WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«Разработка промышленной технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2b ...»

-- [ Страница 3 ] --

1.10.10.1. Пегилированный интерферон альфа-2b (ПЕГИНТРОН) Первый препарат пегилированного интерферона альфа-2 появился на фармацевтическом рынке в 2000 г. под торговым названием Пегинтрон. Его разработкой занималась корпорация Шеринг-плау (Ирландия). Пегинтрон представляет собой ковалентный конъюгат на основе интерферона альфа-2b человека и сукцимидилкарбонат ПЭГ с молекулярным весом 12 кДа и линейной структурой. Схема реакции пегилирования приведена на рисунке 13 [95].

Изучение процесса пегилирования показало, что в зависимости от значения рН модификации преимущес твенно подвергаются N – концевая аминогруппа (кислые значения рН), или остаток гистидина в позиции 34 (нейтральные значения рН), или ос татки лизина (щелочные значения рН). Сравнение биологической активности получаемых продуктов показало, что наибольшей противовирусной активностью обладает продукт, получаемый при нейтральном значении рН.

Рис. 13. Общая схема модификации аминогрупп сукцинимидилкарбонат ПЭГ Схема модификации остатка гистидина приведена на рисунке 14 [95].

–  –  –

В результате проведенных исследований было определено, что оптимальное значение рН составляет 6,5. В результате реакции конъюгации образуется 14 позиционных изомеров, при этом на долю изоформы гистидин 34 приходится около 47 % от общего количества изоформ, 25 % приходится на N – концевую изоформу, 25 % приходится на группу лизиновых изоформ, оставшиеся 3 % приходятся на иные изоформы [122]. Локализация основных сайтов пегилирования в молекуле интерферона альфа-2b предс тавлена на рисунке 15 [52].

Изучение полученного продукта методом кругового дихроизма показало, что в результате присоединения молекулы ПЭГ вторичная и третичная структура интерферона альфа-2b не претерпела значительных изменений.

Рис. 15. Локализация основных сайтов пегилирования в молекуле интерферона альфа-2b человека [52] Полученный продукт монопегилированного интерферона альфа-2b продемонстрировал свою стабильнос ть при нейтральном значении рН (в процессе хранения в течение 30 дней и значении рН 6,8 только 4 % конъюгатов подверглось разрушению). Хранение при комнатной температуре и значении рН 6,8 приводило к разрушению 22 % конъюгатов в течение 24 часов [130]. Активное разрушение монопегилированной формы в растворе связано в первую очередь с низкой стабильнос тью связи, образуемой между ПЭГ и остатком гистидина, по этой причине хранение продукта осуществляют в лиофилизированном виде.

Разрушение основной изоформы монопегилированного интерферона альфаb не является недос татком. Пегилированный интерферон альфа-2b относится к конъюгатам с контролируемым высвобождением действующего вещества, т.е. при введении Пегинтрона пациенту начинается пос тепенный гидролиз основной изоформы с высвобождением нативного интерфероном. В работе[122] приведено сравнительное изучение активности основных изоформ пегилированного интерферона альфа-2b in vitro. Данные предс тавлены в таблице 3. Выделение отдельных изоформ проводили методом аналитической катионобменной хроматографии, некоторые изоформы не удалось выделить в отдельном виде.

–  –  –

Как отмечалось выше, пегилирование позволяет увеличить время циркуляции препарата в крови пациента, при этом изменяется фармакокинетический и фармакодинамический профиль препарата. Сравнительное изучение данных параметров для нативного интерферона альфа-2b и Пегинтрона продемонстрировало, что время полужизни в сыворотке пегилированного препарата составило 40 часов - в 10 раз больше, чем в случае нативного интерферона. Уровень клиренса Пегинтрона снизился в 12 раз и составил 22 мл/ч на кг веса (для нативного интерферона 231 мл/ч на кг веса). Фармакокинетический профиль Пегинтрона представлен на рисунке 16.

Устойчивая максимальная концентрация Пегинтрона в сыворотке держалась в промежутке 48-72 часа после инъекции, далее начиналась фаза медленной элиминации. Для нативного интерферона максимальная концентрация достигалась на 8-12 час после инъекции, после чего сразу начиналась активная элиминация, в результате препарат практически полнос тью выводился из организма в течение 24 часов [55].

Рис 16. Фармокинетический профиль нативного и пегилированного интерферона альфа-2b [55] Клинические испытания Пегинтрона показали его эффективнос ть и безопасность. В частности однократные инъекции Пегинтрона больным гепатитом С в дозировке 1,5 мкг / кг веса показали большую эффективность в сравнении с аналогичными дозировками нативного интерферона, вводимого трижды в неделю.

<

1.10.10.2. Пегилированный интерферон альфа-2а (ПЕГАСИС)

Дальнейшее развитие технологии пегилирования привело к созданию еще одного препарата пегилированного интерферона альфа-2 – Пегасиса. Препарат появился на фармацевтическом рынке в 2001 году. Его разработкой занималась компания Хофман-ля-Рош (Швейцария). Пегасис представляет собой ковалентный конъюгат на основе интерферона альфа-2а и разветвленного N – гидроксисукцинимидилэфир ПЭГ с молекулярным весом 40 кДа. Схема реакции пегилирования приведена на рисунке 17.

В данном случае процесс пегилирования осуществляют при щелочном значении рН реакционного буфера – 9,0, в результате чего модификации подвергаются исключительно остатки лизина. Локализация сайтов присоединения ПЭГ на молекуле интерферона альфа-2а представлена на рисунке 18. Четыре изоформы:

Lys31, Lys121, Lys131 и Lys134 являются основными, на их долю приходится около 94 % от общего количества изоформ, остальные 6 % приходятся на Lys70 и Lys83.

Рис. 17. Схема реакции пегилирования интерферона альфа-2а N – гидроксисукцинимидилэфир ПЭГ с молекулярным весом 40 кДа [10]

–  –  –

Антивирусная активность Пегасиса - 1,4 * 107 МЕ/мг, что составляет около 7 % от биологической активнос ти нативного интерферона альфа-2а (2,0 * 108 МЕ/мг).

У здоровых людей высокие концентрации Пегасиса определяются в сыворотке через 3-8 ч после однократного введения 180 мкг препарата. Пегасис поступает в системный кровоток с пос тоянной скоростью, а максимальная сывороточная концентрация (С mах), составляющая 14,2 мкг/л, достигается в среднем через 78 ч. (Т mах). В то же время максимальные концентрации с тандартного интерферона альфа достигаются через 3-8 ч. после введения, однако интерферон не определяется в сыворотке через 24 ч. [55].Фармакокинетический профиль Пегасиса предс тавлен на рисунке 19.

Рис. 19. Фармокинетический профиль нативного и пегилированного интерферона альфа-2а Сывороточные концентрации Пегасиса поддерживаются на терапевтическом уровне значительно дольше, чем концентрации стандартного интерферона альфа.

Сохранение терапевтических сывороточных уровней Пегасиса на протяжении всего 7-дневного интервала дозирования приводит к стойкому подавлению репликации вируса [10].

Пегасис всасывается и метаболизируется медленнее, чем обычный интерферон альфа, что способствует поддержанию его терапевтических уровней in vivo и позволяет назначать препарат один раз в неделю. Степень всасывания при подкожном введении составляет 61%, обычного интерферона альфа – около 80%. Однако, попадая в кровоток, Пегасис в меньшей степени подвергается разрушающему воздействию протеолитических ферментов, чем стандартный интерферон – альфа.

Благодаря большому размеру молекулы, Пегасис в основном распределяется в сосудах, т.е. в крови. Объем крови у человека сравнительно постоянный и составляет примерно 7-10 л. Пегасис накапливается в крови и поступает, в основном, в печень и в меньшей степени в почки, костный мозг и селезенку. Высокое отношение уровней Пегасиса в печени/крови по сравнению с таковым стандартного интерферона альфа приводит к повышению концентрации активного препарата в печени, где локализуется первичный очаг инфекции, что способствует увеличению противовирусной активности [10]. Напротив, нативный интерферон альфа и интерферон, пегилированный небольшими линейными молекулами первично распределяются в организме, а затем накапливаются в почках, где осуществляется их метаболизм.

Клинические исследования Пегасиса продемонс трировали его высокую эффективность. В рамках второй стадии клинических испытаний на пациентах с гепатитом С, не осложненным циррозом печени, было установлено, что эффективнос ть лечения составила 76 %, при этом в контрольной группе пациентов, принимавших нативный интерферон альфа-2а эффективность лечения составила только 17 %.

Клинические испытания в рамках 2/3 фазы исследований на больных с гепатитом С, осложненным циррозом печени, показали, что эффективность терапии Пегасисом составляет 29 % против 6 % в случае нативного интерферона.

Таким образом, в результате проведенных исследований было показано, что Пегасис, обладающий только 7 % от активнос ти нативного интерферона альфа-2а, значительно превосходит по своей эффективности последний. Не в последнюю очередь высокая эффективность Пегасиса связана профилем его клиренса.

Исследования по сравнению эффективности Пегинтрона и Пегасиса у пациентов с гепатитом С позволяют говорить об определенном преимуществе Пегасиса.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

–  –  –

В процессе выполнения работ по ренатурации интерферона альфа-2, его дальнейшей очистки, пегилированию и выделению монопегилированной формы использовали следующие реактивы и материалы: полисорбат 20 (Fluka, кат.

Y0000289 ); полисорбат 80 (Panreac, кат. 146075); цистин (Sigma, кат. 30199);

трисгидроксиметиламинометан ( Sigma, кат. 252859 ), мочевина (Sigma, кат.

U0631), фенилметансульфонил фторид (Sigma, кат. P7626); ЭДТА (ApplyChem, кат. А-1103); дитиотреитола (Sigma-Aldrich, кат. 43815); натрия гидроксид кат. гуанидин гидрохлорид кат.

(Sigma-Aldrich, 06203); (Scharlau, GU00611000); ацетат натрия (Sigma Aldrich, кат. 32319), хлорид натрия (Panreac, кат. 141659.1214); гистидин (Ajinomoto, кат. 71-00-1); борат натрия (Sigma-Aldrich, кат. 31457), кислота уксусная (Sigma Aldrich, кат. 27255), кислота соляная 37 % (Merc, кат. 1.00317.1000).

Для проведения процесса пегилирования интерферона альфа-2b использовали активированный ПЭГ с молекулярным весом 12 кДа и линейной структурой (NOF, кат. ME120TS), интерферона альфа-2а – активированный ПЭГ с молекулярным весом 40 кДа и разветвленной структурой (NOF, кат. LY400NS).

Для проведения хроматографической очистки использовали сорбенты: SP – сефароза (GE Healthcare, кат. №17-1087-01), Superdex 75 (GE Healthcare, кат.

17-1044-04);, MacroCap SP (GE Healthcare, кат. 17-5440-01), YMC Biopro S30 (YMC, SPA0S30), Sephadex G25 (GE Healthcare, кат. 17-0032-01).

–  –  –

Хроматографию проводят в изократическом режиме на колонне Superose 12 10/300 GL. В качестве подвижной фазы выс тупает натрий-фосфатный буферный раствор, рН 6,5. Скорость потока через колонну составляет 0,5 мл/мин, продолжительнос ть анализа – 50 минут. Температура процесса – комнатная. Детекцию осуществляют спектрофотометрически (длина волны 210 нм).

2.1.2.2. Ионообменная хроматография на сорбенте TSKgel SP-5PW

Колонна 75 x 7,5 мм. В качес тве уравновешивающего буферного рас твора используют 10 mМ натрий фосфатный буфер, рН=5,70 (буфер А).

В качестве элюирующего буферного рас твора используют 80 mМ натрий фосфатный буфер, рН=5,70 (буфер В).

Предварительно проводят пробоподготовку образца при помощи микроцентрифужного концентратора VIVA SPIN 500. Образец белка разводят водой до концентрации 0,2 мг/мл. После чего переносят 500 мкл разведенного образца в концентратор и центрифугируют до 50 мкл. К 50 мкл сконцентрированного образца добавляют 450 мкл буфера А и центрифугируют до 50 мкл (повторяют процедуру дважды). Полученные 50 мкл раствора переносят в микроцентрифужную пробирку, добавляют туда 450 мкл буфера А, встряхивают на шейкере, после чего производят инжектирование в аналитический хроматограф. Элюируют белок градиентным методом в 100 % буфера В.

Скорость потока 0,5 мл/мин, продолжительнос ть анализа 70 минут. Температура процесса – комнатная Детекцию осуществляют спектрофотометрически (длина волны 210 нм).

2.1.2.3. Метод обращенно-фазовой хроматографии

Колонна: 250х4,6 мм, сорбент октадецил (C18) силикагель, диаметр час тиц 5 мкм, размер пор 300. Хроматографию проводят в градиентом режиме с использованием буферных растворов:

буфер А: 0,1 % ТФУ в воде;

буфер Б: 0,1 % ТФУ в ацетонитриле.

Скорость потока 1 мл/мин, температура процесса 35±1) °С.

Градиентная программа:

Интервал, (мин) Элюент А, (% об.) Элюент В, (% об.) Детекцию осуществляют спектрофотометрически (длина волны 210 нм).

2.1.2.4. Метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии лаурилсульфата натрия (в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях) с окраской нитратом серебра К образцу белка добавляют буфер для образца, в одном случае содержащий DTT (восстанавливающие условия), в другом случае без DTT (невосстанавливающие условия). Электрофорез проводили в 12% полиакриламидном геле. После проведения ЭФ гели окрашивают раствором нитрата серебра. Для этого гели помещают в контейнер с раствором для отмывки гелей, содержащий этиловый спирт и уксусную кислоту и нагревают до 50 60 С, выдерживают 5-7 минут при постоянном перемешивании на горизонтальной мешалке. Далее декантируют рас твор для отмывки гелей и заливают гели нагретым до 50 60 С медицинским асептическим раствором, разбавленным в 10 раз дистиллированной водой, выдерживают 10 – 15 минут при постоянном перемешивании на горизонтальной мешалке. Сливают медицинский асептический раствор и промывают гели дис тиллированной водой в течение 1-2 минут при постоянном перемешивании на горизонтальной мешалке. Погружают гели в реактив нитрата серебра и инкубируют 15 – 17 минут при постоянном перемешивании на горизонтальной мешалке. Декантируют раствор нитрата серебра и промывают гели тремя сменами воды очищенной в течение 15-20 мин. Переносят гели в проявляющий раствор, содержащий уксусную кислоту и фармальдегид и выдерживают, пока на дорожке геля с нанесенным образцом не становилась видимой основная полоса. Быстро переносят гели в 10% раствор уксусной кислоты и инкубируют не более 10 минут, затем промывают гели водой.

2.1.2.5. Определение специфической активности

Специфическую активность определяют в культуре перевиваемых линий клеток, чувствительных к интерферону альфа-типа в сравнении с международным стандартным образцом (WHO International Standard INTERFERON ALPHA 2b, (Human rDNA derived) NIBSC code 95/566) против индикаторного вируса. Используют следующую пару клетка/вирус : клетки линии MDBK, индикаторный вирус вирус везикулярного стоматита.

–  –  –

2.1.3.1. Растворение телец включения предшественника интерферона альфаВ стеклянном стакане необходимой вместимости взвешивают навеску телец включений. Далее добавляют воду, исходя из соотношения 2,8 мл воды на 1 г телец включений, концентрированные растворы: 100 mМ PMSF до к.к. 1 мМ; 1 М Tris-HCl, pH = 8,0 до к.к. 40 мМ. Полученную смесь гомогенизируют с помощью диспергатора до состояния однородной суспензии, затем добавляют навеску гуанидингидрохлорида до к.к. 6 М. Полученный раствор тел включений перемешивают с помощью магнитной мешалки в течение 15 минут при 200 об./мин. К полученному раствору добавляют концентрированный рас твор 1 М дитиотреитола до к.к. 3 мМ и инкубируют при комнатной температуре в течение 90 минут. Раствор телец включений фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.

2.1.3.2. Процесс ренатурации интерферона альфа-2

В реактор с охлажденным до 2 - 8 о С ренатурационным буфером (20 мМ Трис HCl, pH = 8,0; 0,8 М мочевины; 0,1 % полисорбата 20; 0,5 мМ цистина, pH = 8,5) при перемешивании 120 об/мин, используя перистальтический насос, вносят раствор телец включений, исходя из нагрузки 4,86 г телец на 1 л ренатурационного буфера. Вслед за раствором тел включения в реактор, используя насос-дозатор, вносят ULP протеиназу (1 мг протеиназы на 1 г телец включений).

Ренатурат инкубируют при температур 2 - 8 о С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 80 об/мин не менее 6 часов.

Для остановки процесса ренатурации при перемешивании 80 об./мин добавляют в раствор концентрированный раствор 2,5 М AcNa рН 4,5 до конечной концентрации AcNa около 12,5 мМ. Полученный рас твор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм.

2.1.3.3. Предварительная очистка интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте CM Sepharose FF Колонну с сорбентом CM Sepharose FF уравновешивают буферным рас твором 8 (50 мМ AcNa; pH = 4,5). Далее на колонну наносят рас твор ренатурированного интерферона альфа-2 в 50 % градиенте воды исходя из нагрузки 10 мг белка на 1 мл сорбента. После нанесения белка колонну отмывают буфером 8 для удаления компонентов ренатурационного буфера. Элюцию целевого белка с колонны осуществляют градиентом буфера 9 (50 мМ AcNa; 500 мМ NaCl; pH = 5,5) в буфере 8 от 0 до 100 % за 1 колоночный объем. Начиная с оптической плотности 200 mAU (UV 280 нм), собирают целевую фракцию. Полученный раствор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм.

Процесс хроматографии проводят при температуре 2-8°С.

2.1.3.4. Процесс тонкой очистки интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте YMC Biopro S30 Колонну с сорбентом YMC Biopro S30 уравновешивают буферным рас твором 8. Далее на колонну наносят раствор интерферона альфа-2 с предыдущей стадии очистки исходя из нагрузки 5 мг белка на 1 мл сорбента. После нанесения белка колонну отмывают буфером 8 для удаления несвязавшихся примесных белков. Элюцию целевого белка с колонны осуществляют в изократическом режиме буфером S30 (15 мМ His; 65 мМ NaCl; pH = 5,0). Начиная с оптической плотности 100 mAU (UV 280 нм), собирают целевую фракцию. Полученный раствор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм.

Процесс хроматографии проводят при температуре 2-8°С.

2.1.3.5. Процесс концентрирования интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте CM Sepharose FF Колонну с сорбентом CM Sepharose FF уравновешивают буферным рас твором 8 (50 мМ AcNa; pH = 4,5). Далее на колонну наносят раствор очищенного интерферона альфа-2 с предыдущей стадии очис тки исходя из нагрузки 20 мг белка на 1 мл сорбента. После нанесения белка колонну отмывают буфером 8 для удаления несвязавшихся белков. Элюцию целевого белка с колонны осуществляют градиентом буфера 9 в буфере 8 от 0 до 100 % за 0,5 колоночных объема. Начиная с оптической плотнос ти 500 mAU (UV 280 нм), собирают целевую фракцию.

Полученный раствор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм.

Процесс хроматографии проводят при температуре 2-8°С.

2.1.3.6. Перевод очищенного интерферона альфа-2 в буфер хранения методом гель-фильтрационной хроматографии на сорбенте Superdex 75 Колонну с сорбентом Superdex 75 уравновешивают буферным раствором SE (50 мМ AcNa; 0,5 мМ EDTA; pH = 5,0). Далее на колонну наносят концентрированный рас твор очищенного интерферона альфа-2 с предыдущей с тадии (не более 5 % от объема колонны). Элюцию целевого белка с колонны осуществляют в изократическом режиме буферным раствором SE. Начиная с оптической плотности 100 mAU (UV 280 нм), собирают целевую фракцию. После определения концентрации методом обращено-фазовой хроматографии производят нормирование полученной субстанции до концентрации 1 мг/мл. Полученный раствор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм и хранят при температуре минус 18°С.

Процесс хроматографии проводят при температуре 2-8°С.

2.1.3.7. Процесс пегилирования интерферона альфа-2b

Предварительно сконцентрированный рас твор белка (12-14 мг/мл) в реакционном буфере (100 мМ NaP; pH = 6,8) подогревают до комнатной температуры.

После установления температуры раствора в диапазоне 18 – 28 0 С, добавляют необходимый объем раствора активированного ПЭГ (12 кДа, линейная структура) в 1 мМ соляной кислоте, исходя из того, чтобы в реакционной смеси создавалось соотношение белок / ПЭГ 1 к 0,7 по массе. Реакционную смесь инкубируют при температуре 18 – 28 0 С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 250 - 300 об./мин. в течение 80 мин.

Для остановки процесса пегилирования в реакционную смесь добавляют концентрированный 2 М раствор глицина до к.к. 20 мM. Выдерживают раствор при температуре 18 – 28 0 С и постоянном перемешивании со скоростью 250-300 об/мин в течение 30 мин.

Полученную реакционную смесь разбавляют водой в 5 раз (для уменьшения проводимости) и снижают значение рН до 4 – 5 ед. (эти операции необходимы для того, чтобы содержащийся в растворе продукт на следующей с тадии хроматографической ож6чистки связался с сорбентом). Полученный рас твор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм.

2.1.3.8. Процесс пегилирования интерферона альфа-2а

В предварительно сконцентрированный раствор белка (12-14 мг/мл) в реакционном буфере (50 мМ NaB; pH = 9,0) вносят диметилсульфоксид до к.к. 30 %.

Полученный раствор охлаждают до температуры 2-8°С.

В охлажденный раствор интерферона альфа-2а вносят необходимый объем раствора активированного ПЭГ (40 кДа, разветвленная структура) в 1 мМ соляной кислоте, исходя из того, чтобы в реакционной смеси создавалось соотношение белок / ПЭГ 1 к 2 по массе. Реакционную смесь инкубируют при температур 2 – 8 0 С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 250

- 300 об./мин. в течение 10 мин.

Для остановки процесса пэгилирования добавляют в реакционную смесь концентрированный 2 М раствор глицина до к.к. 20 мM. Выдерживают раствор при температуре 2 – 8 0 С и постоянном перемешивании со скоростью 250-300 об/мин в течение 30 мин.

Разбавляют рас твор водой до кондуктивности до 5,0 mS/cm в и снижают значение рН до 4,5 ед. (эти операции необходимы для того, чтобы содержащийся в растворе продукт на следующей стадии хроматографической ож6чистки связался с сорбентом). Полученный рас твор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм.

2.1.3.9. Процесс тонкой очистки пегилированного интерферона альфа-2b

Колонну с сорбентом MacroCap SP уравновешивают буферным раствором MCA (40 мМ AcNa; 0,01 % полисорбат 80; pH = 4,5). Далее на колонну наносят реакционную смесь, содержащую целевую монопегилированную форму интерферона альфа-2b исходя из нагрузки 5 мг белка на 1 мл сорбента. После нанесения белка колонну отмывают буфером MCA для удаления компонентов реакционной среды. Элюцию целевого белка с колонны осуществляют градиентом буфера MCB (40 мМ AcNa; 0,5 M NaCl; 0,01 % полисорбат 80; pH = 4,5) в буфере МСА от 0 до 40 % за 10 колоночных объемов.

Начиная с оптической плотности 50 mAU (UV 280 нм), собирают фракции пегилированного интерферона альфа-2b. Проводят объединение фракций, соответствующих монопегилированному интерферону альфа-2b. Полученный раствор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм.

Далее колонну с адсорбированным немодифицированным интерфероном альфа-2b промывают буфером МСС (100 мМ NaP; 0,01 % полисорбат 80; pH = 4,5) для удаления ацетата натрия. Элюцию интерферона альфа-2b осуществляют градиентом буфера MCD (100 мМ NaP; 0,01 % полисорбат 80; pH = 7,0) в буфере МСC от 0 до 100 % за 1 колоночный объем, в результате чего получают сконцентрированный рас твор интерферона альфа-2b в реакционном буфере, после чего передают раствор на стадию пегилирования.

Процесс хроматографии проводят при температуре 2-8°С.

2.1.3.10. Процесс тонкой очистки пегилированного интерферона альфа-2а

Колонну с сорбентом MacroCap SP уравновешивают буферным раствором MCA. Далее на колонну наносят реакционную смесь, содержащую целевую монопегилированную форму интерферона альфа-2а исходя из нагрузки 3 мг белка на 1 мл сорбента. После нанесения белка колонну сначала отмывают буфером MCA для удаления компонентов реакционной среды, затем буфером MCH (50 мМ AcNa; 30 % ДМСО; 0,01 % полисорбат 80; pH = 4,5) для селективного удаления дипегилированной формы. Элюцию целевого белка с колонны осуществляют 35 % буфером MCB в буфере МСА от 0 до 35 %. Начиная с оптической плотности 20 mAU (UV 280 нм), собирают фракцию монопегилированного интерферона альфа-2а. Полученный раствор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм.

Элюцию немодифицированного интерферона альфа-2а осуществляют буфером MCG (50 мМ NaB; 0,01 % полисорбат 80; pH = 9,0), в результате чего получают сконцентрированный рас твор интерферона альфа-2а. После добавления ДМСО до концентрации 30 %, полученный раствор передают на стадию пегилирования.

Процесс хроматографии проводят при температуре 2-8°С.

2.1.3.11. Процесс концентрирования пегилированного интерферона альфа-2 на сорбенте MacroCap SP Колонну с сорбентом MacroCap SP уравновешивают буферным раствором MCA. Далее на колонну наносят раствор очищенного монопегилированного интерферона альфа-2 с предыдущей стадии очис тки исходя из нагрузки 10 мг белка на 1 мл сорбента (в случае интерферона альфа-2b) или 5 мг белка на 1 мл сорбента (в случае интерферона альфа-2а). После нанесения белка колонну отмывают буфером MCA для удаления несвязавшихся белков. Элюцию целевого белка с колонны осуществляют градиентом 35 % буфера MCA в буфере MCB. Начиная с оптической плотности 200 mAU (UV 280 нм), собирают целевую фракцию. Полученный раствор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм.

Процесс хроматографии проводят при температуре 2-8°С.

2.1.3.12. Перевод очищенного монопегилированного интерферона альфа-2 в буфер хранения методом гель-фильтрационной хроматографии на сорбенте Sephadex G25 Колонну с сорбентом Sephadex G25 уравновешивают буферным раствором SE1 (50 мМ NaP; 0,01 % полисорбат 80; pH = 6,5) в случае пэгинтерферона альфаb или SE2 (50 мМ NaP; 0,01 % полисорбат 80; pH = 5,5) в случае пэгинтерферона альфа-2а. Далее на колонну наносят концентрированный рас твор очищенного монопегилированного интерферона альфа-2 с предыдущей с тадии (не более 30 % от объема колонны). Элюцию целевого белка с колонны осуществляют в изократическом режиме буферным раствором SE1 или SE2, соответс твенно. Начиная с оптической плотности 100 mAU (UV 280 нм), собирают целевую фракцию. После определения концентрации методом гель-фильтрационной хроматографии производят нормирование полученной субстанции до концентрации 1 мг/мл. Полученный рас твор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм и хранят при температуре минус 40°С (в случае пэгинтерферона альфа-2b) или 2-8°С (в случае пэгинтерферона альфа-2а).

Процесс хроматографии проводят при температуре 2-8°С.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.2.1. Разработка технологии ренатурации телец включений интерферона альфа-2 В рамках создания технологии пегилирования интерферона альфа-2 человека необходимо разработать технологию производства субстанции интерферона альфа-2. В качестве штамма – продуцента интерферона использовался штамм – продуцент E. coli BL21, в который была помещена плазмида, экспрессирующая целевой белок в виде телец включений. Выбранная схема экспрессии предполагает наличие стадии т.н. ренатурации. Ренатурация – это процесс восстановления структуры денатурированного белка за счет создания оптимальных физикохимических условий.

Анализ литературы показал, что в случае интерферона альфа-2 отсутствую т работы по оптимизации процесса ренатурации. При этом спрос на интерферон альфа-2 постоянно растет не только как на полупродукт для синтеза пегилированных форм, но и как на отдельный препарат, нашедший широкое применение в медицинской практике.

Следующим этапом после ренатурации является процесс очистки. Очистке интерферона посвящено большое количес тво статей, в которых приведены различные методики. В большом количес тве методик фигурирует обращеннофазовая хроматография, которая предполагает использование высокотоксичных реагентов с высоким классом опасности: органические растворители (ацетонитрилл, изопропанол, метиловый спирт и т.д.) и галогенорганические соединения (трифторуксусная кислота). При этом ни одна из описываемых методик не позволяет получать препарат, соответствующий по своим показателям качества Европейской фармакопее. По этой причине разработка оригинальной технологии очистки интерферона альфа-2 без использования обращенно-фазовой хроматографии с получением продукта, отвечающего требованиям Европейской фармакопеи, является актуальной задачей.

2.2.1.1. Оптимизация процесса ренатурации телец включений интерферона альфа Разработка технологии производства субстанции интерферона альфа-2а и альфа-2b включает ряд стандартных этапов: создание штамма – продуцента интерферона альфа-2а и альфа-2b, разработку и масштабирование процесса культивирования, создание схемы ренатурации телец включений, разработку схемы хроматографической очистки.

После проведения процесса культивирования получали тельца включений, содержащие интерферон альфа-2. Данные тельца включений подвергали денатурации с последующим переводом денатурированного белка в растворимую форму с правильной конформацией, т.е. осуществляли процесс ренатурации.

В качестве исходной точки эксперимента использовали условия, разработанные в 2011 году сотрудниками ООО «Фармапарк»:

состав буферного рас твора: 20 мМ Трис HCl pH = 8.0; 0,8 М Urea; 35 мМ NaCl; 0,1% Triton X-114; 3 мМ GSSG; 1 мМ GSH; рН = 8,0;

продолжительность процесса 9-100 часов;

температура 2- 8°С;

нагрузка на ренатурационный буфер 2,43 г т.в./л.

Приведенная схема процесса ренатурации позволяет получать 0,14±0,01 г/л целевого белка, при его содержании в ренатурационном буфере в количестве 41±0,2 % от общего количества белков в растворе. Попытка масштабирования данного процесса по причине рас тущей потребнос ти в интерфероне альфа-2 показала, что увеличение объема ренатурации приводило к повышению мутности раствора, в результате чего снижался выход процесса. Сводные данные по содержанию целевого белка в ренатурате на момент окончания процесса представлены в таблице 4.

–  –  –

Недос таток исходной схемы процесса состоит в низком выходе целевого белка, его низкой чистоте, высокой мутности получаемого раствора, что осложняет его фильтрацию, а так же невозможности масштабирования данной технологии. При повышении объема ренатурации с 1 до 37 л выход процесса ренатурации снижался на 40 %, при этом содержание целевого белка незначительно снижалось с 41±0,2 % до 38±0,19 %.

По причине низкой эффективнос ти процесс перед нами стояла задача разработки оптимиз ированной схемы процесса ренатурации интерферона альфа-2.

–  –  –

В качестве первого шага оптимизации стадии ренатурации было исследовано влияние восстанавливающих и окисляющих агентов на данный процесс. Известно, что два дисульфидных мос тика в составе молекулы интерферона оказывают значительное влияние на стабилизацию прос транс твенной молекулы в растворе. Наибольшее влияние на процесс формирования дисульфидных связей оказывают восстанавливающие и окисляющие агенты.

В исходный состав ренатурационного буферного раствора входили восстанавливающие агенты: восстановленный глутатион (GSH) и дитиотреитол (ДТТ), последний попадал в раствор вместе с раствором телец включений. ДТТ используется для лучшего растворения телец включений при их переводе в растворимую денатурированную форму. Так же в состав буферного раствора входил окисляющий агент – окисленный глутатион (GSSG).

В процессе исследования было установлено, что восстанавливающие агенты оказывают негативное влияние на процесс ренатурации интерферона. В частности, удаление восстановленного глутатиона из состава ренатурационного раствора позволило увеличить концентрацию целевого белка на 15 % с 0,14±0,01 мг/мл в исходном опыте до 0,16±0,01 мг/мл в исследуемом опыте. График зависимости концентрации интерферона альфа-2 в ренатурационном буфере от содержания GSH предс тавлен на рисунке 20.

Так же было определено оптимальное содержание другого восстанавливающего агента – дитиотреитола (ДТТ) – 3 мМ (рис. 21). При меньшем содержании ДТТ не происходило полноценного перевода телец включений в растворимую форму, что приводило к снижению выхода процесса ренатурации.

–  –  –

0,15 0,13 0,11 0,09 0,07 36 0,05 34

–  –  –

0,21 0,22 0,19 0,20 0,18 0,17 0,18 0,16 0,16 0,15 0,16 0,14 0,12 0,10

–  –  –

Далее была определена оптимальная концентрация окисляющего агента, в качестве которого рассматривали окисленный глутатион (GSSG) и цис тин (Cs).

Зависимость концентрации целевого белка от концентрации окисляющего агента представлена на рисунке 22.

0,25

–  –  –

Оптимальная концентрация Cs составила 0,5 мМ (концентрация белка 0,18 мг/мл), GSSG – 1 мМ (концентрация белка 0,19 мг/мл). Цистин является предпочтительным окислителем, так как его стоимость более чем в 10 раз ниже стоимости GSSG. Таким образом, за счет оптимизации концентрации восстановителей и окислителей в ренатурационном буфере удалось повысить выход процесса на 30 % в сравнении с исходным вариантом, при этом возросла и чис тота получаемого продукта с 41±0,2 % до 70±0,4 % (по данным ОФВЭЖХ).

2.2.1.3. Исследование влияния детергентов на процесс ренатурации

За счет оптимизации концентрации окисляющих и восстанавливающих агентов удалось значительно увеличить выход процесса и повысить чистоту получаемого продукта, однако, не удалось решить еще одну важную проблему –мутнос ть ренатурата. Анализ образующегося осадка и супернатанта методом ЭФ в ПААГ (восстанавливающие условиях), представленный на рисунке 23, показал, что состав белков в них совпадает. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что мутнос ть раствора значительно снижает выход процесса ренатурации.

–  –  –

В результате исследования было установлено, что использование детергентов Тритон X-100, Палаксомер 188 и Чапс не оказывало значительного влияния на процесс ренатурации с точки зрения мутности получаемого ренатурата. При использовании Полисорбатов 20 и 80 удалось решить главную задачу – снизить мутнос ть рас твора ренатурата. При этом, при использовании Полисорбата 20 в концентрации 0,1 % выход процесса возрастает на 15 % по сравнению с ТритонX114 (до 0,21±0,01) мг/мл, используемым в стандартной технологии. Таким образом, в качестве основного детергента был выбран полисорбат 20 в концентрации 0,1 %.

2.2.1.4. Исследование влияния ионной силы раствора, концентрации хаотропного агента и значения рН на процесс ренатурации Следующим шагом оптимизации процесса ренатурации с тало определение оптимальной ионной силы раствора. Как известно, ионная сила рас твора является важным фактором при формировании пространственной структуры белка. Было проведено исследование влияния данного фактора на процесс ренатурации интерферона альфа-2b. Ионную силу в растворе создавали путем добавления хлорида натрия в диапазоне концентраций 0 – 100 мМ. Полученные данные свидетельствуют о том, что содержание хлорида натрия не оказывает существенного влияния на процесс ренатурации. Высокая ионная сила может в значительной степени усложнять очистку получаемого белка методом ионообменной хроматографии, по этой причине хлорид натрия был удален из состава ренатурационного буферного раствора.

В качес тве двух хаотропных агентов были рассмотрены мочевина и гуанидингидрохлорид. Хаотропные агенты при их добавлении в растворы меняют структуру растворителей, образуя дополнительные водородные связи, что так же оказывает значительное влияние на фолдинг белков. Изучение влияния мочевины и гуанидингидрохлорида проводили путем их добавления в ренатурационный буферный раствор в концентрации 0 – 1,6 М. Полученные результаты зависимости процесса ренатурации от содержания хаотропных агентов представлены на рисунке 24.

–  –  –

Полученные результаты свидетельс твуют о том, что оптимальная концентрация мочевины составляет 0,8 М, при этом достигается концентрация целевого белка 0,21±0,01 мг/мл. Оптимальная концентрация гуанидингидрохлорида составляет 0,6 М, при этом концентрация целевого белка достигает значения 0,2±0,01 мг/мл. Таким образом, в качестве хаотропного агента была выбрана мочевина в концентрации 0,8 М.

Далее было определено оптимальное значение рН ренатурационного буферного раствора. Исследование процесса ренатурации проводили в диапазоне рН 7,0

– 9,0 ед. с шагом 0,5 ед. Результаты зависимости концентрации целевого белка в ренатурате на момент окончания процесса от значения рН ренатурационного буфера представлены на рисунке 25.

Концентрация белка,

–  –  –

Рис. 25. Зависимость концентрации целевого белка в ренатурате на момент окончания процесса от значения рН ренатурационного буферного раствора (по данным ОФВЭЖХ) Предс тавленные данные указывают на то, что оптимальное значение рН ренатурационного буфера составляет 8,5 ед. Проведение процесса ренатурации при данном значении рН позволяет повысить выход процесса дополнительно на 30 % до 0,28±0,01 мг/мл. При более низком значении рН наблюдается резкое снижение концентрации целевого белка.

2.2.1.5. Исследование влияния дополнительных компонентов на процесс ренатурации В процессе выявления влияния дополнительных компонентов на процесс ренатурации было установлено, что значительное влияние на процесс способен оказывать аргинин. Была показана прямая зависимость выхода процесса ренатурации от концентрации аргинина, результаты представлены на рисунке 26.

Концентрация белка,

–  –  –

0,31 0,29 0,27 0,25

–  –  –

Рис. 26. Зависимость концентрации целевого белка в ренатурате на момент окончания процесса от концентрации аргинина в ренатурационном буферном растворе (по данным ОФВЭЖХ) Изучение полученного ренатурата методом ОФВЭЖХ (рис. 27) продемонстрировало наличие дополнительного пика в левом плече целевого пика (на рисунке 27 данный пик выделен красным цветом).

Рис. 27. Анализ интерферона альфа-2, полученного в процессе ренатурации в присутствии аргинина в ренатурационном буферном растворе, методом ОФВЭЖХ Дальнейшая очис тка целевого белка не позволила удалить данную примесь, по этой причине аргинин не был включен в состав ренатурационного буферного раствора.

Таким образом, в результате проведенной оптимизации был установлен оптимальный состав ренатурационного буферного раствора:

20 мМ Трис HCl pH = 8.0; 0,8 М Urea; 0,1% polysorbate 20; 0,5 мМ Cs; рН = 8,5 2.2.1.6. Определение оптимальной нагрузки телец включений на ренатурационный буфер На следующем этапе необходимо было определить оптимальную нагрузку телец включений. Поиск оптимальной нагрузки обусловлен необходимостью повышения технологичнос ти процесса. При повышении нагрузки происходит снижение выхода процесса ренатурации, по этой причине стояла задача определения максимально возможной нагрузки, при которой не наблюдается значительного снижения эффективности процесса.

В качес тве начальной точки выступала нагрузка 2,43 г т.в. / л, используемая в исходных условиях проведения эксперимента. Результаты зависимости концентрации интерферона альфа-2 в ренатурационном буфере от нагрузки т.в. представлены на рисунке 28.

–  –  –

Рис. 28. Зависимость концентрации целевого белка в ренатурате от нагрузки телец включений (по данным ОФВЭЖХ) Линейная зависимость повышения концентрации сохраняется до нагрузки 4,86 г/л, после чего кривая выходит на плато. Следовательно, нагрузка 4,86 г/л является оптимальной.

–  –  –

Следующим шагом стало определение оптимальной продолжительности процесса ренатурации.

Процесс ренатурации проводили в двух диапазонах температуре: 2 – 8°С и комнатной температуре. Эксперимент проводили в течение 8 часов, отбирая пробы каждый час. Результаты исследования динамики представлены на рисунке 29. Из полученных данных можно сделать вывод, что оптимальная продолжительность процесса ренатурации при комнатной температуре составляет 3 часа (концентрация белка 0,51±0,01 мг/мл), при температуре 2 - 8°С – 6 часов (концентрация белка 0,53±0,01 мг/мл). Однако при проведении процесса при комнатной температуре значительно повышалась мутность раствора, по этой причине процесс решено проводить при температуре 2 - 8°С.

–  –  –

Рис. 29. Результаты исследования динамики ренатурации интерферона альфа-2 в двух диапазонах температур

По результатам процесса оптимизации с тадии ренатурации установлены следующие параметры процесса:

состав буферного раствора: 20 мМ Трис HCl pH = 8.0; 0,8 М Urea; 0,1% polysorbate 20; 0,5 мМ Cs; рН = 8,5; температура 2 - 8°С; продолжительность не менее 6 ч; нагрузка на ренатурационный буферный раствор 4,86 г т.в. / л.

В результате процесса оптимизации удалось повысить выход процесса в 1,9 раза, продолжительность процесса уменьшить в 1,5 раза, уменьшить затраты на данной стадии на 40 % за счет использования более дешевых реактивов, увеличить чистоту целевого белка с 41±0,2 % до 81±0,4 % по сравнению в исходным неоптимизированным процессом.

2.2.1.8. Масштабирование оптимизированного процесса ренатурации Далее был проведен процесс масштабирования процесса ренатурации в оптимизированных условиях. Результаты процесса масштабирования представлены в таблице 6.

–  –  –

Полученные данные демонстрируют, что разработанные условия ренатурации позволяют проводить масштабирование процесса. Снижение концентрации целевого белка при увеличении объема ренатурации в 37 раз (с 1 до 37 л) составило не более 5 %.

2.2.2. Разработка технологии очистки интерферона альфа-2

–  –  –

Следующим этапом в разработке технологии получения интерферона альфаявляется разработка стадии очистки. В рамках разработки технологии очис тки необходимо было разработать схему, позволяющую получать препарат по своим показателям качества соответствующего Европейской фармакопее.

На стадии предварительной очистки использовалась ионообменная хроматография. Данный тип хроматографии отличается прос тотой, низкими потерями, быстротой и низкой стоимостью как сорбента, так и применяемых буферных растворов.

Были проанализированы различные типы катионообменных и анионообменных смол производства компании GE (Швеция). Основными критериями приемлемости выступали продолжительнос ть процесса, выход целевого продукта со стадии, чистота получаемого препарата. В таблице 7 предс тавлены сравнительные характеристики, полученные для различных сорбентов. По результатам испытаний был выбран сорбент CM Sepharose FF, который позволяет получать очищенный и сконцентрированный целевой белок с конечным содержанием в суммарной фракции не менее 90±0,45 %. При этом потери на стадии не превышают 5 %.

–  –  –

Элюцию белка с CM Sepharose FF возможно проводить как путем повышения проводимости раствора, так и путем повышения значения рН. Был разработан процесс с совмещением двух типов элюции с использованием буферных рас творов:

буферный раствор 8: 50 мМ AcNa; рН = 4,5;

буферный раствор 9: 50 мМ AcNa; 500 мM NaCl; рН = 5,5.

Схема проведения очис тки включала следующие стадии:

Уравновешивание колонны буферным рас твором 8 Нанесение раствора ренатурированого интерферона альфа-2 в 50 % градиенте воды (для снижения проводимости раствора) Промывка колонны с адсорбированным белков буферным раствором 8 для удаления компонентов ренатурационного буфера Элюция интерферона альфа-2 путем повышения содержания элюирующего буферного раствора 9 в подвижной фазе от 0 до 100 % за 1 колоночный объем.

Хроматограмма очис тки интерферона альфа-2 представлена на рисунке 30.

Рис. 30. Хроматограмма предварительной очистки интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте CM Sepharose FF В результате очистки получали сконцентрированный раствор интерферона альфа-2 (с = 5 ± 0,5 мг/мл). Потери целевого белка на стадии составили менее 5%.

Анализ суммарной фракции после очис тки осуществляли методом ОФВЭЖХ, результаты представлены на рисунке 31.

–  –  –

11 - 34.783 12 - 35. 33 7 - 2 7.63 3 4 - 25 0 33. 8 - 28.5 00 0 5 - 25.8 33 6 - 26 7 50.

1 0 - 3 3.51 7

–  –  –

–  –  –

После проведения предварительной очистки целевого белка необходимо провести тонкую очистку для удаления большинства примесей.

2.2.2.2. Разработка стадии тонкой очистки интерферона альфа-2 Анализ литературы продемонстрировал, что наиболее распространенным подходом к тонкой очистке является обращенно-фазовая хроматография. Был разработан процесс тонкой очистки с использованием обращенно-фазового сорбента Vydac C18.

В качестве подвижных фаз использовали следующие буферные растворы:

буфер А: 0,1 % ТФУ в воде;

буфер Б: 0,1 % ТФУ в ацетонитриле.

Трифторуксусная кислота (ТФУ) выступала в качестве ион-парного агента, улучшающего эффективность разделения целевого и примесных белков.

Элюцию белка с колонны осуществляли пос тепенным повышением буферного раствора Б в подвижной фазе. Результаты очис тки предс тавлены на рисунке 32.

Рис. 32. Хроматограмма тонкой очистки интерферона альфа-2 на сорбенте Vydac C18.

Анализ фракций целевого пика (анализируемые фракции показаны на рисунке 32) проводили методом аналитической ОФВЭЖХ и ЭФ в ПААГ. Результаты анализы фракций методом ОФВЭЖХ продемонстрировали высокую с тепень чистоты целевого белка. Наименьшая чистота целевого белка наблюдалась во фракции А3 и составляла 95±0,5 %. В суммарной фракции интерферона альфа-2 после очистки содержание целевого белка составило боле 99±0,6 %. Изучение фракций методом ЭФ в ПААГ приведено на рисунке 33.

Рис. 33. Изучение фракций пика целевого белка после проведения стадии тонкой очистки на сорбенте Vydac C18 методом ЭФ в ПААГ (восстанавливающие условия) Как видно из рисунка 33 в каждой фракции содержалась дополнительная примесь с меньшей подвижнос тью, чем целевая полоса (показана красной стрелкой). Содержание данной примеси составило около 0,5±0,05% от общего количества белка. Европейская фармакопея не допускает наличия дополнительных полос с интенсивностью более чем 0,2 % интенсивности основной полосы и меньшей подвижностью, чем основной белок при анализе препарата методом ЭФ в ПААГ (восстанавливающие условия) с окраской нитратом серебра.

Совместно с компанией Proteome Factory AG (Германия) была проведена идентификация данной примеси. В рамках исследования препарат интерферона альфа-2 с дополнительной полосой был проанализирован методом 2D электрофореза. Полученные результаты представлены на рисунке 34.

Рис. 34. Анализ препарата интерферона альфа-2 с дополнительной полосой методом 2D электрофореза По результатам анализа белковых пятен было установлено, что пятно 1 представляющее собой искомый примесный белок, представляет собой белок штамма-продуцента – нуклеотид – связывающий белок yajQ (молекулярный вес 25 кДа).

Попытка удаления данного примесного белка в процессе дальнейшей очистки показала, что ни один из типов хроматографических сорбентов: металлхелатный, гель-фильтрационный, гидрофобный не позволяет провести селективное удаления. Элюция белка с данных типов сорбентов градиентом элюирующего буфера и последующий анализ целевого пика по фракциям методом ЭФ в ПААГ продемонс трировал наличие дополнительной примеси во всех фракциях с равномерным распределением от левого к правому плечу целевого пика. Единственным типом хроматографии, позволяющим достичь неравномерного распределение примеси, была ионообменная хроматография.

Для очистки обозначенной примеси был исследован ряд ионообменных сорбентов с мелким размером гранул: CM Sepharose HP (GE, США), Q HP Sepharose (GE, США), YMC Biopro S30 (YMC, Япония). Мелкозернистые сорбенты обеспечивают более эффективное разделение целевого и примесного белков. Из приведенных сорбентов наилучшие результаты продемонстрировал сорбент YMC Biopro S30.

С помощью данного сорбента была разработана простая и эффективная схема тонкой очистки интерферона альфа-2 с использованием следующих буферных растворов:

буферный раствор 8: 50 мМ AcNa; рН = 4,5;

буферный раствор S30: 15 mM His; 65 mM NaCl; pH 5,0.

Схема разработанной хроматографической очистки включает несколько стадий: уравновешивание колонны буферным рас твором 8 Нанесение раствора интерферона альфа-2, полученного в результате предварительной очистки на СМ Промывка колонны с адсорбированным белков буферным раствоSepharose FF ром 8 для удаления белков, не связавшихся с колонкой Элюция интерферона альфа-2 в изократическом режиме буферным раствором S30. Регенерацию колонны проводили методом ее промывки 0,5 М раствором хлорида натрия.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Похожие работы:

«Проскурякова Лариса Александровна НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ СОХРАНЕНИЯ ЗДОРОВЬЯ...»

«Регузова Алёна Юрьевна Исследование специфической активности полиэпитопных Т-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«ПОПОВ ВИКТОР СЕРГЕЕВИЧ НАУЧНОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ СРЕДСТВ И СПОСОБОВ ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ У СВИНЕЙ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук,...»

«ИВАНОВ Сергей Иванович Особенности воспроизводства атлантического лосося (Salmo salar L.) в озерно-речной системе реки Шуя (Республика Карелия) Специальность 03.02.06 – ихтиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени...»

«ДЯТЛОВА ВАРВАРА ИВАНОВНА ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Специальность: 03.02.03 – микробиология. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«КОНОНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НОВЫХ СОРТОВ СТЕВИИ Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley ПРИ ВВЕДЕНИИ В КУЛЬТУРУ В ЦЕНТРАЛЬНОМ ПРЕДКАВКАЗЬЕ по специальности 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«CИЛИ ИВАН ИВАНОВИЧ УДК 621.341 ЭНЕРГОИНФОРМАЦИОННАЯ РАДИОИМПУЛЬСНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ И ЭЛЕКТРОННЫЕ СИСТЕМЫ УНИЧТОЖЕНИЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ КАРТОФЕЛЯ 05.11.17 – биологические и медицинские устройства и системы Диссертация на соискание научной степени кандидата технических наук Научный руководитель: Федюшко Юрий Михайлович доктор технических наук, профессор Мелитополь – 2015 СОДЕРЖАНИЕ...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ГАБЫШЕВ Виктор Александрович ФИТОПЛАНКТОН КРУПНЫХ РЕК ЯКУТИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ТЕРРИТОРИЙ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ 03.02.10 – Гидробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант Доктор биологических наук Доцент Л.Г. Корнева Якутск 2015 Оглавление ВВЕДЕНИЕ Глава 1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 2. ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНА И ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ...»

«ЛИТВИНЮК ДАРЬЯ АНАТОЛЬЕВНА МОРСКОЙ ЗООПЛАНКТОН И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ЕГО ИЗУЧЕНИЯ Специальность 03.02.10. – Гидробиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Самышев Эрнест Зайнуллинович МОСКВА 2015 СОДЕРЖАНИЕ Стр. ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ РАЗДЕЛ 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. История изучения и методологические аспекты оценки...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Гуляева Анна Федоровна ТРАВЯНЫЕ МЕЛКОЛИСТВЕННЫЕ ЛЕСА КУЗНЕЦКОЙ КОТЛОВИНЫ: СИНТАКСОНОМИЯ, ЭКОЛОГИЯ, ГЕОГРАФИЯ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., ст.н.с. Н.Н. Лащинский Новосибирск 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОСТИ...»

«СЕРЕГИН Алексей Петрович ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ФЛОРЫ ВЛАДИМИРСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант Павлов Вадим Николаевич, д.б.н., проф., член-корр. РАН Москва ОГЛАВЛЕНИЕ Введение 1 Мировой опыт сеточного картирования флоры: обзор литературы 1.1 Атласы и базы данных (сбор и представление данных) 1.2 Методы и приемы (анализ...»

«Гуськов Валентин Юрьевич МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БУРОГО МЕДВЕДЯ URSUS ARCTOS LINNAEUS, 1758 ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, с.н.с. А.П. Крюков Владивосток – 2015 Оглавление Введение Глава 1. Обзор...»

«Щепитова Наталья Евгеньевна Биологические свойства фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«Артеменков Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Брук...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.