WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«Разработка промышленной технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2b ...»

-- [ Страница 2 ] --

Активная деградация интерферона альфа-2 в организме по различным механизмам, а так же значительный объем распределения (около 30 л) выражаются в малом времени жизни интерферона в организме (время полувыведения около 3 ч).

При этом для эффективной терапии интерферонсодержащими препаратами различных заболеваний необходимо постоянно поддерживать высокий уровень концентрации интерферона в крови, что выражается в увеличении дозы препараты и частоты инъекций, что в свою очередь повышает вероятность проявления негативных эффектов от приема препарата.

Основные негативные эффекты от приема интерферона можно условно разделить на несколько основных категорий [89]:

1. Общие (усталость, головная боль, повышенная светочувствительность, озноб, обезвоживание, потеря веса, анорексия, лихорадка, миалгии);

2. Нервно-психические (спутанность сознания, головокружение, вялость, онемение, покалывания, депрессия);

3. Гематологические (тромбоцитопения, анемия, нейтропения, лейкопения);

4. Желудочно-кишечные (диарея, рвота, тошнота, боль в животе, запор);

5. Сердечнососудистые (гипотензия, гипертензия, синусовая тахикардия);

6. Метаболические (гипокальциемия, гипергликемия, гипогликемия, гипофосфатемия);

7. Другие (аллергическая реакция, зуд, сухость кожи, сыпь).

Период полувыведения интерферона альфа составляет около 3 часов, а полного выведения около 24 часов [55]. Повышение частоты инъекций интерферон – содержащих препаратов ухудшает качество жизни пациентов. Перечисленные недостатки потребовали разработки нового поколения препаратов на основе интерферона альфа-2, которые не подвергались бы с толь быстрому выведению из организма пациента, но при этом сохраняли бы эффективность, схожую с нативным интерфероном, т.е. обладали пролонгированными свойствами.

1.10. Создание лекарственных препаратов с пролонгированным действием 1.10.1. Способы пролонгирования действия белковых молекул

Для решения проблем, связанных с применением препаратов на основе белковых молекул, было разработано несколько подходов:

Изменение аминокислотной последовательнос ти;

кроссшивки с другими белковыми молекулами (к примеру, альбумином);

ковалентное присоединение Fc фрагмента антител;

включение в мицеллы;

присоединение различных полимеров;

гипергликозилирование;

пасилирование.

Методы, связанные с внесением изменений в первичную структуру, сложны, но высокоэффективны с точки зрения пролонгации дейс твия препарата. К таким методам, к примеру, относится современный метод – пасилирование белковых молекул. Суть метода состоит в том, что к N или C концу белковой молекулы методом генетической инженерии присоединяют аминокислотный «хвост», состоящий обычно из 200 аминокислотных ос татков: пролин, аланин, серин [110]. Недостатком этого метода является изменение первичной структуры белков, что может сказаться на их иммуногенности и биологической активности.

Метод включений целевого белка в мицеллы широко используется при производстве различных препаратов. Однако мицеллы обладают одним существенным недостатком - высокой стоимостью. При этом существует проблема получения гомогенного препарата, так как мицеллы отличаются между собой размером, что приводит к изменению фармакокинетики препаратов от серии к серии.

Метод, направленный на получение гипергликозилированных форм белков, также используется в современной практике. С применением данного подхода создан препарат гипергликозилированного эритропоэтина – дарбэпоэтин (Аранесп) [140]. Данный подход является эффективным, однако крайне сложен для реализации, еще один недостаток – сложность воспроизведения полученных результатов вследствие чувствительности клеток к компонентам питательной среды и другим условиям проведения процесса, в результате чего может изменяться профиль гликозилирования целевой молекулы.

Метод кроссшивок целевого белка с другими белковыми молекулами (к примеру, альбумином) не нашел широкого применения. В процессе получения данного типа препаратов используются специальные сшивающие реагенты с двумя терминальными реактивными группами, в итоге значительно снижается выход целевой формы и повышается содержание побочных.

Среди вышеперечисленных методов наиболее широкое распространение нашел способ конъюгации молекул белка с инертными молекулами полимеров, самым распространенным из которых является полиэтиленгликоль. Данный метод пролонгирования действия белковых молекул называется пегилированием.

1.10.2. Пегилирование. Общая информация

Полиэтиленгликоль – это инертный полимер, который отличается низкой иммуногеннос тью, низкой реакционной способностью, высокой рас творимостью, а так же структурной простотой. Присоединение полиэтиленгликоля позволяет достичь целый ряд желанных целей: повышение периода полураспада in vivo;

уменьшение иммуногенности, токсичности и уровня почечного клиренса; улучшения мембранного транспорта; защита от протеолиза; повышение стабильнос ти в более широком диапазоне рН и температуры; уменьшение объема распределения и длительной адсорбции в зоне введения. Эти новые свойства препаратов усиливают эффективность применения, повышают терапевтический отклик, уменьшать местные эффекты и снижают частоту инъекций [55].

В результате реакции пегилирования к молекуле белка присоединяется одна или несколько молекул ПЭГ. Чаще всего целевой формой является монопегилированная форма, так как олигопегилирвоанные формы отличаются низкой активностью вследствие с терических затруднений, создаваемых присоединяемыми молекулами ПЭГ. Монопегилированная форма в свою очередь так же не всегда является гомогенной, а состоит из ряда изоформ, которые отличаются аминокислотным остатком, по которому происходит реакция [46]. Химизм процесса пегилирования будет детально рассмотрен далее.

Основное свойство молекул ПЭГ состоит в их высокой гидрофильнос ти – 1 структурная единица ПЭГ способна акцептировать 2-3 молекулы воды, а суммарная фактическая масса конъюгата увеличивается в 5 – 10 раз по сравнению с теоретическим значением [59]. В результате вокруг получаемого конъюгата образуется «облако» из молекул воды. Данное «облако» оказывает значительное влияние на изначальные физико-химические и биологические свойства белковых молекул. За счет значительного увеличения гидродинамического радиуса конъюгата изменяется и профиль клиренса применяемого препарата, что позволяет использовать процесс пегилирования в качестве системы доставки активных веществ в целевые ткани [118].

На сегодняшний день наиболее широкое применение в медицинской практике получили пегилированные формы белков, однако существуют работы, в которых продемонс трирована возможность пегилирования пептидов, а так же веществ не белковой природы. Развитию пегилирования способствует коммерческая доступность ПЭГ с различной структурой и молекулярным весом.

Открывателем процесса пегилирования является Дэвис [1;2]. Им было показано, что присоединение гидрофильных полимеров может способствовать снижению иммуногеннос ти и увеличивать продолжительнос ть полураспада белков in vivo. Однако значительной проблемой было найти полимер для данной технологии. Преимуществами ПЭГ по сравнению с другими полимерами является возможность его получения в больших количествах и его безопасность, доказанная в процессе его применения в различных отраслях промышленности, в том числе пищевой и фармацевтической - в качестве наполнителя для медицинских препаратов.

Сам по себе ПЭГ является химически инертной молекулой и не способен вступать в реакции с белковыми молекулами. По этой причине для придания реакционоспособности, молекулы ПЭГ предварительно активируют путем присоединения активных групп, строение которых зависит от желаемого сайта присоединения на поверхнос ти молекулы белка.

Для пролонгирования белковых препаратов применяются и другие гидрофильные полимеры со схожими свойствами [84;104;109;120]. Основная проблема при использовании полимеров, отличных от ПЭГ, заключается в их высокой полидисперсности, связанной со сложной схемой полимеризации. Препарат, получаемый с использованием таких полимеров не гомогенен. ПЭГ, напротив, обладает низкой полидисперсностью - в пределах от 1,01 для молекул с низким молекулярным весом (меньше 5 кДа) до 1,1 для молекул с высоким молекулярным весом (более 50 кДа) [118]. На сегодняшний день на рынке представлен только один препарат на основе конъюгата белок – полимер, в состав которого входит не ПЭГ.

Это антираковый препарат неокарциностатин.

Альтернативой ПЭГ является перспективный полимер полиоксазолин, который, несмотря на совсем другое строение по сравнению с ПЭГ, демонстрирует ряд полезных свойств: он может быть получен с малой полидисперсностью благодаря легкому контролю за анионной полимеризацией, он так же амфифилен и может быть получен только с одной терминальной реактивной группой [14].

Еще одно интересное направление – создание конъюгатов на основе молекул белка и полисахаридов. Разработаны технологии, позволяющие активировать полисахаридную цепь в одной точке [32]. В качес тве примера можно привес ти препарат стрептодеказа, представляющий собой конъюгат на основе декстрана и стрептокиназы.

В развитии технологии пегилирования приянто выделять 4 этапа. Первый этап (1970 – 1980 гг.) относится к разработке идеи использования ПЭГ для создания ковалентных конъюгатов. На данном этапе использовались токсичные материалы и высокополидисперсный ПЭГ. Получаемые конъюгаты отличались значительной гетерогеннос тью. Результатом данного этапа можно считать выявление общих закономерностей процесса пегилирования и определние его критических точек. В рамках второго этапа (1980– 1990 гг.) удалось значительно понизить полидисперсность получаемых активированных ПЭГ. Были разработаны активированные ПЭГ с меньшим количес твом диольных примесей, появляются первые работы по сайт-специфическому пегилированию, позволяющие обьеспечить гомогеннос ть получаемых препаратов. Третий период (1990 – 2000 гг.) характеризуется началом производства первых пегилированных препаратов и их выводом на фармацевтический рынок, при этом активно развиваются технологии сайт-направленного пегилирования. Получаемые препараты отличаются высокой гомогеннос тью. На четветом этапе (2000 г. – н.в.) детально изучена химия пегилирования, произведена полная характеризация конъюгированных препаратов. Продемонстрирована возможность пегилирования не только белковых молекул, но и веществ небелковой природы. Пегилирование начинает применяться совместно с другими методами. К примеру, методами генной инженерии в молекулы белка вводятся дополнительные редкие аинокислотные остатки, по которым далее осуществляют процесс пегилирования.

На рынок выводится большое количество пегилированных препаратов.

1.10.3. Химия пегилирования

В общем виде ПЭГ представляет собой полимер с линейной или разветвленной структурой с одной или двумя терминальными гидроксильными группами, в зависимости от того, с помощью чего производилась инициация полимеризации этиленоксида при синтезе ПЭГ: водой или метанолом. В первом случае ПЭГ будет обладать двумя терминальными гидроксильными группами, во втором

– одна терминальная группа – гидроксильная, вторая – метиловая.

Общая структура ПЭГ соответственно: НO–(CH2 CH2 O)n –CH2 CH2 –OH или CH3 O–(CH2 CH2 O)n –CH2 CH2 –OH.

Наибольшее распространение приобрел монометокси ПЭГ, так как при использовании данного реактива значительно сокращается количес тво побочных кроссшитых продуктов реакции пегилирования. Коммерчески доступные монометоксиПЭГ содержат значительное количес тво диольных молекул по причине присутствия небольших количеств воды в процессе проведения реакции полимеризации. Содержание диольных форм ПЭГ может достигать до 15 % от общего количества ПЭГ [106]. Однако разрабатываются технологии, которые позволяют получать гомогенный монометокси ПЭГ без примеси диольных молекул [15].

Молекулы ПЭГ являются химически инертными. Для взаимодействия с группами на поверхности молекулы белка необходимо провести их предварительную модификацию путем присоединения активной группы. Тип активной группы зависит от мишени на поверхности молекулы белка. Модификацию молекул белка обычно проводят по боковым цепям остатков лизина, цистеина, гистидина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина, тирозина, а так же N – терминальной аминогруппе и С – терминальной группе [106].

Наибольшее распространение получили активированные ПЭГ, содержащие активные группы, подходящие для реакции с остатками лизина или N – терминальной группой. Лизин одна из самых распространенных аминокислот в белках и может составлять до 10 % от общего количес тва аминокислотных остатков. В результате взаимодействия ПЭГ с остатками лизина на выходе образуется гетерогенная смесь, которая отличается не только местом присоединения ПЭГ, но и количес твом присоединяемых молекул ПЭГ, т.е получаемые продукты могут отличаться своей степенью модификации [106].

Обычно высокая степень модификации увеличивает время полужизни и снижает вероятность антигенности [26]. Каждый позиционный изомер гетерогенной смеси по-разному экранирует антигенные эпитопы, что определяет иммуногеннос ть получаемых конъюгатов. Гетерогенность продуктов реакции пегилирования вызывает определенную озабоченность для фармацевтических веществ на основе ПЭГ – конъюгатов. По этой причине необходимо демонс трировать, что профиль пегилирования для каждого препарата может быть определен и воспроизведен от серии к серии.

Все активированные ПЭГ условно подразделяют на два поколения. Первое поколение активированных ПЭГ отличалось низкой с тепенью чистоты, низким молекулярным весом, нестабильностью образуемых связей, отсутствием селективности при модификации. Данные проблемы были частично решены при разработке второго поколения активированных ПЭГ.

–  –  –

Примерами первого поколения модифицирующих агентов могут служить молекулы ПЭГ со следующими активными группами: дихлоротриазин, трезилат, сукцинимидилкарбонат, бензотриазолкарбонат, п – нитрофенилкарбонат, трихлорофенилкарбонат, карбонилимидазол, сукцинимидилсукцинат. Структура данных активированных ПЭГ предс тавлена на рисунке 5.

Дихлоротриазин ПЭГ реагирует с множес твенными нуклеофильными группами на поверхности белка: остатками лизина, серина, тирозина, цистеина и гистидина. В результате реакции один остаток хлора замещается на белковую молекулу с образованием вторичного амина. Показано, что второй атом хлора так же может принимать участие в реакции. В результате чего могут образовываться побочные кроссшитые продукты [137].

Трезилат ПЭГ более селективно реагирует с группами белка, чем дихлоротриазин ПЭГ, однако было показано, что он так же образуется гетерогенную смесь продуктов реакции по различным сайтам на поверхности белка. При этом часть из этих продуктов имеет сульфаминовую связь, которая легко гидролизуется в водных растворах [88].

Наибольшее распространение среди активированных ПЭГ первого поколения получили сукцинимидилкарбонат ПЭГ [90;134] и бензотриазолкарбонат ПЭГ [37]. Данные реагенты реагируют преимущественно с азотом остатков лизина с образованием карбамидной связи, но также способны реагировать с остатками гистидина и тирозина с образованием имидазолкарбамидной связи, которая подвергается гидролизу в водных растворах. Данный недостаток данных ПЭГ был использован для создания пролонгированных белковых препаратов с контролируемых высвобождением активного вещества, которые будут рассмотрены ниже.

П – нитрофенилкарбонат ПЭГ, трихлорофенилкарбонат ПЭГ и карбонилимидазол ПЭГ не получили широкого распространения за счет более низкой реакционной способности. Однако за счет снижения реакционной способности повышается селективность реакции [11;117].

Сукцинимидилсукцинат ПЭГ содержит эфирную связь в цепи ПЭГ, которая после присоединения ПЭГ к молекуле белка может подвергаться гидролизу, в результате на поверхности белка может остаться сукцинатная группа, которая может привес ти к повышению иммуногенности белковой молекулы [25].

Рис. 5. Примеры активированных ПЭГ первого поколения (1 - дихлоротриазин, 2 - трезилат, 3а - сукцинимидилкарбонат, 3b - бензотриазолкарбонат, 3c п – нитрофенилкарбонат, 3d - трихлорофенилкарбонат, 4 - карбонилимидазол, 5 - сукцинимидилсукцинат) [106] Как видно из приведенных примеров, активированные ПЭГ первого поколения отличаются низкой эффективностью и селективностью.

При этом час ть продуктов реакции пегилирования содержат ковалентные связи, которые подвергаются гидролизу в водных растворах, что сказывается на стабильности получаемых препаратов. Важно так же отметить, что технологии синтеза активированных ПЭГ первого поколения, предполагающие активацию терминальных ОН групп молекул ПЭГ с помощью ангидридов, хлоридов, хлороформиатов, а так же карбонатов, не позволяют получать активированные ПЭГ с большим молекулярным весом. Данные недостатки были решены в процессе разработки активированных ПЭГ второго поколения, которые получили более широкое распространение.

–  –  –

Как уже отмечалось выше, активированные ПЭГ второго поколения отличались от ПЭГ первого поколения практически полным отсутствием контаминации диольными формами ПЭГ, а так же возможностью синтеза молекул с большой молекулярной массой. Применяемые активные группы позволили значительно повысить селективность модификации белковых молекул. При этом все активированные ПЭГ второго поколения можно разделить на несколько групп в зависимости от типа селективной модификации.

1.10.3.2.1. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации аминогрупп Первым предс тавителем данного типа активированных ПЭГ является пропиональдегид ПЭГ [56]. Отличительной особеннос тью данного активированного ПЭГ является его высокая селективность по отношению к N – концевой аминогруппе при проведении реакции пегилирования при слабокислом значении рН (около 5 ед.) по причине значительного отличия pKa терминальной аминогруппы по сравнению с другими нуклеофильными группами [72]. Атака электрофильных групп активированного ПЭГ на нуклеофильные группы белка возможна только в случае, если рН реакционного буфера соответствует или больше pKa модифицируемой группы. Полная селективность процесса не достигается, однако гетерогенность продукта, часто наблюдаемая в случае модификации лизинов, значительно снижена. Присоединение альдегидов к первичным аминогруппам происходит за счет образования оснований Шиффа, которое восстанавливается с образованием стабильного вторичного амина (схема реакции представлена на рисунке 6).

Рис. 6. Схема модификации N – терминальной NH2 группы с использованием пропиональдегид ПЭГ [106] Еще один вариант активированных ПЭГ второго поколения для модификации аминогрупп – активные эфиры карбоксильных кислот ПЭГ. Данные виды ПЭГ реагируют с первичными аминами с образованием с табильной амидной связи. Реакция молекул белка с данными ПЭГ приведена в общем виде на рисунке 7.

Рис. 7. Примеры активированных ПЭГ второго поколения для селективной модификации аминогрупп (1 – гидроксисукцинимидилэфир (линейная структура), 2 - гидроксисукцинимидилэфир (разветвленная структура) [106] Важная отличительная черта данных видов ПЭГ состоит в том, что существующие технологии позволяют получать их с чистотой около 97 % путем очис тки методом ионообменной хроматографии.

Первым активированным ПЭГ, полученным по такой технологии был карбоксиметилированный ПЭГ (CM-PEG) [135]. Сукцинимидилэфир данного ПЭГ (SCM-PEG) крайне реактивен (время полужизни в растворе составляет 0,75 мин при рН = 8,0 и 25°С), что значительно затрудняло его использование. Для создания ПЭГ с кинетикой, более подходящей для модификации белков были разработаны новые варианты ПЭГ – на основе пропионовой и бутановой кислот. Внесение дополнительных метильных групп между активным эфиром и основной цепью ПЭГ позволило снизить скорость гидролиза с 0,75 минут до 16,5 и 23 минут в случае применения пропионовой и бутановой кислот, соответственно [58].

1.10.3.2.2. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации цистеинов Другой путь селективного пегилирования белковых молекул – модификация тиоловых групп. Модификация данных групп является перспективным направление, так как количество остатков цистеина на поверхности молекулы белка значительно меньше, чем количес тво остатков, к примеру, лизина. В случае отсутствия цистеинов в нативной форме белка, дополнительные цистеины могут быть добавлены методами генной инженерии [51].

Преимущество данного подхода заключается в том, что в данном случае можно проводить пегилирование по облас тям на поверхнос ти белка, которые, к примеру, не учас твуют в связывании с рецептором, в результате чего пегилирование не будет приводить к снижению активности белка. Однако данный подход не лишен недостатков. Введение дополнительных цистеинов может привести к формированию нежелательных дисульфидных связей и увеличению вероятнос ти агрегации.

Для модификации тиоловых групп был разработан ряд активных ПЭГ: малеимид, винилсульфон, иодацетамид, ортопиридилдисульфид [51;74;91;128].

Данные ПЭГ были созданы для пегилирования белковых молекул по остаткам цистеина. Структура данных ПЭГ приведена на рисунке 8.

Каждый из данных ПЭГ имеет свои преимущества и недос татки.

Винилсульфон ПЭГ медленно реагирует с тиолами с образованием стабильных тиоэфирных связей при слабощелочном значении рН раствора (7-8 ед.), но процесс может протекать быс трее при увеличении значения рН. Данный вид ПЭГ стабилен в водных растворах, однако он способен реагировать с остатками лизина при высоких значениях pH.

Малеимид ПЭГ реактивен по отношению к тиолам при кислых значениях рН (6-7 ед.), но он не стабилен в водных растворах и легко в них разрушается.

Иодацетамид ПЭГ медленно реагирует со свободными тиоловыми группами путем нуклеофильной атаки и образует с табильные тиолоэфирные связи. Реакцию следует проводить при небольшом молярном превосходстве ПЭГ в темноте с целью ограничения генерации свободного иодида, который может реагировать с другими аминокислотными остатками. Тиолоэфирная связь между данным ПЭГ и белком стабильна [106].

Рис. 8. Примеры активированных ПЭГ второго поколения для селективной модификации тиоловых групп (1 – малеимид, 2 - винилсульфон, 3 - иодацетамид, 4 -ортопиридилдисульфид) [106] Ортопиридилдисульфид ПЭГ специфично реагирует с сульфогидрильными группами как при кислом, так и при щелочном значении рН (3-10 ед.) с формированием дисульфидной связи между ПЭГ и белком. Данная связь стабильна при отсуттвии в среде восстановителей, которые могут привести к ее разрушению.

1.10. 3.2.3. Активированные ПЭГ второго поколения для модицифкации окисленных карбогидратов Окисление карбогидратных остатков или N – терминального серина или треоинна является альтернативным методом сайт-направленного пегилирования.

Карбогидраты могут быть окислены с помощью ферментов, таких как глюкоз – оксидаза или химически, к примеру с помощью натрия периодата. Окисленные карбогидратные остатки образуют реактивные альдегидные группы, которые могут реагировать как с ПЭГ гидразидом с образованием гидразиновой связи, так и с ПЭГ - аминами с образованием основания Шиффа [136]. Схема модификации окисленных карбогидратов предс тавлена на рисунке 9.

Рис. 9. Схема модификации окисленных карбогидратов с использованием ПЭГ аминов [106] Гидразиновая связь может быть восстановлена с помощью цианоборогидрида натрия до более стабильной алкил гидразидной, а основание Шиффа может быть восстановлено до вторичной аминной связи. Использование амино ПЭГ затруднено по причине возможного формирования кроссшитых продуктов реакции.

Гидразиды ПЭГ являются более селективными агентами, при кислом значении рН данные типы реагентов селективно модифицируют карбогидратные остатки.

1.10.3.3. Реверсивное пегилирование Большинс тво техник пегилирования направлено на создание конъюгатов со стабильной связью между ПЭГ и белком. В большинстве случаев стабильная вязь является преимуществом по причине более долгого хранения, более легкой очистки и дос тупности в преднаполненных шприцах.

Известно, что стабилная связь с белком может снижать активность по причине нахождения молекулы ПЭГ в области сайта связывания с рецептором, в результате чего могут возникать стерические затруднения. Хотя вес ПЭГ напрямую влияет на активность, конъюгаты на основе тяжелых молекул ПЭГ демонстрируют более низкую активность но более высокую за счет лучшего in vitro, in vivo фармакокинетического профиля [10]. Большинство техник пегилирования направлено на создание конъюгатов, которые с одной стороны дольше циркулировали в крови, а с другой стороны не теряли активность.

В своем препарате Пегинтрон (пегилированный интерферон альфа-2b) компания Экзон (США) использовала технику т.н. реверсильного пегилирования, за счет котороой удалось добиться улучшения фармакокинетики препарата, но при этом минимизировать риск потери активности интерферона альфа-2b [57].

Для этого они использовали связь между ПЭГ и интерфероном, подверженную процессу гидролиза в физиологичсеких условиях.

Пегинтрон сформирован путем конъюгации сукцинимидилкарбонат ПЭГ с интерфероном альфа-2b путем проведения реакции в слабокислых условиях рН.

Конюгация привела к формированию смеси ПЭГ конъюгатов, основным из которых является конъюгат по остатку Гис34. По этой причине ПЭГ присоединяется к N1 позиции имидазольного кольца с образованием неусточивой связи, которая через некторое время подергается деградации с высвобождением нативного интерферона. Более подробно реверсивное пегилирование на примере препарата Пегинтрон будет рассмотрено ниже.

1.10.3.4. Гетерофункциональные активированные ПЭГ

Еще одним современным подходом в области пегилирования является разработка гетерофункциональных молекул активированного ПЭГ. Суть данного вида ПЭГ состоит в том, что молекула ПЭГ несет не одну активную группу, а несколько. Наличие двух активных групп позволяет получать гомо и гетеродимеры белковых молекул [22;133].

Еще одно направление, в котором может могут быть задействованы гетерофункциональные ПЭГ – связывание макромолекул с различными поверхнос тями, что актуально при проведении иммуноферментных анализов. Гетерофункциональные ПЭГ могут так же использоваться для создания платформ для направленной доставки лекарств, липосом и вирусов в ткани.

–  –  –

На сегодняшний день на рынке представлено большое количество активированных ПЭГ с различной структурой. Наиболее часто применяемые структуры молекул ПЭГ предс талвены на рисунке 10.

–  –  –

Все активированные ПЭГ можно условно разделить на активированные ПЭГ с одной активной группой и активированные ПЭГ с несколькими активными группами. Каждая из групп в свою очередь в зависимости от строения основной цепи разделяются на линейные (рис. 10 - А), разветвленные (рис. 10 - Б) и мультиразветвленные (рис. 10 - В).

Считается, что увеличение молекулярного веса уменьшает активность целевого вещества in vitro, но при этом повышает активность in vivo за счет увеличения времени циркуляции препарата в организме. Однако, при значительном увеличении размера присоединяемой молекулы ПЭГ, активнос ть целевого белка может снижаться крайне значительно. Таким образом, при выборе активированного ПЭГ необходимо соблюдать баланс между размером и структурой активированного ПЭГ и биологической активностью целевого вещества.

1.10.5. Влияние пегилирования на физико – химические и биологические свойства белковых молекул Как уже отмечалось выше, пегилирование придает препаратам новые физикохимические и биологические свойства.

1.10.5.1. Влияние на гидрофильность, молекулярный вес и гидродинамический радиус Одной из важнейших особенностей модифицированных ПЭГ является их высокая гидрофильность. Присутствие эфирных атомов кислорода способствует гидратации цепей ПЭГ с образованием ионов оксония. Подобный эффект влечет за собой формирование «водного облака» вокруг модифицированной молекулы «ПЭГ - биополимер», за счет чего значительно повышается ее гидродинамический радиус. Этот своеобразный «щит» воды вокруг модифицированной молекулы, с одной стороны, значительно повышает растворимость и биодоступнос ть препарата, а с другой, - защищает молекулу от других белков (нейтрализующие антитела, комплемент) [94]. Таким образом ПЭГ-модифицированные белки и пептиды значительно более защищены от опсонизации и активного фаго- и эндоцитоза.

Повышение гидрофильности коньюгатов способствует повышению их растворимости, к примеру, в органических растворителях. Растворимые в органических растворителях пегилированные ферменты могут использоваться в органическом синтезе для проведения высокоселективных реакций в неводной среде [65].

1.10.5.2. Влияние на конформацию

Несмотря на то, что с труктурные свойства коньюгатов белок - ПЭГ изучены недостаточно, можно утверждать, что в данном случае конформация коньюгата будет определяться конформацией ПЭГ. Так как ПЭГ может принимать различные конформации, зависящие от состава раствора, в котором он растворен, возможны несколько моделей конформации коньюгата [61]. Возможные конформации ПЭГ представлены на рисунке 11.

Рис. 11. Возможные конформации коньюгатов белок - ПЭГ. Желтой точкой показана активная группа ПЭГ. Сплошная черта означает ковалентную связь белок-ПЭГ, пунктирная – нековалентную связь [61] Одна из возможных конформаций белок - ПЭГ подразумевает сольватацию водой гидрофильных облас тей белка, в то время как гидрофобные участки ПЭГ взаимодействуют с соответствующими структурами белка. Такая конформация называется панцирной (PEGshell -на риунке 11). При такой конформации молекулы ПЭГ окружают молекулу белка по кругу. Такая с труктура крайне стабильна и снижает распознавание молекулы белка иммунной системой.

Еще одной возможной конформацией коньюгата является спиралевидная структура. Отличительная особеннос ть данной структуры в том, что ПЭГ, прикрепленный к белку, свободно «колеблется» в растворе.

–  –  –

ПЭГ является нейтральным полимером, т.е. сам по себе не несет никакого заряда, но при этом он может влиять на заряд белков по трем механизмам. Первый механизм предполагает экранирование поверхностного заряда молекулы белка, что в целом влияет на заряд молекулы. Второй механизм заключается в том, что молекула ПЭГ ковалентно связывается с заряженными группами белка, что изменяет заряд этих групп (к примеру, аминная группа превращается в амидную). Третий механизм предполагает образование водородных связей между молекулой ПЭГ и кислотными ос татками (или другими группами), что приводит к увеличению их pKa [33].

<

1.10.6. Клиренс пегилированных препаратов

Большинс тво белков, представляющих фармацевтический интерес: ферменты, цитокины, гормоны обладают молекулярной массой от 15 до 30 кДа. Такой же молекулярной массой обладают и фрагменты антител – перспективные препараты

– заменители полноразмерных антител. Молекулы с данным молекулярным весом подвергаются активному клиренсу, что зачас тую препятствует их активному применению в медицинской практике [77].

Механизм процесса экскреции пегилированных препаратов и его скорость зависят от сайтов связывания ПЭГ на поверхнос ти белка и от количества молекул ПЭГ, присоединенных к одной молекуле белка. Понимание поведения ПЭГ в составе конъюгата и в его свободной форме является основой для выбора с тратегии пегилирования.

Белки с молекулярной массой менее 60 кДа преимущественно выводятся с мочой, однако клиренс молекул ПЭГ нельзя сравнивать с клиренсом глобулярных белков. Молекулы ПЭГ обладают значительной гибкостью и могут преодолевать различные барьеры. При этом считается, что ПЭГ не является биоразлагаемым полимером. Есть данные, свидетельствующие о том, что низкомолекулярные ПЭГ (до 400 Да) могут разлагаться рядом ферментов: алкогольдегидрогеназами [71], альдегиддегидрогеназами [47] и цитохромомом Р-450 [16] с образованием токсичных продуктов разложения.

При этом для производства медицинских препаратов используется ПЭГ с молекулярным весом ниже порога выведения через почки (60 кДа). На сегодняшний день наиболее крупная молекула ПЭГ, используемая в производстве коммерческого препарата, имеет молекулярный вес 40 кДа (препарат (Пегасис). При увеличении молекулярного веса более 60 кДа, время циркуляции препаратов значительно увеличивается, и они начинает накапливаться в печени [118].

Известно, что время полураспада пегилированного препарата в крови пациента прямопропорционально размеру присоединенной молекулы ПЭГ. Так, при присоединении к молекуле гемоглобина молекулы ПЭГ с молекулярным весом 10 кДа гидродинамический объем конъюгата составляет 712 нм3, а при присоединении 20 кДа ПЭГ – 1436 нм3 [86]. Интересно так же отметить, что при проведении ряда экспериментов по компьютерному моделированию возможного поведения молекул ПЭГ в растворе было показано, что молекулы ПЭГ с молекулярным весом 5 и 10 кДа равномерно окружают молекулу белка, при этом 20 кДа ПЭГ способны самостоятельно сворачиваться в стороне от молекулы и в меньшей степени защищать молекулу белка от протеолиза, что может влиять на клиренс препарата. В работе [43] продемонстрирована зависимость клиренса пегилированных препаратов от с труктуры ПЭГ. Показано, что конъюгаты на основе молекул ПЭГ с разветвленной структурой демонстрируют большее время полужизни по сравнению с конъюгатами, содержащими в составе линейные молекулы ПЭГ с аналогичным молекулярным весом. Авторы утверждают, что разветвленные ПЭГ формируют динамический гидратный слой в форме «зонтика», что позволяет лучше маскировать поверхность белка, и как следствие улучшать их устойчивость по отношению к дейс твию протеиназ, антител и иммунных клеток. Примером успешного применения разветвленных ПЭГ являются коммерческие препараты: Пегасис, Цимизиа, Макуген, созданные с применением разветвленного активированного ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа (две цепи по 20 кДа).

Таким образом, построение модели клиренса пегилированных препаратов является многофакторной сложной задачей.

1.10.7. Токсичность ПЭГ Выбор ПЭГ в качестве основного модифицирующего агента был во многом обусловлен его низкой токсичнос тью (за исключением очень высоких доз) при различных путях введения в организм пациента. ПЭГ активно используется в повседневной жизни, к примеру, входит в состав зубной пасты – около 10 %, а так же в целом ряде медицинских препаратов в качестве наполнителя. По оценкам международной организации здравоохранения допус тимая суточная доля для ПЭГ составляет до 10 мг / 1 кг, при этом не указывается с труктура ПЭГ, молекулярный вес - до 10 кДа [48].

Токсичность молекул ПЭГ широко изучена. Большинство исследований направлено на изучение токсичнос ти ПЭГ при пероральном введении. Показано, что при увеличении молекулярного веса ПЭГ оральная абсорбция снижается [123]. Большинство токсикологических исследований было проведено на молекулах ПЭГ с двумя терминальными гидроксильными группами. В рамках проведенных исследований было показано, что молекулы ПЭГ обладают минимальной токсичностью, однако была продемонстрирована способность ПЭГ вызывать вакуолизацию проксимальных почечных канальцев [5]. При этом токсичнлсть показана для молекул ПЭГ с молекулярной массой до 7,5 кДа.

Работы, посвященные изучению токсичнос ти ПЭГ с молекулярной массой в диапазоне кДа, чаще всего применяемых для производства 20-40 фармацевтических препаратов, практичеси отсутствуют. В таблице 1 приведены данные по токсичности ПЭГ с различной молекулярной массой [101].

Как уже отмечалось выше, в большинс тве работ по изучению токсичности используется ПЭГ с двумя терминальными гидроксильными группамми, при этом на данный момент для производства препаратов используется метоксиПЭГ.

Изучение токсичнос ти данного вида ПЭГ на различных типах животных:

мыши, крысы, обезьяны показало, что данный тип ПЭГ обладает более низкой токсичностью, чем диольные формы ПЭГ.

Опираясь на описанные в литературе данные, можно сделать вывод, что низкомолекулярные ПЭГ могут оказывать негативное влияние на почки, однако для проявления данного влияния необходимы высокие дозы ПЭГ, не достижимые при терапии.

–  –  –

В ряде работ показано, что в организме человека на молекулы ПЭГ происходит выработка антител [28;29;87;105]. Важно отметить, что сам по себе ПЭГ не иммуногенен, выработка антител происходит только в случае активированных ПЭГ, которые содержат ароматические или гетероциклические группы. В литературе отсутствуют данные о том, что выработка антител влияет на биологическую активность конъюгатов на основе ПЭГ, однако показано, что выработка антител ускоряет клиренс пегилированных препаратов из организма пациента. Антитела против ПЭГ нашли активное применение в аналитических методиках для контроля содержания ПЭГ в различных биологических жидкостях.

1.10.8. Критические параметры реакции пегилирования. Очистка пегилированных белков После выбора стратегии пегилирования целевого белка, необходимо определить оптимальные условия проведения реакции пегилирования, обеспечивающие максимальный выход процесса, а так же разработать схему выделения целевой пегилированной формы.

Среди основных факторов, влияющих на проведение реакции пегилирования, можно выделить следующие [9]:

1. Значение рН реакционного буфера. Как уже отмечалось выше, данный фактор является ключевым для всех видов ПЭГ, именно значение рН определяет изоформенный состав получаемого препарата.

2. Соотношение белок – ПЭГ. Данный фактор способен оказывать значительное влияние на процесс пегилирования с точки зрения выхода целевой пегилированной формы. Слишком большой избыток ПЭГ способен приводить л2к формированию нежелательных мультипегилированных форм белка.

3. Концентрация белка. Часто увеличение концентрации белка приводит к увеличению эффективнос ти процесса.

4. Время реакции. Продолжительнос ть реакции является важнейшим фактором, определяющим выход процесса. Зачастую время реакции пегилирования определяется скоростью гидролиза активированной группы ПЭГ. Увеличение времени реакции может приводить к образованию нежелательных мультипегилированных форм белка.

5. Температура реакции. Увеличение температуры чаще всего ускоряет процесс пегилирования, однако при этом так же увеличивается скорость гидролиза активной группы ПЭГ, что может приводить к снижению выхода процесса.

После проведения процесса пегилирования необходимо проводить очис тку целевого продукта. Сложность очистки пегилированных белков заключается в схожих физико – химических свойствах целевой и примесной форм.

Предложено большое количество методик очис тки пегилированных белков, все их можно разделить на 3 группы:

Очистка за счет большой разницы в молекулярном весе между основными продуктами реакции пегилирования (ультрафильтрация, гель-фильтрация);

Очистка за счет разницы в заряде молекул;

Очистка за счет разницы в гидрофобности/гидрофильности продуктов реакции пегилирования.

1.10.8.1. Очистка пегилированных белков за счет разницы в гидродинамическом радиусе Теоретический поход к очистке пегилированных белков методом гельфильтрации/ультрафильтрации базируется на разнице в гидродинамическом радиусе между целевой формой (обычно монопегилированной) и примесными (основные из которых – олигопегилированная и нативная формы белка). Выше уже говорилось, что молекулы ПЭГ крайне гидрофильны, по этой причине фактический радиус молекул ПЭГ в водных растворах значительно возрастает. В таблице 2 приведены эквивалентные молекулярные массы глобулярных белков для наиболее распространенных молекул ПЭГ. Из приведенной таблицы видно, что присоединение молекулы ПЭГ к молекуле белка может многократно увеличивать молекулярный вес образующегося конъюгата.

Данное свойство молекул ПЭГ легло в основу работ по очистке пегилированных белков методом гель-фильтрационной хроматографии. Так, к примеру, в работе [42] представлено исследование очис тки пегилированного бычьего цитохрома С на сорбенте Superdex 200. Приведенные результаты приведены на рисунке 12.

<

–  –  –

щен целый ряд работ [20;27;40]. Эдвардс с коллегами [39] описали процесс концентрирования на 10 кДа мембране пегилированного рецептора к фактору некроза опухоли первого типа (молекулярный вес конъюгата 85 кДа). При этом авторы столкнулись с проблемой высоких потерь.

Рис. 12. Очистка конъюгатов бычьего цитохрома С с молекулами ПЭГ различного молекулярного веса на сорбенте Superdex 200. Пик 10 кДа – монопегилированная форма, пики 20 kDa – монопегилированная форма с 20 кДа ПЭГ и дипегилированная форма с 10 кДа ПЭГ, пик 30 кДа – трипегилированная форма с 10 кДа ПЭГ, пики 40 кДа – монопегилированная форма с 40 кДа ПЭГ и дипегилированная форма с 20 кДа ПЭГ, пик 80 кДа – дипегилированная форма с 40 кДа ПЭГ [42] Процесс ультрафильтрации пегилированных молекул является сложным и неоднозначным и требует тщательного подбора условий и материалов.

–  –  –

Еще одним способом очис тки пегилированных белков является гидрофобная хроматография. Как уже отмечалось выше, молекулы ПЭГ обладаю высокой гидрофильностью. Различие в гидрофобности между пегилированными и нативными белками легло в основу очистки методом гидрофобной хроматографии.

В ряде работ [79;80] предлагается использовать данное свойство для очистки пегилированных белков методом обращенно-фазной хроматографии. Однако, данный способ не нашел широкого применения в области препаративной очис тки пегилированных белков.

Ряд авторов предлагает использовать гидрофобную хроматографию для очистки пегилированных белков. В качестве первой стадии очистки пегилированного гормона роста Кларк предлагает использовать гидрофобный сорбент phenyl TSK 5PW [26].

В процессе использования гидрофобной хроматографии возникают риски, связанные с использованием агрессивных условий (низкие значения рН, органические растворители, сульфат аммония), что может привести к деградации белковых молекул или снижению их биологической активнос ти.

1.10.8.3. Очистка пегилированных белков за счет разницы в заряде молекулы Наиболее простым и эффективным методом очистки, позволяющим разделять целевые продукты пегилирования по изоформам, является ионообменная хроматография. Теоретический основа метода заключается в разнице заряда между пегилированными молекулами. Существует три основных подхода, объясняющих влияние молекул ПЭГ на заряд нативного белка:

1. Изменение поверхностного заряда молекулы белка за счет экранирования заряженных групп на поверхности белка.

2. Изменение заряда за счет связывания с заряженным группами (к примеру, NH2 группами лизина).

3. Изменение заряда за счет образования водородных связей между молекулами ПЭГ и кислыми или другими группами и изменения их константы кислотнос ти pKa.

Очистка, основанная на изменении заряда белковой молекулы в процессе пегилирования, является наиболее распространенным вариантом и описана в Ли с коллегами [78] в качестве основной стадии очистки монопегилированного гранулоцитарного макрофагового колониес тимулирующего фактора использовал хроматографию на анионообменном сорбенте.

В работе [99] описывается технология производства пегилированного релизинг-фактора гормона роста (GRF) с использованием в качестве основной с тадии очистки ионообменной хроматографии. Выход процесса составлял 41% и чис тота 97%.

Несомненно, очистка методом ИОХ не лишена недостатков. В частнос ти, для нанесения на ионообменные сорбенты рас творы белка приходится разводить до низкого значения ионной силы. По причине разведения увеличивается время процессов. Еще одним минусом является низкая емкость сорбентов. Так для нативных белков емкость составляет несколько десятков миллиграмм на 1 мл сорбента.

Для пегилированных – несколько мг на 1 мл сорбента. Для решения последней проблемы применяют сорбенты, имеющие специальный гидрофильный спейсер между поверхностью сорбента и ионообменным лигандом.

1.10.9. Примеры использования пегилированных препаратов в медицине

Процесс пегилирования за счет своей простоты и эффективности приобрел широкое распространение. На сегодняшний день на фармацевтическом рынке представлено большое количество препаратов на основе конъюгатов белок – ПЭГ

- 11 наименований. При этом значительная час ть препаратов находится на с тадии прохождения клинических испытаний.

Адаген, предс тавляющий собой пегилированную аденозин диаминазу, был выведен на рынок в 1990 г и является первым зарегис трированным препаратом на основе конъюгата белок-ПЭГ. Адаген нашел активное применение при терапии ряда иммунодефицитных заболеваний. Препарат относится к первому поколению пегилированных препаратов и предс тавляет собой мультипегилированный конъюгат белка с линейным ПЭГ с молекулярной массой 5 кДа. На примере Адагена была показана эффективность технологии пегилирования, однако, наряду с этим он обладал и рядом недостатков, характерных для препаратов первого поколения, а именно: высокой скоростью выведения из организма вследствие использования низкомолекулярного ПЭГ, а так же гетерогенным изоформенным составом [81] Аналогичные Адагену недостатки можно перечислить и в отношении Онкоспара – препарата пегилированной L - аспарагиназы, который и по сей день активно применяется при лечении лейкемии у детей. Онкоспар представляет собой мультипегилированный конъюгат на основе линейного ПЭГ с молекулярной массой 5 кДа. Изоформенный состав препарата гетерогенен и представляет собой смесь изомеров [53] Пегилированный филграстим, представляющий собой монопегилированный конъюгат на основе молекулы гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и линейной молекулы ПЭГ с молекулярным весом 20 кДа, нашел широкое применение в восстановительной медицине после химиотерапии. ПЭГ-ГКСФ относится ко второму поколению препаратов и имеет гомогенный изоформенный состав, представляющий собой N – концевую изоформу [131].

Мирцера представляет собой монопегилированный конъюгат эритропоэтина и линейной молекулы ПЭГ с молекулярным весом 30 кДа. Основные изоформы:

N – концевая аминогруппа, остатки лизина в положении 45 и 52.

Сомаверт – мультипегилированный антагонис т рецептора гормона роста на основе 5 кДа ПЭГ. Применяется для лечения состояние называемого акромегалия.

При данном заболевании происходит выработка слишком большого количества гормона роста в теле пациента.

1.10.10. Пегилированный интерферон альфа-2 – различные стратегии Как уже отмечалось выше, на сегодняшний день терапия вирусных и онкологических заболеваний является крайне актуальной задачей. Только вирусом гепатита С больны около 3 % человеческой популяции. Всего на данный момент открыто 11 генотипов вируса гепатита С: 1 – 11, при этом каждый тип подразделяется на субтипы, к примеру, 1a, 1b и т.д [113]. Генотипы 1 – 3 распространены по всему миру. На субтипы 1а и 1б приходится около 60 % всех больных. Субтип 1а распространен в Северной Америке и Северной Европе. В Восточной и Южной Европе, а так же в Японии наиболее распространен генотип 1б. В Юго-Восточной Азии широкое распространение получил генотип 3 [118].

Для лечения различных форм гепатита С применяется интерферон альфа-2.

Первый генотип вируса гепатита С наихудшим образом подвергается монотерапии интерфероном альфа-2, эффективность терапии составляет около 15-20 %, при этом для генотипов не первого типа эффективность доходит до 60 %. Средняя эффективность терапии интерфероном альфа-2 для всех типов генотипов составляет около 50 %, при этом у 50 – 80 % пациентов наблюдались рецидивы [60]. Для повышения эффективности интерферон применяют в составе комплексной терапии с гуанозид-подобным аналогом (препарат Рибавирин). В результате эффективность терапии гепатита С увеличивается до 40 % в случае первого генотипа.

При лечении гепатита С инъекции интерферона альфа-2 осуществляют трижды в неделю, в независимости от типа терапии. Такая высокая частота инъекций обусловлена быс трой скоростью выведения интерферона из организма пациента, при этом для высокоэффективной терапии необходимо поддерживать высокую концентрацию интерферона в крови. Слабая эффективность терапии нативными формами интерферона альфа-2 и высокие риски его применения по причине высокой частоты инъекций подтолкнули к созданию пегилированных препаратов с пролонгированным действием.

В странах Запада в качестве основного средства для лечения гепатита С применяются пегилированные интерфероны альфа-2b и альфа-2а – препараты Пегинтрон и Пегасис, соответс твенно.

В случае препарата Пегасис был использован более сложный и крупный ПЭГ – NHS ПЭГ с разветвленной структурой и молекулярным весом 40 кДа, по этой причине данный препарат относят ко второму поколению препаратов.

Конъюгат, получаемый в результате реакции пегилирования с данным ПЭГ, отличается стабильностью.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Похожие работы:

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«ПОЛУЭКТОВА ЕКАТЕРИНА ВИКТОРОВНА ФИТОТОКСИЧЕСКИЕ МЕТАБОЛИТЫ ГРИБА PARAPHOMA SP. ВИЗР 1.46 И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Шифр и наименование специальности: 03.02.12 – микология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Берестецкий А.О. кандидат биологических наук Санкт-Петербург...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«Рагимов Александр Олегович ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПОЧВ В ФОРМИРОВАНИИ УРОВНЯ БЛАГОПОЛУЧИЯ НАСЕЛЕНИЯ ВЛАДИМИРСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Кузнецов Василий Андреевич ПОЧВЫ И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПАРКОВО-РЕКРЕАЦИОННЫХ ЛАНДШАФТОВ МОСКВЫ Специальность 03.02.13-почвоведение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, И.М. Рыжова Москва-2015 Содержание Введение Глава 1. Влияние рекреации на лесные экосистемы (Литературный обзор) 1.1.Состояние проблемы 1.2....»

«ГЕНС ГЕЛЕНА ПЕТРОВНА Роль молекулярно-биологических маркеров и многофункционального белка YB-1 в лечении и прогнозе больных раком молочной железы 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант:...»

«УДК 5 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 «антропология» по биологическим наукам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор исторических наук, чл.-корр. РАН А.П. БУЖИЛОВА...»

«ГОРБУНОВА Анна Николаевна ГИДРОЛИЗ РАЦЕМИЧЕСКИХ АМИДОВ ФЕРМЕНТАМИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Максимов А. Ю. Пермь – 201 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»

«ПОПОВ ВИКТОР СЕРГЕЕВИЧ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ СРЕДСТВ И СПОСОБОВ ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ У СВИНЕЙ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«Флоринский Игорь Васильевич Теория и приложения математико-картографического моделирования рельефа Специальность 25.00.33 – картография Диссертация на соискание ученой степени доктора технических наук Пущино – 2010 СОДЕРЖАНИЕ Обозначения и сокращения Введение Глава 1 Основные понятия и методы моделирования рельефа 1.1 Цифровые модели рельефа и морфометрические характеристики 1.1.1 Методы...»

«Шершнева Анна Михайловна ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ: ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА, ПРИМЕНЕНИЕ Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Шишацкая Екатерина Игоревна...»

«ЕГОРОВА Ангелина Иннокентьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У МУЖЧИН КОРЕННОЙ И НЕКОРЕННОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ ЯКУТИИ В РАЗНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Д.К....»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических...»

«ХАФИЗОВ ТОИР ДАДАДЖАНОВИЧ ОСОБЕННОСТИ РОСТА, РАЗВИТИЯ И ПРОДУКТИВНОСТИ ЧАЙОТА (SECHIUM EDULE L. – CHAYOTE) В УСЛОВИЯХ ГИССАРСКОЙ ДОЛИНЫ ТАДЖИКИСТАНА Специальность: 06.01.01. – общее земледелие, растениеводство ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор, Гулов С.М. Душанбе – 201 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.