WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломычеловека 6/11 и 16/18 типов ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное унитарное предприятие

«Государственный научно-исследовательский инс титут генетики и селекции

промышленных микроорганизмов»

На правах рукописи

Леонов Вячеслав Сергеевич

Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин

против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломычеловека 6/11 и

16/18 типов

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Хамитов Р.А.

Москва – 2015 г

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Необходимость создания вакцины для высокоспецифичной иммунотерапии инфекции ВПЧ

1.2. Принцип действия вакцины для иммунотерапии заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 6, 11, 16 и 18 типов

1.3. Белки E7 – их структура и функции

1.4. Белок HSP-70 – структура и функции

1.5. Примеры получения фьюза Е7-HSP-70

1.6. Производство рекомбинантных белков в S. cerevisiae в промышленных условиях

2. СОБСТ ВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Разработка процесса культивирования штаммов – продуцентов гибридных рекомбинантных белков Е7(11)-HSP70, Е7(6)-HSP70 и Е7(16)HSP70, Е7(18)-HSP70

2.2.1.1. Описание штаммов-продуцентов

2.2.1.2. Обоснование общей стратегии процесса культивирования на основании проведенного анализа

2.2.1.3. Оценка ростовых свойств и продуктивности штаммов-продуцентов.

2.2.1.4. Выбор модельного штамма для проведения исследований............ 57 2.2.1.5. Разработка этапа накопления биомассы

2.2.1.6. Этап экспрессии целевого белка

2.2.1.6.1. Питательная среда и условия культивирования этапа экспрессии целевого белка

2.2.1.6.2. Выбор оптимального способа индукции и углеродсодержащего субстрата....78 2.2.1.6.3. Анализ протестированных способов индукции

2.2.1.6.4. Оптимизация этапа биосинтеза путем математического моделирования........89 2.2.1.6.5. Апробация двухстадийной подпитки на штаммах-продуцентах SCR-E7(18)HSP70 и SCR-E7(11)-H SP70, SCR-E7(6)-H SP70

2.2.2. Разработка способа дезинтеграции

2.2.2.1. Выбор состава лизирующего буфера

2.2.2.2. Влияние температуры на стабильнос ть целевого продукта.......... 120 2.2.2.3. Выбор соотношения лизирующий буфер – биомасса

2.2.2.4. Влияние давления и количества циклов дезинтеграции............... 123 2.2.3. Очистка субстанции гибридных рекомбинантных белков.................. 127 2.2.4. Изготовление готовых лекарственных форм терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки

2.2.5. Технологическая схема производства терапевтических вакцин......... 13 2.2.6. Предвалидация технологического процесса

3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРАКТ ИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.. 142

6. РЕКОМЕНД АЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ....... 143

7. СПИСОК ЛИТ ЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Вирус папилломы человека (ВПЧ) – это семейство ДНК вирусов, включающее в себя около 200 типов вирусов. ВПЧ является самым распространенным вирусом, передаваемым половым путем [190, 211].

Основываясь на клиническом прогнозе развития заболевания, типы ВПЧ делят на «ВПЧ низкого риска» и «ВПЧ высокого риска» [45]. «ВПЧ низкого риска» или неонкогенные, к которым относятся типы 6 и 11, могут вызывать доброкачественные или малоопасные аномалии шейки матки, доброкачественную эпителиальную гиперплазию (возникновение аногенитальных кондилом, папиллом) и заболевание дыхательных путей – рецидивирующий респираторный папилломатоз (РРП) [130].

Заболеваемость аногенитальным кондиломатозом наиболее высока среди женщин в возрасте 15-24 лет и мужчин в возрасте 20-29 лет [212]. Показатель заболеваемости аногенитальным кондиломатозом в некоторых регионах России достигает 120 – 150 человек на 100 тыс. населения. Кондиломы у детей и новорожденных часто появляются в результате заражением вирусом при прохождении через родовые пути [31, 44, 175, 214]. Несмотря на отсутствие летальных случаев, аногенитальные кондиломы наносят существенный вред здоровью, снижают качество жизни пациентов, требуют длительного лечения и часто рецидивируют независимо от типа лечения [3, 6, 19, 36, 74, 103].

Причиной заболевания РРП является вирус папилломы человека, преимущественно 6 и 11 типа [1, 8, 26, 37, 122, 221]. РРП является тяжелой патологией (рост папиллом в самом узком участке дыхательных путей приводит к выраженному стенозу гортани, вплоть до асфиксии) из-за длительности заболевания и его клинической непредсказуемости [32, 33].

«ВПЧ высокого риска» или онкогенные, к которым относятся типы 16 и 18, могут привести к неоплазии аногенитальной области, в том числе раку шейки матки, вульвы, влагалища, пениса и ануса, а также некоторым видам рака ротоглотки [95, 159, 209]. Среди последствий инфекций ВПЧ, ассоциированных с онкологическими заболеваниями, самым серьезным является рак шейки матки. В 2008 году в мире было зафиксировано более чем 500 000 случаев заболевания и 275 000 смертей, вызванных раком шейки матки [82, 159]. Инфекции ВПЧ высокого риска обнаруживаются почти во всех случаях рака шейки матки; около 70% случаев рака шейки матки в мире связано с типами 16 и 18 [55, 89].

В Российской Федерации заболеваемость раком шейки матки находится на высоком уровне – 14 случаев на 100 000 взрослого женского населения (для сравнения в США этот показатель составляет 9 случаев на 100 000). Ежегодно в России впервые выявляется около 12-13 тысяч случаев заболевания раком шейки матки; 8 тысяч женщин умирает от этого заболевания [11, 38-41].

Высокоспецифичная терапевтическая вакцина для иммунотерапии ВПЧ высокого и низкого риска, активирующая Т-клеточный иммунный ответ против антигенов ВПЧ, экспрессируемых в инфицированных клетках, позволила бы в случае инфекции ВПЧ низкого риска избежать рецидивов заболевания или снизить их число, а в случае ВПЧ высокого риска избежать поражений, ведущих к аномальным изменениям эпителиальных клеток, возникновению предракового состояния и инвазивному раку [17, 29].

Для создания терапевтической вакцины против ВПЧ в качестве антигена для стимуляции специфического иммунного ответа был выбран белок Е7, который играет ключевую роль в репликации ВПЧ и способен влиять на дифференциацию инфицированных клеток.

Белок Е7 является белком исключительно вирусного происхождения, постоянно присутствует в инфицированных клетках и отсутствует в неинфицированных, поэтому он является подходящей мишенью для высокоспецифичной иммунотерапии для предотвращения и лечения папилломатоза.

Иммуногеннос ть белка Е7 в составе терапевтических вакцин увеличена за счет присоединения к нему белка-носителя, стимулирующего Т-клеточный ответ,

- белка теплового шока HSP70 Mycobacterium tuberculosis. Иммунные системы животных способны распознавать многочисленные B и T клеточные эпитопы, которые присутс твуют в составе этого белка, что позволяет ему выполнять функцию мощного неспецифического стимулятора иммунной системы [171].

К настоящему моменту в мире существуют две эффективные профилактические вакцины против ВПЧ. Это квадривалентная вакцина Гардасил, а также бивалентная вакцина Церварикс. Терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с ВПЧ в мире не существует.

В качес тве штамма-продуцента в производстве Гардасила используется штамм-продуцент Saccharomyces cerevisiae, экспрессирующий растворимый капсидный белок L1 соответствующего серотипа в количестве 300-400 мг/л [62], а при производстве Церварикса – линия клеток насекомых, экспрессирующая капсидный белок L1 в количестве 100-200 мг/л культуральной жидкости. Кроме того, для терапевтической вакцины против ВПЧ необходимы дозировки активных компонентов пятикратно превышающие используемые в профилактичеких вакцинах.

Для создания эффективной и коммерчески рентабельной технологии производства отечес твенной терапевтической вакцины против ВПЧассоциированных заболеваний, которая могла бы сравниться с зарубежными аналогами, необходимо обеспечить в три-пять раз большую продуктивность процесса культивирования.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась разработка технологии производства двух терапевтических вакцин для иммунотерапии заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 6/11 и 16/18 типов, на основе 4-х гибридных рекомбинантных белков E7 ВПЧ соответствующего серотипа и белка теплового шока HSP 70 Mycobacterium tuberculosis для проведения доклинических испытаний в рамках соответствующих государственных контрактов № 16.N08.12.1024 по теме: «Доклинические исследования отечественной терапевтической вакцины против рецидивирующего респираторного папилломатоза и аногенитального кондиломатоза, произведенной на основе клеток эукариот» и № 13411.1008799.13.173 по теме: «Доклинические исследования лекарственного средства на основе композиции рекомбинантных белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов и белка теплового шока Mycobacterium tuberculosis для иммунотерапии и профилактики опухолевых заболеваний аногенитальной области»

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать универсальный способ культивирования рекомбинантных штаммов SCR-702-Е7(6)-HSP70, SCR-702-Е7(11)-HSP70, SCR-702-Е7(16)HSP70 и SCR-702-Е7(18)-HSP70, созданных на основе штамма-реципиента S.

D702 и экспрессионного вектора pPDX3U-Е7-HSP70, сerevisiae продуцирующих гибридные белки E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70 и E7(18)-HSP70.

2. Создать математическую модель стадии биосинтеза целевого белка E7(16)HSP70, позволяющую прогнозировать выходные параметры процессов культивирования.

3. Разработать способ дезинтеграции биомассы штаммов-продуцентов SCR-702Е7(11)-HSP70, SCR-702-Е7(6)-HSP70, SCR-702-Е7(16)-HSP70 и SCR-702- Е7(18)-HSP70.

4. Создать на основе полученных субстанций готовые лекарственные формы двух терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки.

5. Разработать опытно-промышленные регламенты на производство вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека.

Научная новизна.

Впервые в России создана математическая модель с тадии биосинтеза целевого белка E7(16)-HSP70, позволяющая оптимизировать процесс культивирования. Рассчитанная по математической модели двухстадийная подпитка лимитирующим компонентом позволяет максимизировать объемную продуктивность и прогнозировать выходные параметры процесса культивирования. Оптимизированная двухстадийная подпитка состоит из подпитки по экспоненциальному закону при удельной скорости роста 0,08 ч-1 и подпитки с расходом, рассчитанным по оптимальному постепенно снижающемуся профилю скорости роста, вычисленному с применением методов вариационного исчисления, а именно уравнений Эйлера-Лагранжа.

Впервые в России разработана универсальная технология промышленного культивирования штаммов, созданных на основе штамма-реципиента S. сerevisiae D702 и экспрессионного вектора pPDX3U-Е7-HSP70, продуцирующих гибридные рекомбинантные белки E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70 и E7(18)HSP70.

На основании разработанного способа культивирования подана заявка на патент РФ №2013146057 на изобретение «Способ микробиологического синтеза гибридного белка Е7(6)-HSP70 или Е7(11)-HSP70 или Е7(16)-HSP70 или Е7(18)HSP70», принято решение Роспатента о выдаче патента (приоритет от 16.10.2013).

значимость. Разработанная технология использована в Практическая производстве ГЛФ вакцин для проведения доклинических испытаний и исследований стабильнос ти в рамках государственных контрактов №

16.N08.12.1024 и № 13411.1008799.13.173 от Минобрнауки и Минпромторга России.

Разработаны и утверждены опытно-промышленные регламенты на производство терапевтических вакцин по № 00479942-03-14 и № 00479942-01-15.

Произведены опытные серии двух терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки, прошедшие контроль согласно ФСП.

Личный вклад соискателя. Автор выполнял работу по созданию и характеризации клеточных банков культур, исследованию ростовых и продуктивных свойств штаммов-продуцентов, разрабатывал способ культивирования штаммов-продуцентов, разрабатывал математическую модель процесса биосинтеза, способ дезинтеграции биомассы, осветления клеточного лизата. Автор выполнял работы по масштабированию процессов культивирования, дезинтеграции и проведению установочных серий.

Разработка методики очис тки целевых белков выполнялась совместно с нач.

лаб. биохимии Селищевым С. В. Разработка способа получения фармацевтических субстанций и ГЛФ терапевтических вакцин, контроль стабильнос ти проводились совместно с Жученко М.А. Нормативная документация на производство вакцин разрабатывалась совместно с Кухаренко А.Е.

Штаммы-продуценты были получены в лаборатории эукариотических систем экспрессии генов (лаб. №20) под руководством зав. лаб. к.б.н. Д.Г. Козлова (ФГУП ГосНИИгенетика), за что выражаю ему глубокую благодарность.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика»

(Москва, 2014).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, подана 1 заявка на патент.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 190 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практическое использование результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список литературы (221 источников, из них 180 иностранных авторов). Диссертация включает 48 рисунков, 20 таблиц, 22 страницы приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Промышленная технология, основанная на использовании штаммареципиента Saccharomyces cerevisiae D702 и экспрессионного вектора pPDX3U-Е7-HSP70, базирующаяся на двухстадийном культивировании с оптимизированными подпитками, обеспечивает получение целевых рекомбинантных белков E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70, E7(11)-HSP70 и E7(6)HSP70 для изготовления терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 16/18 и 6/11 типов, с продуктивностью не менее 180,0 ± 17,5 мг, 692,4 ± 72,1 мг, 425,1 ± 35,3 мг, 395,0 ± 43,2 мг очищенного белка с 1 л культуральной жидкости, соответственно.

2. Математическая модель стадии биосинтеза целевого белка E7(16)-HSP70, позволяет путем использования оптимизированного профиля подпитки лимитирующим компонентом увеличить объемную продуктивность полунепрерывных процессов культивирования штаммов-продуцентов SCRE7(16)-HSP70, SCR-E7(18)-HSP70, SCR-E7(11)-HSP70 и SCR-E7(6)-HSP70, соответс твенно, в 16,7 раз, в 9,4 раз, в 10,6 раза и в 10,2 раза по сравнению с периодическим процессом.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

–  –  –

Вирус папилломы человека (ВПЧ) – это семейство Д НК вирусов, включающее в себя около 200 типов вирусов, которые обладают заметным тропизмом по отношению к тканям эпителия [145]. Несмотря на сходное строение генома, разные типы ВПЧ поражают эпителий на различных областях тела. Около 40 типов ВПЧ инфицируют аногенитальную область и слизистую оболочку полости рта. ВПЧ является наиболее распространенным вирусом, передаваемым половым путем. Например, в США каждый год им заражаются 6,2 миллиона человек [211]. Основываясь на клиническом прогнозе развития заболевания, типы ВПЧ делят на «ВПЧ низкого риска» и «ВПЧ высокого риска» [152].

«ВПЧ низкого риска» или неонкогенные, к которым относятся типы 6 и 11, могут вызвать доброкачес твенные или малоопасные аномалии шейки матки, доброкачественную эпителиальную гиперплазию (возникновение аногенитальных кондилом, папиллом) и заболевание дыхательных путей – рекуррентный респираторный папилломатоз (РРП) [130].

«ВПЧ высокого риска» или онкогенные, к которым относятся типы 16 и 18, могут привести к неоплазии аногенитальной области, в том числе раку шейки матки, вульвы, влагалища, пениса и ануса, а также некоторым видам рака ротоглотки [95, 159, 209]. Среди последствий инфекции ВПЧ, ассоциированных с онкологическими заболеваниями, самым серьезным является рак шейки матки. В 2008 году в мире было зафиксировано более чем 500 000 случаев заболевания и 275 000 смертей, вызванных раком шейки матки [82, 159]. В Российской Федерации заболеваемость раком шейки матки находится на высоком уровне – 14 случаев на 100 000 взрослого женского населения (для сравнения в США этот показатель составляет 9 случаев на 100 000). Ежегодно в России впервые выявляется около 12-13 тысяч случаев заболевания раком шейки матки; 8 тысяч женщин умирает от этого заболевания. При этом аналогичный показатель смертности в США составляет только 3,5 тыс. женщин в год при сопоставимом количестве заболевших. Причиной этого является скрининг, проводимый в США и направленный на выявление ранних форм заболевания [11, 38-41].

Инфекции ВПЧ высокого риска обнаруживаются почти во всех случаях рака шейки матки; около 70% случаев рака шейки матки в мире связано с типами 16 и 18 [55, 89]. Хотя хроническая инфекция ВПЧ высокого риска считается необходимым условием для развития рака шейки матки, она не является достаточным условием, так как у подавляющего большинства женщин, инфицированных ВПЧ высокого риска, рак не развивается [90, 112, 148].

Генитальные инфекции ВПЧ, в первую очередь передаются путем генитального контакта, обычно (но не обязательно) посредством полового контакта [213]. Большинство инфекций ВПЧ являются временными и бессимптомными и не вызывают никаких клинических проявлений. Исследования показали, что более 90% новых случаев инфицирования ВПЧ, в том числе и ВПЧ высокого риска, самоизлечиваются или становятся недетектируемыми в течение двух лет. Исчезновение инфекции обычно происходит в первые 6 месяцев после инфицирования [113, 148, 149, 180].

Неонкогенными формами проявления инфекции ВПЧ являются аногенитальный кондиломатоз и рецидивирующий респираторный папилломатоз (РРП).

Практически все случаи аногенитального кондиломатоза – возникновение кондилом в аногенитальной области у мужчин и женщин – связаны с инфицированием ВПЧ низкого риска. Примерно за 90% случаев этого заболевания ответственны ВПЧ 6 и 11 типов, за оставшиеся 10 % случаев – ВПЧ 42 и 54 типов [4, 24].

Заболеваемость аногенитальным кондиломатозом наиболее высока среди женщин в возрасте 15-24 лет и мужчин в возрасте 20-29 лет [212]. Показатель заболеваемости аногенитальным кондиломатозом в некоторых регионах России достигает 120 – 150 человек на 100 тыс. населения. Кондиломы у детей часто появляются в результате инокуляции вируса при рождении [31, 44, 175, 214].

Аногенитальный кондиломатоз обычно развивается примерно через 2-3 месяца после заражения ВПЧ. Однако, не все у всех лиц, инфицированных ВПЧ 6 и 11 типов, развиваются остроконечные кондиломы. Кондиломы аногенитальной области поддаются лечению, хотя многие (20-30%) спонтанно регрессируют [190].

Клинические проявления остроконечных кондилом многообразны: в некоторых случаях они ограничиваются объемным образованием в перианальной области, в других – появляются жалобы на кровотечение, зуд, дискомфорт.

Течение заболевания длительное, нередко осложняющееся присоединением вторичной инфекции [7, 12, 31].

Несмотря на отсутствие летальных случаев, аногенитальные кондиломы наносят существенный вред здоровью, снижают качество жизни пациентов и часто рецидивируют независимо от типа лечения [6, 9, 19, 21, 74, 103].

РРП является редким заболеванием, при котором в верхних дыхательных путях, в частности в гортани, образуются рецидивирующие папилломы.

Выделяют две формы респираторного рецидивирующего папилломатоза:

юношеский (с началом заболевания либо в младенческом возрасте, либо в возрасте 11-12 лет) и взрослый (возникающий в возрасте 30-40 лет и старше 60 лет) [5]. Юношеская форма, как полагают, возникает в результате передачи инфекции ВПЧ в перинатальный период от матери к ребенку во время родов.

Отмечено, что более чем у 75% больных симптомы РРП возникают до 5 лет, а пик заболеваемости приходится на детей первого (22,8 %) и второго (23,6 %) годов жизни [34].

РРП является тяжелой патологией. Рост папиллом в самом узком участке дыхательных путей приводит к выраженному стенозу гортани, вплоть до асфиксии. Заболевание длительно и клинически непредсказуемо [3, 37, 33].

Анализ литературы свидетельствует, что этиологическим фактором РРП является вирус папилломы человека, преимущественно 6 и 11 типов. Это подтверждается в подавляющем большинстве случаев при исследовании биопсийного материала удалённых папиллом гортани методом полимеразной цепной реакции [1, 3].

ВПЧ-инфекция вызывается вирусом и потому сама инфекция практически не излечима; лечение направлено на облегчение состояний, ассоциированных с инфекцией ВПЧ. Основная цель лечения видимых аногенитальных папиллом – их удаление. У большинства пациентов лечение помогает на какой-то период избавиться папиллом. Единственного и универсального метода лечения, идеально подходящего всем пациентам, не существует. Большинству пациентов требуется курс терапии, а не однократное лечение [190]. Удаление кондилом не исключает последующей передачи вируса партнеру, поскольку пациент остается вирусоносителем и при поверхностном расположении в коже зараженных клеток может являться источником инфицирования [13, 14].

К настоящему времени в миресуществуют две вакцины против ВПЧ, лицензированные FDA (Food and Drug Administration of the United States Department of Health and Human Services, USA): квадривалентная вакцина (ВПЧ4;

Гардасил, Merck и Co, Inc) и бивалентная вакцина (ВПЧ2; Церварикс, Glaxo Smith Kline) [81]. Обе вакцины состоят из вирусоподобных частиц, полученных из рекомбинантного капсидного белка L1 целевых типов ВПЧ. Вакцина Церварикс направлена против двух онкогенных типов (ВПЧ 16 и 18), вакцина Гардасил направлена против двух онкогенных типов (ВПЧ 16 и 18) и двух неонкогенных типов (ВПЧ 6 и 11). Вакцины являются профилактическими и не оказывают терапевтического эффекта на заболевания, связанные с ВПЧ или на риск прогрессирования болезни у лиц, которые имеют ВПЧ-инфекции во время вакцинации. Вакцина Гардасил получила в 2006 и 2009 годах лицензии от FDA для использования у женщин и мужчин в возрасте от 9 до 26 лет. Церварикс получила лиценз ию от FDA в 2009 году для использования у женщин в возрасте от 10 до 25 лет [79, 139].

Клинические испытания, в которых участвовали более 18 000 женщин в возрасте 15-25 лет для ВПЧ2 и более 20 000 женщин в возрасте 16-26 для ВПЧ4, продемонс трировали высокие уровни эффективнос ти обеих вакцин в профилактике предраковых состояний рака шейки матки, вызванными целевыми типами ВПЧ у женщин, не имевших инфекции во время вакцинации. ВПЧ4 также продемонс трировала высокую эффективнос ть против ВПЧ 6 и ВПЧ 11, вызывающих образование остроконечных кондилом у мужчин и женщин (56, 78, 80, 156, 174].

Высокоспецифичная терапевтическая вакцина для иммунотерапии ВПЧ высокого и низкого риска, активирующая Т-клеточный иммунный ответ против антигенов ВПЧ, экспрессируемых в инфицированных клетках, позволила бы в случае инфекции ВПЧ низкого риска избежать рецидивов заболевания или снизить их число, а в случае ВПЧ высокого риска избежать поражений, ведущих к аномальным изменениям эпителиальных клеток, возникновению предракового состояния и инвазивному раку [17, 29].

Таким образом, создание высокоспецифичной терапевтической вакцины для иммунотерапии ВПЧ высокого и низкого риска, к которым относятся 16/18 и 6/11 типы соответс твенно, способствует повышению качества жизни и здоровья населения РФ и является актуальной задачей.

1.2. Принцип действия вакцины для иммунотерапии заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 6, 11, 16 и 18 типов Для создания терапевтической вакцины против ВПЧ необходимо выбрать антиген для стимуляции специфического иммунного ответа.

Белок Е7 играет ключевую роль в репликации ВПЧ и способен влиять на дифференциацию инфицированных клеток. Белок Е7 нарушает регуляцию контроля клеточного цикла, образуя стабильный неактивный комплекс с серией регулирующих клеточный цикл белков, инициирует репликацию вирусных генов и нарушает регуляцию пролиферации инфицированных клеток [28, 73].

Белок Е7 является белком исключительно вирусного происхождения, постоянно присутствует в инфицированных клетках и отсутствует в неинфицированных, поэтому он является подходящей мишенью для высокоспецифичной иммунотерапии для предотвращения и лечения папилломатоза.

Иммуногеннос ть белка Е7 в составе терапевтических вакцин может быть увеличена за счет присоединения к нему белка-носителя, который стимулирует Тклеточный ответ. Этим белком может являться белок теплового шока HSP70 Mycobacterium tuberculosis. Иммунные системы животных способны распознавать многочисленные B и T клеточные эпитопы, которые присутствуют в составе этого белка, что позволяет ему выполнять функцию мощного неспецифического стимулятора иммунной системы [170]. Показано, что для того чтобы стимулировать полноценный иммунный ответ, E7 должен располагаться на Nконце относительно белка HSP70 [132].

Таким образом, иммунотерапия нацелена на активацию Т-клеточного иммунного ответа против антигенов ВПЧ, экспрессируемых в инфицированных клетках [121], а антиген, активный компонент вакцины, используемый для стимулирования специфического ответа против ВПЧ, представляет собой рекомбинантный гибридный белок Е7-HSP70, то есть онкобелок Е7 ВПЧ 6, 11, 16 или 18 типов, слитый с аминокислотной последовательностью белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (HSP70) бактерий Mycobacterium tuberculosis [15].

1.3. Белки E7 – их структура и функции Трансформация клеток белками Е7 ВПЧ. В середине 1980-х годов было признано, что геномы ВПЧ высокого риска кодируют некую активность, направленную на трансформацию клеток. Это было показано при исследовании на линии фибробластов грызунов, таких как клетки NIH3T3 [218] или в классических клетках для анализа онкогенов – в клетках почек крысят [141].

Последующие мутационные исследования показали, что в этих системах анализа основную роль в трансформирующей активности ВПЧ высокого риска играет белок Е7 [49, 120, 162, 206, 207, 219].

Более поздние исследования показали, что экспрессия клонированных геномов ВПЧ высокого риска в клетках, являющихся природным хозяином ВПЧ, т.е. в эпителиальных клетках гениталий человека, вызывает увеличение продолжительности жизни и иммортализацию клеток, ингибирует дифференциацию кератиноцитов и облегчает иммортализацию [181, 215].

Мутационный анализ показал, что белок Е7 совместно с белком E6 необходим для трансформационной активнос ти в эпителиальных клетках человека [49, 106, 117, 150, 151]. Трансформирующая активнос ть белков Е7 ВПЧ коррелирует с классификацией ВПЧ низкого риска/высокого риска. Так, белки Е7 ВПЧ низкого риска, в частности ВПЧ 6 и 11 типов, показывают значительное снижение способности к трансформации и иммортализации по сравнению с белками Е7 ВПЧ высокого риска [47, 105].

Биохимические характеристики белков Е7. Белки Е7 представляют собой небольшие кислые полипептиды, состоящие приблиз ительно из 100 аминокислот (Рисунок 1). N-конец E7 содержит область, чья последовательность сходна с частью консервативной области 1 (conserved region 1, CR1) и полной консервативной областью CR2 аденовируса Ad Е1А, а также с последовательностями, родственными последовательностям большого опухолевого антигена (Т Ag) вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40) [86, 162, 205].

Консервативные области CR1 и CR2, как и SV40 Т Ag и Ad Е1А, вносят значительный вклад в трансформирующую активность онкобелков Е7 ВПЧ высокого риска [119, 161, 186, 208]. Мотив Leu-X-Cys-X-Glu (LXCXE) в гомологичной области CR2 является необходимым и достаточным для связывания белка Е7 с белком-супрессором опухоли ретинобластомы PRB (англ.

retinoblastoma tumor suppressor protein, PRB) [150]. С-конец Е7 содержит домен связывания цинка, который состоит из двух мотивов Cys-X-X-Cys и функционирует как домен димеризации [48, 61, 133, 154].

У белка E7 отсутс твует какая-либо природная ферментативная активность и специфическая ДНК связывающая активнос ть, и в настоящее время признается, что биологическая активность E7 связана с его способностью подрывать нормальную деятельность клеточных регуляторных комплексов путем взаимодействия с ними.

На рисунке 1 [145] схематично изображен онкопротеин ВПЧ Е7 и процесс трансформации клеток.

–  –  –

Нес труктурированный N-конецевой домен из Е7 ВПЧ 16 типа размером 37 аминокислотных остатков имеет последовательности сходные с частью CR1 (зеленый) и полноразмерной CR2 (красный) аденовируса Ad Е1А со специфическими идентичными и химически сходными аминокислотными остатками, указанными красными и синими блоками соответственно.

Последовательности CR1 необходимы для трансформации клеток и деградации белка-супрессораPRB, но напрямую не способствуют связыванию PRB. Ядро сайта связывания PRB (LXCXE) необходимое для трансформации находится в CR2, прилегает к консенсус-последовательности сайта фосфорилирования казеинкиназы II (CKII). Здесь показан С-конецевой домен E7, чья с труктура определена с помощью рентгеновской кристаллографии [154]. Эта часть последовательности E7 имеет компактную 12, 32 топологию и представляет собой уникальную структуру, связывающую цинк. Клеточные процессы, затронутые E7 и обсуждаемые в этой главе, указаны в серых блоках на рисунке 1.

Аминокислотные Сравнение белков Е7 различных типов ВПЧ.

последовательности белков Е7 6, 11, 16 и 18 типов ВПЧ были проанализированы c помощью программы CLUST ALO [69] и показано, что четыре белка Е7 имеют 32 идентичные аминокислотные поз иции (выделение серым цветом на рисунке 2).

При сравнении белков Е7 попарно, исходя из классификации по степени риска, белки Е7 высокой степени риска, то есть Е7 16 и 18 типов имеют 40 % гомологии, а белки Е7 низкого риска, т.е. Е7 11 и 6 типов, имеют 54,5 % гомологии (Рисунок 2).

–  –  –

Можно предположить, что при экспрессии гибридных рекомбинантных белков, в состав которых входят гомологичные белки Е7 6, 11, 16, 18 типа, их штаммы-продуценты будут иметь при культивировании сходные свойства.

–  –  –

Белки теплового шока (Heatshockprotein, HSP) относятся к семейству стрессовых белков и представляют собой полифункциональные белки, метаболизм которых в клетках изменяется в ответ на воздействие неблагоприятных условий. Внутриклеточный уровень стрессовых белков (в том числе HSP) повышается в условиях теплового стресса, ацидоза, гипоксии или гипероксии, энергетического истощения клетки, а также при вирусных и микробных инфекциях [127].

Важнейшими свойствами белков HSP являются их способность к улучшению презентации антигена на поверхности дендритных клеток и макрофагов, а также способность выступать в роли носителей иммуногенных пептидов [15, 29, 91, 124, 134].

Одними из наиболее важных представителей белков HSP являются белки семейства HSP70. В настоящее время известно более 10 представителей HSP 70 эукариот [51]. В качестве основного компонента новых препаратов наиболее предпочтительным является использование HSP 70 молекулярной массой около 70 кДа из Mycobacterium tuberculosis, поскольку этот белок вызывает наиболее мощную стимуляцию клеточного иммунологического ответа к связанным с ним антигенным пептидам [10,15].

1.5. Примеры получения фьюза Е7-HSP-70

Рекомбинантные гибридные белки, состоящие из слитых последовательностей белка Е7 и белка теплового шока HSP70, могут быть получены в клетках бактерий или дрожжей, несущих экспрессионную конструкцию [10, 17, 27].

В патенте компании «Stressgen Biotechnologies corp.» [25] описан способ лечения заболеваний, связанных с ВПЧ (бородавки, рак шейки матки и прямой кишки и т.д.) с помощью композиции, содержащей гибридный белок, включающий микобактериальный белок теплового шока (HSP 65 или HSP 70 из Mycobacterium bovis) и белок ВПЧ. Лечение может осуществляться либо путем введения пациенту рекомбинантного гибридного белка, либо путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, которая содержится в вирусном векторе. Клинические испытания этой вакцины дали положительный результат – при лечении рецидивирующего респираторного папилломатоза трехкратное применение вакцины в дозе 500 мкг позволило более чем на 40% увеличить интервал между рецидивами.

Российская компания ООО «Аванген» разработала способ получения препарата на основе гибридного белка Е7-HSP70, состоящего из онкобелка Е7 ВПЧ 11 типа и белка HSP70 Mycobacterium tuberculosis [29]. Дозировка белка Е7HSP70 в препарате «Аванген» составляет от 100 до 2500 мкг, при этом препарат обладает высокой степенью стандартности и слабой реактогеннос тью. В способе, разработанном ООО «Аванген», биосинтез целевого белка осуществляют в клетках Escherichia coli, трансформированных плазмидой pQE30-E711-dnaK.

После разрушения клеток бактерий тельца включения отмывают и проводят денатурацию-ренатурацию целевого белка. Исходя из описания [29], можно предположить, что отсутствие в процессе получения белка Е7-HSP70 специфических стадий очистки препарата от комплекса липополисахаридов (ЛПС) будет приводить к тому, что препараты белка Е7-HSP70, получаемые согласно описанной процедуре, будут содержать значительное количество бактериального ЛПС, обладающего токсичным и пирогенным действием. Тем самым применение в лечебных целях белка Е7-HSP70, синтезированного в клетках E. coli, будет затруднено.

Дрожжевые штаммы-продуценты имеют ряд преимуществ по сравнению с бактериальными. Дрожжи S. cerevisiae входят в список микроорганизмов, безопасных для человека и не содержат комплекс токсичных и пирогенных бактериальных липополисахаридов [100].

Одним из важнейших преимуществ дрожжевых продуцентов по сравнению с бактериальными продуцентами является их способность к выделению растворимого целевого белка в больших количествах в среду культивирования.

Но в случае с гибридным белком Е7-HSP70 получить такой штамм не удалось [17]. Целевой белок Е7-HSP70 накапливается внутриклеточно в растворимой форме. Способ получения гибридного белка Е7-HSP70 состоит из следующих этапов: биосинтеза рекомбинантных белков в клетках генномодифицированных штаммов-продуцентов дезинтеграции клеточной биомассы, S. cerevisiae, осветлении клеточного лизата, выделении, хроматографической очистки рекомбинантных белков до чистоты не менее 95% и создании на их основе композиции для иммунотерапии.

1.6. Производство рекомбинантных белков в S. cerevisiae в промышленных условиях В нас тоящее время производство рекомбинантных белков является многомиллиардным рынком [142]. Разработка нового продукта начинается с выбора штамма-реципиента, в котором будет экспрессироваться рекомбинантный белок. Поскольку одного идеального штамма-реципиента для всех рекомбинантных белков не существует, то на практике используются несколько систем экспрессии – от бактериальных реципиентов до клеток млекопитающих.

По сравнению с прочими реципиентами, дрожжи сочетают в себе преимущества одноклеточных микроорганизмов, такие как быс трый рос т и простота генетических манипуляций, и преимущества эукариотических организмов, в том числе наличие путей секреции, ведущих к корректному процессингу, и системы пост-трансляционной модификации рекомбинантных белков, которая необходима для биологической активнос ти и с табильнос ти белка.

Дрожжи способны секретировать многие белки в культуральную среду в растворимой и биологически активной форме, что может значительно упрос тить выделение и очистку рекомбинантного белка.

Некоторые дрожжи, в том числе S. cerevisiae, Kluyveromyces marxianus var.

marxianus и K. marxianus var. lactis широко используются в пищевой промышленности и имеют статус безопасных (англ. generally regarded as safe, GRAS) [142]. Это является важным преимуществом для их использования в пищевой или фармацевтической промышленности, так как, в таком случае, регулирующие органы требуют проведения менее обширных испытаний безопасности штамма-продуцента.

1.6.1. Штаммы-реципиенты, используемые при производстве рекомбинантных белков Получение белков путем экспрессии в генно-инженерных организмах изначально являлось альтернативой их экстракции из природных ис точников.

Природные источники белков часто ограничены, концентрация в них целевого продукта, по большей части, низка, что делает выделение белков из них дорогостоящим или даже невозможным. Кроме того, в зависимости от природного происхождения белка, выделенный белок быть загрязнен токсичными или инфекционными агентами. В случае же гибридных белков, не имеющих природных аналогов, каким и является белок E7-HSP70, использование генноинженерного штамма – единственно возможный способ получения продукта.

Первым рекомбинантным продуктом на мировом рынке, произведенным с помощью генно-инженерных методов, стал инсулин (1982 г. препарат Humulin, компания Eli Lilly). За ним последовали многие биофармацевтические белки, такие как интерферон, эритропоэтин, вакцины; в последнее время появились технологии получения моноклональных антител, а также промышленных ферментов.

S. cerevisiae изначально являлся модельным организмом для экспрессии гетерологичных генов в дрожжах. Первым продуктом гетерологичного гена, экспрессированным в S. cerevisiae, был кроличий -глобулин [50].

Сегодня производство рекомбинантных белков является многомиллиардным рынком. В 2008 году продажи биофармацевтических белков составили 87 млрд.

долларов и, как ожидается, в 2014 году возрастут до 169 млрд. долларов США [99, 136]. Рынок промышленных ферментов составлял 5,1 млрд. долларов США в 2009 году и, по прогнозам, вырастет до 6,5 млрд. долларов США в 2013 году [216].

В 2009 году из 151 утвержденных рекомбинантных биофармацевтических продуктов, более чем 40 % дохода принесли 29 моноклональных антитела, далее идут вакцины, TNF-блокаторы и гормоны, такие как инсулин и эритропоэтин.

Около 20% биофармацевтических белков производятся в дрожжах, 30% - в E. coli и 50% в клетках высших эукариот, в основном, в клетках млекопитающих и гибридомах [83].

В нас тоящее время почти все продукты дрожжевого происхождения, существующие на рынке, производятся в S. cerevisiae. В 2009 годуFDAодобрило первый биофармацевтический белок, произведенный в не-Saccharomyces дрожжах

– ингибитор калликреина, полученый в Pichia Pastoris (Kalbitor производства «Dynax Inc»)).

Несмотря на то, что большое число белковых препаратов производятся в клетках высших эукариот, по-прежнему существует значительный интерес биофармацевтической промышленнос ти к разработке улучшенных микробных платформ для экспрессии рекомбинантных белков (в основном в E. coli и дрожжах).

Доминирование в качестве продуцента для производства E. coli гетерологичных белков отражает количество и качество информации, накопленной к настоящему времени, о генетике, молекулярной биологии, биохимии и технологии культивирования. Фракция рекомбинантных белков, экспрессируемых в E. coli, может достигать до 50% от общего веса биомассы [157]; разработаны протоколы для культивирования клеток до высокой плотности (HCDC), позволяющие получать до 100 г биомассы на литр [194].

Бактериальные продуценты не обладают системой посттрансляционной модификации белка и, в большинстве случаев, гетерологичные белки экспрессируются внутриклеточно в виде телец включений, что приводит к потере ферментативной активности рекомбинантного белка. Если белки не могут быть правильно повторно ренатурированы in vitro из неактивной денатурированной формы, любое их использование в организме человека исключается.

Нужно отметить, что благодаря достижениям генной инженерии к настоящему времени, догма, что штаммы E. coli не способны секретировать или гликозилировать рекомбинантные белки устарела: для прокариотических продуцентов были показаны и секреция внеклеточного белка [153], и гликозилирование [158]. Однако, достигнутые выходы (не более 100 мг/л секретируемого белка) и аутентичность гликанов далеки от аналогичных параметров эукариотических систем.

1.6.2. Дрожжевые штаммы-реципиенты

Огромные достижения в области молекулярной генетики дрожжей дали широкий спектр векторов, маркеров селекции, промоторов, терминаторов и сигналов секреции для экспрессии гетерологичных генов.

Преимущества использования дрожжей в качестве реципиентов уже были упомянуты выше – это и легкость генетических манипуляций, и способность к быстрому росту, и возможность осуществлять процессинг белка, характерный для эукариотических организмов, а также отсутствие эндотоксинов, онкогенной или вирусной ДНК. Начиная с 1980-х годов, большинство рекомбинантных белков, продуцируемых дрожжами, были экспрессированы в S. cerevisiae [111].

Однако, у штаммов S. cerevisiae есть и существенные недос татки – они обладают сильным метаболизмом брожения и показывают невысокую продуктивность по рекомбинантному белку. Кроме того, рекомбинантные белки, продуцируемые часто гипергликозилированы; также часто S. cerevisiae, наблюдается удержание продукта в периплазматическом пространстве с последующей его частичной деградацией [173, 178, 167]. Эти продукты деградации, как правило, очень трудно удалить из финального продукта.

Указанные недос татки способствовали тому, что, начиная с середины 1980-х годов, шел поиск альтернативных дрожжевых штаммов-реципиентов. Началась разработка систем экспрессии в, так называемых, нетрадиционных дрожжах.

Наиболее известными и яркими примерами нетрадиционных дрожжей являются Hansenula polymorpha [94, 189, 197], Pichia pastoris [66, 135], Kluyveromyces lactis [200], Kluyveromyces marxianus [88], Yarrowia lipolytica [137], Arxula adeninivorans [53, 185], Pichia methanolica [172], Schizos. pombe [191] и Zygos. bailii[70].

–  –  –

Выбор дрожжевого хозяина имеет первостепенное значение для эффективности всего процесса культивирования и получения целевого рекомбинантного белка. На эту тему, в последние годы были опубликованы различные обзоры [54, 57, 59, 77, 92, 94]. Как правило, дрожжевые хозяева делятся на две основные категории: (а) традиционные и нетрадиционные или (б) Крэбтри положительные и Крэбтри отрицательные. В этом отношении S.

cerevisiae, являются традиционными дрожжами и одними из немногих Крэбтри положительных дрожжей (то есть в аэробных условиях продуцируют этанол). Тем не менее, с учетом последних тенденций в области систем для экспрессии гетерологических белков, дрожжи должны быть сгруппированы в две категории:

неметилотрофные и метилотрофные (Таблица1).

Во многих дрожжах дикого типа, перечисленных выше, отсутствуют и эндотоксины, и литические вирусы, которые могут проявлять свою активность при производстве этанола, напитков, ароматизаторов, ферментов, витаминов, органических кислот и дрожжевой биомассы. Главным преимуществом неметилотрофных продуцентов по сравнению с метилотрофными является продолжительная история изучения и использования этих дрожжей молекулярными биологами, биохимиками, физиологами и технологами. Больше всего это относится к S. cerevisiae, и меньше – к К.lactis и Y.lipolytica, геном

–  –  –

шаблоном при экспрессии белка. Метод, используемый для введения ДНК в клетку реципиента, влияет на количество копий ДНК, которое в свою очередь имеет большое значение для продукции белка.

Скорость транскрипции белка определяется несколькими факторами, в том числе, силой промотора и тем, конститутивный или регулируемый промотор был выбран. Образованная в ходе транскрипции мРНК транслируется в аминокислотную последовательность. Фолдинг и, возможно, посттрансляционные модификации происходят перед секрецией белка. Дрожжевые клетки также содержат специальные механизмы для удаления некорректно фолдированных белков. Белки при этом расщепляются и их строительные блоки используются в клетке повторно [128].

Рисунок 3. Экспрессия рекомбинантных белков в дрожжевых клетках

–  –  –

Разработка нового продукта начинается с выбора штамма-реципиента и экспрессионного вектора. Выбор, сделанный на этом этапе, будет оказывать влияние на последующие стадии процесса и весь производственный процесс вцелом, в том числе на процесс культивирования штамма-продуцента и очистку рекомбинантного белка [142].

Ядром, основой биотехнологического процесса, базирующимся на дрожжевом штамме-реципиенте, является культивирование штамма в реакторе.

Любой перспективный результат, полученный при культивироваии в колбе, который не воспроизводим в биореакторе, является с промышленной точки зрения бессмысленным. Высокоэффективный процесс ферментации должен быть как можно более коротким и дешевым с высокой объемной производительностью.

Важнейшую роль играют параметры экспрессии рекомбинантного белка – является ли синтез белкавнутриклеточным или внеклеточным, является ли белок растворимым или нерас творимым, высок или низк выход рекомбинантного белка.

Все эти параметры определяют процесс выделения и очис тки белка, а, главное, расходы на выделение и очистку целевого белка. Нужно учитывать, что расходы на эти стадии процесса составляют основную часть себестоимости продукта – не менее 70–95% от себестоимости продукта [109].

1.6.5. Разработка процесса культивирования

Наиболее распространенной ферментационной стратегией для культивирования рекомбинантных микроорганизмов, позволяющей получить высокую концентрацию биомассы, является полунепрерывное культивирование с подпиткой. Конкретные детали протокола оптимиз ированного культивирования с подпиткой в значительной степени зависят от физиологических параметров штамма-продуцента. Основными моментами, которые следует учитывать, являются два вопроса:(1) является ли штамм-хозяин Крэбтри-положительным или отрицательным по отношению к субстрату? (2) является ли экспрессия продукта конститутивной или регулируемой и, если регулируется, то каким образом?

Если штамм Крэбтри-положительный, то выход биомассы в периодической фазе культивирования будет сравнительно низким (0,1 - 0,2 г сухой биомассы / г потребленного субстрата), а образовавшиеся побочные продукты (в основном этанол) должны будут метаболизироваться, прежде чем начнется фаза подпитки, в результате чего время, необходимое для периодической фазы, увеличится.

Скорость подачи углеродсодержащего субстрата должна быть ограничена таким образом, чтобы предотвратить возможную аэробную ферментацию. Обычно это приводит к скорости роста ниже 0,1 час -1 [142]. Оптимальная скорость подачи углеродсодержащего субстратане должна превышать критического предела удельной скорости потребления сахара.

Второй важной задачей для оптимизации скорости подачи подпитки является максимизация выхода по продукту, что, конечно, важно и для Крэбтриотрицательных дрожжей. Синтез продукта может быть положительно связан с ростом, быть независимым от роста или отрицательно связан с ростом.

Положительная связь скорости образования продукта и удельной скорости роста была отмечена в ряде различных типов процессов и может рассматриваться как парадигма для продукции гетерологичного белка в дрожжах [67, 115, 125, 143]. Отклонение от этой модели в основном наблюдается для секретируемых белков и может быть связано с ограничениями в секреции при высокой удельной скорости роста [169]. В таком случае, на первый взгляд, оптимизация процесса должна означать увеличение удельной скорости роста. Тем не менее, наиболее важным параметром промышленного процесса является не удельная скорость образования продукта, а объемная производительнос ть на единицу объема ферментера и времени (или выход на единицу объема и времени, space time yield;

вычисляется путем деления общего продукта на фактический объем и время культивирования), определяющая расходы по использованию ферментационного оборудования, и финальный титр продукта, как основной параметр для начальных стадий очистки.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Похожие работы:

«Чикаев Антон Николаевич Пептиды-имитаторы эпитопов ВИЧ-1, узнаваемых нейтрализующими антителами широкого спектра действия 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, проф....»

«ХУДЯКОВ Александр Александрович ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT В РАЗВИТИИ АРИТМОГЕННОЙ КАРДИОМИОПАТИИ НА МОДЕЛИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор...»

«ШАРАВИН Дмитрий Юрьевич IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А.И. Саралов Пермь – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СТР. ВВЕДЕНИЕ.. 4...»

«УДК 5 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 «антропология» по биологическим наукам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор исторических наук, чл.-корр. РАН А.П. БУЖИЛОВА...»

«БОЛГОВА Светлана Борисовна РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Антипова...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«ТИТОВА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА Влияние фитопатогенных микроорганизмов на энзиматическую активность растения-хозяина Glycine max (L.) Merr. и Glycine soja Sieb. et Zucc. 03.02.08 ЭКОЛОГИЯ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., доцент Семенова Е.А. БЛАГОВЕЩЕНСК –...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«АСБАГАНОВ Сергей Валентинович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТРОДУКЦИИ РЯБИНЫ (SORBUS L.) В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. А.Б. Горбунов Новосибирск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 8 Ботаническая...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических...»

«МАХАЧЕВА ХАННА ГАДЖИЕВНА СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ МОДЕРНИЗАЦИИ ОТОРИНОЛАРИНГОЛОГИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ В РЕСПУБЛИКЕ ДАГЕСТАН 14.01.03 – болезни уха, горла и носа 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Н.А. Дайхес доктор медицинских наук, профессор Л.М. Асхабова...»

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент И.В. КИСЕЛЕВА Санкт-Петербург – ОГЛАВЛЕНИЕ Раздел 1....»

«Рагимов Александр Олегович ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПОЧВ В ФОРМИРОВАНИИ УРОВНЯ БЛАГОПОЛУЧИЯ НАСЕЛЕНИЯ ВЛАДИМИРСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Черногаев Виталий Геннадьевич ВОЗДЕЙСТВИЕ ТЕХНОГЕННЫХ НАРУШЕНИЙ НА ДИНАМИКУ ПОЧВЕННО-РАСТИТЕЛЬНОГО ПОКРОВА МЕЩЕРСКОЙ НИЗМЕННОСТИ Специальность 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ПЛОТНИКОВ ВАДИМ АЛЕКСЕЕВИЧ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ПТИЦ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 03.02.02 вирусология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководительдоктор биологических наук, профессор Алипер Т. И. Москва-20 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ И ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск...»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бакиев А.Г. Тольятти – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. К...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.