WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«Разработка промышленной технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2b ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное унитарное предприятие

«Государственный научно – исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

На правах рукописи

Шамонов Николай Алексеевич

Разработка промышленной технологии производства

пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2b

03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Хамитов Р.А.

Москва – 2015

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...………………………………………………………………... 7

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………... 11

1.1. Интерферон. Общие сведения…………………………………………. 11

1.2. Структура интерферона альфа-2………………………………………. 13

1.3. Биологическая активность интерферона альфа-2…………………….. 16

1.4. Активация синтеза интерферона в клетках…………………………… 17

1.5. Рецепторы интерферона альфа………………………………………… 17

1.6. Сигналы, вызванные дейс твием интерферона на клетку…………….. 20

1.7. Клиническое применение интерферона………………………………. 23 1.7.1. Общая информация…………………………………………………... 23 1.7.2. Терапия хронического гепатита B…………………………………... 23 1.7.3. Терапия хронического гепатита С…………………………………... 24 1.7.4. Терапия волосоклеточной лейкемии………………………………... 24 1.7.5. Терапия саркомы Капоши……………………………………………. 25

1.8. Требования качества к интерферон – содержащим препаратам…….. 25

1.9. Недостатки использования нативного интерферона альфа-2……… 27

1.10. Создание лекарственных препаратов с пролонгированным дейст- 28 вием…………………………………………………………………………...

1.10.1. Способы пролонгирования действия белковых молекул………… 28 1.10.2. Пегилирование. Общая информация………………………………. 30 1.10.3. Химия пегилирования………………………………………………. 33 1.10.3.1. Активированные ПЭГ первого поколения………………………. 34 1.10.3.2. Активированные ПЭГ второго поколения………………………. 36 1.10.3.2.1. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации 37 аминогрупп 1.10.3.2.2. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации 39 цистеинов…………………………………………………………………….

1.10. 3.2.3. Активированные ПЭГ второго поколения для модицифкации 40 окисленных карбогидратов………………………………………………….

1.10.3.3. Реверсивное пегилирование……………………………………… 41 1.10.3.4. Гетерофункциональные активированные ПЭГ…………………. 42 1.10.4. Структура активированных ПЭГ…………………………………... 43 1.10.5. Влияние пегилирования на физико – химические и 43 биологические свойства белковых молекул……………………………….

1.10.5.1. Влияние на гидрофильнос ть, молекулярный вес и гидродина- 44 мический радиус……………………………………………………………..

1.10.5.2. Влияние на конформацию………………………………………… 44 1.10.5.3. Влияние на заряд…………………………………………………... 45 1.10.6. Клиренс пегилированных препаратов……………………………... 46 1.10.7. Токсичность ПЭГ……………………………………………………. 47 1.10.8. Критические параметры реакции пегилирования. Очистка пеги- 49 лированных белков…………………………………………………………..

1.10.8.1. Очистка пегилированных белков за счет разницы в гидродина- 50 мическом радиусе…………………………………………………………… 1.10.8.2. Очистка пегилированных белков за счет разницы в гидро- 52 фильнос ти…………………………………………………………………….

1.10.8.3. Очистка пегилированных белков за счет разницы в заряде мо- 53 лекулы………………………………………………………………………...

1.10.9. Примеры использования пегилированных препаратов в медици- 54 не……………………………………………………………………………...

1.10.10. Пегилированный интерферон альфа-2 – различные стратегии…. 55 1.10.10.1. Пегилированный интерферон альфа-2b (ПЕГИНТРОН)……… 57 1.10.10.2. Пегилированный интерферон альфа-2а (ПЕГАСИС)…………. 60

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………………… 65

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ…………………….. 65 2.1.1. Материалы…………………………………………………………….. 65 2.1.2. Аналитические методы………………………………………………. 66 2.1.2.1. Гельфильтрация на сорбенте Superose 12………………………… 66 2.1.2.2. Ионообменная хроматография на сорбенте TSKgel SP-5PW……. 66 2.1.2.3. Метод обращенно-фазовой хроматографии………………………. 67 2.1.2.4. Метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 67 лаурилсульфата натрия (в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях) с окраской нитратом серебра…………………………………… 2.1.2.5. Определение специфической активности………………………… 68 2.1.3. Препаративные методы………………………………………………. 68 2.1.3.1. Растворение телец включения предшественника интерферона 68 альфа-2………………………………………………………………………..

2.1.3.2. Процесс ренатурации интерферона альфа-2……………………… 69 2.1.3.3. Предварительная очистка интерферона альфа-2 методом катио- 69 нообменной хроматографии на сорбенте CM Sepharose FF……………… 2.1.3.4. Процесс тонкой очис тки интерферона альфа-2 методом катио- 70 нообменной хроматографии на сорбенте YMC Biopro S30……………….

2.1.3.5. Процесс концентрирования интерферона альфа-2 методом ка- 70 тионообменной хроматографии на сорбенте CM Sepharose FF…………..

2.1.3.6. Перевод очищенного интерферона альфа-2 в буфер хранения 71 методом гель-фильтрационной хроматографии на сорбенте Superdex 75.

2.1.3.7. Процесс пегилирования интерферона альфа-2b………………….. 71 2.1.3.8. Процесс пегилирования интерферона альфа-2а………………... 72 2.1.3.9. Процесс тонкой очис тки пегилированного интерферона альфа- 73 2b…………………………………………………………………………….

2.1.3.10. Процесс тонкой очис тки пегилированного интерферона альфа- 73 2а……………………………………………………………………………… 2.1.3.11. Процесс концентрирования пегилированного интерферона 74 альфа-2 на сорбенте MacroCap SP………………………………………… 2.1.3.12. Перевод очищенного монопегилированного интерферона аль- 74 фа-2 в буфер хранения методом гель-фильтрационной хроматографии на сорбенте Sephadex G25…………………………………………………

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ…………………………………... 75 2.2.1. Разработка технологии ренатурации телец включений интерферо- 75 на альфа-2…………………………………………………………………..

2.2.1.1. Оптимизация процесса ренатурации телец включений интерфе- 76 рона альфа………….………………………………………………………..

2.2.1.2. Исследование влияния окисляющих и восстанавливающих аген- 78 тов на процесс ренатурации……………………………………………….

2.2.1.3. Исследование влияния детергентов на процесс ренатурации…. 80 2.2.1.4. Исследование влияния ионной силы раствора, концентрации 82 хаотропного агента и значения рН на процесс ренатурации……………..

2.2.1.5. Исследование влияния дополнительных компонентов на про- 84 цесс ренатурации…………………………………………………………… 2.2.1.6. Определение оптимальной нагрузки телец включений на рена- 85 турационный буфер………………………………………………………….

2.2.1.7. Определение оптимальной продолжительности процесса рена- 86 турации……………………………………………………………………...

2.2.1.8. Масштабирование оптимизированного процесса ренатурации…. 87 2.2.2. Разработка технологии очистки интерферона альфа-2…………… 88 2.2.2.1. Разработка стадии предварительной очистки интерферона аль- 88 фа-2…………………………………………………………………………… 2.2.2.2. Разработка стадии тонкой очистки интерферона альфа-2……… 91 2.2.2.3. Стадия концентрирования интерферона альфа-2……………….. 96 2.2.2.4. Стадия перевода интерферона альфа-2 в буфер хранения………. 97 2.2.3. Разработка технологии пегилирования и дальнейшей очистки ин- 100 терферона альфа-2а и альфа-2b…………………………………………… 2.2.3.1. Разработка процесса пегилирования интерферона альфа-2b……. 101 2.2.3.1.1. Оптимизация значения рН реакционного буферного раствора.. 103 2.2.3.1.2. Исследование кинетики реакции пегилирования интерферона 105 альфа-2b, определение оптимальной температуры……………………… 2.2.3.1.3. Определение причины низкого выхода реакции пегилирова- 107 ния…………………………………………………………………………….

2.2.3.1.4. Оптимизация соотношения белок – ПЭГ в реакционном буфе- 109 ре……………………………………………………………………………… 2.2.3.1.5. Определение оптимальной концентрации интерферона альфа- 110 2b в реакционном буфере…………………………………………………..

2.2.3.2. Разработка технологии очистки монопегилированного безме- 112 тионинового интерферона альфа-2b………………………………………..

2.2.3.2.1. Очистка методом тангенциальной фильтрации……………….. 112 2.2.3.2.2. Очистка пегилированного интерферона альфа-2 методом гель- 113 фильтрации………………………………………………………………….

2.2.3.2.3. Очистка методом гидрофобной хроматографии………………. 114 2.2.3.2.4. Очистка монопегилированного интерферона альфа-2b мето- 116 дом катионообменной хроматографии…………………………………… 2.2.3.2.5. Концентрирование монопегилированного интерферона альфа- 120 2b…………………………………………………………………………… 2.2.3.2.6. Перевод монопегилированного интерферона альфа-2b в буфер 121 хранения……………………………………………………………………..

2.2.3.2.7. Сравнение полученного препарата монопегилированного ин- 122 терферона альфа-2b с коммерческим препаратом Пегинтрон…………..

2.2.3.3. Разработка технологии пегилирования интерферона альфа-2а… 123 2.2.3.3.1. Влияние значения рН на процесс пегилирования интерферона 124 альфа-2а……………………………………………………………………..

2.2.3.3.2. Изучение кинетики процесса пегилирования интерферона 126 альфа-2а, определение оптимальной температуры процесса…………….

2.2.3.3.3. Определение причины низкого выхода реакции пегилирова- 127 ния…………………………………………………………………………….

2.2.3.3.4. Исследование влияния концентрации интерферона на процесс 128 пегилирования……………………………………………………………… 2.2.3.3.5. Определение оптимального соотношения белок – ПЭГ……… 129 2.2.3.3.6. Изучение влияния структуры растворителя на процесс пеги- 130 лирования интерферона альфа-2а………………………………………… 2.2.3.4. Разработка технологии очистки монопегилированного интерфе- 133 рона альфа-2а……………………………………………………………….

2.2.3.5. Сравнение полученного препарата монопегилированного ин- 136 терферона альфа-2b с коммерческим препаратом Пегасис……………… 2.2.4. Масштабирование технологии получения субстанции пегилиро- 137 ванного интерферона альфа-2b и альфа-2а, валидация процессов……….

2.2.5. Исследование стабильнос ти полученных препаратов пегилиро- 139 ванного интерферона альфа-2а и альфа-2b………………………………...

2.2.6. Экономическая эффективнос ть процесса производства пегилиро- 140 ванных форм интерферона…………………………………………………

3.ВЫВОДЫ………………………………………………………………… 141

4. ПРАКТ ИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ 142

РЕЗУЛЬТАТОВ……………………………………………………………..

5. РЕКОМЕНД АЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ 142

ВЫВОДОВ…………………………………………………………………..

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ…………………….. 143 ПРИЛОЖЕНИЯ……………………………………………………………... 157

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. На сегодняшний день мир сталкивается все с новыми вызовами, связанными с распространением тяжелых вирусных заболеваний.

Только от хронического гепатита С в мире ежегодно умирают около 500 тыс. человек. В Российской Федерации по официальной статистике число больных хроническим гепатитом В и С составляет около 5,35 млн. человек, общее число носителей около 9 млн [139].

Значительную проблему представляет и распространение вирусных заболеваний у различных видов животных. К примеру, в случае молодняка крупного рогатого скота значительную опасность предс тавляет вирусная диарея, падеж от которой составляет 30 – 50 % [34]. Не меньшую опасность представляют и другие вирусные заболевания: ящур, везикулярный стоматит, герпес, гепатит и т.д.

Классическим подходом к терапии вирусных заболеваний считается терапия интерфероном альфа. Интерферон альфа – это цитокин, синтезируемый в основном лейкоцитами и моноцитами в ответ на проникновение инфекции [12].

Однако, терапия гепатита нативным интерфероном не в полной мере эффективна и безопасна из-за недостатков, присущих всем препаратам на основе нативных белковых молекул: малое время полужизни в крови пациента, высокая иммуногеннос ть, большой объем распределения препарата в организме пациента и т.д [62]. Обозначенные недостатки были нивелированы за счет создания пролонгированных форм интерферона – пегилированного интерферона альфа-2b (препарат Пегинтрон, 2000 г) [122] и пегилированного интерферона альфа-2а (препарат Пегасис, 2001 г) [10]. Важно отметить, что обозначенные препараты созданы на основе интерферона альфа без N – концевого метионина, что так же повышает их эффективность. Препараты пегилированного интерферона альфа-2а и альфа-2b получили широкое распространение при терапии больных с вирусом гепатита С.

Пегинтрон и Пегасис входят в список жизненно важных лекарственных средств и востребованы в больших объемах. При этом в Российской Федерации не производятся. По этой причине разработка отечественной технологии промышленного производства субстанций интерферона альфа-2b и альфа-2а без N – концевого метионина и дальнейшего получения на их основе пегилированных форм путем ковалентной сшивки с молекулами ПЭГ является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целью данного исследования являлась разработка промышленной технологии производства субстанции нативных (без N – концевого метионина) и пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2b.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести оптимизацию процесса ренатурации интерферона альфа-2.

2. Разработать схему хроматографической очистки интерферона альфа-2.

3. Определить оптимальные параметры пегилирования интерферона альфа-2.

4. Разработать схему выделения монопегилированной формы интерферона альфа-2.

5. Провести масштабирование разработанных процессов на производственной площадке ООО «Фармапарк» и их последующую валидацию.

6. Рассчитать экономическую эффективнос ть разрабатываемой технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2.

Научная новизна. Впервые в России проведена работа по ус тановлению критических параметров проведения процесса ренатурации интерферона альфа-2 (концентрация окисляющих и восстанавливающих агентов; значение рН; тип детергента; ионная сила раствора; концентрация хаотропных агентов; температура проведения процесса; продолжительность процесса; нагрузка телец включений) и определению их оптимальных значений. Впервые в мире проведена оптимизация процесса пегилирования интерферона альфа-2 и определены критические параметры данного процесса (соотношение белок / ПЭГ; исходная концентрация белка; температура и продолжительнос ть процесса; влияние структуры растворителя). На основании разработанных технологий впервые в России получены субстанции пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2b.

По результатам проведенной работы подана заявка на патент России № 2014114369 от 11.04.2014 на изобретение «Способ получения отдельных изоформ пегилированного интерферона альфа-2b и их смеси».

Практическая значимость. Разработаны и утверждены руководством ООО «Фармапарк» промышленные регламенты на производство: субстанции интерферона альфа-2b (ПР 56882590-22-14 от 04.12.14), субстанции пегилированного интерферона альфа-2b (ПР 56882590-23-15 от 13.01.15); пусковой регламент на производство готовой лекарственной формы пегилированного интерферона альфа-2b (ПУР 56882590-21-14 от 02.07.2014). Субстанции интерферона альфа-2b и его пегилированной формы внесены в реес тр лекарственных средств под № ФС 000434 (решение Минздрава РФ от 15.11.12) и № ФС 000831 (решение Минздрава РФ от 06.05.14). Готовая лекарственная форма пегилированного интерферона альфа-2b (торговое название ПегАльтевир) внесена в реестр лекарственных средств под № ЛП 002542 (решение Минздрава РФ от 23.07.14).

Полученная субстанция интерферона альфа-2а использована для производства препарата пегилированного интерферона альфа-2а, который в настоящее время проходит доклинические исследования на обезьянах Личный вклад соискателя. Автором была проведена работа по оптимизации процесса по оптимизации процесса ренатурации интерферона альфа-2 из телец включений; разработке технологии очистки интерферона альфа-2; оптимизации процесса пегилирования интерферона альфа-2а и альфа-2b и дальнейшей очистки целевой монопегилированной формы. Автор провел анализ и статис тическую обработку полученных данных и на основании этого сделал выводы и скорректировал план дальнейших работ. Совместно с начальником лаборатории биохимии ООО «Фармапарк» Селищевым С. В. автором выполнено масштабирование разработанных процессов и их перенос на производственную площадку, где была проведена их валидация.

Совместно с с.н.с., к.б.н. Гавриловой Н. А., н.с. Орловой Н. В. автор разработал нормативную документацию на субстанцию и готовую лекарс твенную форму пегилированного интерферона альфа-2а и альфа-2b.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на межлабораторном семинаре сотрудников Государственного научноисследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и совещании сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2014).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК (Биофармацевтический журнал).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; обзора литературы; описания собственных исследований; материалов и методов исследований; результатов исследований; обсуждения полученных результатов; выводов; описания практического использования результатов; рекомендаций по использованию научных выводов; списка литературы и приложений.

Работа изложена на 163 с траницах, включая 68 рисунков, 17 таблиц и 6 с траниц приложений.

Список цитируемой литературы содержит 140 источников, в том числе 3 на русском языке.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Проведенная оптимизация процесса ренатурации интерферона альфа-2 из телец включений (по параметрам: концентрация окисляющих и восстанавливающих агентов; значение рН; тип детергента; ионная сила рас твора; концентрация хаотропных агентов; температура проведения процесса; продолжительнос ть процесса; нагрузка телец включений) позволяет увеличить выход процесса на 90±0,5 %, повысить содержание целевого белка в ренатурате до 81±0,4 %, снизить стоимость процесса ренатурации на 40 % по сравнению с известным аналогом.

2. Разработанная промышленная технология получения интерферона альфа-2 (без N – концевого метионина) обеспечивает выпуск кондиционного продукта с производительностью не менее 11±0,5 г белка с одного производственного цикла в течение 4 суток.

3. Проведенная оптимизация процесса пегилирования (по параметрам: соотношение реагирующих компонентов; концентрация белка в реакционном буфере;

значение рН; продолжительность процесса; температура процесса; структура растворителя) позволяет увеличить эффективнос ть пегилирования в 4,2 раза (в случае интерферона альфа-2b) и в 3 раза (в случае интерферона альфа-2a).

4. Разработанная промышленная технология получения субстанций пегилированного интерферона альфа-2b и альфа-2а обеспечивает выпуск продукта с производительностью не менее 450±20 мг белка (в случае пегилированного интерферона альфа-2b) и 600±25 мг (в случае интерферона альфа-2а) с одного производственного цикла в течение 4 суток.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

–  –  –

В 1957 году Азеком и Линдеманом было обнаружено, что после инкубации клеток хорион-аллантоисной оболочки куриных эмбрионов с инактивированным вирусом гриппа высвобождается новый фактор. Данный фактор при добавлении к свежим клеткам хорион-аллантоисной оболочки препятствовал их заражению живым вирусом гриппа. Данное явление было названо вирусной интерференцией, а фактор, препятствующий заражению – интерфероном [66].

На сегодняшний день открыто несколько классов интерферонов: альфа, бета, гамма, омега и тау [12]. Все классы интерферонов обладают антивирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей функциями [8].

Все интерфероны разделяют на два класса в зависимости от типа рецептора, с которым происходит взаимодейс твие [89]:

- интерфероны первого типа. К данному типу относятся интерфероны альфа, бета, омега и тау. Данный тип характеризуется взаимодейс твием с рецепторным комплексом IFNAR на поверхности клетки – мишени [76];

- интерфероны второго типа. К данному типу относится интерферон гамма.

Интерферон гамма взаимодействует с рецептором IFNGR [124].

Синтез интерферонов запускается в ответ на попадание в организм антигенов. Интерфероны первого типа синтезируются в ответ на двухцепочную РНК вирусов или липополисахариды бактерий, а так же цитокины [96;67]. Интерфероны второго типа вырабатываются в ответ на митогены [127]. Все три типа интерферона участвуют в первичном противовирусном ответе и в дальнейшем в формировании специфического иммунного ответа [138].

Человеческий интерферон альфа предс тавляет собой семейство белков, состоящих из 22 различных подтипов [12], за синтез которых отвечают 14 различных генов, локализованных в девятой хромосоме человека [35;54;63]. Интерфероны бета и гамма представляют собой единичные белки, предс тавленные в геноме единс твенным геном, расположенным в 9 [12] и 12 хромосоме [89], соответственно. Полиморфизм генов интерферона альфа связан с несколькими причинами [138]:

- тканево-специфическим типом экспрессии;

- тропизмом к различным тканям;

- использованием различных сигнальных систем клеток.

При этом различные субтипы интерферона альфа обладают различной активностью по отношению к различным вирусам [45;132]. Все субтипы интерферона альфа предс тавляют собой белковые цепи длиной 166 аминокислотных остатков, за исключением альфа-2 длиной 165 аминокислотных остатков [12]. Гомогенность между различными субтипами интерферонов альфа составляет около 80 %.

При этом гомогенность между альфа-2 и бета составляет около 30%, между альфа и гамма интерферонами 75% [73].

Наиболее широкое применение в медицинской практике в качес тве противовирусного, антиполиферативного и иммуномодулирующего препарата нашел интерферон альфа-2. Изначально его получали из лейкоцитарной или моноцитарной массы путем ее обработки вирусами [23]. Такой подход обеспечивает получение интерферона, идентичного по своим свойствам интерферону альфа-2, вырабатываемому в организме человека. Получаемый таким способом препарат характеризуется гетерогеннос тью и содержит около 15 субтипов интерферона. На четыре основных (IFN-l, IFN-2, IFN-4, IFN-) приходится около 95 % от общего количества интерферонов. Субтипы IFN-5, IFN-7, IFN-8, IFN-10, IFN-14, IFNIFN-21 являются минорными и предс тавлены в незначительных количествах. Основными ограничениями данной технологии являются низкий выход интерферона, лимитированное количество лейкоцитов и необходимость их использования в течение 48 часов после выделения [119]. Все эти параметры влияют на стоимость конечного продукта. При этом велики риски контаминации вирусами готовых лекарственных форм и как следствие заражение пациентов.

По вышеобозначенным причинам на данный момент абсолютное большинство препаратов интерферона альфа-2 получают на основе рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2, синтезируемого в бактериальных клетках, так как такой подход является наиболее безопасным и эффективным. Интерферон альфа-2, синтезируемый в бактериальных клетках, не в полной мере повторяет структуру интерферона, синтезируемого в организме. Однако, данные отличия не являются критическими. В частнос ти такой интерферон не подвергается внутриклеточному гликолизилированию, а N – концевой аминокислотой является метионин, что обусловлено спецификой экспрессионной системы бактериальных клеток.

1.2. Структура интерферона альфа-2

Интерферон альфа-2 - белковая молекула с молекулярной массой около 19,3 кДа и длиной 165 аминоскислотных остатков. Существует два подтипа интерферона альфа-2: интерферон альфа-2b и интерферон альфа-2а. Отличие между данными подтипами заключается в одном аминокислотном остатке в позиции 23 (лизин в случае интерферона альфа-2а или аргинин в случае интерферона альфа-2b) [112].

Сайт О – гликозилирования находится в позиции 106 (остаток треонина в позиции 106) и отличает интерферон альфа-2 от других интерферонов альфа, не имеющих ос татка треонина в 106 позиции [3;93]. Структура интерферона альфа-2 включает два дисульфидных мостика, образованных ос татками цистеина в позициях 1 и 98 (мостик Cys 1-98); 29 и 138 (мостик Cys 29-138) [125;126]. При этом показано, что первый из них не задействован в связывании рецептора и, по всей видимости, необходим для поддержания структуры.

По данным исследования методом кругового дихроизма в молекуле интерферона альфа-2 около 59 % всех структур приходится на альфа спирали и около 16 % на бета листы [64]. Методами крис таллографии и ядерного магнитного резонанса установлена точная структура белков, относящихся к классу интерферона альфа-2 [24]. Структура интерферона альфа-2 приведена на рисунке 1.

Рис. 1. Структура интерферона альфа-2 человека [24]

Основа структуры интерферона альфа-2 – пять антипараллельных альфа спиралей (A, B+B’, C, D, E), пересекающихся под углом от 18 до 31 градуса, четыре из которых (A, B+B’, C, E) формируют сердцевину молекулы [103]. Спираль А располагается от 11 до 21 аминокислотного остатка, B – от 52-68, B’ – от 70 до 75, С – от 78 до 100, D – от 110 до 132, E – от 137 до 157. Все альфа спирали прямые за исключением спирали В, имеющей ярковыраженный изгиб (около 70С) в положении 69 (остаток тирозина) [103]. Участок спирали В после изгиба принято обозначать как В’. Соединение между спиралями осуществляется петлями АВ, ВС, СD и DE. При этом петли BC, CD, DE относительно просты по своей структуре, их размер составляет 2, 6 и 4 аминокислотных остатка, соответс твенно.

Петля АВ значительно крупнее других петель и более гетерогенна по своей структуре. В частности, в ней выделяют три участка: АВ1 (22-33), АВ2 (34-39) и АВ3 (40-51). Участок АВ1 располагается перпендикулярно к осям спиралей и соединен с N – концом спирали Е путем образования дисульфидной связи между остатками цистеина в положениях 29 и 138. Участки петли АВ1 26-29 и 30-33 формируют две 310 спирали: 310 А и 310 В. Остатки лейцин 26, фенилаланин 27 и лейцин 30 спиралей 310 А и 310 В формируют поверхнос ти, имеющие значительную доступнос ть для рас творителей. 310 В спираль предшествует учас тку АВ2 и разворачивает основную цепь на 90 параллельно центральным альфа спиралям. Конформация 310 В позволяет осуществлять дополнительные взаимодействия с боковыми цепями аминокислотных остатков спирали D. Остатки АВ2 глицин 37, фенилаланин 36 и фенилаланин 38 формируют вытянутую структуру, входящую в гидрофобный кор молекулы. Сразу после участка АВ2 остатки участка АВ3 40-43 формируют третью 310 структуру – 310 С. Следующие за структурой 310 С остатки 44 – 51 соединяют петлю АВ со спиралью В [103].

Гидрофобный кор молекулы интерферона альфа-2 состоит в основном из гидрофобных остатков за исключением шести полярных остатков (Ser11, Thr14, Ser72, Ser150, Ser154, Thr155) и четырех заряженных боковых цепей (Glu87, Glu141, Arg144, Glu146) [73]. Атом кислорода в позиции остатка серина 11 способен образовывать водородные связи с кислородом 1 остатка глицина 91, в то время как гидроксильные атомы кислорода других полярных аминокислот, входящих в состав гидрофобного кора, формируют водородные связи с карбонильными атомами кислорода основной цепи. Для глутамина в позиции 87 не обнаружено партнеров для образования водородных связей. Боковые цепи глутамина 141 и аргинина 144 стабилизированы за счет образования внутренних солевых мостиков друг с другом и сетью гидрофобных связей с боковой цепью аргинина 22 в случае глутамина 141 или карбонильными атомами кислорода лейцина 12 или глутамина 141 в случае аргинина 144 [59]. О атомы глутамина 146 образуют водородные связи с атомом азота основной цепи фенилаланина 36, с О атомом тирозина 122 и гуанидиновой группой аргинина 149. Спираль D и петля АВ так же включены в гидрофобный кор за счет гидрофобных ос татков (лейцин, изолейцин и валин) в случае спирали D и за счет ароматических колец остатков фенилаланина в случае петли АВ.

1.3. Биологическая активность интерферона альфа-2

Известно, что интерферон проявляет свою биологическую активность за счет взаимодействия со специфическими рецепторами [38;92;116]. В структуре интерферона альфа-2 выделяют несколько областей, ответственных за связывание рецептора: 29 – 35, 78 – 95 и 123 – 140. Участки 29 – 35 и 123 – 140 находятся в непосредственной близости за счет формирования дисульфидной связи между остатками цис теина 29 и 138, соединяющей петлю АВ со спиралью Е [76].

Замена или делеция цистеинов в позициях 29 или 138 значительно снижае т биологическую активнос ть интерферона альфа-2. Третий участок 78 – 95 так же ответственен за связывание с рецептором [75]. Более подробное изучение данных участков показало, что участки 29 – 35 и 123 – 140 ответс твенны в первую очередь за антивирусной активности интерферона альфа-2. Изучение влияния остатков отдельных аминокислот на активность показало, что одним из важнейших является аргинин в позиции 33. Его замена, к примеру, на лизин или аланин приводит к снижению биологической активнос ти в 500 и 2500 раз, соответственно [21].

Более подробное изучение области 78 – 95 показало, что она ответственна преимущественно за антипролиферативную активнос ть [44]. Показано, что регион 81-95 является важным участком, ответственным за антипролиферативную активность интерферон альфа-2 [64]. В своей работе Hu с коллегами методом сайт - направленного мутагенеза ус тановили, что остатки тирозина и изолейцин в позициях 86 и 90 являются ключевыми аминокислотными ос татками, ответственными на антипролиферативную активность. В процессе своей работы авторы заменяли тирозин в положении 86 на аспарагиновую кислоту, изолейцин, лизин или аланин.

Замена на изолейцин не принесла значительных изменений в антипрофилеративной активнос ти, в остальных трех случаях наблюдалось снижение активности в 100 раз. В противоположность, замена изолейцина в позиции 90 на тирозин значительно увеличивала активность. При этом методом кругового дихроизма было показано, что при описанных заменах значительного изменения во вторичной структуре не происходило, т.е. не было значительных конформационных изменений, способных повлиять на взаимодействие интерферона с рецептором.

–  –  –

В процессе ответа на специфические компоненты вирусов или других патогенов клетки актируют различные сигнальные каскады, которые выражаются в синтезе цитокинов и хемокинов, которые в свою очередь препятствуют репликации вируса и инициируют иммунный ответ. Антивирусный и антимикробный сигналинг выражается в активации транскрипционных факторов, таких как NFkB, IRF и AP-1 за счет посттрансляционной модификации – преимущественно фосфорилирования. После активации данных белков за счет специальных механизмов эти клеточные белки взаимодействуют с промоторами генов интерферона альфа и других иммуномодуляторных генов для дальнейшей инициации антивирусного ответа [85;108;111].

После синтеза интерферона альфа происходит паракринная или аутокринная регуляция синтеза новых молекул иммунного ответа по средствам JAK-STAT сигнального пути, в результате чего активируются интерферон-стимулируемые гены (ИСГ). Транскрипция ИСГ достигается за счет фактора ISGF3, включающего фактор IRF9 и гетеродимер, состоящий из белков STAT1 и STAT2. Данный комплекс поступает в ядро, где далее связывается с ДНК в специальной области ISRE, в результате чего происходит индукция синтеза интерферона и других цитокинов [89].

1.5. Рецепторы интерферона альфа Как уже отмечалось выше, биологическая активность интерферона осуществляется за счет его взаимодействия со специфическими рецепторами на поверхности интерферон - чувствительных клеток. Интерфероны 1 типа, к которым относится интерферон альфа-2, взаимодействует с двумя типа рецепторов: высокоафинным рецептом IFNAR1 и низкоафинным рецептором IFNAR2 [124].

Несмотря на то, что интерферон альфа стимулирует множественные клеточные эффекты, он дейс твует через основной рецепторный комплекс IFNAR (рецепторный комплекс для всех интерферонов первого типа), который предс тавлен в незначительных количес твах на поверхности клеток (от 100 до 5000 рецепторов на клетку) позвоночных. Данный рецепторный комплекс состоит из двух субчастиц: IFNAR1 и IFNAR2. Структура субъединиц рецепторного комплекса представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Структура субъединиц рецепторного комплекса интерферона альфа [49] Зрелый IFNAR1 представляет собой белок длиной 530 аминокислотных остатков, интегрированный в клеточную мембрану [76]. Он состоит из внеклеточного домена (409 аминокислотных остатков), трансмембранного домена (21 аминокислотный ос таток) и внутриклеточного домена (100 аминокислотных ос татков) [12].

Зрелый человеческий IFNAR2 предс тавлен в трех формах. Основная форма

- IFNAR2с состоит из 487 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 115 кДа [12]. Внутриклеточный домен состоит из 251 аминокислотных остатков.

Две другие формы IFNAR2 отличаются значительно меньшим размером и называются IFNAR2b и IFNAR2a. IFNAR2b состоит из 303 аминокислотных ос татков, из которых лишь 67 составляют внутриклеточный домен [92; 98]. IFNAR2a представляет собой рас творимую форму IFNAR2 с молекулярной массой 40 кДа и лишен трансмембранного и внутриклеточного доменов [92]. На данный момент роль растворимых форм рецепторов до конца не ясна, однако, показано, что они могут выступать как в роли агонис тов и при взаимодейс твии с интерфероном проявлять антивирусную активнос ть, так и в роли антагонис тов, блокируя интерферониндуцированный ответ.

Рецепторы интерферонов первого типа относятся ко второму классу семейства спиралевидных цитокиновых рецепторов и содержат консервативную фибронектин тип III - подобную (FNIII) структуру, которая формирует внеклеточный лиганд-связывающий сайт [115]. Внеклеточная область IFNAR1 состоит из четырех фибронектин тип III – подобных повторностей, которые формируют два домена, разделенных последовательнос тью из трех пролинов. Каждый домен состоит из примерно 200 аминокислотных ос татков и так же может быть рассмотрен в виде двух гомологичных субдоменов размером 100 аминокислотных остатков каждый. Внеклеточная облас ть рецептора IFNAR-2 состоит из двух FNIII доменов, каждый из которых состоит из 100 аминокислотных остатков [115].

Существует модель взаимодейс твия молекулы интерферона с комплексным рецептором. Согласно данной модели, N – терминальный FBN III домен рецептора IFNAR-1 формирует «крышку» вокруг присоединившегося лиганда [12].

IFNAR1 и IFNAR2 имеют разный вклад в связывание лиганда, но при этом оба необходимы для формирования функционально активного сайта связывания молекул интерферона.

Трансмембранные участки IFNAR1 и IFNAR2 не обладают ферментативной активностью, но их внутриклеточные домены нековалентно связаны с тирозиновыми киназами TYK-2 и JAK-1 соответс твенно [92;114;115]. После связывания интерферона с экстраклеточным доменом рецепторного комплекса, цитоплазматические домены активируют данные киназы. Вдобавок к тирозиновым киназам с комлексом IFNAR так же связаны тирозин фосфатазы. Их роль состоит в регуляции учас тия T YK-2 и JAK – 1 в интерферон-индуцированном ответе [100].

Продемонстрирована важность наличия обоих элементов IFNAR комплекса.

В отсутствие одного из них не происходит высокоафинного связывания молекул интерферона с рецепторным комплексом, активации тирозин киназ и белков STAT, и как следствие не происходит биологического ответа на интерферон. Константа диссоциации IFNAR комплекса составляет 10-11, при этом IFNAR1 обладает более высокой аффинностью (10-7 ) по отношению к интерферонам первого типа, чем IFNAR2 (10-9 ) [30;107].

Один из самых интересных аспектов рецепторного комплекса состоит в способности различать различные типы и субтипы интерферонов первого типа и осуществлять различный биологический эффект в зависимости от типа лиганда.

Различные типы интерферонов первого типа вызывают различный биологический ответ.

1.6. Сигналы, вызванные действием интерферона на клетку

Исследования механизма сигналов, вызванных взаимодействием интерферона альфа со своим рецепторным комплексом, продемонстрировали, что существует множество путей данных сигналов, и привели к открытию ряда ключевых компонентов. Главными из этих компонентов являются [68]:

- Янус киназа (JAK);

- тирозин киназа (TYK);

- семейство белков трансдукторов сигналов и активаторов транскрипции (STAT);

- малый G – белок из суперсемейства ГТФаз (Rac-1);

- митоген активируемые протеинкиназы (MAPK);

- субстрат инсулинового рецептора (IRS);

- каскад фосфотидилинозитол-3 киназы (PI3K);

- crk – подобный белок, содержащий домены для взаимодействия с тирозинфосфорилированным белками (CrkL).

Схематическое изображение интерферон – индуцируемого каскада приведено на рисунке 3.

Рис. 3. Схематическое изображение каскада, индуцированного интерфероном альфа [70] Классической схемой пути, индуцированным интерферонами первого типа, является взаимодейс твие интерферона с двумя субтипами рецепторного комплекса IFNAR-1 и IFNAR-2, которые нековалентно связаны с TYK-2 и JAK-1 соответственно. T YK-2 и JAK-1 фосфорилируют остатки тирозина на внутриклеточном домене рецептора, что обеспечивает формирование сайтов связывания для SH-2 (src-homology-2) доменов белков семейства STAT [41]. Далее происходит фосфорилирование белков STAT. Фосфорилированные STAT высвобождаются от рецептора и формируют как гомодимеры, так и гетеродимеры. В ответ на дейс твие интерферонов первого типа ST AT-2 взаимодействует с цепью IFNAR-1, после чего он фосфорилируется T YK-2 и служит в качестве приманки для ST AT-1 [50].

Данная гипотеза утверждает, что фосфорилирование ST AT-1 зависит от предварительной активации STAT-2. В других работах показано, что активация ST AT-1 возможна в отсутствии ST AT-2. После высвобождения от рецептора гетеродимер STAT-1/2 взаимодействует с Д НК – связывающим белком р48 (так же называемым IRF-9), формируя комплекс, называемый ISGF-3. После формирования ISGFпроисходит его транслокация в ядро, где происходит его взаимодействие со специальным участком Д НК ISRE, расположенным выше генов, активируемых интерфероном, и инициирует транскрипцию. ISRE регулирует транскрипцию большинс тва генов, инициируемых интерфероном, и находится в пределах 200 пар оснований от начала точки транскрипции. Хотя фосфорилирование ST AT-1 в позиции Tyr701 является необходимым условием для связывания ISGF3 ДНК, дополнительная активация сайта серин 727, вызванное киназой С (PKC-) является существенным условием для эффективной активации транскрипции [17;31]. В добавок к STAT-1 и STAT-2 другие представители семейс тва белков STAT – 3, 4, 5 и 6 так же имеют важную роль в процессе клеточного ответа на интерфероны первого типа. Показано, что фосфорилирование ST AT-3 ассоциировано с IFNARSTAT-3 так же выполняет функции адапторного белка для р85 субъединицы сериновой киназы – фосфатидилинозитол 3-киназы (PI3K). Данное взаимодействие запускает PI3K – сигнальный путь.

PI3K – сигнальный путь играет значительную роль в выживаемости клеток в ответ на действие интерферонов первого типа. JAK – зависимая PI3K сериновая киназа состоит из р85 субъединицы и каталитической субъединицы р110. Субъединица р85 взаимодействует как с IRS-1, так и с IRS-2. Данное взаимодейс твие выражается в активации субъединицы р110. Результатом каскада PI3K является нуклеофильный фактор каппа-В (NF-kB), ассоциированный с антиаппоптотическим эффектом. Другим белком, являющимся так же результатом каскада PI3K и включенным в процесс клеточного выживания является внеклеточная регуляторная киназа (ERK) [121]. До конца роль ERK все еще не изучена.

Антивирусный ответ, активированный интерферонами первого типа, связывают с р38 – сигнальным путем, который так же является частью каскада PI3K.

Р38 MAPK сигнальный каскад индуцируется двумя малыми белковыми молекулами: Rac1 и Cdc42. Несмотря на то, что промежуточный посредник между Rac1 и p38 не найден, исследования демонстрируют, что PKC- функционирует как верхний регулятор р38. В клетках, имеющих нокатут по р38, проявляется дефектная транскрипция генов. Более того, фармакологическое ингибирование р38 приводит к блокированию интерферон – зависимого антивирусного ответа [82].

–  –  –

Как уже отмечалось выше, интерферон вырабатывается практически всеми эукариотическими клетками в ответ на воздействие различных патогенов. Интерферон альфа активно используется во многих странах для лечения различных заболевании, включая хронические формы гепатита, меланому, лимфому, лейкоз и другие.

Рекомбинантный человеческий интерферона альфа-2а и альфа-2b были первыми препаратами, одобренными регуляторными органами США (FDA) для лечения волосатоклеточного лейкоза [12]. На данный момент зарегистрировано большое количество препаратов на основе интерферона альфа или его модифицированных форм.

Первое клиническое применение интерферона относится к 1970-м годам. На данном этапе была показана эффективнос ть интерферона на примере неочищенного экстракта из лейкоцитарной массы, обработанной вирусом [18]. В рамках проведенного исследования была продемонс трирована перспектива интерферона в качестве противовирусного и противоопухолевого агента [97].

На данный момент большинство терапевтических препаратов содержит интерферона альфа-2, полученный по рекомбинантной технологии. В качес тве основных экспрессионных систем используется кишечная палочка (E. Coli) и различные виды дрожжей.

1.7.2. Терапия хронического гепатита B Вирусные гепатиты являются серьезной проблемой мирового здравоохранения. Ежегодно от гепатита В умирает значительное количество людей во всем мире. Существуют острая и хроническая формы гепатита В. Доля больных хронической формой составляет около 10 % от общего количества пациентов, около 350

– 400 млн. человек во всем мире. Больные гепатитом B находятся в зоне риска, так как у них могут развиться такие заболевания как цирроз печени или гепатоклеточная карцинома. Показано, что интерферон альфа-2 является эффективным агентом, супрессирующим репликацию вируса. В результате терапии интерфероном альфа-2 значительно снижается содержание вирусной Д НК в крови. Эффективность терапии составляет около 40 % [36;83;129].

1.7.3. Терапия хронического гепатита С

Вирус гепатита С распространен во всем мире. По данным всемирной организации здравоохранения около 3 % мировой популяции являются носителями вируса гепатита С. Как и в случае гепатита В, гепатит С имеет острую и хроническую формы. При этом у 85 % больных острая форма переходит в хроническую, примерно у 20 % больных хронической формой развивается цирроз печени.

Сложность терапии гепатита С заключается в большом количес тве субтипов (на данный момент выделено и охарактеризовано 11 субтипов) и их склонности к мутации. Интерферон альфа-2 был впервые применен для лечения гепатита С в 1986 году, однако, монотерапия интерфероном альфа-2 дает результат только в случае 15 – 20 % пациентов [62]. На сегодняшний день интерферон используют в составе комплексной терапии с рибавирином – ингибитором синтеза вирусной ДНК. Эффективность данного вида терапии составляет 38 – 43 % [102].

1.7.4. Терапия волосоклеточной лейкемии

Интерферон альфа нашел широкое применение и при терапии ряда онкологических заболеваний, к примеру, волосоклеточной лейкемии. Данный вид лейкемии относится к медленно прогрессирующим видам рака. При данном виде рака опухолевые клетки обнаруживаются как в перифирической крови, так и в костном мозге. В 1984 году было показано, что волосоклеточная лейкемия чувствительна к интерферону. В 1986 интерферон альфа-2 был одобрен для терапии данного вида заболевания. Эффективность терапии составляет около 60 % [4].

1.7.5. Терапия саркомы Капоши

Саркома представляет собой тип рака, который развивается в соединительных тканях: хрящах, костях, жировой ткани, мышцах [69]. Саркома Капоши названа в честь Морица Капоши, который открыл данный тип рака в 1872 году. Существует несколько типов саркомы Капоши, которые отличаются между собой.

Причиной саркомы Капоши является вирус герпеса человека – 8, который похож на другие субтипы вируса герпеса, а так же на вирус Эпштейна-Барра и цитомегаловирус, однако саркому вызывается только 8 субтип вируса [6;7]. Стандартного подхода к терапии саркомы Капоши не существует, используют различные подходы: хирургия, лучевая терапия, иммунотерапия интерфероном альфа-2. Эффективность монотерапии интерфероном альфа-2 высока и достигает 45 – 70 %.

Как видно из приведенных данных, интерферон альфа-2 является эффективным средством для лечения целого ряда вирусных и онкологических заболеваний. Приведенные примеры отражают лишь малую часть заболеваний, при которых назначается интерферон альфа-2 в виде моно и комплексной терапии.

1.8. Требования качества к интерферонсодержащим препаратам

На начальных этапах в медицинской практике применялись препараты на основе интерферона альфа-2, полученного из лейкоцитарной массы человека, обработанной различными вирусами. Такой подход не позволял обеспечить гомогенность получаемого препарата, при этом остается опаснос ть контаминации конечного продукта вирусными частицами. Еще один недостаток данного метода состоит в том, что выделенную лейкоцитарную массу необходимо использовать в течение 48 часов.

В 1986 году впервые были получены генно-инженерные препараты интерферона альфа-2а и альфа-2b человека. В качестве клетки – продуцента использовалась кишечная палочка (E. Coli). На сегодняшний день большинство интерферонсодержащих препаратов производится на основе рекомбинантного интерферона, получаемого в бактериальных клетках, по причине высокой эффективности, безопасности и низкой с тоимости данной технологии. Основной проблемой при производстве препаратов в бактериальных клетках является тот факт, что любой синтезируемый белок обладает N – концевым метионином. Данное явление связано с устройством экспрессионной системы бактерий. Наличие N – концевого метионина, наряду с отсутствием гликозилирования, отличает получаемый белок от белка, вырабатываемого в организме человека.

Показано, что отсутс твие гликозилирования в значительной мере не влияе т ни на физико - химические, ни на биологические свойства интерферона альфа. В противоположнос ть этому наличие N – концевого метионина влияет на иммуногенность и стабильность белка. N - концевой метионин препятствует образованию дисульфидной связи Cys1-29, что приводит к повышенной способности к агрегации и как следствие к повышению иммуногеннос ти [13].

Существует целый ряд способов получения белков без N – концевого метионина, а именно: производство белков в эукариотических клетках,; применение протеиназ, специфично отщепляющих N - концевой метионин; технологии на основе протеолиза белка – предшественника. Наиболее удобной и широко применяемой технологией удаления N – концевого метионина является SUMO – технология. Суть технологии состоит в том, что первоначально в бактериальной клетке экспрессируется не зрелый белок, а его SUMO – предшес твенник. Данный предшественник представляет собой фьюжн – белок, состоящий из 1 молекулы целевого белка и одной молекулы дрожжевого белка SUMO-1. Далее полученный белок – предшественник подвергается ренатурации и расщеплению специфичной к SUMO1 ULP – протеиназой. ULP осуществляет расщепление пептидной связи, следующей после пары Gly-Gly, которая соответствует C – концевой последовательнос ти SUMO1 [19]. Схема расщепления предшественника интерферона представлена на рисунке 4.

Рис. 4. Схема расщепления SUMO – предшественника интерферона альфа-2 с образованием молекулы интерферона без N – концевого метионина В странах Западной Европы и США все препараты на основе интерферона альфа-2 и его модифицированных форм не должны содержать N – концевого метионина. Данное требование прописано в соответс твующих фармакопеях. В Российской Федерации на сегодняшний день по-прежнему разрешено применение интерферона альфа, содержащего N – концевой метионин, при этом практически не применяются технологии для производства интерферона альфа-2 в бактериальных клетках без N – концевого метионoина.

1.9. Недостатки использования нативного интерферона альфа-2

Несмотря на активное применение интерферона альфа-2 в современной медицинской практике, терапия на его основе не лишена недостатков. Как и другие препараты на основе белковых молекул, интерферонсодержащие препараты:

Активно разрушаются ретикулоэндотелиальной системой;

обладают высоким уровнем клиренса;

высокоиммуногенны;

разрушаются протеиназами;

обладают большим объемом распределения в организме пациента.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Похожие работы:

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Ковалев Сергей Юрьевич ПРОИСХОЖДЕНИЕ, РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ЭВОЛЮЦИЯ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук 03.02.02 – вирусология ЕКАТЕРИНБУРГ 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«Артеменков Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Брук...»

«НГУЕН ВУ ХОАНГ ФЫОНГ ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ КРУПНЫХ ГОРОДОВ В СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ ВЬЕТНАМ Специальность: 03.02.08экология (биология) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Чернышов В.И. Москва ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА...»

«Иртегова Елена Юрьевна РОЛЬ ДИСФУНКЦИИ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ И РЕГИОНАРНОГО ГЛАЗНОГО КРОВОТОКА В РАЗВИТИИ ГЛАУКОМНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ 14.01.07 – глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«Кузнецов Василий Андреевич ПОЧВЫ И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПАРКОВО-РЕКРЕАЦИОННЫХ ЛАНДШАФТОВ МОСКВЫ Специальность 03.02.13-почвоведение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, И.М. Рыжова Москва-2015 Содержание Введение Глава 1. Влияние рекреации на лесные экосистемы (Литературный обзор) 1.1.Состояние проблемы 1.2....»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Черногаев Виталий Геннадьевич ВОЗДЕЙСТВИЕ ТЕХНОГЕННЫХ НАРУШЕНИЙ НА ДИНАМИКУ ПОЧВЕННО-РАСТИТЕЛЬНОГО ПОКРОВА МЕЩЕРСКОЙ НИЗМЕННОСТИ Специальность 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Жукова Дарья Григорьевна ДИАГНОСТИКА И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РЕАКЦИЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЛЕКАРСТВЕННЫМ ПРЕПАРАТАМ У БОЛЬНЫХ В ПЕРИОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ В УСЛОВИЯХ МНОГОПРОФИЛЬНОГО СТАЦИОНАРА 14.03.09 клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор...»

«ЖЕСТКОВА ДАРЬЯ БОРИСОВНА СОСТАВ И СТРУКТУРА ТРАВЯНИСТОГО ПОКРОВА ПРИДОРОЖНЫХ ТЕРРИТОРИЙ АВТОМАГИСТРАЛЕЙ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА Специальность: 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«ЗАУЗОЛКОВА Наталья Андреевна АГАРИКОИДНЫЕ И ГАСТЕРОИДНЫЕ БАЗИДИОМИЦЕТЫ ЛЕСОСТЕПНЫХ СООБЩЕСТВ МИНУСИНСКИХ КОТЛОВИН 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – кандидат биологических наук, И. А. Горбунова Абакан – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ... ГЛАВА 1....»

«ТУНЁВ ВИТАЛИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ И ПРОМЫСЕЛ ПЕЛЯДИ Coregonus peled (Gmelin, 1789) ТАЗОВСКОГО БАССЕЙНА Специальность 03.02.08 – экология (биология) 03.02.06 – ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«Лямина Наталья Викторовна УДК 591.148:574.52(262.5) ДИНАМИКА ПАРАМЕТРОВ ПОЛЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В ЧЁРНОМ МОРЕ И ИХ СОПРЯЖЁННОСТЬ С ФАКТОРАМИ СРЕДЫ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор Ю. Н. Токарев Севастополь 2014 г. СОДЕРЖАНИЕ Стр. ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ. ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ ИСТОРИЯ...»

«Лёвкина Ксения Викторовна Влияние сроков, норм высева и удобрений на урожайность и качество зерна озимой твердой пшеницы в подзоне светло-каштановых почв Волгоградской области Специальность: 06.01.01 – общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«ТУРТУЕВА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ 14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор НИКОЛАЕВА ГАЛИНА ГРИГОРЬЕВНА Улан-Удэ – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.