WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломычеловека 6/11 и 16/18 типов ...»

-- [ Страница 2 ] --

1.6.6. Физиологические и технологические аспекты культивирования генетически-модифицированных штаммов S. cerevisiae для получения рекомбинантных белков в полупромышленном и промышленном масштабе Методы культивирования. Для производства рекомбинантных белков в дрожжах существуют три метода культивирования: периодическое культивирование (батч), полунепрерывное культивирование с подпиткой (федбатч) и непрерывное культивирование.

Для того чтобы быть коммерчески жизнеспособным, любой метод культивирования должен соответс твовать ряду критериев. Они включают в себя высокую объемную продуктивность, высокую конечную концентрацию продукта, стабильность и воспроизводимость процесса и возможность использования дешевых, хорошо растворимых субстратов. Правовые ограничения, например, связанные с применением методов рекомбинантной Д НК, также являются важным фактором.

Несмотря на все плюсы периодического культивирования в лабораторных условиях, для крупномасштабного производства оно не подходит. Высокая начальная концентрация сахаров вызывает катаболитную репрессию, а у S.

cerevisiae, даже в присутствии кислорода запускает спиртовое брожение (Крэбтри-эффект) [84, 198]. Таким образом, использование сахара в периодическом процессе вызывает спиртовое брожение, что в результате приводит к снижению выхода биомассы и сопутствующему снижению выхода продукта. Кроме того, в периодическом культивировании невозможно контролировать скорость роста культуры.

В ходе полунепрерывного культивирования с подпиткой и непрерывного культивирования скоростью роста можно управлять, контролируя добавление субстрата. Таким образом, можно избежать образования побочных продуктов и катаболитной репрессии, а потребление кислорода и выделение тепламожно адаптировать к ограничениям, которые налагаются конструктивными особенностями реактора.

Непрерывные процессы применяются не часто. Причины этого различны:

генетическая нестабильность может привести к потере продуктивнос ти, повышенный риск контаминации и, что особенно касается биофармацевтической промышленности, нет четкого нормативного определения понятий «серия» и «время жизни процесса» в отношении непрерывного культивирования. Однако многие рекомбинантные экспрессионные системы чрезвычайно стабильны, например, когда гетерологичный ген встроен в геном хозяина или, когда используются плазмиды со стабилизирующими последовательностям [98]. В ряде работ были показаны многообещающие результаты при непрерывном культивировании S. cerevisiae [98, 159] и P.pastoris [67].

Примеров использования непрерывного культивирования в промышленности немного, и они включают в себя производство глюкозоизомеразы [75], производство пива [116] и некоторых молочных продуктов [131]. Для этих процессов характерны высокие скорости разбавления, что приводит к высокой объемной производительности. Однако ограничения по переносу кислорода и охлаждающей способности реактора лимитируют плотность клеток, которая может быть достигнута при высокой скорости разбавления. Таким образом, преимущества по отношению к общей продуктивности не так и велики, как часто предполагают [108]. При длительном культивировании штамма-продуцента с минимальной генетической нестабильностью накопление клеток с меньшей продуктивностью или с отсутствием продуктивности может привести к снижению выхода рекомбинантного белка. Длительное поддержание асептических условий также является трудоемким процессом, например, в случае замены неисправного оборудования. Эти соображения приводят к тому, что полунепрерывное культивирование с подпиткой является предпочтительным способом для крупномасштабного производства рекомбинантных белков в дрожжевых штаммах.

Хотя, в принципе, в ходе полунепрерывного культивирования с подпиткой все необходимые питательные вещества можно добавлять непрерывно, на практике подпитку, главным образом, ограничивают небольшим количеством компонентов, в частности, источником углерода [52]. Теория полунепрерывного культивирования с подпиткой и его преимущества для производства биомассы и микробных продуктов были тщательно проанализированы в ряде обзоров [164, 217]. После периодической фазы культивирования концентрированная подпитка, содержащая источник углерода и других питательных веществ, непрерывно подается в реактор. Скорость подачи подпитки является ключевым параметром управления культивированием, определяет скорость роста культуры, связанное с ним потребление кислорода и выделение тепла. В зависимости от масштаба процесса скорость подачи (и, соответс твенно, скорость роста культуры) может ограничиваться либо переносом кислорода в культуру, либо теплопередачей от культуры (охлаждение). Расход подпитки, необходимый для предотвращения лимита по кислороду, может быть рассчитан или контролироваться обратной отрицательной связью.

В системах управления с обратной связью для S. cerevisiae появление спиртового брожения может быть использовано в качестве индикатора кислородного лимита или избытка сахара. Например, в производстве проурокиназы в S. cerevisiae скорость подачи подпитки регулировали путем поддержания соотношения количества продуцируемой двуокиси углерода к потреблению кислорода (RQ) ниже критического значения, апри производстве FL-галактозидазыиспользовали контроль с обратной связью, соединенный с измерением этанола в выходящих газах [169, 170].

Из-за ограниченной массопередачи кислорода и/или теплообмена, связанных с конструктивными особеннос тями реактора, экспоненциальный рост культуры не может быть длительным. Таким образом, снижение скорости роста является характерной чертой всех крупномасштабных процессов с подпиткой [42, 187, 196].

Масштаб производства. Промышленное производство рекомбинантных белков в дрожжах направлено на два рыночных сектора: фармацевтические белки и промышленные ферменты. Логарифмическая зависимость между годовым размером рынка и ценой белков была показана в литературе [46, 102]. На основе размера рынка и цены, рекомбинантные белки можно разделить на три класса [165]. Массовые белки обычно стоят $ 5-100/кг и имеют годовой рынок 105 -107 кг.

Специализированные белки имеют более высокую стоимость ($ 100/кг) и ежегодный рынок 103 -105 кг. Самый дорогой класс (обычно $ 1000/кг) – это медицинские и аналитические белки с годовым размером рынка 1-103 кг. Размер рынка является ключевым фактором, определяющим промышленный масштаб производства рекомбинантного белка. В общем, белки высокой стоимости производятся в реакторах объемом 0,1-5 м3, белки средней стоимости – 1-50 м3 и белки массового спроса – 100 м3 или более.

Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), производимый в дрожжах, можно привести как пример ферментации, необходимой для производства рекомбинантного белка массового потребления. ЧСА применяется при лечении шока, ожогов и потери крови. Его ориентировочный годовой рынок 3105 кг по цене около 2000 $ за кг [87]. Если положить, что концентрация продукта в культуральной жидкости равна 2,5 кг/м3 и игнорировать потери продукта при выделении и очистке, то для удовлетворения годового мирового спроса необходимы 1200 ферментацийобъемом 100 м3. Однако, масштабирование культивирования на промышленный ферментер подобного объема является трудной задачей, при решении которой необходимо учитывать ряд факторов, которые будут обсуждены ниже.

Удельная скорость образования продукта в дрожжах. При исследовании штаммов-продуцентов в колбах об уровне производства гетерологичного белка в дрожжах, как правило, судят по концентрации продукта в культуральной жидкости в момент окончания процесса культивирования. При этом обычно связывают концентрацию продукта с концентрацией биомассы, присутствующей на момент окончания роста.

Однако если промежуток времени, в течение которого происходило образование продукта не известен, такие данные могут, в лучшем случае, дать приблизительную оценку удельной скорости образования продукта.

Такой параметр, как объемная производительность штамма-продуцента, также нелегко использовать для сравнения различных систем экспрессии, так как, в зависимости от состава среды и других параметров роста, концентрации биомассы могут отличаться на целых два порядка.

В таблице 2 приведены данные по удельным скоростям образования продукта qp для ряда рекомбинантных белков в дрожжах при определенныхусловиях роста. Простейшей экспериментальной системой для определения qp является непрерывное культивирование при пос тоянной скорости

–  –  –

Тем не менее, тот факт, что удельные скорости образования продукта варьируются на порядок для процесса с подпиткой и хемостата показывает, что в случае некоторых продуктов, есть значительные возможности для улучшения процесса и повышения удельной скорости образования продукта. Даже в тех случаях, когда штамм-реципиент и система экспрессии идентичны, как и в случае пертактина и C фрагмента столбнячного токсина, производимых в P. pastoris (Таблица 2), были обнаружены различные qp.

Эти различия, скорее всего, связаны с особенностями, присущими конкретному гетерологичному белку (стабильнос ть, токсичность и т.д.) или кодирующей их ДНК или РНК последовательнос тей (частота встречаемости кодонов, вторичные структуры и т.д.). Пока молекулярные механизмы, ответственные за такие различия не полностью известны и поняты, скрининг реципиентов и векторов экспрессии останется важным шагом в разработке коммерческих процессов производства гетерологического белка.

1.6.7. Влияние физиологических параметров напродукцию рекомбинантного белка Чаще всего промышленный процесс Образование метаболитов.

полунепрерывного культивирования с подпиткой, направленный на производство рекомбинантных белков ведется в аэробных и лимитированных по сахарам условиях. Тем не менее, при культивировании дрожжей в большом объеме при высоких плотнос тях биомассы практически невозможно избежать локальных градиентов в концентрации сахара и кислорода. Они могут иметь огромное влияние на возникновение спиртового брожения. Энергетическая эффективность спиртового брожения гораздо ниже, чем аэробного метаболизма сахара, что оказывает негативное влияние на выход биомассы и рекомбинантного белка.

Как было уже указано выше, дрожжи делятся на две группы, в зависимости от их склонности к спиртовому брожению при аэробных условиях. Так называемые Крэбтри-положительные дрожжи осуществляют спиртовое брожение в аэробных условиях при высокой скорости подачи сахара и нелимитированной скорости роста [71, 160, 201]. У S. cerevisiae это ферментативный ответ происходит при концентрациях глюкозы 0,15 г/л [204]. У Крэбтри-отрицательных дрожжей образование этанола в аэробных условиях не происходит. Однако и они быстро индуцируют спиртовое брожение при лимите кислорода.

С другой стороны, существует зависимость между удельной скоростью роста культуры дрожжей и их склонностью к спиртовому брожению. В 1969 году Х.

Каспар Вон Мейнбург провел исследования роста культур дрожжей в условиях непрерывного культивирования, варьируя скорость разбавления (которая в условия непрерывного культивирования равна удельной скорости роста) от 0 до 0,45 ч-1. Он показал, что рост S. сerevisiae в непрерывной культуре при скорости ч-1 разбавления в диапазоне 0,0-0,24 отличается чисто дыхательным метаболизмом (RQ = 1,0), а при увеличении скорости разбавления от 0,24 до 0,45 ч-1 катаболизм глюкозы идет по типу брожения [123].

Продукция этанола почти всегда сопровождается выделением других метаболитов, в том числе слабых органических кислот [168]. Поскольку дрожжи обычно культивируют при кислых значениях рН, слабые органические кислоты, проходя через плазматическую мембрану, ослабляют трансмембранный градиент рН [43, 203]. Для того, чтобы поддерживать внутриклеточный рН почти нейтральным, протоны должны выводиться из клетки комплексом АТФаз плазматической мембраны. АТФ, необходимое для осуществления этого процесса, обеспечивается диссимиляцией глюкозы, тем самым, снижая выход биомассы и рекомбинантного белка [203].

С появлением методов непрерывного Энергия поддержания.

культивирования микроорганизмов, стало ясно, что экономический коэффициент YXS при росте в условиях лимитированной подачи субстрата не является постоянной величиной и зависит от удельной скорости роста µ.

В соответс твии с концепцией энергии поддержания [163, 188], часть метаболической энергии, образующейся при катаболизме, не используется непосредственно для формирования биомассы. Вместо этого, эта, так называемая энергия поддержания, используется для различных процессов, не связанных с ростом, таких как поддержание рН, гомеостаза, кругооборот макромолекул.

В наиболее часто используемой модели для описания физиологии энергии поддержания, предполагается, что коэффициент энергии поддержания не зависит от скорости роста. Исходя из этого предположения, выход биомассы при росте на субстрате S может быть описан уравнением = +, в котором Y' XS является наблюдаемым экономическим коэффициентом, YXS – «истинным» экономическим коэффициентом с поправкой на энергию поддержания, µ - удельная скорость роста и ms – коэффициент энергии поддержания (кг субстрата/ ( кг биомассы)-1· ч-1 ).

Высокая энергия поддержания увеличивает расходы на рост биомассы и образование продукта [72, 187, 202] и, следовательно, не желательна при производстве рекомбинантного белка.

Чтобы проиллюстрировать эффект, который оказывает увеличение энергии поддержания на крупномасштабное производство рекомбинантных белков в дрожжах, в работе [109] ввели значения разных mS в процесс, смоделированный с помощью компьютерной программы. Моделирование показало, что при увеличении значения mSс 0,024 до 0,040 прогнозируемая продукция белка снизилась на 16,5%.

На энергию поддержания дрожжей сильно влияют параметры окружающей среды, в том числе температура, рН, состав среды и наличие метаболитов [204].

Величина энергии поддержания является ключевым фактором в выборе организма-хозяина и условий роста для производства рекомбинантного белка.

Часто при Влияние скорости роста на образование продукта.

моделировании процессов культивирования предполагают, что удельная скорость образования продукта qp не зависит от удельной скорости роста культуры µ.

Однако это предположение не совсем верно. На самом деле, уровень продуктивности многих гомологичных белков меняется в зависимости от µ (Рисунок 4) или qp =f(µ). Поскольку постоянное понижение скорости роста культуры является общей чертой всех процессов с подпиткой, то взаимосвязь между µ и qp имеет ключевое значение.

Экспрессия многих генов регулируется в первую очередь на уровне транскрипции. Когда экспрессия гетерологичного белка регулируется гомологичным промотором, информация о свойствах промотора и экспрессии может быть получена при изучении регулирования гомологичного гена под контролем этого промотора.

–  –  –

Но такие исследования могут быть полезны только в том случае, когда экспрессионный вектор присутс твует в клетке в малом числе копий. В ситуации большого числа копий на клетку, появляются другие факторы – иные, чем инициация транскрипции – которые могут ограничить скорость экспрессии и определить вид зависимости qp =f(µ).

Нужно отметить, что кривая зависимости qp от D, измеренная в непрерывных культурах, не обязательно совпадает с зависимостью qp от µ, которая наблюдается в полунепрерывном культивировании с подпиткой. Ключевым фактором в этом отношении является то, что, в непрерывных культурах, qp измеряется в стационарном состоянии, тогда как в культивировании с подпиткой, стационарного состояния не существует (или оно является очень кратким), так как скорость роста постоянно снижается. Степень, в которой µ-qp в двух системах сопоставимы, зависит от времени релаксации системы регуляции экспрессии гетерологичного гена [177].

Могут быть предложены четыре модели отношений между µ и qp (Рисунок 5 [193]).

Рисунок 5. Теоретические взаимоотношения между удельной скоростью роста µ и удельной скоростью образования продукта qp[205] А.

Продукция рекомбинантного белка репрессирует рост культуры или увеличивает нагрузку на клетку, повышая величину энергии поддержания.

В. Продукция белка ассоциирована с ростом культуры.

С. Продукция белка имеет кинетику насыщения.

D. Продукция белка не ассоциирована с ростом культуры.

В связи с тем, что в культивировании с подпиткой происходит пос тоянное уменьшение скорости роста и возрастание концентрации биомассы, крайне желательна высокая q p при низкой удельной скорости роста. На практике же чаще наблюдаются продукция белка, ассоциированная с ростом, или продукция с кинетикой насыщения (Рисунок 4).

Знание зависимости между µ и qp позволяет вычислить оптимальный профиль скорости роста в промышленном процессе с подпиткой [72, 107] и, соответс твенно, добиться максимальной объемной продуктивности процесса. Но, нужно учитывать, что на общую продуктивнос ть влияет не только скорость формирования белка qp, но и концентрация биомассы. Максимальная объемная продуктивность не обязательно получается при той скорости роста, при которой qp максимальна [72].

1.6.8. Применение математического моделирования для оптимизации биосинтеза рекомбининтных белков в полунепрерывном культивировании с подпиткой Моделирование биопроцессов с целью рациональной оптимизации применяется с 1970-х годов. Математическое описание процессов роста и образования продукта осуществлено в достаточной степени, однако планирование биотехнологических процессов производства все еще не является установившейся практикой. В особенности трудным случаем являются непрерывные процессы или полунепрерывные процессы с подпиткой, поскольку такие динамические системы обычно не достигают установившегося состояния. Основные попытки моделирования для полунепрерывного процесса культивирования с подпиткой описаны в обзоре [182]. Основываясь на принципах моделирования, были предприняты попытки оптимизации полунепрерывных процессов с подпиткой, с использованием принципа максимума Понтрягина [147, 220], теоремы Грина [155] или динамического программирования.

Эти подходы довольно сложны и не находят применения в рутинной производственной практике. Поскольку рентабельнос тьпроизводства многих рекомбинантных белков в дрожжевых штаммах-продуцентах определяется стоимостью и эффективностью процесса культивирования, крайне желательно иметь инструмент, позволяющий надежно и достаточно просто предсказывать продуктивность, время процесса и титр продукта.

Описаны подходы для оптимизации полунепрерывных процессов культивирования с подпиткой метилотрофных дрожжей P.pastoris [125, 193].

Применение динамического программирования путем деления процесса на дискретное число интервалов обладает существенным недостатком – при таком подходе время процесса фиксируется и не является параметром оптимизации.

Математическомуописанию процессов выращивания микроорганизмови биосинтеза секретируемых гетерологичных белков посвящено большое количество исследований [2, 16, 125, 155, 220]. Между тем работ, посвященных математическому описанию процессов биосинтеза внутриклеточных продуктов в дрожжевых продуцентах, обнаружить не удалось. В этом случае накопление продукта в клетке начинает влиять на параметры роста штамма-продуцента, по этой причине исследование роста таких культур в хемостате не предс тавляется возможным. Следовательно, для каждого из штаммов, продуцирующих рекомбинантный белок внутриклеточно, необходима разработка собственной математической модели. Данные для моделирования могут быть получены в ходе экспериментов по полунепрерывному культивированию с подпиткой.

1.6.9. Заключение

К настоящему времени накоплен большой объем данных о процессах культивирования дрожжевых штаммов-продуцентов. В литературе существует множество материалов о моделировании ферментационных процессов дрожжевых штаммов. Это позволило создать алгоритм разработки процесса культивирования штамма-продуцента S. cerevisiae SCR-E7-HSP70.

Общая стратегия процесса культивирования штамма-продуцента определяется физиологическими особенностями штамма, параметрами экспрессии целевого белка и свойствами целевого белка. Для дрожжевых продуцентов чрезвычайно важно, является ли штамм-хозяин Крэбтриположительным или отрицательным по отношению к субстрату. Именно эти два фактора и определяют общую стратегию процесса культивирования.

После определения общей стратегии ферментации процесс культивирования можно разделить на отдельные этапы, в каждом из которых будет решаться своя оптимизационная задача (например, этап накопления биомассы штаммапродуцента и этап биосинтеза целевого белка). Для оптимизации отдельных этапов могут использоваться методы математического моделирования. Данные для моделирования должны быть получены в ходе экспериментов по полунепрерывному культивированию с подпиткой.

Для снижения временных, трудовых и материальных затрат разработка этапов будет вестись раздельно, а затем они будут соединены в единой схеме и апробированы на практике.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа по разработке технологии была выполнена в 2011 - 2014 гг. в Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов в отделе медицинской биотехнологии (ОМБ).

Разработанная технология была масштабирована и апробирована для четырех белков Е7(6)-HSP70, Е7(11)-HSP70, Е7(16)-HSP70, Е7(18)-HSP70. Анализ субстанций и ГЛФ был проведен в лаборатории физико-химического контроля ОМБ.

Микроорганизмы. В работе были использованы следующие штаммы S.

cerevisiae:

1) SCR-702-E7(6)-HSP70 – продуцент гибридного белка Е7(6)-HSP70 (номер ВКПМ Y-3919).

2) SCR-702-E7(11)-HSP70 – продуцент гибридного белка Е7(11)-HSP70 (номер ВКПМ Y-3853).

3) SCR-702-E7(16)-HSP70 – продуцент гибридного белка Е7(16)-HSP70 (номер ВКПМ Y-4057).

4) SCR-702-E7(18)-HSP70 – продуцент гибридного белка Е7(18)-HSP70 (номер ВКПМ Y-4058).

При проведении Питательные среды, растворы и реактивы.

экспериментов для приготовления питательных сред были использованы дрожжевой экстракт (Biospringer, Springer 0207), дрожжевой экстракт (Difco, TC Yeastolate UF), пептон соевый (Аmresco 140), пептон соевый (Amresco, GMOFree), пептон соевый (BD, BactoSoytone), пептон (BD, Difco BBL Phytone), пептон (BD, DifcoBBLBiosate), пептон соевый (BD, DifcoSelect Phytone UF, пептон соевый (BD, Difco Select Soytone), аммония сульфат (Sigma Aldrich 31119), калия дигидрофосфат KH2 PO4 (Sigma Aldrich 04243), кальция хлорид 2-водный CaCl2 (Sigma Aldrich 31307), магния сульфат 7-водный MgSO4 ·H2 O (Sigma Aldrich 63145). Для приготовления подпитки были использованы технический гидролизат казеина (BD, Bacto 223120), глюкоза безводная (Panreac 141341), глицерин (Panreac, 141339). Для поддержания заданного значения рН использовали стерильные растворы аммиака (Sigma Aldrich 30501) и фосфорной кислоты (Sigma Aldrich 04107). Для пеногашения в ходе процесса культивирования использовали синтетический пеногаситель (Sigma Aldrich A6426).

При проведении процессов дезинтеграции клеточной биомассы в приготовлении буферных растворов использовали трис(гидроксиметил)аминометан (Panreac 141940), этилендиаминтетрауксусная кислоту (Sigma Aldrich27285), полисорбат 20 (Sigma Aldrich 44112), мочевину (Merck 137030), PMSF (Sigma Aldrich P7626), дитиотрейтол (Sigma 43815), имидазол (Sigma Aldrich 56748). Для подтитровки буферных рас творов были использованы 37%-ная соляная кислота (J.T.Baker 9544) и гидроксид натрия NaOH (Sigma Aldrich 6203).

В ходе фильтрации лизата биомассы использовался фильтр Сартопор 2, 0,22 (Sartorius) площадью фильтрации 300 см2.

В биохимической очистке были использованы сорбенты: Imac 6 FF (GE Healthcare), QHP Sepharose (GE Healthcare), Superdex 200 (GE Healthcare). Для приготовления буферных растворов использовали трис(гидроксиметил)аминометан (Panreac 141940), этилендиаминтетрауксусную кислоту (Sigma Aldrich 27285), мочевину (Merck 137030), имидазол (Sigma Aldrich 56748), глутатион восстановленный GSH (Applichem A2084), глицерин (Panreac 141339), полисорбат 20 (Sigma Aldrich 44112), полисорбат 80 (Sigma Aldrich 59924), сахарозу (Panreac 141621).

В сорбции вакцины на адъювант использовали 2%-ный гель гидроксида алюминия (Brenntag, ALHYDROGEL 2% ST-IXO 6367-1/2006). Для приготовления буферных растворов использовали полисорбат 20 (Sigma Aldrich 44112), натрия хлорид (Panreac 141659), сахарозу (Panreac 141621), натрия дигидрофосфат моногидрат (Sigma Aldrich S9638), натрия гидрофосфат додекагидрат (Sigma Aldrich 71649).

Методы исследований.

Культивирование штаммов-продуцентов. Культивирование штаммовпродуцентов проводили в ферментере Biostat C DCU 30 (BBI, Германия) общим объемом 42 л в объеме жидкой питательной среды от 10 л до 30. В таблице 3 приведены параметры процесса культивирования.

–  –  –

Дезинтеграция биомассы и осветление лизата. Биомассу продуцента размораживали в течение 6 часов при температуре +4О С и диспергировали в лизирующем буфере ЛБ (100 мМ Tris-HCl pH 8.0, 30 мM имидазол, 500 мМ NaCl, 4 M мочевины, 0.1 % полисорбата 20, 1 мM EDTA, 5 мМ дитиотрейтола, 2 мМ PMSF, pH 8.0) в соотношении биомасса: буфер 1:3. Суспензию клеток разрушали в дезинтеграторе APV 1000 (APV, Дания) при давлении 950 бар. В начале каждого цикла суспензия циркулировала в системе стакан дезинтегратора – камера разрушения – охлаждающий стеклянный теплообменник на протяжении 1,5 мин.

Затем клеточную суспензию собирали в охлаждаемую льдом колбу, охлаждали до температуры 8-10 о С и проводили следующий цикл разрушения. Общее число циклов дезинтеграции определялось результатами микроскопии (не менее 95% разрушенных клеток) и равнялось 7-8. Клеточный гомогенат осаждали на проточной центрифуге Heraeus Stratos (Thermo, Германия) при 15 000 об/мин и скорости протока 25 мл/мин при температуре +4 О С. Супернатант фильтровали с помощью фильтра Sartopore 2 диаметром пор 0,22 мкм.

Биохимическая очистка. Очистку проводили на хроматографе AKT A Purifier 100 (GEHealthcare) с применением металл-хелат аффинной, ионообменной и гельфильтрующей хроматографии.

Приготовление вакцины. Сорбция антигенов на адъювант осуществлялась в реакторе. Содержание гидроксида алюминия в вакцине составляло 0,8 мг/мл.

Буфер для сорбции антигенов содержал 0,86 мг/мл натрия дигидрофосфата моногидрата, 6,71 мг/мл натрия гидрофосфата додекагидрата, 8,76 мг/мл натрия хлорида, 50 мг/мл сахарозы, 0,005 мг/мл полисорбата 20. В зависимости от вида вакцины концентрация антигенов Е7(6)-HSP70, Е7(11)-HSP70 составляла 0,2 мг/мл и 0,2 мг/мл, антигенов Е7(16)-HSP70, Е7(18)-HSP70 - 0,4 мг/мл и 0,4 мг/мл соответс твенно.

Степень Определение степени разрушения клеток биомассы.

разрушения визуально контролировалась при помощи фазово-контрас тной микроскопии (Carl Zeiss Axiostar, Германия) при увеличении х1000. Образец пробы наносился на предметное стекло в количестве 5 мкл, равномерно распределялся по его поверхнос ти так, чтобы он не выходил за пределы покровного стекла. Количество целых клеток подсчитывалось не менее чем в 10 полях зрения. Подсчет клеток проводили с применением специального программного обеспечения Carl Zeiss Zen. Вычисленное среднее число целых клеток по отношению к контрольному среднему количеству клеток в образце до процедуры дезинтеграции определялось, как степень разрушения в процентах.

Определение клеточной плотности. Клеточная плотность определялась двумя способами: спектрофотометрически измерением значения поглощения света при длине волны 600 нм на спектрофотометре Aquarius CE 7500 (Cecil Instruments, Англия) и измерением абсолютно сухого веса (АСВ) клеток из расчета на 1 л культуральной жидкости.

Для измерения АСВ образец пробы культуральной жидкости из ферментера объемом 5 мл осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин, ресуспендировали осадок в 5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, промывая, таким образом, клетки от остатков компонентов питательной среды. Суспензию снова осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Суспензию полученного осадка в 2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида использовали для измерения АСВ в анализаторе влажности Sartorius MA 150 (Германия).

о Применялся следующий режим высушивания: температура 120 С, время высушивания 20 минут.

Измерение удельной продуктивности. Для анализа использовали образцы культуральной жидкости продуцента гибридного белка, нормированные из такого расчета, что 1 мл образца имел АСВ 10 мг. Образцы центрифугировали в пластиковой пробирке на 1,5 мл 15 минут при 10000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 0,1 мл 0,1 М раствора NaOH, инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Вносили в пробирку с биомассой 150-200 мг стеклянных шариков. Добавляли 0,1 мл лизирующего буфера ЛБ (состав см. выше). Биомассу в пробирке дезинтегрировали в аналитическом дезинтеграторе BulletBlender (Next Advance, США) в течение 4 минут при скорости 10 дважды. После 1 часа инкубации при комнатной температуре суспензию осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 10000 об/мин. В полученном супернатанте определяли содержание растворимого гибридного белка методом электрофореза в 8% ПААГ в присутс твии SDS по Лэммли в восстанавливающих условиях. Анализ интенсивности полос на электрофореграммах и расчет выхода целевого продукта проводился с использованием программы Gene Tools (Syngene, Англия).

Определение концентрации глюкозы и глицерина в культуральной жидкости. Образец культуральной жидкости продуцента гибридного белка осаждали при 4000 об/мин в течение 15 мин. В супернатанте определяли содержание аналита методом ВЭЖХ на аналитическом хроматографе Ultimate 3000 (Dionex,США) на колонне PolyamineII (YMC, Япония). В качестве стандартов использовали растворы глюкозы и глицерина в концентрации 5 мг/мл.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Разработка процесса культивирования штаммов – продуцентов гибридных рекомбинантных белков Е7(11)-HSP70, Е7(6)-HSP70 и Е7(16)HSP70, Е7(18)-HSP70 2.2.1.1. Описание штаммов-продуцентов Штаммами-продуцентами гибридных белков Е7-HSP70 (Е7(11)-HSP70, Е7(6)-HSP70, Е7(16)-HSP70 и Е7(18)-HSP70) служат генетически модифицированные штаммы S. сerevisiae SCR-702-Е7(11)-HSP70, SCR-702-Е7(6)HSP70, SCR-702-Е7(16)-HSP70 и SCR-702-Е7(18)-HSP70, депонированные во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационными номерами ВКПМ Y-3853, ВКПМ Y-3919, ВКПМ Y-4057 и ВКПМ Y-4058 соответс твенно (Приложение 1-4).

Штаммы-продуценты были получены в лаборатории эукариотических систем экспрессии генов (лаб. №20) под руководством зав.лаб. к.б.н. Д.Г. Козлова (ФГУП ГосНИИгенетика).

Нуклеотидная последовательность, кодирующая целевой белок Е7-HSP70, включающая структурные гены белка Е7 соответствующего типа, была получена в результате химического синтеза.

Штаммы синтезируют гибридные рекомбинантные белки, состоящие из слитых последовательностей онкобелка Е7 ВПЧ соответс твующего типа (6, 11, 16 или 18), белка теплового шока HSP70 Mycobacterium tuberculosis и белка убиквитина дрожжей S. cerevisiae, занимающего в составе слитого белка Nконцевое положение и содержащего сайт процессинга, распознаваемый природными убиквитин-специфичными протеиназами дрожжей. В ходе экспрессии гибридный рекомбинантный белок подвергается внутриклеточному процессингу, а в клетках накапливается белок Е7-HSP70, не содержащий убиквитин.

В белке теплового шока HSP70 16 С-концевых аминокислотных остатков замещены на искусственную последовательнос ть, включающую 6 остатков гистидина (Рисунок 6).

–  –  –

Экспрессия гибридного белка Е7-HSP70 находится под контролем промотора Gal1, который дерепрессируется отсутствием в среде сахаров. В присутс твии сахаров, промотор Gal1 репрессирован, экспрессия целевого белка подавляется. Таким образом, для индукции синтеза целевого белка в среде должны отсутствовать сбраживаемые углеродсодержащие субстраты, такие как сахароза, глюкоза, фруктоза, которые являются предпочтительными субстратами для штаммов S. cerevisiae.

В то же время, присутствие в среде сбраживаемого углеродсодержащего субстрата создает селективное давление на культуру штамма-продуцента и позволяет отсеивать клетки, утерявшие плазмиду. Рост культуры в присутствии сахаров позволяет повысить стабильнос ть экспрессионной системы, а, следовательно, и уровень экспрессии целевого белка.

Таким образом, для создания селекционного давления на культуру штаммапродуцента и условий для максимального роста биомассы необходимо одну часть процесса культивирования проводить с использованием сахаров, а в другой части процесса избегать присутс твия сахаров в высокой концентрации, для того чтобы создать оптимальные условия для экспрессии целевого белка.

Промотор Gal1, под контролем которого находится синтез белка E7-HSP70, не обладает галактозозависимой индукцией, но по своей сути является индуцируемым. Как уже сказано в литобзоре, в случае индуцибельного промотора процесс культивирования делится на две части – этап накопления биомассы и этап биосинтеза целевого белка. Эти два этапа имеют различные цели, поэтому и состав питательной среды, и условия проведения процесса на этих двух этапах будут различаться.

Стадия накопления биомассы должна проводиться с использованием сахара в качестве углеродсодержащего субстрата. Экспрессия целевого белка при этом репрессируется, а на культуру штамма продуцента оказывается селективное давление. Культура должна максимально эффективно использовать углеродсодержащий субстрат и накопить большой пул биомассы за минимальное время, т.е. экономический коэффициент YXS и объемная производительность по биомассе QX(или выход на единицу объема и времени, space time yield, STY) должны быть максимальными.

Стадия биосинтеза должна пройти с максимально большой объемной продуктивностью целевого белка QP и, соответственно, QP является основным параметром оптимизации и математического моделирования стадии биосинтеза.

Как подробно изложено ниже и в литературном обзоре, величина QР определяется величиной удельной скорости роста µ и величиной удельной скорости образования продукта qР, которая в свою очередь также зависит от µ. Таким образом, параметр µ является основной переменной при оптимизации стадии биосинтеза. Условия и режим культивирования стадии биосинтеза должны быть направлены на поддержание необходимой величины удельной скорости роста µ, которая обеспечивает максимальную объемную продуктивнос ть целевого белка Qp.

Такие параметры процесса, как способ экспрессии целевого белка и точка индукции, оказывают сильное влияние на продуктивность целевого белка.

Экспрессия целевого белка может быть индуцирована несколькими альтернативными способами:

1. В ходе периодического процесса после исчерпания внесенного в среду сбраживаемого углеродсодержащего субстрата с помощью автоиндукции.

При этом сбраживаемый субстрат может вноситься в достаточно высокой начальной концентрации – около 2-5%. В качестве субстрата может быть использована глюкоза, фруктоза и сахароза. Автоиндукция начинается при исчерпании ферментируемого сахара в среде культивирования ниже определенного уровня и является по сути неконтролируемой. Концентрация сахара, при которой начинается автоиндукция, зависит от конкретного штамма-продуцента и, по нашим экспериментальным данным, может составлять 0,3% сахара в среде культивирования и менее.

2. В полунепрерывном процессе с подпиткой, при использовании в качестве подпитки таких несбраживаемых углеродсодержащих субстратов, как глицерин или этанол. В этом случае первый этап накопления биомассы проходит в присутствии сахаров, а второй этап биосинтеза целевого белка – при подпитке глицерином или этанолом. Переключение на несбраживаемый углеродсодержащий субстрат индуцирует синтез целевого белка.

3. В полунепрерывном процессе с подпиткой, при лимитированной подаче сбраживаемого углеродсодержащего субстрата. Скорость подачи и остаточная концентрация сахара, при которой происходит индукция синтеза целевого белка, зависят от конкретного штамма-продуцента и могут быть определены только экспериментально.

Индукция процесса может проводиться при разной концентрации биомассы в среде, разной скорости роста культуры и в разных фазах роста.

Степень влияния этих факторов на продуктивнос ть процесса может быть определена только экспериментальным путем, так как реальные внутриклеточные взаимодействия очень сложны и в большой степени определяются свойствами целевого белка.

Далее будут подробно рассмотрены и исследованы способы реализации двух этапов процесса для создания оптимальной ферментационной стратегии.

–  –  –

Для оценки продуктивности и ростовых свойств штаммов-продуцентов были проведены оценочные культивирования в ферментере в объеме 10 л.

Продуктивность и ростовые свойства штаммов оценивали в периодическом процессе культивирования. Сахароза вносилась в начале процесса культивирования в концентрации 30 г/л. Автоиндукция экспрессии целевого белка начинается при исчерпании сахарозы в среде культивирования.

Для того чтобы избежать возможных лимитов по азоту, минеральным солям и витаминам для культивирования использовалась богатая питательная среда.

Проведение процесса культивирования в ферментере дало возможность измерять и контролировать такие параметры, как потребление кислорода, изменение величины рН, что позволило глубже понять процессы, проходящие при культивировании штамма-продуцента.

Основные параметры процессов культивирования приведены в таблице 3.

В процессе культивирования отбирали пробы культуральной жидкости, измеряли оптическую плотность клеточной суспензии, концентрацию сахарозы и глюкозы в среде, сухой вес биомассы и количество целевого белка.

Форма кривых, отражающих изменение таких параметров культивирования, как концентрация сахарозы и глюкозы в среде, уровень растворенного кислорода в среде рО2 и изменение рН среды, имели одинаковую форму для всех штаммовпродуцентов. На рисунке 7, как пример, приведены параметры роста штаммапродуцента SCR-702-E7(11)-HSP70, на рисунке 8 – изменение концентрации глюкозы в процесссе культивирования.

Рисунок 7. Параметры роста штамма-продуцента SCR-702-E7(11)-HSP70 в ходе периодического процесса

–  –  –

Из электрофоретического анализа видно, что синтез целевого продукта E7HSP70 начался на 32-34 час процесса (Рисунок 9). Таким образом, между индукцией, которая происходит после исчерпания из среды культивирования сахара, т.е. на 23 час роста, и началом экспрессии прошло около 10 часов.

Рисунок 9. Анализ культуральной жидкости методом электрофореза в периодическом процессе культивирования штамма-продуцента SCR-702E7(18)-HSP70 в объеме 10 л Нужно отметить, что худшими ростовыми свойствами (Рисунок 10) обладает штамм-продуцент SCR-702-E7(16)-HSP70.

Он растет медленнее других штаммов, но за 48-ми часовое культивирование достигает той же оптической плотности, что и другие штаммы.

Экспрессия целевых белков идет, когда культуры находятся в стационарной фазе роста (Рисунок 10), а удельная скорость роста очень низка – ниже 0,05 ч-1 (Рисунок 11).

SCR-702-E7(16)-HSP70 SCR-702-E7(6)-HSP70 SCR-702-E7(11)-HSP70 SCR-702-E7(18)-HSP70

–  –  –

2.2.1.4. Выбор модельного штамма для проведения исследований Для того, чтобы снизить временные, материальные и трудовые затраты на разработку процесса культивирования и, учитывая, что генетическая конс трукция штаммов идентична, было решено необходимые исследования проводить на одном из четырех штаммов, а затем апробировать разработанную схему на остальных штаммах.

Оценочные исследования продуктивнос ти и ростовых свойств штаммов показали, что штамм SCR-702-E7(16)-HSP70 обладает самой низкой продуктивностью и худшими ростовыми свойствами. Скорее всего, это связано с особенностями целевого белка E7(16)-HSP70, который, вероятно, является трудно экспрессируемым белком и оказывает негативное влияние на рост клетки.

Как модельный штамм для проведения исследований был выбран штаммпродуцент SCR-702-E7(16)-HSP70. Предполагалось, что эффективное культивирование, разработанное для штамма с наихудшими ростовыми свойствами и продуктивностью, будет успешно воспроизводиться на штаммах с большей продуктивностью и лучшими ростовыми свойствами.

2.2.1.5. Разработка этапа накопления биомассы На Условия внешней среды, влияющие на рост дрожжей.

жизнедеятельнос ть и продуктивность дрожжей оказывают значительное влияние следующие факторы внешней среды:

а) состав питательной среды;

в) рН;

г) температура;

д) аэрация.

Определение оптимального состава культуральной среды. Состав среды является одним из наиболее важных факторов, определяющих скорость роста культуры, а также выход продукта в процессе культивирования. Культуральная среда включает азотсодержащие и углеродсодержащие компоненты, а также может содержать минеральные соли, соли редких металлов, витамины, которые могут служить в качестве простерических групп, кофакторов или лигандов для рекомбинантных белков.

Стандартной комплексной средой для S. cerevisiae является, так называемая среда YPD, содержащая 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% декстрозы (D-глюкозы). Среда YPD в избытке обеспечивает наличие аминокислот, предшественников нуклеотидов, витаминов и незаменимых метаболитов, необходимых для оптимального клеточного роста. При росте на среде YPD клетки делятся каждые 90 мин в экспоненциальной фазе роста [213].

Но хотя среда YPD имеет определенный состав, ее компоненты – пептон и дрожжевой экстракт – могут быть получены из различных источников по различным технологиям, что и будет в итоге определять ростовые свойства среды.

Поэтому при использовании комплексной среды необходимо протес тировать ряд компонентов и выбрать наиболее оптимальные для роста биомассы и продуктивности.

Азотсодержащий компонент. В качестве азотсодержащего компонента среды были исследованы 8 марок пептона:

• Пептон 140 (производство Amresco кат. № J849) - гидролизат сои.

• Пептон Animal-free&GMO-free (производство Amresco кат. № 454) – папаиновый / панкреатический гидролизат обезжиренной соевой муки, полученной из генетически немодифицированных источников.

• Пептон Bacto Soytone BD (производство BD Biosciences кат. № 243620) гидролизат соевой муки, полученный с помощью ферментов животного происхождения.

• Пептон BBL Phytone BD (производство BD Biosciences кат. № 211906) – соевый пептон, ферментативный гидролизат соевой муки, не содержит компонентов животного происхождения.

• Пептон Difco TC Yeastolate, UF (производство BD Biosciences кат. № 292804) – водорастворимый, не содержащий продуктов животного происхождения автолизат дрожжей S. cerevisiae. Представляет собой смесь пептидов, аминокислот, простых и сложных углеводов, а также витаминов.

• Пептон BD BBL Biosate (производство BD Biosciences кат. № 211862) – пептон из сырья животного происхождения.

• Пептон Difco Select Phytone, UF (производство BD Biosciences кат. № 210931) – соевый пептон, не содержащий компонентов животного происхождения.

Ультрафильтрован.

• Пептон Difco Select Soytone (производство BD Biosciences кат. № 212488) – гидролизат соевого белка, не содержит компонентов животного происхождения.

Для исследования влияния пептона на рост биомассы и продуктивность было проведено сравнительное культивирование штамма-продуцента SCR-702-Е7(11)HSP70 в колбах. На основе каждого из пептонов была приготовлена питательная среда, содержащая 20 г/л пептона и 10 г/л дрожжевого экстракта. Кривые роста штамма-продуцента на разных субстратах предс тавлены на рисунке 12.

Оптическая плотнос ть культуральной жидкости после 48 часов выращивания в восьми колбах была практически одинаковой и составляла 30-31 о.е.

–  –  –

Рисунок 13. Анализ экстрактов дрожжевых клеток, выращенных в средах с разными пептонами, методом электрофореза Стандарт – внутренний стандарт гибридного белка Е7(11)-HSP70, MW – белковые маркеры веса, 1-8 экстракты клеток дрожжей, выращенных в средах на основе пептонов: peptone 140 Amresco, peptone GMO Free Amresco, BD Bacto Soytone, BBL Phytone peptone Difco, TC Yeastolate UF Difco, BBL Biosate peptone BD, Select Phytone UF Difco, Select Soytone Difco.

Использование пептонов пептон 140 и TC Yeastolate UF дает наиболее высокий уровень экспрессии гибридного белка Е7(11)-HSP70. Продуктивность целевого белка в средах на основе данных пептонов составила 153 мг и 150 мг на литр культуральной жидкости соответственно.

Для дальнейшего исследования ростовых свойств и определения концентрации пептона необходимой для проведения культивирования в ферментере был выбран пептон 140, как более дешевый по сравнению с пептоном TC Yeastolate UF.

Для оценки ростовых свойств пептона 140 был проведен процесс культивирования штамма SCR-702-Е7(11)-HSP70 с градиентной подпиткой сахарозой в объеме 10 л, при начальной концентрации пептона в среде 20 г/л, концентрации дрожжевого экстракта 20 г/л.

Скорость подпитки в процессе подбиралась экспериментально таким образом, чтобы концентрация сахарозы в культуральной жидкости не превышала 0,2 %.

Измерение концентрации сахарозы производилось при помощи набора “sucrose assay kit” (Sigma, США). Кроме того, активнос ть усвоения углеводной подпитки косвенно контролировалась по уровню концентрации рас творенного кислорода в среду pO2, %. Кривая роста штамма-продуцента приведена на рисунке 14.

Из данных, предс тавленных на рисунке 14, видно, что начальная концентрация пептона в среде 20 г/л позволяет достигнуть в культивировании с возрастающей подпиткой сахарозой конечной оптической плотности 130 о.е. или, соответс твенно, концентрации биомассы 38 г АСВ /л. Пептон 140 с начальной концентрацией 20 г/л удовлетворяет потребности штамма-продуцента в азоте и может быть использован в качестве составного компонента питательной среды для промышленной технологии. Пептон 140, полученный гидролизом соевого белка, не содержит веществ животного происхождения, что важно для переноса технологии в производство по стандартам GMP.

–  –  –

Факторы роста, минеральные соли и соли тяжелых металлов. Факторы роста, или витамины необходимы для роста микроорганизмов. К ним относятся некоторые витамины группы В, такие как тиамин (В1); рибофлавин (В2);

никотиновая кислота (В3); пиридоксин (В6); витамин (В12); биотин (В7), а также фолиевая кислота и парааминобензойная кислота. Для нормального роста требуются лишь следовые количества витаминов. Кроме того, могут потребоваться и другие органические вещества, такие как пурины и пиримидины.

Источником этих веществ в комплексной среде служит дрожжевой экстракт Springer 0207 (Biospringer, Франция). Его состав микроэлементов и витаминов варьируется в очень широких границах [35]. Для того чтобы снять все возможные лимиты по микроэлементам и витаминам в питательной среде для культивирования штамма используется концентрация дрожжевого экстракта 20 г/л.

Как показано выше, питательная среда с содержанием 20 г/л пептона и 20 г/л дрожжевого экстракта, позволяет достигнуть концентрации биомассы не менее 38 г АСВ/л.

2.2.1.5.1. Режим подачи углеродсодержащего субстрата

Такие сахара, как сахароза и глюкоза, являются предпочтительным субстратом для штаммов S. cerevisiae и имеют больший экономический коэффициент по сравнению с другими субстратами. Присутствие в среде сахаров подавляет экспрессию рекомбинантного белка, а, следовательно, снижается энергия поддержания и нагрузка на клетку штамма-продуцента и повышается выход биомассы.

Таким образом, использование сахарозы или глюкозы в качестве углеродсодержащего субстрата на этапе накопления биомассы является логичным и обоснованным.

Дрожжи делятся на Крэбтри-положительные и Крэбтри-отрицательные, в зависимости от их склонности к спиртовому брожению при росте на сахарах в аэробных условиях [71, 160, 201]. Штаммы-продуценты Е7-HSP70 являются Крэбтри-положительными и в аэробных условиях при высокой скорости подачи сахара осуществляют спиртовое брожение, которое характеризуется нелимитированной скоростью роста культуры.

В начале культивирования при переносе посевного материала в среду культивирования концентрация биомассы составляет 0,2-0,3 г АСВ/л. При простейшем расчете с использованием данных, приведенных в таблице 5, можно заключить, что при скорости подачи глюкозы большей, чем 0,22 г·ч-1, или при начальной концентрации глюкозы, способной обеспечить потребление большее, чем 1,08 г·г-1 ·ч-1, неизбежно возникнет процесс брожения.

–  –  –



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Похожие работы:

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«МАКАРОВ Андрей Олегович Оценка экологического состояния почв некоторых железнодорожных объектов ЦАО г. Москвы специальность 03.02.13 – «почвоведение» и 03.02.08 – «экология» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук, Яковлев А.С. кандидат биологических наук Тощева Г.П. Москва 201 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«» Ткаченко Лия Викторовна Морфо – функциональная характеристика лимфатической системы легких и их регионарных лимфатических узлов кроликов в норме и эксперименте 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, онкология, патология и морфология животных Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук...»

«БЕСЕДИНА Екатерина Николаевна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ ЯБЛОНИ IN VITRO Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Л.Л. Бунцевич Краснодар 201 Содержание...»

«Гуляева Анна Федоровна ТРАВЯНЫЕ МЕЛКОЛИСТВЕННЫЕ ЛЕСА КУЗНЕЦКОЙ КОТЛОВИНЫ: СИНТАКСОНОМИЯ, ЭКОЛОГИЯ, ГЕОГРАФИЯ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., ст.н.с. Н.Н. Лащинский Новосибирск 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОСТИ...»

«Проскурякова Лариса Александровна НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ СОХРАНЕНИЯ ЗДОРОВЬЯ...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«ШИГАПОВ Иршат Сайдашович ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ МАЛЫХ ОЗЕР УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (на примере города Казани) 25.00.36 Геоэкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, зав. каф. природообустройства и водопользования, зав. лабораторией оптимизации водных экосистем КФУ МИНГАЗОВА Н.М. Научный консультант: доктор...»

«СИМАНИВ ТАРАС ОЛЕГОВИЧ ОПТИКОМИЕЛИТ И ОПТИКОМИЕЛИТ-АССОЦИИРОВАННЫЕ СИНДРОМЫ ПРИ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ 14.01.11 – Нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук М. Н. Захарова Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Обзор литературы Оптиконевромиелит Аквапорины и их биологическая функция 13 Патогенез...»

«Иртегова Елена Юрьевна РОЛЬ ДИСФУНКЦИИ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ И РЕГИОНАРНОГО ГЛАЗНОГО КРОВОТОКА В РАЗВИТИИ ГЛАУКОМНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ 14.01.07 – глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«САФИНА ЛЕЙСЭН ФАРИТОВНА Анафилактический шок на ужаления перепончатокрылыми насекомыми (частота встречаемости, иммунодиагностика, прогнозирование) 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Лёвкина Ксения Викторовна Влияние сроков, норм высева и удобрений на урожайность и качество зерна озимой твердой пшеницы в подзоне светло-каштановых почв Волгоградской области Специальность: 06.01.01 – общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«ЖЕСТКОВА ДАРЬЯ БОРИСОВНА СОСТАВ И СТРУКТУРА ТРАВЯНИСТОГО ПОКРОВА ПРИДОРОЖНЫХ ТЕРРИТОРИЙ АВТОМАГИСТРАЛЕЙ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА Специальность: 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«БОЛГОВА Светлана Борисовна РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Антипова...»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«Аканина Дарья Сергеевна РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДЕТЕКЦИИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н5N 03.02.02 – вирусология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Д.б.н., профессор Гребенникова Т. В. Москва 20 ОГЛАВЛЕНИЕ Список использованных сокращений 1. Введение 2. Обзор литературы 2.1. Описание заболевания 2.2. Общая характеристика вируса гриппа 2.3. Эпидемиология вируса гриппа А...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.