WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломычеловека 6/11 и 16/18 типов ...»

-- [ Страница 3 ] --

При утилизации глюкозы или сахарозы культурой S. cerevisiae экономический коэффициент процесса зависит от того проходит ли в культуре брожение или дыхание. При протекании процесса брожения (т.е. при скорости роста от 0,2-0,24 ч-1 до 0,45 ч-1 ) экономический коэффициент снижается с 0,55 до 0,145 г сухой биомассы/г субстрата [123]. Брожение приводит к снижению выхода биомассы, нецелесообразному расходу субстрата и неконтролируемому росту культуры, поэтому его следует избегать или, если это невозможно, минимизировать.

Брожение является частью двухфазного процесса – аэробной ферментации.

При переносе посевного материала в среду культивирования культура штаммапродуцента утилизирует сахарозу до образования этанола, а затем, по исчерпании сахарозы (или при критических количествах этанола в среде) культура утилизирует спирт, накопленный в среде культивирования в ходе процесса брожения. Катаболизм этанола в S. cerevisiae идет по трем путям, но, в итоге, образуется ацетил-КоА, который далее поступает в цикл трикарбоновых кислот.

При катаболизме 1 молекулы глюкозы в процессе дыхания образуется 38 молекул АТФ, а в процессе аэробной ферментации – 24 молекулы АТФ (из которых 2 АТФ образуются в процессе брожения, а 22 АТФ – при катаболизме этанола). Таким образом, итоговый энергетический выход процесса аэробной ферментации, при котором глюкоза утилизируется до этанола и углекислого газа и далее этанол утилизируется до ацетил-КоА, в 1,58 раз ниже, чем выход при утилизации глюкозы в процессе дыхания.

Полностью избежать брожения нельзя, так как создать такой низкий расход подпитки по сахару в начале процесса культивирования, чтобы не инициировать при этом брожения, не представляется технически возможным. Кроме того, в процессе дыхания скорость роста культуры не может быть выше 0,2-0,24 ч-1 [123], что сильно увеличит продолжительность процесса. Процесс брожения можно только минимизировать. Его продолжительнос ть зависит от количества сбраживаемого субстрата, внесенного в начале процесса культивирования.

Протекание процесса брожения сопровождаются изменениями определенных параметров культивирования. Прежде всего, спиртовое брожение является анаэробным процессом, поэтому в ходе процесса брожения уровень растворенного кислорода в среде остается постоянным. Скорость роста культуры при протекании процесса брожения очень высока. Утилизация этанола является аэробным процессом, поэтому уровень растворенного кислорода в среде начинает снижаться, а скорость роста падать. Концентрация этанола в ходе процесса брожения возрастает, а затем падает. Таким образом, определить конец процесса брожения возможно по изменению параметров процесса культивирования.

Существует несколько режимов введения в среду культивирования углеродсодержащего субстрата на этапе накопления биомассы.

1. Периодический процесс – весь углеродсодержащий субстрат вносится в начале процесса культивирования. Культура последовательно проходит стадии брожения и аэробной ферментации, после чего этап накопления биомассы завершается.

2. Периодический процесс совместно с подпиточным – часть субстрата вносится в начале процесса культивирования. После окончания брожения начинается подпиточный процесс, в котором углеродсодержащий субстрат подается в лимитирующих количествах. При этом целью стадии брожения является накопление такого пула клеток, который бы дал возможность реализовать подпиточный процесс с контролируемой скоростью роста и стабильным дыхательным метаболизмом. В данном случае, с учетом особенностей штаммов-продуцентов E7-HSP70 и используемого оборудования, количество биомассы для перехода к подпиточному процессу должно составлять порядка 9-10 г АСВ. Это позволяет использовать для подпитки концентрированный раствор субстрата и избежать разбавления культуральной среды.

3. Подпиточный процесс – подпиточный процесс начинается с начала культивирования, субстрат подается с постоянной скоростью. При данном способе внесения углеродсодержащего субстрата культура последовательно проходит стадии брожения, аэробной ферментации и роста культуры с метаболизмом дыхания в условиях лимитированной подачи сахара. Удельная скорость роста культуры контролируется скоростью подачи сахара. В ряде источников указано, что в процессе, идущем в ферментере большого объема, удельную скорость роста культуры не рекомендуется повышать выше 0,1 ч-1 [142].

При превышении этого значения появляется риск возникновения локальных областей с повышенной концентрацией сахара и, следовательно, появление процесса брожения. Конечной целью подпиточного процесса является накопление пула клеток достаточного для начала экспрессии целевого белка.

Нами на практике исследованы все режимы внесения субстрата. Схемы процессов культивирования приведены в таблице 6, кривые роста штаммовпродуцентов в процессах с различными режимами подачи углеродсодержащего субстрата приведены на рисунке 15, а результаты процессов – в таблице 7.

Таблица 6. Различные режимы подачи углеродсодержащего субстрата Стадия процесса Параметры культивирования

–  –  –

Как показали дальнейшие исследования, стадию синтеза целевого белка целесообразно начинать при концентрации биомассы 20-30 г АСВ/л, поэтому конечные показатели эффективнос ти процессов при различных режимах сравниваются при среднем значениям АСВ 25± 6 г/л.

Как видно из таблиц 6 и 7, самый неэффективный режим – периодический процесс, когда углеродсодержащий субстрат вносится в начале процесса в высокой концентрации. При периодическом процессе невозможно достигнуть заданной концентрации биомассы, а продуктивнос ть по биомассе крайне низка.

Режим № II является наилучшим по эффективнос ти использования субстрата и одним из лучших по продуктивности. Недос татком этого режима является необходимос ть включения подпитки по исчерпанию с тартового субстрата, что требует контроля и присутствия оператора. Стадию накопления биомассы по режиму № II нельзя провести в ночное время в автоматическом режиме, что создает излишнюю нагрузку на персонал.

–  –  –

Режим № III (Таблица 7) был проведен при трех различных расходах субстрата. Наилучшим являются варианты IIIbи IIIс со скоростью внесения субстрата 1,7 и 1,6 г/(л·ч). Оба режима имеют высокий экономический коэффициент утилизации субстрата и продуктивность по биомассе и могут быть проведены в автоматическом режиме.

Режим подачи углеродсодержащего субстрата № IIIс был выбран для использования промышленной технологии.

Итоговый состав питательной среды и режим внесения углеродсодержащего субстрата для культивирования штамма SCR-702-E7(16)-HSP70.

Состав питательной среды и режим внесения углеродсодержащего субстрата, выбранные для этапа накопления биомассы процесса культивирования штаммапродуцента приведены в таблице 8.

–  –  –

Температура. В диапазоне температур 20-36 С удельная скорость роста S.

cerevisiae повышается прямо пропорционально повышению температуры. При температуре выше 36 С удельная скорость роста клетокS. cerevisiaeрезко понижается и при 40 С рост практически прекращается. При температуре 45С дрожжи погибают.

Для исследования влияния температуры на рост штамма-продуцента были проведены процессы культивирования в объеме 10 л при температурах 24 С, 28 С и 30 С. Процессы были проведены по схеме, приведенной в таблице 3 с использованием питательной среды, приведенной в таблице 8. При каждой из температур были проведены по 3 процесса. Кривые роста штамма-продуцента приведены на рисунке 33 (показаны данные для 28 С и 30 С).

–  –  –

Из рисунка 16 видно, что при росте культуры штамма-продуцента при 28 С концентрация биомассы 23-27 г АСВ/л достигается за 28-30часов роста, тогда как при росте культуры при 30С такая же концентрация достигается за 22-24 часа.

Таким образом, повышение температуры на 2С позволяет снизить продолжительность стадии накопления биомассы на 5-6 часов. Соответственно, снижаются затраты электроэнергии, охлаждающей воды и времени персонала.

Для проведения стадии накопления биомассы выбрана температура 30 С.

В процессе культивирования штамма-продуцента рН pH среды.

поддерживается равным 5,9. При закислении среды подтитровка осуществляется 12,5% раствором аммиачной воды, при защелачивании – 20 % раствором фосфорной кислоты.

Аэрация Аэрация и уровень растворенного кислорода в среде.

питательной среды обеспечивает, прежде всего, непрерывное снабжение клеток кислородом и удаление из среды углекислого газа. Косвенно, аэрация влияет на доставку к клеткам питательных веществ и поддержание клеток во взвешенном состоянии.

Кислород, поступающий в среду культивирования, постоянно тратится дрожжами в процессе дыхания. Расход кислорода происходит тем быстрее, чем больше в ней дрожжевых клеток и чем они моложе. Расход кислорода на 1 г АСВ молодых и старых клеток составляет 225-280 мг/час и 112-170 мг/час соответс твенно [215].

В реальных условиях растворимость кислорода в среде очень невелика – 7,44 мг/л при 30о C – и она снижается при росте температуры, клеточной плотности культуры и концентрации минеральных веществ в среде. Поэтому не весь внесенный с воздухом кислород будет растворяться в среде и поступать в клетки.

При постоянном потреблении кислорода дрожжами его концентрация снижается до 1,5-1 мг/л, поэтому должно идти пос тоянное насыщение кислородом питательной среды. При уменьшении концентрации кислорода в среде до 1 мг/л рост и размножение дрожжей практически останавливаются [215].

Для определения потребнос ти штамма-продуцента SCR-702-Е7(11)-HSP70 в кислороде было проведено культивирование в объеме 10 л с уровнем аэрации 1 л воздуха/мин:1 л среды (10 л/мин) и при постоянной скорости вращения мешалки 800 об/мин, в котором с помощью подпитки по глюкозе поддерживали активный рост и процесс дыхания в культуре дрожжей.

Целью этого эксперимента было наблюдение за уровнем растворенного кислорода в среде в процессе культивирования и определение возможного лимита по кислороду, который будет негативно влиять на рост клеток.

С 25 часа процесса при постоянном уровне аэрации 10 л/мин началась градиентная подпитка по углеродсодержащему субстрату, скорость которой регулировали так, чтобы в ходе культивирования поддерживать в культуре процесс дыхания. В качестве субстрата использовали глюкозу, т.к. имелась методика измерения концентрации глюкозы в культуральной жидкости в режиме “реального времени” спектрофотометрически. Основные параметры культивирования приведены в таблице 3.

Было показано, что при установке аэрации 10 л/мин и перемешивании 800 об/мин большую часть процесса аэрация является избыточной, подаваемый кислород не используется клетками и не лимитирует рост культуры, при этом даже в ходе активного роста в процессе дыхания уровень рО2 не падает ниже 40 % (Рисунок 17).

При уровне рО2 40 % культура активно растет, оптическая плотность возрастает с 70 о.е. до 130 о.е., величина АСВ – с 20 г/л до 38 г/л. В среду подается большое количес тво глюкозы и при этом поддерживается процесс дыхания, что говорит о достаточном количестве кислорода (нет эффекта Пас тера).

160 6,3

–  –  –

Рисунок 17. Изменение концентрации растворенного кислорода в среде при культивировании штамма-продуцента SCR-702-E7(11)-HSP70 в объеме 10 л, аэрации 10 л/мин при использовании глюкозной градиентной подпитки.

Для экономии электроэнергии и снижения износа компрессионной установки было принято решение в ходе всего процесса культивирования поддерживать уровень растворенного кислорода равным 40%.

–  –  –

Для проведения экспериментальных работ по моделированию процесса культивирования чрезвычайно важно иметь посевной материал стандартного качества. Это обеспечивается работой с одним мастер банком и рабочим банком с охарактеризованными свойствами и выращиванием инокулята при одних условиях культивирования на стандартной среде.

Наиболее активными ростовыми свойствами обладает инокулят, выращенный до середины логарифмической фазы. Колбы Эрленмейера емкостью 2 л были засеяны культурой рабочего банка и инкубированы в шейкере инкубаторе в течение 48 ч при температуре 28о С при перемешивании 210 об/мин.

Каждый час отбиралась проба культуральной жидкости и измерялась оптическая плотность. Результаты представлены на рисунке 18.

30 0,5 25 0,4

–  –  –

Рисунок 18. Кривая накопления биомассы и удельная скорость роста инокулята штамма-продуцента SCR-E7(16)-HSP70 На основании полученных данных была принята схема выращивания инокулята, приведенная в таблице 3.

Разработанная схема получения инокулята позволяет получать культуру со стандартными ростовыми свойствами, что в свою очередь гарантирует стабильное воспроизведение процесса культивирования.

2.2.1.5.4. Апробация оптимизированного этапа накопления биомассы Для корректного исследования и разработки этапа биосинтеза продукта необходимо обеспечить воспроизводимость и стабильность этапа накопления биомассы. Также для уменьшения временных затрат и снижения нагрузки на персонал желательно проводить стадию накопления биомассы в автоматическом режиме.

Разработанная технологическая схема стадии накопления биомассы (Таблица 3, 8) была три раза протестирована в объеме 10 л. Кривые роста штаммапродуцента SCR-702-E7(16)-HSP70 при апробации оптимизированной стадии накопления биомассы приведены на рисунке 19.

–  –  –

Рисунок 19. Кривые роста штамма-продуцента SCR-702-E7(16)-HSP70 при апробации оптимизированной стадии накопления биомассы Выходные параметры процессов приведены в таблице 9.

–  –  –

Питательная среда. Стартовый состав питательной среды, приведен в таблице 20. Добавки компонентов питательной среды на стадии биосинтеза будут обсуждаться ниже в разделе 2.2.1.6.4.

Условия культивирования.

Аэрация и концентрация растворенного кислорода рО2. В стадии биосинтеза потребности культуры в кислороде не увеличиваются, так как, как будет описано ниже, в ходе продукции целевого белка скорость роста культуры снижается, потому уровень растворенного кислорода поддерживается равным 40%, как и на стадии накопления биомассы.

Температура. Согласно уравнению Аррениуса, влияние температуры на константу скорости химической реакции может быть описано следующим образом:

, т.е. скорость химической реакции повышается с ростом температуры.

В определенных пределах эта зависимость верна и для биологических процессов. Как показано в разделе 2.2.1.5.2, повышение температуры увеличивает скорость роста культуры штамма-продуцента, следовательно, оно должно влиять и скорость образования целевого белка.

Для исследования зависимости уровня продукции белка E7(16)-HSP70 от температуры были проведены две ферментации штамма-продуцента SCR-E7(16)HSP70в объеме 10 л, в которых стадия накопления биомассы проводилась при температуре 28 о С (Таблица 3, Таблица 8), а стадия биосинтеза при – 28 о С и 32 о С. Индукция проводилась внесением глицерина до концентрации 64 г/л на 32 час культивирования.

В ходе стадии биосинтеза продукта при 32 о С после 42 – 43 часа началась деградация целевого белка и лизис клеток. На рисунке 20 приведены фотографии образцов культуральной жидкости 43 и 61 часов. На фотографии клеток 61 часа роста наблюдается большое количество темных лиз ировавшихся клеток продуцента SCR-E7(16)-HSP70, а также конгломераты клеточных обломков уже лизировавшихся ранее клеток. На фотографии же образца 43 часа роста видны только типичные жизнеспособные клетки штамма SCR-E7(16)-HSP70.

–  –  –

К 61 часу концентрация биомассы снизилась на 8 г АСВ/л, т.е. на 20 %, а концентрация целевого белка на 612 мг/л, т.е. на 72 % (Рисунок 21, Рисунок 22).

Таким образом, практически весь целевой белок к 61 часу культивирования деградировал. В процессе культивирования, стадия биосинтеза которого была проведена при более низкой температуре 28о С, такого явления не наблюдали.

Рисунок 21. Почасовой электрофорез процесса культивирования штамма-SCR-E7(16)-HSP70 со стадией биосинтеза, проведенной при температуре 32 о C MW- белковые маркеры веса, 32-61 – часы роста, ВПЧ16 – внутренний стандарт белка E7(16)HSP70 Показано, что при температуре 32 о C скорость продукции белка и уровень экспрессии очень высоки, но клетки находятся в стрессовом состоянии и потому лизируются, продукт при этом деградирует.

Рисунок 22. Сравнение кривых роста биомассы и концентрации целевого белка E7(16)-HSP70 на этапе биосинтеза при температурах 32о C и 28о C;

стрелками указан момент внесения глицерина Еще одной особенностью экспрессии белка при 32 о C, является то, что временной промежуток между индукцией (внесением глицерина) и началом экспрессии меньше, чем при экспрессии при 28 о C. На рисунке 22 приведены кривые роста концентрации биомассы и целевого продукта E7(16)-HSP70 на этапе биосинтеза, проведенной при 28 о C и 32 о C.

Временной промежуток между индукцией и экспрессией при температуре 28 о C составил 6 часов (внесение глицерина – 33 часа, начало экспрессии – 39 часов), тогда как при 32 о C – 3,8 часа (внесение глицерина – 32,2 часа, начало экспрессии

– 36 часов). Таким образом, повышение температуры на 4 градуса снижает задержку экспрессии на 37%.

Видимо, это различие объясняется опосредованной косвенной экспрессией синтеза целевого белка. Белок-активатор Gal1 должен синтезироваться, накопиться в необходимом количестве и вступить во взаимодействие с промотором Gal1, после чего и начинается экспрессия целевого белка.

Повышение температуры ускоряет эти процессы и, соответственно, ускоряет начало продукции белка.

Экспрессия при повышенной температуре позволяет сократить время процесса культивирования, но деградация продукта и лизис клеток, вероятность которых повышается при возрастании температуры, могут привести к загрязнению целевого белка его же фрагментами, которые крайне трудно подвергаются очистке. Как оптимальная температура для стабильной продукции целевых белков E7-HSP70 была выбрана температура 28 о С.

–  –  –

Альтернативные способы индукции были рассмотрены выше в разделе 2.2.1.2. Для исследования влияния способа индукции на продукцию целевого белка на практике были реализованы семь режимов культивирования (Таблица10).

Таблица 10. Культивирование с использованием различных способов индукции экспрессии белка E7(16)-HSP70 и E7(11)-HSP70 Стадия процесса Параметры культивирования

–  –  –

Индукция при исчерпании углеродсодержащего субстрата из среды (автоиндукция).

Автоиндукция, при которой синтез белка начинается по исчерпании ферментируемого сахара в среде культивирования, была реализована в режимах № 1а и 1b, т.е. в периодическом и полунепрерывном процессах, соответственно (Таблица 10).

Выход продукта в режиме 1b был крайне низким – питательных веществ не хватило на продукцию целевого белка. Электрофорез образцов культуральной жидкости на последний час культивирования (Рисунок 23) показал, что содержание целевого белка в культуральной жидкос ти в режиме 1b намного ниже, чем в режиме 1а, хотя выход биомассы в режиме 1b выше, чем в режиме 1а в 2,2 раза (Таблица 11).

Для увеличения выхода целевого белка необходимо внести в стадию биосинтеза углеродсодержащий субстрат, чтобы клеткам хватало энергии на продукцию целевого белка.

Рисунок 23. Образцы культуральной жидкости штамма SCR-E7(16)-HSP70 на последний час культивирований по режимам 1a и 1b, проанализированные методом электрофореза MW-белковые маркеры веса, 11.10.13- режим 1a, 21.02.14 – режим 1b, ВПЧ16 внутренний стандарт белка E7(16)-HSP70 Индукция при внесении в среду несбраживаемого углеродсодержащего субстрата.

Несбраживаемыми углеродсодержащими субстратами, которые не препятствуют экспрессии целевого белка являются этанол и глицерин. Этанол катаболизируется до ацетил-КоА, который далее переходит в цикл Кребса, а глицерин превращается в диоксиацетон-фосфат (Рисунок 24), который является промежуточным продуктом гликолиза. В процессе гликолиза при дальнейшем катаболизме диоксиацетонфосфата образуется 2 молекулы АТФ и 1 молекула НАД·Н. Таким образом, при использовании глицерина как углеродсодержащего субстрата гликолиз и дыхательная цепь продолжают функционировать, клетка потребляет кислород и способна к активному росту. Экономический коэффициент при росте биомассы на глицерине равен 0,58 г биомассы/г субстрата, тогда как экономический коэффициент при росте на сахарозе равен 0,5 г биомассы/г субстрата [109].

–  –  –

Индукция путем внесения в среду несбраживаемого углеродсодержащего субстрата была реализована в режимах 2а и 2b. Первый этап накопления биомассы в обоих процессах был одинаковым с внесением сахарозы в среду культивирования со скоростью 1,6 г/(л·ч) (Таблица 10).

Этап биосинтеза в режиме 2а был проведен при внесении на 24 – 35 ч культивирования порций этанола до концентрации в среде 0,3 %. Для того, чтобы избежать возможного угнетающего действия спирта и гибели культуры каждая последующая порция этанола вносилась после того, как предыдущая была полностью утилизирована, что определялось возрастанием уровня рО2. На 35 час была включена подпитка этанолом с расходом 1,65 г/(л·ч) (Таблица 10).

Подпитка этанолом была подобрана и проведена корректно. Никакого угнетения культуры штамма-продуцента не наблюдалось, культура активно росла, конечная концентрация биомассы была равна 37,2 г АСВ/л. Несмотря на это накопление целевого белка в ходе ферментации было очень незначительным (Рисунок 25). Концентрация белка в культуральной жидкости составила 46,3 мг/л, что сравнимо с выходом в периодическом процессе в режиме 1а. Таким образом, индукция путем внесения этанола не повысила выход целевого белка в сравнении с автоиндукцией.

В режиме 2b на 32 ч, при концентрации биомассы равной 26,4 г АСВ/л, в среду культивирования вносили глицерин до конечной концентрации 52 г/л. Рост культуры продолжался до 61,5 ч. Концентрация биомассы на последний час культивирования составляла 41,6 г АСВ/л.

Рисунок 25. Почасовой электрофорез процесса культивирования штамма-SCR-E7(16)-HSP70 в режиме 2a с несбраживаемым углеродсодержащим субстратом этанолом.

MW – белковые маркеры веса, 24ч-49ч – час роста, ВПЧ16 – внутренний стандарт белка E7(16)HSP70, 310114 – продуктивность в ферментации в режиме 2b.

Кривая потребления глицерина показана на рисунке 26. После внесения глицерина в среду культивирования на 32 часу роста он сразу же стал потребляться клетками, при этом поддерживалась высокая скорость роста культуры – 0,1 – 0,06 ч-1, а экономический коэффициент процесса был очень высоким – 0,76 г/г, что намного выше значения, приведенного в литературе. На 36-38 час роста начался процесс экспрессии продукта (Рисунок 27) и на 40 час культивирования удельная скорость образования продукта достигла максимального значения. Скорость рос та культуры при этом резко упала до уровня 0,03 – 0,01 ч-1, что, видимо, связано с негативным воздействием целевого белка на жизнедеятельнос ть и рост клеток.

Из-за снижения скорости роста культуры и начала продукции целевого белка на кривой потребления глицерина на 40 час произошел перелом – скорость потребления глицерина понизилась. Экономический коэффициент процесса снизился до 0,05 г/г, что намного ниже литературного значения. Это, видимо, связано с возросшей стрессовой нагрузкой на клетку из-за негативного действия экспрессируемого внутриклеточного растворимого белка, концентрация которого к этому моменту составляла 300-350 мг/л. Из-за падения скорости роста и возросших затрат на энергию поддержания упала и удельная скорость образования продукта, т.е. в данном случае мы видим случай отрицательной обратной связи, когда высокая удельная скорость образования продукта создает токсический эффект и, в результате уменьшает сама себя.

–  –  –

Если рассматривать общий баланс процесса, то в ходе этапа биосинтеза концентрация глицерина в среде снизилась на 31 г/л, а концентрация биомассы возросла на 15,6 г/л, т.е. общий экономический коэффициент равен 0,49 г /г, что соответс твует литературному значению.

Целевой белок начинает экспрессироваться на 36-37,5 час культивирования, т.е. через 4-5,5 часов после внесения глицерина (Рисунок 27). Концентрация белка на последний час культивирования составила 650 мг/л, что в 11,6 раза выше, чем при автоиндукции в периодическом культивировании и в 14,1 раза выше, чем при индукции этанолом.

Индукция при лимитированной подаче сбраживаемого углеродсодержащего субстрата.

При индукции с лимитированной подачей сбраживаемого углеродсодержащего субстрата, весь подаваемый сахар практически полностью утилизируется, и либо отсутствует в среде культивирования, либо присутствует в остаточной концентрации, которая не препятс твует продукции белка.

Этот способ индукции не удалось реализовать для штамма E7(16)-HSP70, хотя было протестировано множество режимов с различными скоростями подачи субстрата, т.к. при лимитированной подаче сахара в культуре неизбежно начинался процесс брожения.

В качестве примера, приведен режим 3а, в котором сахароза подавалась с постоянной скоростью 2,3 г/(л·ч) (Таблица 10). На протяжении всего процесса в среде измерялась концентрация углеводов и было показано их отсутствие. На 39 час при концентрации биомассы 31,7 г АСВ/л началась осцилляция значения pO2 и рост культуры остановился. Типичный график процесса приведен на рисунке28, где хорошо видны осцилляции pO2 – колебания концентрации растворенного кислорода в среде, обусловленные постоянными колебаниями культуры из режима брожения в режим аэробной ферментации.

Такая же картина наблюдалась и при других скоростях подачи субстрата.

Видимо, даже мгновенное возрастание концентрации сахара приводит к запуску Крэбтри эффекта и переводит культуру в режим брожения. Предсказать момент перетитровки вносимым субстратом заранее затруднительно, т.к. “падение” культуры в брожение происходит мгновенно, а вернуть культуру к дыхательному метаболизму невозможно ни снижением расхода субстрата, ни повышением аэрации, ни полной остановкой подпитки.

–  –  –

Рисунок 28. Колебания концентрации растворенного кислорода в среде в ходе культивирования штамма-продуцентаSCR-E7(16)-HSP70 в режиме 3a С другими штаммами-продуцентами этот способ индукции удалось успешно реализовать. Со штаммом SCR-E7(11)-HSP70 этот способ был реализован в двух режимах с постоянной и градиентной подпиткой – 3b и 3с (Таблица 10).

Концентрация целевого белка E7(11)-HSP70 на последний час культивирования составила 509 мг/л для режима 3b и 561 г/л в случае режима 3c.

Но нужно учесть, что базовая продуктивность штамма SCR-E7(11)-HSP70, определенная в периодическом процессе, в 1,8 раз превосходит базовую продуктивность штамма SCR-E7(16)-HSP70.

Ни в одном из режимов, даже при высокой скорости подачи субстрата культура SCR-E7(11)-HSP70 не переходила к метаболизму брожения. Видимо, штамм SCR-E7(16)-HSP70 имеет индивидуальные особенности метаболизма, связанные с природой белка E7(16)-HSP70, которые делают невозможным реализацию данного способа индукции.

2.2.1.6.3. Анализ протестированных способов индукции Из рисунка 29, видно, что, с точки зрения выхода биомассы, наилучшим является режим 2b с подпиткой глицерином, который позволяет накопить наибольшее количество биомассы за наименьшее время. Но, как было указано выше, параметром оптимизации для с тадии биосинтеза служит не выход биомассы, а объемная производительность процесса, которая показывает сколько продукта может быть произведено с единицы объема за единицу времени.

–  –  –

В таблице 11 приведены рассчитанные показатели протес тированных режимов стадии биосинтеза – выход целевого белка с 1 г АСВ биомассы, с 1 л культуральной жидкости и, наконец, объемная производительнос ть. Каждый из этих параметров характеризует определенный технологический аспект исследованного режима.

Выход белка с 1 г АСВ биомассы показывает, какое количество биомассы необходимо будет дезинтегрировать для выделения нужного количества целевого белка. Чем большее количество целевого белка содержится в 1 грамме АС В биомассы, тем меньшая нагрузка ляжет на стадию дезинтеграции, которая является чрезвычайно трудоемкой и повышает риск агрегации и деградации продукта.

Выход белка с 1 л культуральной жидкости определяет объем и количес тво ферментаций необходимых для получения нужного количества продукта.

И, наконец, объемная производительность показывает эффективность процесса в целом. Чем больше удельная объемная производительность процесса, тем меньше будут временные затраты и загрузка ферментационного оборудования при производстве нужного количества продукта.

–  –  –

Из таблицы 11 видно, что наилучшим по всем показателям является режим 2b – процесс с внесением глицерина. Режимы 3b и 3c также показали достаточно высокую эффективность. Нужно отметить, что режимы 3b и 3с были исследованы на штамме SCR-E7(11)-HSP70, чья базовая продуктивность, определенная в периодическом процессе, в 1,8 раз превосходит базовую продуктивность штамма SCR-E7(16)-HSP70. Провести культивирования штамма SCR-E7(16)-HSP70 в режимах 3b и 3с не удалось по причинам, описанным в п. 2.2.1.6.2.

Индукция внесением лимитированной подпитки по сахарозе не универсальна для всех 4-х штаммов-продуцентов SCR-E7-HSP70 и не может быть реализована, как минимум для одного из штаммов. Данный способ не соответс твует поставленной задаче – создать универсальный метод культивирования для всех штаммов и потому не подходит для дальнейшей оптимизации.

Для дальнейшей оптимизации был выбран режим 2b, в котором индукция синтеза целевого белка проводится внесением глицерина.

2.2.1.6.4. Оптимизация этапа биосинтеза путем математического моделирования Особенности роста культуры при индукции экспрессии целевого белка E7(16)-HSP70 глицерином.

При индукции синтеза целевого белка однократным или двукратным внесением глицерина кривая рос та культуры имеет характерную пилообразную форму (Рисунок 26). При варьировании точки индукции в пределах от 19 АСВ г/л до 32 АСВ г/л и количес тва вносимого глицерина от 33,5 г/л до 62 г/л кривая сохраняет свою характерную форму.

Этап накопления биомассы проводился стандартно (Таблица 3, Таблица 8).

Кривые в ходе процесса биосинтеза и накопления целевого белка приведены на рисунках 30А и 30Б. Почасовые электрофореграммы процессов приведены на рисунке 31. Выходные параметры процессов показаны в таблице 12.

А Б

-2 -1 0,16

–  –  –

0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 25 35 45 55 65

–  –  –

Рисунок 30. Скорость роста (А) и удельная скорость образования продукта (Б) при культивировании штамма-продуцента SCR-E7(16)-HSP70 на этапе биосинтеза при индукции в разных точках 1 – индукция при концентрации биомассы 19,4 г АСВ/л, 2 –при 26,4 г АСВ/л, 3 – при 32,2 г АСВ/л Из сопоставления рисунков 30А и 30Б видно, что синтез целевого белка иде т при резких колебаниях скорости роста культуры. Как уже обсуждалось в обзоре литературе, при синтезе многих гетерологичных рекомбинантных белков удельная скорость образования продукта qp зависит от удельной скорости роста µ или, иначе говоря, qP = f(µ) [109, 142, 143].

А

–  –  –

Рисунок 31. Почасовой электрофорез процессов культивирования при разовом внесении глицерина A - поздняя индукция при 32,2 г АСВ/л, B - cредняя индукция–при 26,4 г АСВ/л, C - ранняя индукция при концентрации биомассы 19,4 г АСВ/л Такой характер роста культуры не позволяет провести исследование зависимости qP = f(µ) и дальнейшую оптимизацию стадии биосинтеза. Кроме того, резкие колебания скорости роста могут снижать удельную скорость образования продукта qP, вследствие чего снижается общая объемная продуктивность процесса QP и увеличивается время культивирования.

Для дальнейшей оптимизации стадии биосинтеза необходимо иметь метод управления скоростью роста культуры.

–  –  –

Контроль скорости роста культуры SCR(16)-HSP70 на этапе синтеза целевого белка E7(16)-HSP70.

Один из самых простых и надежных способов контроля скорости роста культуры – введение подпитки по лимитирующему компоненту. Прежде всего, нами была предпринята попытка ввести подпитку по углеродсодержащему субстрату и индуктору – глицерину. Для реализации этого способа с помощью метода ВЭЖХ провели измерение остаточной концентрации глицерина в культуральной жидкости после однократного его внесения и определили потребление глицерина культурой (Рисунок 26). Подпитка по глицерину в ферментации 170714 была рассчитана таким образом, чтобы создать в процессе культивирования лимитирующие условия по углеродсодержащему компоненту.

Но в ходе этой ферментации обнаружилось, что скорость роста продолжае т колебаться и кривая сохранила свою пилообразную форму (Рисунок 32).

0,1 0,08 удельная скорость

–  –  –

Рисунок 32. Кривая удельной скорости роста штаммаSCR-E7(16)-HSP70 на этапе биосинтеза при лимитированной подаче глицерина Этот факт показывает, что в ходе процесса имеется некий неизвестный нам лимитирующий компонент, который и определяет скорость роста культуры. Здесь вступает в действие закон минимума Либиха или закон лимитирующего фактора, согласно которому для организма наиболее значим тот фактор, который более всего отклоняется от оптимального значения, то ес ть в культуральной среде существует лимит компонента, который не дает возможности управлять ростом культуры подачей углеродсодержащего компонента.

Определение лимитирующего компонента в процессе культивирования штамма SCR(16)-HSP70 на этапе синтеза целевого белка E7(16)-HSP70.

Для определения этого компонента была поставлена ферментация, в ходе которой после внесения глицерина поочередно с временным интервалом вносили компоненты культуральной среды, которые могли бы оказывать лимитирующее действие. Этап накопления биомассы проводился стандартно (см. Материалы и методы). В таблице 13 приведена последовательность, состав вносимых добавок и реакция культуры. На рисунке 33 показаны выходные параметры процесса культивирования.

–  –  –

Как видно из таблицы 13 и рисунка 33, при внесении в среду фосфата KH2 PO4 потребление кислорода возросло с 4,80 л/мин до 5,42 л/мин, а угол наклона кривой аэрации изменился и стал равным 45 о С по отношению к оси абсцисс. Внесение же солей редких металлов, таких как MnCl2, ZnCl2, CoCl2, СuSO4, NiSO4, Na2 MoO4, H3 BO3 К, а также FeCl3 и MgSO4 не вызывало никакой реакции, либо вызывало слабый отклик. По сравнению с ферментациями с внесением глицерина без добавок конечный выход биомассы вырос с 39 г АСВ/л до 45,7 г АСВ/л.

Рисунок 33.Изменение потребления кислорода культурой штамма SCRE7(16)-HSP70 в ходе внесения добавок Таким образом, лимитирующим компонентом в данной комплексной среде при культивировании штамма-продуцента SCR-E7(16)-HSP70 является фосфат.

Для управления скоростью роста культуры необходимо ввести подпитку по фосфату.

Контроль скорости роста культуры штамма SCR(16)-HSP70 на этапе синтеза целевого белка E7(16)-HSP70 при подпитке по лимитирующему компоненту

– фосфату.

Для проверки этого предположения была проведена ферментация с постоянной подпиткой фосфатами. В состав подпитки также были включены казаминовые кислоты, как легко доступный ис точник аминокислот, и дрожжевой экстракт. Раствор для подпитки имел следующий состав: 29 г/л KH2 PO4, 100 г/л казаминовых кислот, 100 г/л дрожжевого экстракта и подавался со скоростью 1,0г/(л·ч). В ходе ферментации скорость роста плавно снижалась, никаких резких колебаний не наблюдалось (Рисунок 36).

Рисунок 34. Удельная скорость роста и удельная продуктивность при культивировании штамма SCR-E7(16)-HSP70 с комплексной подпиткой фосфатами, дрожжевым экстрактом и казаминовыми кислотами Таким образом, с помощью подпитки фосфатами можно управлять скоростью роста культуры и, следовательно, оптимизировать стадию биосинтеза.

Исследование зависимости удельной скорости образования продукта от скорости роста культуры (qp=f(µ)) для дальнейшего математического моделирования стадии биосинтеза.

Как уже обсуждалось выше, при синтезе многих гетерологичных рекомбинантных белков удельная скорость образования продукта qp зависит от удельной скорости роста µ или, иначе говоря, qp = f(µ). Вид зависимости qp = f(µ) может быть различным. Теоретически, образование продукта может быть положительно связано с ростом (удельная скорость образования продукта увеличивается с удельной скоростью роста), быть независимым от роста или отрицательно связано с ростом (удельная скорость образования продукта уменьшается с увеличением удельной скорости роста) [109].

Положительная связь скорости образования продукта и удельной скорости роста была отмечена в ряде различных типов процессов и может рассматриваться как парадигма для продукции гетерологичного белка в дрожжах [115, 125, 143].

Отклонение от этой модели в основном наблюдается для секретируемых белков и может быть связано с ограничениями в секреции при высокой удельной скорости роста [169].

Простейшей экспериментальной системой для исследования зависимости удельной скорости образования продукта от скорости роста при синтезе секретируемых белков является непрерывное культивирование при постоянной скорости разбавления (хемостат) [143]. Удельная скорость роста культуры µ при этом равна скорости разбавления D, а =, (1) где D - степень разбавления, CP – концентрация продукта и CX - концентрация биомассы.

В случае штаммов-продуцентов SCR-E7-HSP70 метод хемостата использовать невозможно, т.к. целевой белок синтезируется внутриклеточно и оказывает большое влияние на скорость роста культуры. Синтез белка происходит быс тро – в течение нескольких часов. Уравновесить систему и стабилизировать скорость роста культуры за это время технически невозможно.

В полунепрерывном культивировании с подпиткой и в культурах с рециркуляцией биомассы, расчет qp более сложен, чем в непрерывном культивировании, так как концентрация биомассы, скорость роста и объем культуры постоянно меняются. Возможно, по этой причине, qp редко используют в качестве параметра процесса в исследованиях по полунепрерывному культивированию с подпиткой.

С другой стороны, нужно отметить, что зависимость qp от D, измеренная в непрерывных культурах, не обязательно совпадает с зависимостью qp от µ, которая наблюдается в полунепрерывном культивировании с подпиткой.

Ключевым фактором в этом отношении является то, что, в непрерывных культурах, qp измеряется в стационарном состоянии, тогда как в культивировании с подпиткой, стационарного состояния не существует (или оно является очень кратким), так как скорость роста постоянно снижается [177].

Таким образом, хотя определение зависимости µ-qp в ходе полунепрерывного культивирования с подпиткой и является более трудоемким, но, с другой стороны, оно более приближено к условиям реального ферментационного процесса.

Этап накопления биомассы проводился согласно отработанной схеме (Таблица 3, Таблица 8). Скорость роста культуры на этапе биосинтеза регулировали путем изменения скорости подачи подпитки по лимитирующему компоненту фосфату. В ходе процесса ферментации в культуральной среде измеряли концентрацию биомассы и концентрацию целевого белка E7(16)-HSP70.

При определении зависимости qp =f(µ) из расчетов исключались значения, полученные в начале процесса синтеза белка, когда культура только адаптируется к процессу экспрессии, нарабатываются необходимые ферменты и факторы. В этот период удельная скорость образования белка не зависит от удельной скорости роста культуры, а определяется неизвестными нам параметрами внутриклеточного катаболизм.

В ходе накопления целевого белка, когда концентрация белка превышае т 15,5 мг/г АСВ, экспрессируемый рекомбинантный белок сам начинает влиять на скорость роста культуры. Гетерологичный белок оказывает токсическое действие или повышает нагрузку на клетку, в результате чего рост культуры тормозится.

Удельная скорость образования белка реагирует на падение скорости роста с запаздыванием и в этот промежуток времени удельная скорость образования продукта определяется не скоростью роста культуры, а внутриклеточными процессами.

Мы исследовали диапазон скорости роста культуры 0,02-0,09 ч-1. Большей скорости роста на этапе экспрессии достигнуть не удалось, что, скорее всего,

–  –  –

Р=Р2 – Р1, – прирост продукта за временной интервал [t1 ;t2 ], где Р2 и Р1 – количество продукта в момент времени t2 и t1, соответс твенно;

= – среднее количество биомассы во временном интервале [t1 ;t2 ];

= – средняя удельная скорость роста во временном интервале [t1 ;t2 ];

2. Удельная скорость роста рассчитывается согласно уравнению =, (3)

–  –  –

Зависимость экспериментальных значений qP от µ показана на рисунке 35. В расчете использовались значения, удовлетворяющие граничным условиям, описанным ниже.

С помощью метода наименьших квадратов в программе Grapher (Версия 2.5, Apple Inc.) были вычислены константы этого уравнения - = 5,2542 мг/(г АСВ· ч) и = 0,0382 ч-1.

Погрешнос ть аппроксимации составляет 11,9 %. Фактическое значение Fкритерия Фишера равно 35,10, тогда как табличное значение при уровне значимости 0,05 и степенях свободы k1=1 и k2=12 равно 4,75. Фактическое значение F-критерия Фишера больше табличного значения, потому уравнение регрессии является статистически значимым методом дисперсионного анализа по критерию Фишера было показано, что уравнение является статистически значимым. Коэффициент детерминации составил 0,72.

Подробные расчеты и исследование регрессионной модели приведены в Приложении 5.

Рисунок 35. Экспериментальные значения удельной скорости образования продукта E7(16)-HSP70 в диапазоне значений скорости роста от 0,02 до 0,09 чи кривая аппроксимации, полученная методом наименьших квадратов

–  –  –

где константы уравнения – энергия поддержания ms и истинный экономический коэффициент YXS.

Из литературы [58] "истинный" экономический коэффициент утилизации фосфата YXS= 54,348 г биомассы/г фосфата, энергия поддержания при утилизации фосфата ms =0,0004 ч-1.

Основной параметр оптимизации процесса культивирования штамма SCRE7(16)-HSP70.

В качестве основного параметра математического моделирования выступает главный параметр оптимизации процесса. На первый взгляд, оптимизация процесса должна означать увеличение удельной скорости образования продукта. Тем не менее, наиболее важным параметром для оценки промышленного процесса является не удельная скорость образования продукта, а производительность на единицу объема ферментера и времени (определяющая расходы по использованию ферментационного оборудования), а также финальный титр продукта в качестве основного параметра для начальных стадий очистки.

Объемная производительность (или выход на единицу объема и времени) вычисляется путем деления общего продукта на фактический объем и время культивирования и может быть определена, как наивысший титр продукции, достигаемый за наименьшее время.

Q= (7) Стадия биосинтеза должна пройти с максимальной объемной продуктивностью целевого белка Qp и, соответственно, Qp является основным параметром оптимизации и математического моделирования стадии биосинтеза.

В работе [143] было показано, что прогнозное моделирование процессов с подпиткой позволяет оптимизировать процесс по объемной производительности и титру продукции.

Величина Qp определяется величиной удельной скорости роста µ и величиной удельной скорости образования продукта qP, которая, в свою очередь, также зависит от µ.

Q = g q, (8)

Таким образом, параметр является основной переменной при µ оптимизации стадии биосинтеза.

По существу, максимизация объемной производительности требует первоначальной фазы накопления биомассы с максимальной удельной скоростью роста, за которой следует фаза биосинтеза с непрерывным снижением скорости роста. Условия и режим культивирования стадии биосинтеза должны быть направлены на поддержание необходимого профиля удельной скорости роста µ, которая обеспечивает максимальную объемную продуктивнос ть целевого белка Qp.

Моделирование оптимального профиля удельной скорости роста культуры SCR-E7(16)-HSP70 в ходе биосинтеза белка E7(16)-HSP70.

При математическом моделировании необходимо учитывать особеннос ти штамма-продуцента, которые устанавливают граничные условия моделирования.

Прежде всего, нужно оговориться, что при внесении глицерина в среду культивирования происходит перестроение культуры с утилизации сахарозы на утилизацию глицерина. Этот процесс сопровождается резким падением скорости роста культуры, а затем ее восстановлением и продолжается около 3,5 ч (с 22,5-23 ч по 26-26,5 ч). Избежать этого этапа или сократить его невозможно, так как он связан со сложными внутриклеточными процессами.

Таким образом, после внесения глицерина в течение 3,5 часов идет процесс перестройки культуры на новый углеродсодержащий субстрат, и контролировать скорость роста на этом этапе невозможно. После адаптации культуры и подъема скорости роста до уровня 0,08 ч-1 уже возможно контролировать скорость роста меняя расход подпитки по лимитирующему компоненту.

Во-вторых, экспрессионная система штамма-продуцента E7(16)-HSP70 имеет особеннос ть, что между индукцией и началом экспрессии имеется временной промежуток. В зависимости от условий культивирования – температуры (см. раздел 2.2.1.6.1), скорости роста, способа индукции – он может составлять от 3,8 до 10 часов.

Как было показано экспериментально, при температуре культивирования 28 о С без подпитки фосфатами этот временной промежуток составляет 7 часов, а при подпитке фосфатами – 6 часов. При внесении глицерина на 22,5-23 часу культивирования экспрессия целевого белка начинается на 28-29 часу.

Потому удержать скорость роста, равной 0,08 ч-1, возможно только до 30часа культивирования, после чего скорость роста начинает падать в результате активного процесса экспрессии белка и возросшей нагрузки на клетку.

Повышение концентрации целевого белка выше 15,5 мг/г АСВ приводит к неконтролируемому торможению скорости роста культуры из-за негативного действия целевого белка на клетку и, далее, к падению удельной скорости образования продукта.

Таким образом, граничными условиями нашей модели, обусловленными особенностями роста штамма-продуцента, являются

1) начало подпитки по глицерину в момент времени t0 =0;

2) неконтролируемое падение скорости роста и ее подъем до величины 0,08 ч-1с t0 по t=3,5 час;

3) экспоненциальная стадия роста со скоростью 0,08 ч-1 с t=3,5 час по t=7,5 час и постепенное снижение скорости роста с t=7,5 часа;

4) неконтролируемое падение скорости роста и удельной скорости образования белка из-за токсического воздействия целевого белка на клетку при концентрации целевого белка 15,5 мг/г АСВ.

Для решения нашей оптимизационной задачи мы воспользуемся методом вариационного исчисления. В результате мы получим аналитическое уравнение с неопределенными параметрами, которое описывает оптимальную кривую скорости роста.

–  –  –

где qP – удельная скорость образования, которая и зависит от удельной скорости роста µ согласно уравнению подобному уравнению Моно [156]:

= (11) и начальное значение P(0) = P0.

Прежде всего, мы максимизируем интегральный (общий) выход продукта в фиксированном временном интервале [0, T]. 1/Т P(T) Max эквивалентно P(T) Max.

Следовательно, из формул (10) и (11) мы можем вывести:

= = (12)

–  –  –

2 = (19) 2 = (20) 2 = + (21) интеграл можно преобразовать следующим образом:

= + (22)

–  –  –

Уравнение (24) определяет только необходимые условия оптимальной траектории µ в ходе процесса с неопределенным параметром с и неопределенным оптимальным значением общего времени подпитки Т. Здесь параметр с и оптимальное значение общего периода подпитки Т зависят от граничных условий.

Нами были установлены начальные граничные условия – µ=0,08 ч-1 в момент времени t=7,5 часа.

Так как мы знаем числовое значение k q, вычисленное с помощью метода наименьших квадратов, то мы можем вычислить значение параметра с, подставляя в аналитическое уравнение значения граничных условий иk q =0,01. Мы получили числовое значение параметра с = - 6,921.

Из последнего уравнения определяем оптимальную траекторию удельной скорости µ в каждый момент времени t (Рисунок 36). Подробный расчет параметра с и оптимальной траектории µприведен в Приложении 6.

0,10

–  –  –



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Похожие работы:

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«ХОАНГ ЗИЕУ ЛИНЬ ЭКОЛОГИЗАЦИЯ ЗАЩИТЫ КАПУСТНЫХ КУЛЬТУР ОТ ОСНОВНЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ ВРЕДИТЕЛЕЙ В УСЛОВИЯХ МОСКОВСКОГО РЕГИОНА Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попова Татьяна Алексеевна, кандидат биологических наук, доцент...»

«ЕГОРОВА Ангелина Иннокентьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У МУЖЧИН КОРЕННОЙ И НЕКОРЕННОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ ЯКУТИИ В РАЗНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Д.К....»

«ТОМОШЕВИЧ Мария Анатольевна ФОРМИРОВАНИЕ ПАТОКОМПЛЕКСОВ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» 03.02.08 – «Экология» Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: д.б.н., академик РАН Коропачинский И.Ю. Новосибирск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ: ВВЕДЕНИЕ.. 4 ГЛАВА 1. АНАЛИЗ...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Шумилова Анна Алексеевна ПОТЕНЦИАЛ БИОРАЗРУШАЕМЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В КАЧЕСТВЕ КОСТНОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Шишацкая Екатерина Игоревна Красноярск...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«» Ткаченко Лия Викторовна Морфо – функциональная характеристика лимфатической системы легких и их регионарных лимфатических узлов кроликов в норме и эксперименте 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, онкология, патология и морфология животных Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук...»

«Шершнева Анна Михайловна ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ: ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА, ПРИМЕНЕНИЕ Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Шишацкая Екатерина Игоревна...»

«Калинка Ольга Петровна ОЦЕНКА УЯЗВИМОСТИ АКВАТОРИИ КОЛЬСКОГО ЗАЛИВА И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЕГО БЕРЕГОВ ПРИ РАЗЛИВАХ НЕФТИ Специальность 25.00.28 – Океанология диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель кандидат технических наук Шавыкин Анатолий Александрович Мурманск, 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1....»

«ПЛОТНИКОВ ВАДИМ АЛЕКСЕЕВИЧ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ПТИЦ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 03.02.02 вирусология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководительдоктор биологических наук, профессор Алипер Т. И. Москва-20 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Шубенков Александр Николаевич Эффекты модифицированных наночастиц кремния на культивируемые иммунокомпетентные и мезенхимальные стромальные клетки человека 03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор...»

«ГОЛОЩАПОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА МИКРОЦИРКУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АПИПРОДУКТА ИЗ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО РЕЖИМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Специальность 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ЗАУЗОЛКОВА Наталья Андреевна АГАРИКОИДНЫЕ И ГАСТЕРОИДНЫЕ БАЗИДИОМИЦЕТЫ ЛЕСОСТЕПНЫХ СООБЩЕСТВ МИНУСИНСКИХ КОТЛОВИН 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – кандидат биологических наук, И. А. Горбунова Абакан – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ... ГЛАВА 1....»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«Толмачева Алла Викторовна УДК 633.34:551.АГРОКЛИМАТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА УСЛОВИЙ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ СОИ В УКРАИНЕ 11.00.09 – метеорология, климатология, агрометеорология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: Полевой Анатолий Николаевич, доктор географических наук, профессор Одесса – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ РАЗДЕЛ І. БИОЛОГИЧЕСКИЕ...»

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бакиев А.Г. Тольятти – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. К...»

«Алексеев Иван Викторович РАЗВИТИЕ КОМПЛЕКСНОГО ИНЖЕНЕРНО-ГЕОЛОГИЧЕСКОГО И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА НА ЯКОВЛЕВСКОМ РУДНИКЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ВЕДЕНИЯ ОЧИСТНЫХ РАБОТ ПОД НЕОСУШЕННЫМИ ВОДОНОСНЫМИ ГОРИЗОНТАМИ Специальность 25.00.08 – Инженерная геология,...»

«УДК 591.15:575.17-576.3 БЛЕХМАН Алла Вениаминовна ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННАЯ И ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ШИРОКОАРЕАЛЬНОГО ВИДА HARMONIA AXYRIDIS PALL. ПО КОМПЛЕКСУ ПОЛИМОРФНЫХ ПРИЗНАКОВ 03.00.15 генетика Диссертация на соискание ученой степени V кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук,...»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.