфата аммония в элюирующем буфере. Результаты очистки монопегилированного интерферона альфа-2b на сорбенте Butyl Sepharose представлены на рисунке 50.

Рис. 50. Хроматограмма очистки монопегилированного интерферона альфа-2b методом гидрофобной хроматографии на сорбенте Butyl Sepharose Как видно из приведенной на рисунке 51 хроматографии, в результате проведенной хроматографии наблюдали два пика. Анализ данных пиков методом гельфильтрационной хроматографии показал, что первый из них содержит смесь МоноПЭГИНФ и ДиПЭГИНФ, второй представляет собой немодифицированный интерферон.

Таким образом, проведенные исследования свидетельс твую о том, что методом гидрофобной хроматографии невозможно провести разделение МоноПЭГИНФ и ДиПЭГИНФ, а возможно отделить только немодифицированную форму белка.

2.2.3.2.4. Очистка монопегилированного интерферона альфа-2b методом катионообменной хроматографии Следующим типом хроматографии, исследованным в процессе создания технологии очис тки монопегилированного интерферона альфа-2b, стала ионообменная хроматография. Как уже отмечалось в рамках литературного обзора, присоединение ПЭГ к молекуле интерферона альфа-2b идет по остаткам гис тидина, лизина и N – концевой аминогруппе, т.е. по заряженным группам белка. Присоединение ПЭГ снижает положительный заряд интерферона. При этом влияние каждой модифицированной группы на общий заряд значительно отличается. С учетом этого факта, ионообменная хроматография является предпочтительным способом для очистки монопегилированного интерферона альфа-2b. Возможные проблемы применения данного типа хроматографии заключались в низкой емкости сорбента по отношению к целевой монопегилированной форме по причине экранирующего эффекта заряженных групп, создаваемого молекулами ПЭГ. Критериями приемлимости для данного типа хроматографии являлись не только высокая эффективность разделения продуктов реакции пегилирования, но и значительная емкость сорбента по отношению к целевой монопегилированной форме.

В процессе проведения исследования были протес тированы различные типы ионообменных сорбентов. Элюцию с ионообменных сорбентов проводили путем постепенно повышения содержания соли (хлорида натрия) в подвижной фазе, поступающей на колонну с адсорбированным белком. В таблице 13 предс тавлено сравнение различных сорбентов, протестированных на предмет емкости по отношению к МоноПЭГИНФ.

–  –  –

Полученные данные свидетельс твуют о том, что оптимальным сорбентом для проведения процесса очистки является катионообменный сорбент MacroCap SP.

Отличие данного сорбента от других заключается в наличии инертного спейсерного элемента между ионообменной группой и матрицей сорбента. Наличие данного спейсера увеличивает емкость сорбента и эффективность разделения целевого и примесного белков. Данный сорбент отличается высокой емкостью по монопегилированной форме интерферона альфа-2b – не менее 5 мг/мл сорбента (при ионной силе раствора 8 mS/cm и значении рН = 4,5). Для остальных сорбентов емкость в отношении МоноПЭГИНФ значительно ниже. По всей вероятности, причина низкой емкости заключается в стерических затруднениях при взаимодействии молекул пегилированных форм белка и ионообменных групп сорбентов.

Процесс очистки МоноПЭГИНФ осуществляли с использованием буферных растворов:

буфер MCA: 40 мМ AcNa; 0,01 % polysorbate 80; pH = 4,5;

буфер MCB: 40 мМ AcNa; 0,5 M NaCl; 0,01 % polysorbate 80; pH = 4,5;

буфер MCC: 100 мМ NaP; 0,01 % polysorbate 80; pH = 4,5;

буфер MCD: 100 мМ NaP; 0,01 % polysorbate 80; pH = 7,0.

Схема разработанной хроматографической очистки включает несколько стадий: уравновешивание колонны буферным раствором MCА Нанесение рас твора белка после проведения реакции пегилирования Промывка колонны с адсорбированным белком буферным рас твором MCA для удаления белков, не связавшихся с колонкой, а так же компонентов реакционного буфера Элюция монопегилированного интерферона альфа-2 методом градиентой элюции буферным раствором MCB Промывка колонны буферным раствором MCC для удаления ацетатного раствора с колонны Элюция немодифицированного интерферона альфа-2b методом ступенчатой элюции буферным раствором MCD.

Хроматограмма очис тки монопегилированного интерферона альфа-2b представлена на рисунке 51.

Рис. 51. Хоматограмма очистки монопегилированного интерферона альфа-2b методом катионообменной хроматографии на сорбенте MacroCap SP Предс тавленная хроматография демонстрирует высокую эффективность разделения продуктов реакции пегилирования. Анализ фракций полученных пиков методом гель-фильтрации демонстрирует, что первый пик содержит 99,8±0,5 % ДиПЭГИНФ; второй – 99,5±0,5 % МоноПЭГИНФ; третий – 99,6±0,5 % МоноПЭГИНФ, четвертый – 99,3±0,5 % МоноПЭГИНФ; пятый – 100±0,5 % немодифицированного интерферона. Потери МоноПЭГИНФ на с тадии составляют около 10±1%.

Анализ фракций пиков, соответс твующих монопегилированному интерферону методом катионообменной хроматографии показал, что первый пик соответствует Гис34 изоформе, второй смеси лизиновых изоформ, третий – N – концевой изоформе.

Разработанные условия очистки позволяют получать интерферон альфа-2b, не подвергшийся модификации в результате реакции, в виде раствора в реакционном буфере в высокой концентрации 12±1 мг/мл, что позволяет вновь использовать его для проведения реакции пегилирования.

Cорбент MacroCap SP демонстрирует высокую эффективность разделения по отношению к пегилированному интерферону альфа-2b. Разработанный подход позволяет впервые получать отдельные группы изоформ монопегилированного интерферона альфа-2b в препаративном масштабе, что позволяет создавать препараты с гомогенным изоформенным составом.

Для проверки эффективности выбранного сорбента MacroCap SP был протестирован сорбент SP Sepharose FF, обладающий аналогичной с MacroCap SP ионообменной группой – сульфопропиловой. Основное отличие между сорбентами заключается в отсутствии у SP Sepharose FF инертного спейсера между матрицей и ионообменным лигандом. Очистку монопегилированной формы интерферона на данном сорбенте проводили в условиях, аналогичных используемым в процессе проведения очистки на MacroCap SP. На рисунке 52 представлена хроматограмма очистки МоноПЭГИНФ на сорбенте SP Sepharose FF.

Рис. 52. Хроматограмма очистки монопегилированного интерферона альфа-2b методом катионообменной хроматографии на сорбенте SP Sepharose FF Анализ пиков, полученных в результате проведенной очистки методом гель-фильтрации демонс трирует, что первый пик содержит 21±0,5 % ДиПЭГИНФ и 79±0,4 % МоноПЭГИНФ, второй пик содержит 100±0,5 % немодифицированного интерферона альфа-2b. Таким образом, в результате проведенной очис тки не удалось селективно удалить примесный ДиПЭГИНФ.

2.2.3.2.5. Концентрирование монопегилированного интерферона альфа-2b

На следующем этапе проводили концентрирование очищенного монопегилированного интерферона альфа-2b.

Раствор МоноПЭГИНФ вновь наносили на сорбент MacroCap SP, при этом используя колонну меньшего размера, исходя из того, чтобы нагрузка монопегилированного интерферона на сорбент составляла 8 мг/мл. Далее проводили ступенчатую элюцию целевого белка 35 % буфера MCB в буфере MCA. Такой подход к концентрированию белка не только позволял увеличить его концентрацию в растворе, но и провести его доочистку от остаточного количества свободного нативного интерферона альфа-2b, который образуется при хранении очищенного МоноПЭГИНФ между стадиями.

Хроматограмма концентрирования МоноПЭГИНФ представлена на рисунке 53.

Рис. 53. Хроматограмма концентрирования монопегилированного интерферона альфа-2b на колонне MacroCap SP В результате процесса концентрирования удалось повысить концентрацию белка до 5 мг/мл, при этом потери белка не превышали 5 %. Чистота полученного белка 97,5±0,5%.

2.2.3.2.6. Перевод монопегилированного интерферона альфа-2b в буфер хранения

На следующем этапе осуществляли перевод монопегилированного буферного раствора в буфер хранения следующего состава:

буфер SE1: 50 мМ NaP; 0,01 % polysorbate 80; pH = 6,5.

На стадии перевода в буфер хранения использовался гель-фильтрационный сорбент Sephadex G25, который не подходит для разделения продуктов пегилирования, но позволяет с высокой скоростью осуществлять смену буферного рас твора, в котором находится белок. Хроматограмма перевода МоноПЭГИНФ в буфер хранения с помощью гель-фильтрационного сорбента Sephadex G25 представлена на рисунке 54.

Рис. 54. Хроматограмма перевода монопегилированного интерферона альфаb в буфер хранения Потери на стадии составили не более 3 %, содержание целевой монопегилированной формы составило более 97,5±0,3 %.

Далее полученный рас твор высокоочищенного монопегилированного интерферона альфа-2b нормировали до концентрации 1 мг/мл путем его разведения буфером хранения.

2.2.3.2.7. Сравнение полученного препарата монопегилированного интерферона альфа-2b с коммерческим препаратом Пегинтрон На рисунке 55 представлены данные сравнительного анализа полученной субстанции монопегилированного интерферона альфа-2b и коммерческого препарата Пегинтрон методами: ЭФ в ПААГ в восстанавливающих условиях с окрашиванием нитратом серебра - на предмет наличия примесей неинтерфероновой природы (А); катионообменной хроматографии – на предмет изоформенного состава (Б); гель-фильтрации – на предмет содержания близкородственных примесей

–  –  –

Рис. 55. Сравнительные испытания полученного монопегилированного интерферона альфа-2b с коммерческим препаратом Пегинтрон методом ЭФ в ПААГ (восст. условия) – А; катионообменной хроматографии – Б; гельфильтрации – В Приведенные данные указывают на то, что полученный препарат пегилированного интерферона альфа-2b по своим физико-химическим характерис тикам не уступает коммерческому препарату Пегинтрон.

Сравнение биологических свойств полученной субстанции с коммерческим препаратом проводили с использованием пары клетка – вирус: клетки почки быка (MDBK) – вирус вазикулярного стоматита (VSV).

В результате проведенных испытаний были получены следующие результаты:

активность полученной субстанции – 7,8*107 МЕ/мг;

активность ПегИнтрона – 7,6*107 МЕ/мг.

Приведенные данные указывают на то, что полученный препарат обладает схожей антивирусной активностью, что и коммерческий препарат ПегИнтрон.

2.2.3.3. Разработка технологии пегилирования интерферона альфа-2а Следующим этапом нашей работы стала разработка технологии производства пегилированного интерферона альфа-2а.

В результате проведенного обзора литературы была обнаружена единс твенная печатная работа, описывающая условия реакции пегилирования интерферона альфа-2а [46], данные условия были использованы в качестве исходной точки эксперимента:

состав реакционного буфера: 50 мМ NaB; pH = 9,0; соотношение белок / ПЭГ 1 к 6 по массе; продолжительнос ть реакции 120 минут при температуре 2 - 8°C;

исходная концентрация белка 5 мг/мл.

При проведении реакции в данных условиях содержание монопегилированной формы составляет 40±0,5 %, дипегилированной – 12±0,1%, свободного интерферона – 48±0,24 %. В результате со 100 мг интерферона и 600 мг активированного ПЭГ на входе в процесс при исходных условиях возможно получить около 40 мг монопегилированной формы, в состав которой входит 13 мг интерферона и 27 мг ПЭГ. Таким образом, эффективность процесса пегилирования по интерферону составляет 13 %, по ПЭГ – 4,5 %. Низкая эффективнос ть требует оптимизации условий проведения реакции пегилирования.

2.2.3.3.1. Влияние значения рН на процесс пегилирования интерферона альфа-2а На первом этапе оптимизации условий реакции пегилирования было изучено влияние значения рН реакционного буферного раствора. Как уже отмечалось выше, изоформенный состав препарата Пегасис предс тавляет собой набор лизиновых изоформ. Для селективной модификации азотов лизина процесс необходимо вести при значении рН, сравнимым со значением изоточки аминогрупп остатков лизина. Значение изоточки аминогруппы остатков лизина составляет 10,0. По этой причине было изучено влияние значения рН на выход процесса пегилирования и его селективность в отношении аминогрупп остатков лизина в диапазоне 7,8 - 9,2 ед. Остальные параметры реакции пегилирования оставляли без изменений по сравнению с приведенными в литературе. Процесс пегилирования останавливали путем снижения значения рН реакционной среды до значения рН 4,5 ед. Анализ результатов реакции пегилирования осуществляли методом гель-фильтрации (на предмет содержания продуктов реакции пегилирования) и катионообменной хроматографии (на предмет изоформенного состава).

График зависимости выхода монопегилированной формы интерферона альфа-2а от значения рН реакционного раствора приведен на рисунке 56.

Рис. 56. График зависимости выхода процесса пегилирования от значения рН реакционного буферного раствора Как видно из графика, приведенного на рисунке 57, увеличение значения рН с 7,8 до 9,2 ед. приводит к росту выхода монопегилированной формы в 3 раза (с 13±0,1 % до 38±0,2 %). Анализ изоформенного состава полученного монопегилированного интерферона альфа-2а продемонстрировал, что значение рН не оказывает существенного влияния на изоформенный состав, модификации подвергаются исключительно аминогрупп остатков лизина. Данное утверждение проиллюстрировано на рисунке 57.

Рис. 57. Сравнение изоформенного состава монопегилированного интерферона альфа-2а, полученного в процессе реакции пегилирования при различном значении рН реакционного буфера: 1 - 7,8; 2 - 8,2; 3 - 8,4; 4 - 9,0; 5 - 9,2 Из приведенных результатов можно сделать вывод, что оптимальное значение рН реакционного буферного раствора составляет 9,0 ед.

2.2.3.3.2. Изучение кинетики процесса пегилирования интерферона альфа-2а, определение оптимальной температуры процесса Далее была исследована кинетика протекания процесса пегилирования.

Процесс проводили при значении рН 9,0 ед. и исходной концентрации белка 2 мг/мл в двух диапазонах температур: при комнатной температуре и температуре 2-8°С, соотношение белок – ПЭГ 1 к 6 по массе. Данные температуры были выбраны как наиболее технологичные. Исследование динамики реакции пегилирования проводили в течение 2 часов, отбирая пробы на 2, 5, 10, 20, 30, 50, 80, и 120 минуту реакции. Остановку реакции в пробах осуществляли путем снижения значения рН до 4,5 ед. Анализ содержания продуктов реакции пегилирования проводили методом гель-фильтрации. Динамика образования МоноПЭГИНФ и ДиПЭГИНФ представлена на рисунке 58.

–  –  –

Рис. 58. Динамика протекания процесса пегилирования (рН 9,0 ед., соотношение белок – ПЭГ 1 к 6 по массе, начальная концентрация белка 2 мг/мл) в двух диапазонах температур: комнатной и 2-8°С Изучение данных, приведенных на рисунке 59, свидетельствует о том, что накопление МоноПЭГИНФ формы продолжается до 10 минуты реакции, после чего не происходит нарастания целевого продукта.

Поведение реакции целесообразнее осуществлять при температуре 2 - 8°С, так при данной температуре содержание примесной ДиПЭГИНФ формы значительно меньше – 9,5±0,1 % против 12,0±0,1 % при комнатной температуре. В качестве наиболее вероятной причины остановки реакции через 10 минут от начала процесса можно назвать гидролиз активированного ПЭГ.

2.2.3.3.3. Определение причины низкого выхода реакции пегилирования

Далее был исследован процесс гидролиза активированного ПЭГ в условиях реакционного буфера. Для этого активированный ПЭГ помещали в реакционный буферный раствор, после чего изучали поглощение раствора при длине волны 260 нм. Как и в случае с 12 кДа ПЭГ при гидролизе 40 кДа ПЭГ высвобождалась активная группа, в результате чего поглощение раствора увеличивалось. Результаты исследования представлены на рисунке 59.

Рис. 59. Изучение процесса гидролиза активированного гидроксисукцинимидилэфир ПЭГ (40 кДа) в условиях реакционного буферного раствора – 50 мМ NaB, рН 9,0 ед.

Как видно из приведенного графика, процесс гидролиза активной группы полностью протекал за 10 минут, после чего не происходило увеличения поглощения раствора.

Для подтверждения полученных данных провели реакцию пегилирования после инкубации активированного ПЭГ в условиях реакционного буфера в течение 10, 20 и 30 минут. По ис течении указанных промежутков времени в раствор активированного ПЭГ вносили интерферон и далее проводили процесс пегилирования в течение 30 минут, отбирая пробы на 2, 5, 10, 20 и 30 минуту реакции. Пробы анализировали методом гель-фильтрации. Результаты исследования представлены в таблице 14.

–  –  –

Как видно из приведенных данных, при инкубации активированного ПЭГ в растворе более 10 минут, внесение интерферона альфа-2а не начинало реакцию пегилирования, что свидетельствует о полном гидролизе активированного ПЭГ.

Таким образом, было установлено, что реакция пегилирования интерферона альфа-2а активированным гидроксисукцинимидилэфир ПЭГ лимитируется процессом гидролизом активной группы ПЭГ в щелочных условиях реакции.

–  –  –

Попытка влияния на процесс пегилирования путем повышения концентрации интерферона альфа-2а показала, что данное влияние незначительно. Так, при повышении концентрации белка с 2 до 14 мг/мл, эффективность процесса пегилирования выросла на 3±0,1 %, при этом стадия предварительного концентрирования белка увеличивает его потери и удлиняет производственный цикл.

2.2.3.3.5. Определение оптимального соотношения белок – ПЭГ Одним из возможных путей оптимизации процесса является варьирование соотношения белок / ПЭГ в реакционном буфере. Зависимость выхода процесса пегилирования от соотношения белок / ПЭГ в реакционном буфере представлена на рисунке 60.

42,4 45 39,9 38,2

–  –  –

Как видно из данных, приведенных на рисунке 61, эффективность процесса пегилирования линейно увеличивается до соотношения белок / ПЭГ 1 к 2 по массе, далее наблюдается снижение эффективности процесса. При соотношении белок / ПЭГ 1 к 2 (по массе) содержание целевой монопегилированной формы составляет 25±0,2 %, тогда как трехкратное увеличение соотношения до 1 к 6 позволяет увеличить выход целевой формы только на 68 % (до 42,4±0,4 % МоноПЭГИНФ). Таким образом, соотношение 1 к 2 является оптимальным, так как обеспечивает максимальную эффективнос ть процесса при сохранении его технологичности.

При соотношении белок / ПЭГ 1 к 2 массе содержание МоноПЭГИНФ на момент окончания реакции составляет 25,2±0,3 %.

–  –  –

Следующим этапом оптимизации процесса пегилирования с тало выявление влияния структуры растворителя на процесс пегилирования. Для исследования были выбраны следующие апротонные растворители: пропанол-2 и диметилсульфоксид (ДМСО).

Процесс пегилирования в присутствии данных растворителей проводили в диапазоне концентрации органических растворителей 0-40 % с шагом 10%. Дальнейшее увеличение концентрации приводило к выпадению компонентов реакционного буферного раствора.

На рисунке 61 приведен график зависимости выхода монопегилированной формы интерферона альфа-2а в зависимости от концентрации ДМСО в реакциионном буфере (соотношение белок / ПЭГ 1 к 2 по массе; 2-8°С; 10 минут; концентрация белка 2 мг/мл).

Как видно из графика на рисунке 61, ДМСО значительно увеличивает выход процесса пегилирования (с 25,2±0,2 % в опыте без ДМСО до 45,1±0,5% в присутствии 40 % ДМСО).

Изучение изоформенного состава МоноПЭГИНФ, полученного при различных концентрациях ДМСО представлено на рисунке 62.

45,1 45 40,5

–  –  –

Рис. 61. График зависимости выхода процесса пегилирования интерферона альфа-2а в зависимости от содержания ДМСО в реакционном буфере (соотношение белок / ПЭГ 1 к 2) Рис. 62. Сравнение изоформенного состава монопегилированного интерферона альфа-2а, полученного в процессе реакции пегилирования при различном содержании ДМСО в реакционном буфере: 1 - 0%; 2 - 10%; 3 - 20%; 4 - 30%;

5 - 40% Изоформенный состав, соответствующий коммерческому препарату Пегасис, сохраняется до содержания ДМСО 30 %. При добавлении в среду пегилирования 40 % ДМСО значительно изменяется соотношение основных изоформ.

В случае пропанола-2 были получены аналогичные результаты по повышению выхода реакции пегилирования. Однако, изучение изоформенного состава получаемого МоноПЭГИНФ демонстрирует, что использование пропанол-2 значительно изменяет сайты пегилирования. Результаты сравнительного анализа методом катионообменной хроматографии предс тавлены на рисунке 63.

С учетом приведенных результатов, ДМСО в конечной концентрации 30 % был выбран в качес тве дополнительного компонента реакционного буфера. При обозначенном подходе в результате реакции пегилирования выход МоноПЭГИНФ составляет 40,5±0,5 % (при соотношении белок/ПЭГ 1 к 2 по массе).

Рис. 63. Сравнение изоформенного состава монопегилированного интерферона альфа-2а, полученного при проведении реакции пегилирования в присутствии 30% пропанола-2 (1) и 30% ДМСО (2)

В результате оптимизации процесса пегилирования были установлены следующие физико-химические параметры процесса:

состав реакционного буфера: 50 мМ NaB, 30 % ДМСО; pH = 9,0; соотношение белок / ПЭГ 1 к 2 по массе; продолжительность реакции 10 минут при температуре 2 - 8°C; исходная концентрация белка 2 мг/мл.

Проведение процесса пегилирования в оптимизированных условиях позволяет увеличить эффективность процесса пегилирования по ПЭГ в 3 раза относительного известных аналогов.

2.2.3.4. Разработка технологии очистки монопегилированного интерферона альфа-2а Основной проблемой очистки монопегилированного интерферона альфа-2а является высокое содержание ДиПЭГИНФ формы. Попытка применения параметров хроматографической очистки для пегилированного интерферона альфа-2b с применением аналогичных буферных растворов продемонстрировала невозможность удаления ДиПЭГИНФ формы. Результаты пробной очистки монопегилированного интерферона альфа-2а в условиях, разработанных для выделения монопегилированного интерферона альфа-2b, представлены на рисунке 64.

Рис. 64. Результаты пробной очистки монопегилированного интерферона альфа-2а на сорбенте MacroCap SP Анализ фракций полученных пиков показал, что первый пик содержит смесь ДиПЭГИНФ и МоноПЭГИНФ, а второй представляет собой немодифицированный интерферон альфа-2а, т.е. селективного удаления ДиПЭГИНФ формы не происходит. По этой причине стояла задача разработки подхода, позволяющего удалять ДиПЭГИНФ. Варьирование условий процесса нанесения реакционного раствора на колонну MacroCap SP показало, что нанесение раствора белка в присутствии 30 % ДМСО позволяет селективно получать ДиПЭГИНФ форму в проскоке нанесения. Результаты исследования проскока нанесения (методом гельфильтрации) при варьировании ионной силы рас твора в присутс твии 30 % ДМСО представлены в таблице 15.

–  –  –

Как видно из приведенных данных, при проводимости раствора белка 5,0 mS/cm, в проскоке нанесения наблюдается 100 % ДиПЭГИНФ. При этом при дальнейшем повышении ионной силы до 6,0 mS/cm в проскок нанесения попадает МоноПЭГИНФ. Содержание МоноПЭГИНФ в проскоке при ионной силе 6,0 mS/cm составляет 10 %. Таким образом, была определена оптимальная ионная сила раствора при его нанесении на сорбент MacroCap SP – 5,0 mS/cm.

Для удаления остаточного количества ДиПЭГИНФ были подобраны условия промывки буферным раствором на основании ацетата натрия, рН = 4,5 в присутствии 30 % ДМСО (буфер MCH: 50 мM AcNa; 30% DMSO; 0,01 % polysorbate 80; pH 4,50).

Подобранные условия нанесения белка на колонну и дальнейшей промывки позволили на 98 % (относительно исходного количества) удалить ДиПЭГИНФ.

Далее проводили отмывку ДМСО с колонны с адсорбированным белком буферным раствором МСА, после чего осуществляли ступенчатую элюцию МоноПЭГИНФ 35 % буферного раствора MCB в буфере MCA.

Хроматограмма очис тки МоноПЭГИНФ предс тавлена на рисунке 65.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

Похожие работы:

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«ТИТОВА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА Влияние фитопатогенных микроорганизмов на энзиматическую активность растения-хозяина Glycine max (L.) Merr. и Glycine soja Sieb. et Zucc. 03.02.08 ЭКОЛОГИЯ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., доцент Семенова Е.А. БЛАГОВЕЩЕНСК –...»

«КУРБАТОВА Ольга Леонидовна ДЕМОГРАФИЧЕСКАЯ ГЕНЕТИКА ГОРОДСКОГО НАСЕЛЕНИЯ 03.02.07 – генетика 03.03.02 – антропология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. Материалы и методы ГЛАВА 2. Влияние процессов миграции на генофонды городских популяций 2.1. Теоретические предпосылки 12 2.2....»

«Бабкина Ирина Борисовна ИХТИОФАУНА БАССЕЙНА НИЖНЕЙ ТОМИ: ДИНАМИКА И СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ 03.02.04 – Зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Романов Владимир Иванович Томск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение.. Глава 1....»

«Зубенко Александр Александрович СИНТЕЗ И ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНЫХ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ В РЯДУ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук г. Новочеркасск – 2015 Содержание ВВЕДЕНИЕ.. 6 1.Обзор литературы..19 1.1. Проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов и пути её преодоления..19 1.2. Проблема...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Леонов Вячеслав Сергеевич Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломычеловека 6/11 и 16/18 типов 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«Сигнаевский Воладимир Дмитриевич МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОДУКТИВНОСТИ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТОВ САРАТОВСКОЙ СЕЛЕКЦИИ Специальность 03.02.01 — ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н.,...»

«РАХМАТУЛЛИН Рамиль Рафаилевич БИОПЛАСТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ НА ОСНОВЕ ГИДРОКОЛЛОИДА ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ И РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ХИРУРГИИ...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«ЯМБОРКО Алексей Владимирович ПОПУЛЯЦИОННАЯ ЭКОЛОГИЯ ЛЕСНЫХ ПОЛЕВОК (род CLETHRIONOMYS) СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ АЗИИ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Н.Е. Докучаев Магадан – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. Глава 1. МАТЕРИАЛ И...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«Искам Николай Юрьевич ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НОВОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ АЦИД-НИИММП НА ОСНОВЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ГОВЯДИНЫ 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства; 06.02.08 – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов. ДИССЕРТАЦИЯ на...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Ковалев Сергей Юрьевич ПРОИСХОЖДЕНИЕ, РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ЭВОЛЮЦИЯ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук 03.02.02 – вирусология ЕКАТЕРИНБУРГ 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«НГУЕН ВУ ХОАНГ ФЫОНГ ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ КРУПНЫХ ГОРОДОВ В СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ ВЬЕТНАМ Специальность: 03.02.08экология (биология) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Чернышов В.И. Москва ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«НОВИЧКОВ АНДРЕЙ СЕРГЕЕВИЧ Молочная продуктивность и качество молока коз русской породы в условиях техногенного загрязнения Саратовской агломерации 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.В. Забелина Саратов 2015 СОДЕРЖАНИЕ...»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1.Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1 Экологическая...»

«ШАРАВИН Дмитрий Юрьевич IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А.И. Саралов Пермь – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СТР. ВВЕДЕНИЕ.. 4...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.