WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

«Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломычеловека 6/11 и 16/18 типов ...»

-- [ Страница 4 ] --

Моделирование профиля подпитки для реализации оптимального профиля скорости роста и прогнозирование количества биомассы, продукта и объемной продуктивности процесса культивирования.

Для реализации оптимальной кривой роста необходимо рассчитать профиль подпитки. Для оценки адекватнос ти модели нужно спрогнозировать кривые роста биомассы X, накопления продукта P и объемной продуктивности QP.

Разделим общий период подпитки на равные интервалы [tn, tn+1 ] (1 n N) длиной dt. Таким образом, (25) tn+1 = tn + dt Принимаем значение dt = 15 мин. Это обеспечит достаточную точнос ть при расчете параметров процесса.

В каждый момент времени tn мы обозначаем количество биомассы в ферментере как Xn = X(tn ) и количество продукта как Pn = P(tn).

В начале подпитки глицерином начальные значения X(0) = X0 и P(0) = P0.

Они равны значениям этих параметров, достигнутым в конце фазы накопления биомассы. Сначала мы должны описать рост биомассы. Мы используем простейшую, экспоненциальную модель роста.

= (26)

–  –  –

Значения qP ma x и kq получены из экспериментальных данных, обработанных по методу наименьших квадратов.

Затем мы должны вычислить количество субстрата dS, который должен быть внесен в интервале времени [tn, tn+1 ]. Чтобы это сделать, допустим, что Sn – это количество субстрата, внесенное в ферментер ко времени tn. Тогда скорость потребления субстрата зависит от количества биомассы и на увеличения биомассы, т.е.

= + (31)

–  –  –

Эти выражения используются, чтобы рассчитать профиль подпитки, необходимый для реализации оптимальной кривой роста и прогнозируемые кривые роста количества биомассы, накопления продукта и объемной продуктивности.

Подробные расчеты в таблицах MS Excel приведены в Приложении 7. В таблице 14 приведены только результаты математического моделирования – итоговые графики прогнозируемых параметров культивирования и оптимизированный профиль подачи подпитки, который необходим для получения прогнозируемых результатов.

Таблица 14. Оптимизированный профиль подачи подпитки и прогноз параметров культивирования Установочный Профиль оптимизированной подпитки параметр

Скорость подачи Концентрация компонентов в подпитке:

подпитки для 29 г/л – KH2 PO4, поддержания 100 г/л – казаминовые кислоты, оптимального 100 г/л – дрожжевой экстракт профиля скорости

–  –  –

1,5 КЖ 0,5

–  –  –

2,5 1,5 0,5

–  –  –

Апробация подпитки, полученной путем математического моделирования, в процессе биосинтеза белка E7(16)-HSP70.

Для апробации моделированной подпитки было проведено три процесса культивирования штамма SCR-E7(16)-HSP70. Стадия накопления биомассы проводилась стандартно; на 23 часу культивирования в среду был внесен глицерин до концентрации 62 г/л, и была включена подпитка по фосфату (согласно профилю, рассчитанному в математической модели), казаминовым кислотам и дрожжевому экстракту.

Кривая удельной скорости роста в ходе процесса биосинтеза в сравнении с прогнозируемой кривой приведена на рисунке 37. На 25 часу роста культура адаптируется к глицерину, и скорость роста восстанавливается до значения 0,08 чСкорость роста выходит на плато, а с 30,5 часа начинает постепенно падать.

Начиная с 32-33 часа, скорость роста падает быстрее, чем было спрогнозировано в модели и чем дальше, тем большее расхождение наблюдается между моделью и кривой роста, полученной в процессе культивирования. Так, согласно модели, удельная скорость роста будет равна 0,015 ч-1 на 58,4 ч роста. На самом деле в реальном процессе уже на 36 часу скорость роста равна 0,012 ч-1. Такое снижение скорости роста связано с токсическим действием белка E7(16)-HSP70, поскольку, как было показано позже, при экспрессии других гибридных белков такого падения скорости роста не наблюдалось.

0,1

–  –  –

Рисунок 37. Удельная скорость роста штамма-продуцента SCR-E7(16)HSP70 в ходе биосинтеза белка E7(16)-HSP70 с оптимизированной подпиткой Изменение удельной скорости образования белка в процессе культивирования показано на рисунке 38. На этом графике ярко видны ограничения математической модели, которые накладывают на нее особенности штамма-продуцента и экспрессируемого целевого белка E7(16)-HSP70. В начале процесса экспрессии на 29 часу роста происходит “разгон” клетки – синтезируются факторы транскрипции и трансляции и в этот период рос та удельная скорость образования продукта не зависит от удельной скорости роста, а лимитируется другими факторами.

Математическая модель основана на положении, что qp =f(µ), и потому в точке начала экспрессии удельная скорость образования продукта соответствует удельной скорости роста культуры. В реальной системе в начале процесса экспрессии удельная скорость роста возрастает пос тепенно и независимо от удельной скорости роста. На 37 часу роста удельная скорость образования продукта резко падает. Скорее всего, это связано с негативным действием целевого белка на клетку. Скорость роста культуры при этом продолжает плавно снижаться, то ес ть скорость образования белка падает независимо от удельной скорости роста.

Между этими граничными точками зависимость qp =f(µ) корректна, и математическая модель адекватна. При выходе за эти границы математическая модель и реальный процесс расходятся.

–  –  –

(140914) 2,00 1,50 1,00 0,50

–  –  –

Рисунок 38. Удельная скорость образования белка E7(16)-HSP70 в процессе культивирования штамма SCR-E7(16)-HSP70 с оптимизированной подпиткой в сравнении с прогнозируемой скоростью образования продукта qp Объемная продуктивность процесса достигает своего максимума на 36-37 час, после чего выходит на плато, потому продолжать процесс культивирования далее 37 часа не имеет практического смысла (Рисунок 39).

–  –  –

Проверка адекватности прогнозирования накопления белка.

Погрешнос ть аппроксимации составляет 13,9 %. Фактическое значение Fкритерия Фишера равно 119,3, тогда как табличное значение равно 4,96.

Фактическое значение F-критерия Фишера больше табличного значения, потому уравнение является статис тически значимым.

Проверка адекватности прогнозирования объемной продуктивности.

Погрешнос ть аппроксимации составляет 15,7 %. Фактическое значение Fкритерия Фишера равно 14,88, тогда как табличное значение равно 4,67.

Фактическое значение F-критерия Фишера больше табличного значения, поэтому уравнение является статис тически значимым.

Подробные расчеты и оценка статистической значимости приведены в Приложении 8.

Усредненные значения по параметрам процессов культивирования штаммапродуцента SCR-E7(16)-HSP70 в сравнении с другими технологическими схемами приведены в таблице 15.

Таблица 15. Сравнение эффективности технологических схем этапа биосинтеза гибридного белка E7(16)-HSP70

–  –  –

Объемная продуктивнос ть ферментации с подпиткой, рассчитанной математическим моделированием, в 1,86 раза больше, чем ферментации с внесением глицерина и в 16,7 раз больше, чем в периодического процесса.

2.2.1.6.5. Апробация двухстадийной подпитки на штаммах-продуцентах SCR-E7(18)-HSP70 и SCR-E7(11)-HSP70, SCR-E7(6)-HSP70 Для культивирования штаммов SCR-E7(18)-HSP70 и SCR-E7(11)-HSP70, SCR-E7(6)-HSP70 была использована та же математическая модель, что и для

–  –  –

штамма SCR-E7(16)-HSP70; в процессе культивирования использовался профиль подпитки, рассчитанный для штамма SCR-E7(16)-HSP70.

На рисунке 40 показаны кривые удельной скорости роста для всех 4 штаммов. Кривая удельной скорости роста штамма SCR-E7(16)-HSP70 больше всего приближена к оптимальному профилю удельной скорости роста. Кривые штаммов SCR-E7(11)-HSP70 и SCR-E7(6)-HSP70 чрезвычайно похожи – имеют характерный пик на 29 часу культивирования и резкое падение скорости роста на 32 часу. Кривая удельной скорости роста штамма SCR-E7(18)-HSP70 лежит выше профиля оптимальной скорости роста, что говорит о менее токсичном действии целевого белка E7(18)-HSP70 на клетки штамма-продуцента.

В целом, динамика изменения удельной скорости роста в ходе биосинтеза целевых белков близка к оптимальному профилю.

0,10

–  –  –

0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00

–  –  –

Накопление биомассы в ходе культивирования с оптимизированной подпиткой штаммаSCR-E7(16)-HSP70 шло в соответствие с прогнозом, штаммаSCR-E7(18)-HSP70 – быстрее, а штамма SCR-E7(6)-HSP70 иSCR-E7(11)HSP70 – медленнее (Приложение 7).

Накопление целевого белка в ходе культивирования с оптимизированной подпиткой показано на рисунке 41. Штамм SCR-E7(16)-HSP70 продуцирует белок в соответс твие с прогнозом, но после 37 часа роста происходит торможение синтеза (конечная концентрация в среде 720-841 мг/л за 8-9 часов роста). Штамм SCR-E7(18)-HSP70 накапливает белок в больших количествах – 2769 мг/л за 11,75 часа. Штаммы SCR-E7(6)-HSP70 и SCR-E7(11)-HSP70, как и штамм SCR-E7(16)HSP70, после 37 часа роста тормозят синтез целевого белка, но по количеству экспрессируют белка больше, чем штамм SCR-E7(16)-HSP70 (1680 мг/л и 1600 мг/л за 12,5 ч соответственно).

концентрация белка, мг/л

–  –  –

Рисунок 41. Накопление продукта при культивировании штаммовпродуцентов SCR- E7(16)-HSP70, SCR-E7(18)-HSP70, SCR-E7(11)-HSP70 и SCR-E7(6)-HSP70 с оптимизированной подпиткой

–  –  –

Нужно отметить, что при использовании данного способа индукции и профиля подпитки штаммы имеют различную временную задержку между внесением глицерина и началом экспрессии. Штамм SCR-E7(16)-HSP70 начинает продуцировать белок через 7,5 часов после внесения глицерина, штамм SCRE7(11)-HSP70 и SCR-E7(6)-HSP70 – в момент внесения глицерина, а штамм SCRE7(18)-HSP70 – через 2 часа после внесения глицерина (Рисунок 42).

Это говорит о том, что дерепрессия Gal1 промотора в штаммахпродуцентах происходит при различной концентрации сахаров в среде. Для продукции белка E7(16)-HSP70 в штамме SCR-E7(16)-HSP70 необходимо полное отсутс твие сахаров в среде, тогда как для штаммов SCR-E7(11)-HSP70, SCRE7(6)-HSP70 и SCR-E7(18)-HSP70 наличие остаточной концентрации сахаров в среде не ингибирует синтез целевого белка. Это объясняет и тот факт, что индукцию синтеза подачей лимитированного количества сахара в среду для штамма SCR-E7(16)-HSP70 осуществить не удалось, тогда как остальные целевые белки экспрессировались.

А В Рисунок 42. Почасовой электрофорез процессов культивирования штаммов SCR- E7(18)-HSP70 (А) и SCR- E7(11)-HSP70 (В) с оптимизированной подпиткой MW – маркеры молекулярного веса, ВПЧ 18 и ВПЧ16 – внутренние стандарты белков E7(18)-HSP70 и E7(16)-HSP70 соответственно Удельная скорость образования продукта для штамма SCR-E7(16)-HSP70 соответс твует прогнозированному профилю с учетом граничных условий, о которых говорилось выше. Удельная скорость образования продукта для штаммов SCR-E7(6)-HSP70, SCR-E7(11)-HSP70 и SCR-E7(18)-HSP70 не соответс твует прогнозированию. Для точного прогноза необходимо вычислить для каждого штамма собственные константы математической модели – и.

Объемная продуктивнос ть для штамма SCR-E7(16)-HSP70 достигает своего максимума на 36 час (19,5 мг/(л·час)), для штаммов SCR-E7(11)-HSP70 и SCR-E7(6)-HSP70 – на 37,75 час (44,5 и 42,4 мг/(л·ч) соответс твенно), для штамма SCR-E7(18)-HSP70 – на 38,75 час (71,75 мг/(л·ч)) (Приложение 7).

–  –  –

SCR-E7(11)- 200,0 ± 22,0 4,17 ± 0,46 1680,5 ± 170,1 44,5 ± 4,5 10,6 HSP70 SCR-E7(6)- 200,0 ± 22,0 4,17 ± 0,46 1600,3 ± 165,6 42,4 ± 4,4 10,2 HSP70 Из таблицы 16 видно, что оптимизация подпитки значительно повлияла на объемную производительнос ть и конечный титр целевого продукта штамма SCRE7(16)-HSP70 – объемная продуктивность возросла в 16,7 раз, конечный титр в – 13,9 раз. Для штаммов SCR-E7(11)-HSP70 и SCR-E7(6)-HSP70 положительный эффект оптимизированной подпитки также был высоким – объемная производительность возросла в 10,6 и 10,2 раза, а титр конечного продукта в 8,4 и 8,0 раз, соответственно. Для штамма SCR-E7(18)-HSP70 эффект был наименьшим

– объемная производительнос ть возросла в 9,4 раза, а титр конечного продукта в 7,6 раза.

Различный эффект оптимизированной подпитки объясняется тем, что подпитка была рассчитана с использованием в математической модели констант ( и ), экспериментально полученных для штамма E7(16)-HSP70. Для расчета индивидуальной подпитки необходимо для каждого штамма определить константы и, что является задачей для дальнейшей работы.

–  –  –

При разработке процесса дезинтеграции целью было выделение растворимой фракции гибридных белков Е7(6)-HSP70, Е7(11)-HSP70, Е7(16)HSP70 и Е7(18)-HSP70, так как растворимые белки правильно свернуты на этапе биосинтеза и не требуют дополнительного процесса ренатурации в отличие от нерастворимой формы.

2.2.2.1. Выбор состава лизирующего буфера

Выбор состава лизирующего буфера для дезинтеграции был обусловлен требованиями хроматографической очистки. Экстрагирование белка из фракции растворимых внутриклеточных белков происходило путем специфического связывания на металл-хелатной аффинной колонке с иммобилизованными ионами Ni, сорбентом IMAC 6 FF (GE Healthcare). Для предотвращения неспецифического связывания примесных белков с колонной в ходе хроматографии в состав буфера был внесен имидазол в концентрации 30мМ, а также 500 мМ натрия хлорида. Полисорбат 20 в концентрации 0,1% и мочевина в концентрации 4М ослабляют гидрофобное взаимодействие между неполярными фрагментами полипептидных цепей, что улучшает связывание гибридного белка с колонной [97].

Дитиотрейтол в концентрации 5 мМ восстанавливает дисульфидные связи и препятс твует агрегации целевых белков Е7(6)-HSP70, Е7(11)-HSP70, Е7(16)HSP70 и Е7(18)-HSP70. Разрушение клеточных стенок приводит к высвобождению протеолитических ферментов. Поэтому в буфер добавлены ЭДТА до концентрации 1мМ и фенилметилсульфонилфторид - до 2 мM. Эти компоненты ингибируют действие металлозависимых и сериновых протеаз соответс твенно.

Выбор значения pH буфера равным 8,0, был обусловлен специфическими требованиям сорбента IMAC 6 FF, применяемого в металл-хелатной аффинной хроматографии. При pH ниже значения 6,0 целевой белок слабо связывается с сорбентом и большая его часть уходит в проскок. Кроме того, предварительные исследования стабильности гибридных белков Е7(6)-HSP70, Е7(11)-HSP70, Е7(16)-HSP70 и Е7(18)-HSP70 показали, что при хранении при комнатной температуре в течение семи дней рН 7.4 - 8.0 лучше стабилизирует активный белок в растворе по сравнению с рН 6,0-7.0.

2.2.2.2. Влияние температуры на стабильность целевого продукта

При разрушении клеточной стенки дрожжевой клетки из нее высвобождаются органеллы, цитоплазма, а также большое количество протеаз.

Несмотря на использование ингибиторов, протеазы частично разрезают белки рассечением пептидных связей. При этом целевой белок Е7-HSP70 деградирует до низкомолекулярных белков (Рисунок 43).

Рисунок 43. Электрофореграмма, иллюстрирующая действие протеаз и повышенной температуры на продукты Е7(16)-HSP70 и Е7(18)-HSP70 Скорость протеолиза прямо пропорциональна температуре, поэтому после каждого прохода через гомогенизатор APV суспензия охлаждалась во льду.

Однако, непосредственно на выходе из дезинтегратора температура повышалась до 30 °С уже через 2-3 минуты работы прибора за счет преобразования механической работы в тепловую. Во льду же температура суспензии снижается медленно (с 30 °С до 10 °С за 15-20 минут) из-за низкой скорости теплопередачи.

За счет преобразования механической энергии в тепловую увеличение температуры воды, прошедшей через гомогенизатор, составляет 1,7 °C на каждые 68 Бар. Температура возрастает обратно пропорционально теплоемкости жидкости и не зависит от типа гомогенизатора [146]. Стратегия разрушения выбиралась с учетом температуры суспензии на выходе из теплообменника. Она не должна была превышать 30°C.

Для эффективного охлаждения в линию выхода дезинтеграта из камеры гомогенизатора был встроен с теклянный теплообменник ХСВО-16-19-29 (Химлаборприбор, Россия). В рубашку теплообменника противотоком подавался хладагент из рециркуляционной бани Neslab RTE7 с температурой минус 10 °С.

Такой теплообменник позволил быстро снижать температуру суспензии на 8-10 °С. Кроме того, охлаждался стакан подачи суспензии (Рисунок 44).

Рисунок 44.Схема лабораторной установки для дезинтеграции клеток биомассы штаммов-продуцентов SCR-702-Е7 (6)-HSP70, SCR-702-Е7 (11)HSP70, SCR-702-Е7 (16)-HSP70, SCR-702-Е7 (18)-HSP70 Таким образом, на выходе получали дезинтеграт температурой 18-22 °С, который затем охлаждался в колбе, помещенной в лед. Внедрение теплообменника в технологическую линию позволило минимизировать воздействие протеаз на целевой белок и получать стабильный продукт.

2.2.2.3. Выбор соотношения лизирующий буфер – биомасса Соотношение лизирующий буфер – биомасса SCR-702-Е7(16)-HSP70 на этапе диспергирования суспензии было выбрано 3 к 1. Повышение доли буфера до 5 к 1 и 10 к 1 не повлияло на эффективность разрушения, однако продолжительность процессов дезинтеграции и нанесения лизата на хроматографическую колонну IMAC увеличилось в 1,5-3 раза, подробнее указано в таблице 17. Увеличение продолжительнос ти этих технологических этапов было недопус тимо, так как продукт со временем деградирует под действием протеаз, его нужно как можно быстрее экстрагировать из клеточного лизата.

Таблица 17. Влияние соотношения лизирующий буфер-биомасса на степень разрушения клеток биомассы продуцента Е7(16)-HSP70 Режим разрушения Соотношени Cтепень Общее время процессов е буфер - разрушения дезинтеграции и биомасса биомассы, нанесения на колонну процент ± IMAC объемом 400 мл Давление 950 бар, 3:1 98 ± 1 4 часа 8 циклов дезинтеграции.

циклами 5:1 96 ± 1 7 часов Между суспензию помещали в лед и охлаждали в течение 15 мин до 8- 10:1 95 ± 1 12 часов 10 °С.

Выбранная схема процесса дезинтеграции имела следующий вид: одну часть биомассы продуцента суспендировали в трех час тях лизирующего буфера, охлажденного до температуры +4о С. Буфер с pH 8,0 имел следующий состав:

100мМ Tris-HCl, 30 мM имидазола, 5 мM дитиотрейтола, 1 мM ЭДТА, 2 мM фенилметилсульфонилфторида, 500 мМ хлорида натрия, 0.1 % полисорбата 20, 4М мочевины. Полученную клеточную суспензию дезинтегрировали с помощью лабораторной установки (Рисунок 48) при различных условиях. В начале каждого цикла суспензия циркулировала в системе стакан дезинтегратора – камера разрушения – охлаждающий стеклянный теплообменник на протяжении 1,5 мин.

Затем клеточную суспензию собирали в охлаждаемую льдом колбу, охлаждали до температуры 8-10о С и проводили следующий цикл разрушения. Общее число циклов дезинтеграции определялось результатами микроскопии (не менее 95% разрушенных клеток).

2.2.2.4. Влияние давления и количества циклов дезинтеграции В ходе работы было исследовано влияние давления в камере разрушения гомогенизатора и количества циклов дезинтеграции на выход общего клеточного белка и целевого белка Е7(16)-HSP70 [221].

Было проведено 3 дезинтеграции биомассы продуцента SCR-702-Е7(16)HSP70 в количестве 50 г по влажному весу при давлениях 600 Бар, 750 Бар и 950 Бар. Масса суспензии после этапа диспергирования составляла 200-210 г. Пробы клеточного лизата освобождали от целых клеток и клеточных обломков осаждением на центрифуге при 10000 об/мин в течение 10 мин. В полученном супернатанте измеряли содержание общего белка методом с бицинхониновой кислотой с использованием набора Pierce® BCA ProteinAssayKit (Thermo Scientific). Для анализа содержания растворимого гибридного белка Е7(16)-HSP70 в супернатанте использовали метод электрофореза в 8% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли в восстанавливающих условиях.

Результаты экспериментов изображены на рисунке 45.

Рисунок 45. Влияние давления на эффективность дезинтеграции биомассы штамма-продуцента Е7(16)-HSP70 На рисунке 46 наглядно виден процесс разрушения клеток в динамике, определена его степень в зависимости от номера цикла дезинтеграции.

–  –  –

ж Рисунок 46. Фотографии клеточного лизата. Результаты фазово-контрастной микроскопии лизата после 1,2,4,6,8 и 11 циклов дезинтеграции биомассы штамма SCR-702-Е7(16)-HSP70 при давлении 950 Бар а – исходная клеточная суспензия, степень разрушения 0%; б – 1-ый цикл, степень разрушения 20 %; в – 2-ой цикл, степень разрушения 33 %; г – 4-ый цикл, степень разрушения 62 %; д – 6-ой цикл, степень разрушения 93 %; е – 8-ой цикл, степень разрушения 95 %; ж – 11-ый цикл, степень разрушения 98 %.

При давлении 600 Бар количество общего белка и гибридного белка Е7(16)-HSP70 перестало увеличиваться на 11-12 цикле разрушения и составило 29 мг/мл и 5 мг/мл соответственно, при давлении 750 Бар – на 9 цикле 29,5 мг/мл общего белка и 5,2 мг/мл продукта Е7(16)-HSP70. Несмотря на то, что концентрация целевого продукта достигла своего максимума в 5,4 мг/мл уже после 6 циклов дезинтеграции при давлении 950 Бар, количество общего белка продолжало увеличиваться до 8 цикла и составило 34,8 мг/мл. В конце 6 цикла дезинтеграции большая часть гибридного белка, содержащегося в цитоплазме клеток S. сerevesiae, высвобождается из-за повреждений в клеточных с тенках.

Мембраны клеточной стенки и органеллы продолжают разрушаться, высвобождая белок и увеличивая значение концентрации общего белка вплоть до 9 цикла разрушения.

Было исследовано влияние давления на с табильнос ть гибридного белка Е7(16)-HSP70 в ходе дезинтеграции при давлении 950 Бар. Количество циклов было намеренно завышено, вместо 6 циклов проведено 11. На электрофореграмме (Рисунок 47) видно, что длительное пребывание целевого продукта Е7(16)-HSP70 в стрессовых условиях не вызвало его деградацию.

MW, кДа 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Рисунок 47. Анализ лизатов дрожжевых клеток методом ЭФ в ПААГ в восстанавливающих условиях MW – белковые маркеры веса, 1-11 - лизаты клеток дрожжей штамма SCR-Е7(16)HSP70 с 1-го по 11-ый циклы разрушения при давлении 950 Бар; 12-15 – стандарт гибридного белка Е7(16)-HSP70 в количестве 1000 нг, 500 нг, 250 нг и 100 нг на дорожку.

Использование высокого давления значением в 950 Бар в ходе дезинтеграции позволяет в два раза интенсифицировать процесс по сравнению с разрушением при 600 Бар и получить удельную продуктивность 5,1±0,1 мг гибридного белка Е7(16)-HSP70 из 1 г биомассы. В дальнейшем использовалась схема дезинтеграции, состоящая из 7 циклов дезинтеграции при давлении 950 Бар, как наиболее оптимальная и эффективная.

Разработанный способ дезинтеграции был масштабирован в 8 раз и апробирован в ходе разрушения биомассы штаммов-продуцентовSCR-702-Е7(6)HSP70, SCR-702-Е7(11)-HSP70, SCR-702-Е7(16)-HSP70, SCR-702-Е7(18)-HSP70 в количестве 400 г по влажному весу. Проведено по 3 серии разрушения биомассы каждого из продуцентов, удельная продуктивность на 1 г влажной биомассы при этом составила: 6,2±0,5 мг гибридного белка Е7(16)-HSP70, 16,8±1,0 мг гибридного белка Е7(18)-HSP70, 16,4±1,0 мг гибридного белка Е7(6)-HSP70, 16,0±1,0 мг гибридного белка Е7(11)-HSP70.

2.2.3. Очистка субстанции гибридных рекомбинантных белков Очистку гибридных белков E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70 и E7(18)-HSP70 проводили идентичным образом металл-хелат аффинной, ионообменной и гельфильтрующей хроматографии.

В качестве металл-хелат Металл-хелат аффинная хроматография.

аффинного сорбента использовали IMAC 6 FF (GE Healthcare).

В отфильтрованный лизат дрожжевых клеток, полученный при дезинтеграции 100 г биомассы, добавляли глицерин до конечной концентрации 10 масс. %, наносили на колонну, промывали 2 л Буфера VPH IMAC A VPH IMAC A (20 мМ Tris-HCl, 1мМ EDTA, 10 мМ GSH, 0,1 % Tween 20, pH 8,0).

Элюцию осуществляли градиентом от 0 до 60 % из буфера VPH IMAC A в буфер VPH IMAC B (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 500 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, 10 мM GSH, 1 мМ EDTA, 10 % глицерина 0.1 % полисорбат 20, pH 8.0). Начиная с оптической плотности 30 mAU (длина волны 280 нм) собирали фракцию, содержащую очищенный целевой белок.

Ионообменная хроматография. В качестве ионообменника использовали хроматографический сорбент Q HP Sepharose (GE Healthcare). Разведенный раствор целевого белка с предыдущей стадии наносят на колонну со скоростью 50 мл/мин. Далее колонну промывают 480 мл Буфера VPH QHPA (20 мМ Tris-HCl, 10 мМ GSH, 1 мМ EDTA, 0,1 % Tween 20, pH 8,0) Элюцию с колонны осуществляют градиентом из буфера VPH QHPA в буфер VPH Q HP B (20 мМ TrisHCl, 1М NaCl, 10 мМ GSH, 1 мМ EDTA, 0,1 % Tween 20, pH 8,0) от 0 до 100 % по схеме (см. таблицу 18).

Таблица 18. Схема элюции в ходе ионообменной хроматографии № точки Положение точки, мл Содержание элюирующего буфера SP-B, % Колонну регенерировали 200 мл буфера VPH Q HP B при скорости потока 50 мл/мин. Начиная с оптической плотности 30 mAU (длина волны 280 нм) собирали фракцию, содержащую очищенный целевой белок.

В качестве ионообменника использовали Концентрирование.

хроматографический сорбент Q HP Sepharose (GE Healthcare).

Колонну уравновешивали 600 мл Буфера VPH Q HP A (20 мМ Tris-HCl, 10 мМ GSH, 1мМ EDTA, 0,1 % Tween 20, pH 8,0) со скоростью потока 50 мл/мин.

Разведенный раствор целевого белка с предыдущей стадии наносили на колонну со скоростью 50 мл/мин.Элюцию с колонны осуществляли градиентом из буфера VPH Q HP A в буфер VPH Q HP B Conc (20 мМ TrisHCl, 50 мМ GSH, 1 мМ EDTA, 0,1 % Tween 20, pH 8,0) от 0 до 100 % по схеме (см. таблицу 19).

Таблица 19. Схема элюции в ходе стадии концентрирования № точки Положение точки, мл Содержание элюирующего буфера SP-B, % Колонну регенерировали 200 мл буфера VPH Q HP B Conc при скорости потока 50 мл/мин. Начиная с оптической плотности 150 mAU (длина волны 280 нм) собирали целевую фракцию, содержащую концентрат очищенного целевого белка.

Гельфильтрующая хроматография. В качестве гельфильтрационного сорбента использовали сорбент Superdex 200 (GE Healthcare).

Хроматографию проводили в несколько циклов, нанося каждый раз на колонну не более 5 мл концентрированного раствора целевого белка с предыдущей стадии. Каждый цикл очистки включал в себя следующие стадии:

уравновешивание колонны 150 мл Буфера VPH SE (25 мМ NaH2 PO4; 150 мМ NaCl; 146 мМ сахароза; 0,02 % Tween-80, pH 7.4) со скоростью потока 1.5 мл/мин;

нанесение 5 мл концентрированного раствора целевого белка на колонну со скоростью потока 1,5 мл/мин; промывку колонны 130 мл Буфера VPH SE при скорости потока 1,5 мл/мин; сбор целевой фракции с оптической плотности 100 mAU (длина волны 280 нм). Целевые фракции объединяли и фильтровали через фильтр с мембраной размером пор 0,2 мкм.

Нормирование концентрации. Операцию проводили в ламинарном шкафу. Исходя из данных полученных при анализе раствора целевого белка после очистки гельфильтрующей хроматографией, рассчитывали объем и массу буфера VPH SE (25 мМ NaH2 PO4; 150 мМ NaCl; 146 мМ Sucrose; 0,02 % Tween-80, pH 7.4), необходимого для доведения концентрации целевого белка до 1 мг/мл.

Раствор белка фильтровали через фильтр с мембраной 0,2 мкм во флакон. Через тот же фильтр фильтровали во флакон необходимую навеску буфера VPHSE.

Раствор содержащий 450-550 мг целевого белка объёмом 450 - 550 мл хранили при температуре 28 С не более 3-х суток.

Контроль полученной субстанции проводили согласно НД на субстанцию гибридного белка по показателям: подлинность методом иммуноблоттинга, прозрачность, цветность, pH потенциометрическим методом, отсутс твие видимых механических включений, чистота методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии натрия лаурилсульфата в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, присутствие остаточных белков штаммапродуцента методом иммуноферментного анализа, присутствие остаточной ДНК штамма-продуцента методом иммуноферментного анализа с использованием Threshold системы, присутствие бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛтес та, стерильность методом мембранной фильтрации, содержание общего белка методом Лоури с осаждением, содержание никеля методом атомноабсорбционной спектрометрии.

2.2.4. Изготовление готовых лекарственных форм терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки Приготовление вакцины осуществляли в ламинарном шкафу в асептических условиях при комнатной температуре.

Сорбция антигенов на адъювант. Сорбция антигенов на адъювант осуществлялась в реакторе объемом 10 л. Содержание гидроксида алюминия в вакцине составляло 0,8 мг/мл. Буфер для сорбции антигенов содержал 0,86 мг/мл NaH2PO4 · H2O, 6,71 мг/мл Na2HPO4·12H2O, 8,76 мг/мл NaCl, 50 мг/мл сахарозы, 0,005 мг/мл полисорбата 20.

Для вакцины против аногенитального кондиломатоза и РРП концентрация антигенов Е7(6)-HSP70, Е7(11)-HSP70 составляла 0,2 мг/мл и 0,2 мг/мл соответс твенно. Для вакцины против рака шейки матки концентрация антигенов Е7(16)-HSP70, Е7(18)-HSP70 составляла 0,4 мг/мл и 0,4 мг/мл соответс твенно.

К стерильному входу в реактор через стерильный шланг стерильно подсоединяли гребенку. К входным штуцерам гребенки в асептических условиях через стерильный шланг присоединяли выходы сифонов от бутылей с компонентами (буфер для сорбции антигенов, гель гидроксида алюминия, растворы белков Е7(6)-HSP70 и Е7(11)-HSP70 либо растворы белков Е7(16)HSP70 и Е7(18)-HSP70 в зависимости от вида вакцины).

К соответствующим сифонам с полуфабрикатами через резиновый шланг подключали очищенный сжатый воздух. Посредством сжатого воздуха в реактор сначала перекачивали раствор буфера для сорбции, затем расчетный объем растворов белков и необходимый объем геля гидроксида алюминия. После отсоединения фильтра Сальникова от реактора всю смесь тщательно перемешивали в течение 10-15 минут при помощи стерильного воздуха через барботер, затем инкубировали в холодильной камере в течение 2 часов при температуре (5± 3) °С.

Розлив готовой вакцинной массы по бутылям. При постоянном перемешивании стерильным воздухом через трубу передавливания препарат из реактора разливали по бутылям объемом 1 л. Бутыли с препаратом помещали в холодильную камеру на хранение при температуре (5± 3) °С.

2.2.5. Технологическая схема производства терапевтических вакцин Универсальная технологическая схема производства двух терапевтических вакцин для иммунотерапии заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 6/11 и 16/18 типов, приведена на рисунке 48.

Рисунок 48. Технологическая схема производства вакцины против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и вакцины против рака шейки матки 2.2.6. Предвалидация технологического процесса Руководящий принцип GMP говорит о том, что качество лекарственных средств закладывается на этапе фармацевтической разработке. Поэтому на звершающем этапе фармразработки необходимо провести предвалидацию всего технологияческого процесса производства продукции. Качество, заложенное на этапе фармразработки, проходит экспертизу на этапе регистрации, обеспечивается при производстве путем соблюдения правил GMP. В ходе последующей валидации на производстве создаются гарантии того, что препарат не только соответствует конечной фармакопейной статье предприятия, но и того, что он произведен в соответс твии с тем же порядком дейс твий и при тех же условиях всякий раз, когда осуществляется его выпуск.

До начала предвалидации были разработаны опытно-промышленный регламент (ОПР) на производство вакцины против рецидивирующего респираторного папилломатоза и аногенитального кондиломатоза под № 00479942-03-14 и ОПР на производство лекарственного средства на основе композиции рекомбинантных белков E7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов и белка теплового шока Mycobacterium tumerculosis для иммунотерапии и профилактики опухолевых заболеваний аногенитальной облас ти под № 00479942Приложение 9, 10), СОПы (Стандартная операционная процедура) технологических процессов, в которых подробно описаны используемое сырье, материалы, оборудование и техника проведения технологического процесса, и ТК (технологические карты) для фиксации результатов и параметров процессов.

Установочные серии процессов изготовления вакцин проводились на 3-х сериях продукта. По результатам был составлен отчет о предвалидации. Процесс изготовления вакцин был признан воспроизводимым и валидным на основании сходимости критических параметров технологических процессов и получения стандартного продукта, соответс твующего специфицированным критериям качества.

Параметры качества приготовленной вакцины контролируют согласно ФСП на вакцину (Таблица 20).

–  –  –

3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Вирус папилломы человека (ВПЧ) – это семейство Д НК вирусов, включающее в себя около 200 типов вирусов, которые обладают заметным тропизмом по отношению к тканям эпителия [190]. Несмотря на сходное строение генома, разные типы ВПЧ поражают эпителий на различных областях тела.

Основываясь на клиническом прогнозе развития заболевания, типы ВПЧ делят на «ВПЧ низкого риска» и «ВПЧ высокого риска» [45].

«ВПЧ низкого риска» или неонкогенные, к которым относятся типы 6 и 11, могут вызвать доброкачес твенные или малоопасные аномалии шейки матки, доброкачественную эпителиальную гиперплазию (возникновение аногенитальных кондилом, папиллом) и заболевание дыхательных путей – рекуррентный респираторный папилломатоз (РРП) [130].

Практически все случаи аногенитального кондиломатоза – возникновение кондилом в аногенитальной области у мужчин и женщин – связаны с инфицированием ВПЧ низкого риска. Примерно за 90% случаев этого заболевания ответственны ВПЧ 6 и 11 типа, за оставшиеся 10 % случаев – ВПЧ 42 и 54 типов. Показатель заболеваемости аногенитальным кондиломатозом в некоторых регионах России достигает 120 – 150 человек на 100 тыс. населения.

Кондиломы у детей и новорожденных часто появляются в результате заражением вирусом при прохождении через родовые пути.

Причиной заболевания РРП является вирус папилломы человека, преимущественно 6 и 11 типа [1, 8, 26, 37, 122, 221]. РРП является тяжелой патологией (рост папиллом в самом узком участке дыхательных путей приводит к выраженному стенозу гортани, вплоть до асфиксии) из-за длительности заболевания и его клинической непредсказуемости [32, 33].

«ВПЧ высокого риска» или онкогенные, к которым относятся типы 16 и 18, могут привести к неоплазии аногенитальной области, в том числе раку шейки матки, вульвы, влагалища, пениса и ануса, а также некоторым видам рака ротоглотки [95, 159, 209]. Среди последствий инфекции ВПЧ, ассоциированных с онкологическими заболеваниями, самым серьезным является рак шейки матки. В 2008 году в мире было зафиксировано более чем 500 000 случаев заболевания и 275 000 смертей, вызванных раком шейки матки [82, 159].

К настоящему времени существуют эффективные профилактические вакцины против ВПЧ высокого и низкого риска, тест-системы, выявляющие инфекцию ВПЧ и множество терапевтических средств для удаления образований, ассоциированных с инфекциями ВПЧ высокого и низкого риска. Поскольку ВПЧинфекция вызывается вирусом, то сама инфекция при терапевтическом лечении не лечится; лечение направлено на облегчение состояний, ассоциированных с инфекцией ВПЧ.

Поскольку пациент при этом остается носителем вируса, вероятность рецидива очень велика и не зависит от способа терапии. Очевидно, что рецидивы болезни связаны с неспособностью иммунитета пациента сопротивляться ВПЧинфекции.

Высокоспецифичная терапевтическая вакцина для иммунотерапии ВПЧ высокого и низкого риска, активирующая Т-клеточный иммунный ответ против антигенов ВПЧ, экспрессируемых в инфицированных клетках, позволила бы в случае инфекции ВПЧ низкого риска избежать рецидивов заболевания или снизить их число, а в случае ВПЧ высокого риска избежать поражений, ведущих к аномальным изменениям эпителиальных клеток, возникновению предракового состояния и инвазивному раку [17, 29].

Целью данной работы была разработка конкуретноспособной технологии производства двух высокоспецифичных терапевтических вакцин для иммунотерапии аногенитального кондиломатоза, РРП и иммунотерапии рака шейки матки.

Для создания терапевтической вакцины против ВПЧ в качестве антигена для стимуляции специфического иммунного ответа был выбран белок Е7, который играет ключевую роль в репликации ВПЧ и способен влиять на дифференциацию инфицированных клеток. Белок Е7 нарушает регуляцию контроля клеточного цикла, образуя стабильный неактивный комплекс с серией регулирующих клеточный цикл белков, инициирует репликацию вирусных генов и нарушает регуляцию пролиферации инфицированных клеток.

Белок Е7 является белком исключительно вирусного происхождения, постоянно присутствует в инфицированных клетках и отсутствует в неинфицированных, поэтому он является подходящей мишенью для высокоспецифичной иммунотерапии для предотвращения и лечения папилломатоза.

Иммуногеннос ть белка Е7 в составе терапевтических вакцин увеличена за счет присоединения к нему белка-носителя, который стимулирует Т-клеточный ответ, - белка теплового шока HSP70 Mycobacterium tuberculosis [171].

Для проведения доклинических и, в дальнейшем, клинических исследований необходимо было получить вакцину высокого качества. Для выполнения этой задачи разработана технология получения терапевтических вакцин, соответс твующих по всем параметрам качества ФСП.

Штаммы-продуценты гибридных белков E7-HSP70 созданы на основе штамма-реципиента S. cerevisiae D702 и экспрессионного вектора pPDX3U-Е7HSP70. Экспрессия белка репрессируется в присутствии в среде сахаров и индуцируется при их отсутствии. Несбраживаемые субстраты, такие как глицерин и этанол, не препятствуют синтезу целевого белка.

Была выбрана стратегия культивирования. Процесс культивирования был разделен на два этапа – этап накопления биомассы и этап биосинтеза. Для каждого этапа были определены оптимальные условия культивирования – состав среды, режим подачи углеродсодержащего субстрата и азотсодержащих подпиток, температура, аэрация, рН.

Поскольку производство многих белков в дрожжах определяется его стоимостью, крайне желательно было иметь инс трумент, позволяющий надежно и достаточно прос то предсказывать, и оптимизировать продуктивность, время процесса и титр продукта. Таким инструментом выбрано математическое моделирование. Оно позволило минимизировать временные и финансовые затраты на фармацевтическую разработку и производство продукта. Применяя методы вариационного исчисления, основанные на уравнениях Эйлера-Лагранжа и принципе максимума Понтрягина, была разработана математическая модель стадии биосинтеза гибридного белка E7(16)-HSP70. При этом зависимость удельной скорости образования целевого белка qp от скорости роста культуры штамма-продуцента µ описывалась уравнением, подобным уравнению Моно [143]:

= Значения удельной скорости образования целевого белка qp при соответс твующей скорости роста культуры штамма-продуцента µ были определены экспериментально. Затем с помощью метода наименьших квадратов были вычислены константы уравнения регрессии qPmax и kq.

Далее было проведено прогнозное моделирование и рассчитана оптимизированная подпитка ранее определенным лимитирующим компонентом, которая позволила поддерживать заданный оптимальный профиль удельной скорости роста культуры, обеспечила высокую объемную производительность процесса и позволила создать коммерчески рентабельную технологию [22].

Оптимизированная подпитка, рассчитанная с помощью математического моделирования, была апробирована на всех штаммах SCR-E7-HSP70.

Таким образом, для штаммов, созданных на основе штамма-реципиента S.

сerevisiae D702 и экспрессионного вектора pPDX3U-Е7-HSP70, была разработана универсальная высокоэффективная схема культивирования с использованием оптимизированной двухстадийной подпитки, которая обеспечила высокий выход целевого белка и позволила создать коммерчески рентабельную технологию, обеспечивающую получение стабильного продукта.

На основании разработанного способа культивирования подана заявка на патент РФ №2013146057 на изобретение «Способ микробиологического синтеза гибридного белка Е7(6)-HSP70 или Е7(11)-HSP70 или Е7(16)-HSP70 или Е7(18)HSP70», принято решение Роспатента о выдаче патента (приоритет от 16.10.2013).

Далее разработан процесс дезинтеграции клеток штаммов-продуцентов SCR-E7-HSP70. Выбран состав лизирующего буфера, выбрано давление дезинтеграции, оптимизирована и масштабирована схема разрушения на лабораторной установке с дополнительным охлаждающим теплообменником, позволяющая минимизировать воздействие протеаз на целевой белок и получать стабильный продукт с низкой степенью агрегации [23].

Разработаны процессы выделения и биохимической очистки гибридных белков, получения ГЛФ вакцин.

Полученные ГЛФ вакцин проанализированы, доказано соответствие полученного препарата всем параметрам качества, указанным в ФСП.

Разработана нормативная документация на производство ГЛФ, произведены 10 опытно-промышленных серий вакцины против рецидив ирующего респираторного папилломатоза и аногенитального кондиломатоза и 12 опытнопромышленных серий вакцины для иммунотерапии рака шейки матки, проведен контроль стабильнос ти трех серий каждой из вакцин.

Разработанная технология получения вакцин использована для проведения доклинических испытаний в рамках государственного контракта №

16.N08.12.1024 от 14» июня 2012 г. по теме: «Доклинические исследования отечественной терапевтической вакцины против рецидивирующего респираторного папилломатоза и аногенитального кондиломатоза, произведенной на основе клеток эукариот», а также для проведения доклинических испытаний в рамках госконтракта № 13411.1008799.13.173 от «05» августа 2013 г. по теме:

«Доклинические исследования лекарственного средства на основе композиции рекомбинантных белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов и белка теплового шока Mycobacterium tuberculosis для иммунотерапии и профилактики опухолевых заболеваний аногенитальной облас ти».

4. ВЫВОДЫ

1. Разработан универсальный способ двухстадийного культивирования, состоящий из этапов накопления биомассы и биосинтеза целевого белка, для каждого из которых определены оптимальные условия культивирования, в том числе режимы внесения питательного субстрата. Способ культивирования позволяет с использованием оптимиз ированного профиля расхода подпитки лимитирующим компонентом позволяет достичь продуктивности 740,2 ± 75,4 мг/л, 2770,6 ± 260,2 мг/л, 1600,3 ± 165,6 мг/л и 1680,5 ± 170,1 мг/л по гибридным белкам E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70, E7(6)-HSP70 и E7(11)-HSP70, соответс твенно.

2. Математическая модель стадии биосинтеза целевого белка E7(16)HSP70 путем оптимизации профиля расхода подпитки лимитирующим компонентом позволила увеличить объемную продуктивность полунепрерывных процессов культивирования штаммов-продуцентовSCR-E7(16)-HSP70, SCRE7(18)-HSP70, SCR-E7(11)-HSP70 и SCR-E7(6)-HSP70, соответственно, в 16,7 раз, в 9,4 раз, в 10,6 раза и в 10,2 раза по сравнению с периодическим процессом.

3. Разработанный эффективный способ дезинтеграции клеток штаммовпродуцентов путем 7-кратного пропускания клеточной суспензии через гомогенизатор APV 1000 при давлении 950 бар обеспечивает стабильность целевого продукта и выделение из 1 г биомассы гибридных белков E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70, E7(6)-HSP70 и E7(11)-HSP70 в количестве 6,2 ± 0,5 мг, 16,8 ± 1,0 мг, 16,4 ± 1,0 мг 16,0 ± 1,0 мг соответс твенно.

4. Разработанная технология, включающая способы культивирования, дезинтеграции и биохимической очистки целевых белков E7(16)-HSP70, E7(18)HSP70, E7(11)-HSP70 и E7(6)-HSP70 обеспечивает получение фармацевтических субстанций продуктов, соответствующих требованиям спецификации нормативного документа, в количестве 180,0 ± 17,5 мг, 692,4 ± 72,1 мг, 425,1 ± 35,3 мг, 395,0 ± 43,2 мг очищенного белка с 1 л культуральной жидкости, соответс твенно.

5. На основе полученных субстанций произведены опытные серии готовых лекарственных форм двух терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки, прошедшие контроль качества согласно ФСП.

6. Разработана документация для включения в регистрационное досье вакцин против ВПЧ - ассоциированных с заболеваний, в том числе опытнопромышленные регламенты.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Штаммы-продуценты гибридных белков E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70 были депонированы в ВКПМ (Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов) под номерами Y-3919, Y-3853, YY-4058 соответственно.

2. Разработанная технология использована в производстве ГЛФ вакцин для проведения доклинических испытаний и исследований стабильности в рамках государственных контрактов № 16.N08.12.1024 и № 13411.1008799.13.173 от Минобрнауки и Минпромторга России.

3. Разработаны и утверждены опытно-промышленные регламенты на производство вакцин, содержащие схемы и описание производственных процессов под № 00479942-03-14 и № 00479942-01-15.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать использовать созданную математическую модель для оптимизации стадии биосинтеза новых штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента S. cerevisiae D702.

2. На основании данных, полученных в ходе проведения доклинических исследований по параметрам острой и хронической токсичности, специфической токсичности (репродуктивнос ти, генотоксичности, мутагенности) рекомендовать использовать терапевтическую вакцину против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и терапевтическую вакцину против рака шейки матки для проведения клинических испытаний.

3. Обоснованные научные подходы по разработке технологии производства субстанций терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и рака шейки матки могут быть использованы при создании ветеринарных терапевтических вакцин.

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Антонив, В.Ф. Папилломатоз гортани. Роль вируса папилломы человека, перспективы диагностики и лечения / В.Ф. Антонив, А. Мицконас, Т.В. Антонив // Вестн. Оториноларингологии. — 2004. – № 3. – С. 23–26.

2. Арзамасцев, А.А. Математические модели кинетики микробиологического синтеза: возможности использования и новые подходы к разработке / А.А.

Арзамасцев, А.А. Андреев // Вес тник ТГУ. – 2000. – Т. 5. – С. 111–123.

3. Барышев, В.В. Современные аспекты изучения респираторного папилломатоза. Часть II. Лечение / В. В. Барышев, В.Г. Андреев, В. В. Попучиев // Сиб. Онкол. Журн. – 2010. – № 1 (37). – С. 68–72.

4. Баткаев, Э.А. Вирусные заболевания кожи и слизистых: учебное пособие / Э.А. Баткаев, В.Я. Кицак, И.М. Корсунская, Е.В. Липова. – М., 2001.

5. Башмакова, М.А. Папилломавирусная инфекция / М. А. Башмакова, A.M.

Савичева. – Н. Новгород : Издательство НГМА, 2002. – 20 с.

6. Беляева, Т.Л. Современные аспекты лечения остроконечных кондилом / Т.Л. Беляева, А.А. Антоньев // Вестник дерматологии и венерологии. – 1989. – №7. – С.58–60.

7. Богатырева, И.И. Клиника, диагностика и комбинированный метод лечения проявлений папилломавирусной инфекции человека на слизистых оболочках урогенитального тракта / И.И. Богатырева // Вестник дерматологии и венерологии. – 1997. – № 3. – С.70–72.

8. Богомильский, М.Р. Врожденный ювенильный респираторный папилломатоз гортани / М.Р. Богомильский, Ю.Л. Солдатский, И.В. Маслова и др.

// Вестн. Оторинолар. –1998.– №6. – С. 28.

9. Васильев, В. В. Современные аспекты папилломавирусной инфекции урогенитального тракта (клиника, диагностика, лечение) / В. В. Васильев, И.И.

Богатырева, Л.К. Котова // ЗППП. – 1999. – № 5. – С. 20–26.

10. Гужова, И.В. Шаперон Hsp70 и перспективы его использования в противоопухолевой терапии / И.В. Гужова, С.С. Новоселов, Б.А. Маргулис // Цитология. – 2005. – № З. – С. 187–199.

11. Давыдов, М.И. Статис тика злокачественных новообразований в России и в странах СНГ в 2008 г. / М.И Давыдов, Е.М. Аксель // Вестник РОНЦ им. H.H.

Блохина РАМН. – 2010. – Т.21, №2. (прил. 1). – C.160.

12. Дубенский, В.В. Клинические формы папилломавирусной инфекции и их комплексное лечение / В. В. Дубенский // Российский журнал кожных и венерических болезней. – 2003. – №1. – С. 44–50.

13. Егоров, H.A. О терапии остроконечных кондилом / H. A. Егоров, И.Б.

Щербаков // Вестник дерматологии и венерологии. – 1983. – № 5. – С. 60–61.

14. Жуков, H.A. Лечение остроконечных кондилом у мужчин / H.A. Жуков // Вестник дерматологии и венерологии. –1983. – № 9. - С. 65–66.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

Похожие работы:

«УДК: 576.315:591.465.12 КИСЕЛЁВ Артм Михайлович Состав ядерных доменов и динамика слитого белка Y14-Myc в ооцитах жука Tribolium castaneum 03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор...»

«РАХМАТУЛЛИН Рамиль Рафаилевич БИОПЛАСТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ НА ОСНОВЕ ГИДРОКОЛЛОИДА ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ И РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ХИРУРГИИ...»

«ТИТОВА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА Влияние фитопатогенных микроорганизмов на энзиматическую активность растения-хозяина Glycine max (L.) Merr. и Glycine soja Sieb. et Zucc. 03.02.08 ЭКОЛОГИЯ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., доцент Семенова Е.А. БЛАГОВЕЩЕНСК –...»

«Васильева Ольга Валерьевна Ангиогенные факторы в коже человека в возрастном аспекте 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Доктор медицинских наук профессор Гунин А.Г. Чебоксары – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1....»

«ШИГАПОВ Иршат Сайдашович ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ МАЛЫХ ОЗЕР УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (на примере города Казани) 25.00.36 Геоэкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, зав. каф. природообустройства и водопользования, зав. лабораторией оптимизации водных экосистем КФУ МИНГАЗОВА Н.М. Научный консультант: доктор...»

«ДЯТЛОВА ВАРВАРА ИВАНОВНА ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Специальность: 03.02.03 – микробиология. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«МИХАЙЛОВ РОМАН АНАТОЛЬЕВИЧ ЭКОЛОГО-ФАУНИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ СРЕДНЕЙ И НИЖНЕЙ ВОЛГИ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор И.А. Евланов Тольятти – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«ПОЛУЭКТОВА ЕКАТЕРИНА ВИКТОРОВНА ФИТОТОКСИЧЕСКИЕ МЕТАБОЛИТЫ ГРИБА PARAPHOMA SP. ВИЗР 1.46 И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Шифр и наименование специальности: 03.02.12 – микология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Берестецкий А.О. кандидат биологических наук Санкт-Петербург...»

«Сергеева Ольга Вячеславовна ВОЗДЕЙСТВИЕ ДНОУГЛУБИТЕЛЬНЫХ РАБОТ В ПОРТУ СОЧИ НА ДОННЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И СРЕДУ ИХ ОБИТАНИЯ 03.02.10 – гидробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Мария Владимировна Медянкина Москва – 2015 Оглавление ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Макрозообентос прибрежной части Черного моря, включая портовые акватории 1.2. Ихтиофауна портовых акваторий,...»

«Казарина Ольга Витальевна Научное обоснование совершенствования фониатрической помощи в Российской Федерации 14.01.03 – Болезни уха, горла и носа 14.02.03 – Общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Дайхес Н.А. доктор...»

«МИНАЕВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ ПОВЕДЕНИЕ ЛОСЯ В УСЛОВИЯХ ДОМЕСТИКАЦИИ (биотелеметрическое исследование) Специальность 03.00.08 зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 1992. -2ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. Введение........... 3 Глава 1. Материал и методика....... 7 Глава 2. Система радиоопределения Лось-2 и оптимальные методы работы с...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ВОРОБЬЕВА Ольга Вадимовна СРАВНИТЕЛЬНЫЙ И ИСТОРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕТОДИЧЕСКОГО ПРОГРЕССА В АЛЛЕРГОЛОГИИ: АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент...»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«РЫЛЬНИКОВ Валентин Андреевич ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И ПОДХОДЫ К УПРАВЛЕНИЮ ЧИСЛЕННОСТЬЮ СИНАНТРОПНЫХ ВИДОВ ГРЫЗУНОВ (на примере серой крысы Rattus norvegicus Berk.) Специальность 03.00.16 – экология Диссертация на соискание ученой степени...»

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бакиев А.Г. Тольятти – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. К...»

«МУХА (DIPTERA MUSCIDAE) КАК ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКА ДЛЯ ПТИЦ НА ВОСТОКЕ КАЗАХСТАНА 16.02.02 – кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук КОЖЕБАЕВ БОЛАТПЕК ЖАНАХМЕТОВИЧ Научный руководитель – доктор биологических наук профессор Ж.М. Исимбеков...»

«КОВАЛЕВА АННА ВАЛЕРЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ ФИТОСИРОПОВ И ФИТОЭКСТРАКТОВ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ Специальность 05.18.01 – Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.