WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 |

«Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis ...»

-- [ Страница 2 ] --

5 показана связь между оптической плотностью реакционной смеси и концентрацией аналитов без добавления АО.

На основании этих данных можно сделать вывод, что только формальдегид (кривая А) образует окрашенный продукт с МБТГ в отсутствие АО, но ни метанол, ни муравьиная кислота не образуют (кривые B и C, соответственно). Добавление этого фермента в первой стадии реакции, в присутствии MБТГ, приводит к окислению метанола в формальдегид, который образует окрашенный продукт (рис. 6). Очень схожие результаты этих значений указывают на практически полное окисление метанола до формальдегида в реакции, катализируемой АО. Как видно, АО может окислять, кроме метанола, также формальдегид с образованием муравьиной кислоты, которая не образует окрашенного продукта в реакции с ионами железа (III) (см. рис. 4.14, кривая C).

А 0,8

–  –  –

аддукта формальдегида с MБТГ который, в отличие от свободного формальдегида, не может быть окислен АО, но принимает участие в последующей колориметрической реакции с ионами железа в кислой среде.

0,8

–  –  –

связывающее формальдегид и тем самым предотвращающее окисление формальдегида с участием АО. МБТГ также используется в качестве субстрата для этого аналита в последующей колориметрической реакции с ионами железа. Это означает, что добавление АО к смеси MБТГ не влияет на результаты определения формальдегида, уже присутствующего в тестируемых пробах. Эти выводы подтверждает анализ содержания метанола и формальдегида в модельных растворах (общая концентрация обоих аналитов - 10 мкМ) без добавления АО и в присутствии этого фермента (рис. 8, кривые А и B, соответственно).

Из полученных результатов следует: во-первых, в отсутствие АО, увеличение концентрации метанола не влияет на результаты определения формальдегида, во-вторых, в присутствии АО наблюдали практически те же значения оптической плотности смеси этих двух аналитов в различных молярных соотношениях, но в той же суммарной концентрации.

Об этом свидетельствует увеличение оптической плотности, возникающее при анализе формальдегида уже присутствующего в пробе и формальдегида, вновь образованного из метанола в реакции, катализируемой АО.

–  –  –

Относительное содержание аналитов, молярные % Relative content of the analytes, mole % формальдегида и метанола в смеси был использован для определения этих соединений в образцах различного происхождения промышленных сточных водах (после кислотной дистилляции) и коммерческом продукте формалине, который содержит формальдегид и метанол (как стабилизатор для предотвращения полимеризации формальдегида). Результаты определений в сточных водах показаны в таблице 6. На основании этих данных можно утверждать, что результаты, полученные ферментативно-химическим методом аналогичны результатам, полученным с помощью химических методов и ГХ.

Таблица 6. Определение метанола и формальдегида в разбавленных промышленных стоках после кислотной дистилляции, а также в техническом формалине

–  –  –

На рис. 10 представлены линии регрессии корреляции данных, полученных предложенным методом, и двумя референтными методами. Более низкий коэффициент корреляции с хроматографическим методом можно объяснить сложностью процесса анализа метанола и формальдегида методом ГЖХ.

–  –  –

Рис. 10. Корреляция между результатами определения метанола (мг/л) полученными методом газовой хроматографии (А), химическим методом (В) по отношению к результатам ферментно-химического метода Таким образом, разработан новый ферментно-химический метод для одновременного определения метанола и формальдегида в образцах, содержащих оба этих вещества, с использованием АО и MБТГ. Фермент АО окисляет метанол до формальдегида, а MБТГ играет двойную роль: на первом этапе реакции образуется бесцветный азиновый аддукт с присутствующим ранее и ФА, образованным в результате ферментной реакции, предотвращая его окисление под влиянием АО; на втором этапе реакции происходит окисление азинового аддукта в окрашенный продукт под влиянием Fe+3 в кислой среде. Возможность одновременного определения метанола и формальдегида предложенным методом доказана как на модельных смесях, так и для проб сточных вод фабрики по производству пластмасс в Пусткове (Польша), а также для технического формалина Предлагаемый метод, в отличие от химических методов, не требует использования вредных, агрессивных химических веществ (серная, фосфорная или хромотроповая кислоты, перманганат калия), проще в реализации и может быть использован для контроля аналитов в промышленных сточных водах и различных продуктах, содержащих формальдегид.

4. Конструирование элементов биосенсоров, селективно реагирующих на метанол, этанол и формальдегид.

Возможность использования мутантных клеток метилотрофных дрожжей для разработки биосенсоров, селективных для спиртов (метанол, этанол) и формальдегида, была предметом экспериментальных исследований, изложенных в данной главе.

План опытов включал:

селекцию мутантов метилотрофных дрожжей с генетически модифицированным физиологическим ответом на целевые аналиты - метанол, этанол и формальдегид по следующим параметрам: 1) потребление кислорода, 2) выделение перекиси водорода;

химическую модификацию мутантных клеток в целях повышения селективности аналитического ответа клетки: снижение проницаемости мембран (пермеабилизация) клеток дигитонином или бромидом цетилтриметиламмония;

конструирование биораспознающих элементов путем иммобилизации генетически или химически модифицированных дрожжевых клеток на поверхности трансдуктора;

изучение аналитических характеристик лабораторных прототипов биосенсоров для анализа метанола, этанола или формальдегида.

Для анализа спиртов разработаны микробные амперометрические биосенсоры на основе сконструированных мутантов дрожжей с модифицированной физиологической реакцией на аналит. До сих пор предложено много биосенсоров с использованием амперометрических трансдукторов. В большинстве из них используются селективные электроды: кислородный и перекисный. Для повышения селективности сенсоров использованы методы метаболической инженерии. Нами целенаправленно введены мутации, которые тормозили реакции, связанные с использованием кислорода (кислородный биосенсор) или продукцию других электрохимически активных веществ, способных взаимодействовать с электродом (например, перекись водорода с перекисным электродом). С другой стороны, мы использовали химическую модификацию клеток для повышения проницаемости клеточной мембраны для веществ с низкой молекулярной массой.

Мутантный штамм H. polymorpha 7-4А (gcr1 EАО) с нарушенной катаболитной репрессией и повышенным конститутивным синтезом АО был выделен после мутагенеза УФ из штамма H. polymorpha 33 (gcr1). Колонии с повышенной активностью фермента обладали активностью АО в присутствии ингибитора АО - азида натрия. Другой мутант H. polymorpha C-105 (gcr1 catX) с неактивной каталазой был селекционирован из штамма 33 с нарушенной катаболитной глюкозной репрессий АО. Он неспособен к разложению экзогенной перекиси водорода до кислорода. Изучение дыхательной селективности клеток штамма 7-4А в отношении различных субстратов показало, что зависимое от этанола использование кислорода клетками мутанта 7-4А при росте на глюкозе было на порядок выше по сравнению с диким типом.

Увеличение дигитонином или бромидом цетилтриметиламмония проницаемости мембраны мутантов незначительно усиливаало их зависимое от алкоголя потребление кислорода. Фермент АО, который использует кислород для непосредственного окисления алкоголя, имеет высокую молекулярную массу (около 600 кДа) и содержит нековалентно связанный ФАД в качестве простетической группы. Эти особенности вызывают неспособность АО диффундировать через мембраны клеток, что позволяет использовать их в качестве естественной формы "инкапсулированной АО”.

Отсутствие каталазы у мутанта С-105 вызывало выделение перекиси водорода во время инкубации клеток с метанолом. Увеличение проницаемости мембран, вызванное дигитонином или бромидом цетилтриметиламмония мутантных клеток увеличивает в 4 раза секрецию клетками H2O2. Это связано с облегченной диффузией перекиси водорода через клеточные мембраны и, возможно, «вытеканием» из клеток некоторых ферментов. Как показано на рис. 11, мутанты 7-4А, и С-105 при росте на глюкозе имели высокую активность АО - с 4,5 до 6,0 Ед./мг белка в бесклеточных экстрактах.

Активность АО, Ед./мг

–  –  –

Клетки этих мутантов, иммобилизованные в геле альгината кальция и помещенные на поверхности O2- и H2O2- селективных электродов, были использованы в качестве биоэлементов алкоголь-специфичных сенсоров. Типичные кривые времени отклика для обоих микробных сенсоров показаны на рисунке 12. Сигнал для электрода «клетка/кислород» (1) возрастал быстрее, чем для электрода «клетка/перекись водорода» (2). Оба амперометрических биосенсора показывали высокую чувствительность нижняя граница чувствительности составляла 0,2 мМ для этанола и 0,03 мМ для метанола.

Сконструированные микробные биосенсоры проявляли подобную селективность к спиртам.

Наибольший отклик наблюдали в отношении метанола (100%), меньший - для этанола и формальдегида; очень слабый сигнал был зарегистрирован для глюкозы и глицерина, в отличие от других микробных сенсоров (рис. 13).

Амперометрический ответ, %

–  –  –

Очевидно, некоторые физиологические характеристики клеток метилотрофных дрожжей, таких как секреция H2O2 или потребление O2, могут быть использованы как специфичный сенсорный ответ на метанол, этанол или формальдегид.

5. Биосенсорное определение метанола в промышленных сточных водах.

В опытах по изучению возможности использования амперометрического биосенсора для определения метанола в окружающей среде использовали ферментный тип биоэлемента препарат АО H. polymorpha C-105 очищенный посредством осаждения сульфатом аммония и хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

АО использует кислород в процессе окисления метанола согласно реакции:

CH3OH + O2 HCHO + H2O2.

В присутствии метанола в ячейке сенсора, каталитическое действие АО, иммобилизованной в геле альгината кальция между тефлоновой и поликарбонатной мембранами, приводит к локальному снижению концентрации кислорода на чувствительной поверхности датчика, уменьшая ток в электроде Кларка. Сигнал достигал стационарного уровня после достижения в биомембране равновесия процессов диффузии кислорода и метанола. Разработанный биосенсорный метод был использован для анализа промышленных сточных вод крупного химического предприятия «Кендзежин» в городе Кендзежин-Козле (Польша). В пробах сточных вод, взятых на очистных сооружениях, показано наличие метанола (рис. 14). Для сравнения был использовали предложенный нами ранее ферментнохимический метод фотометрического определения метанола.

Представленный биосенсорный метод позволяет определять метанол в присутствии формальдегида, хотя формальдегид может также окисляться в реакции с АО. Это можно объяснить гораздо более низким сродством АО к формальдегиду по сравнению со сродством АО к метанолу. Даже 3-кратный избыток формальдегида по сравнению с метанолом не влияет на точность определения последнего. Как видно из данных, приведенных на рис. 14, результаты анализа метанола в промышленных сточных водах биосенсорным методом были схожи с данными, полученными при помощи ферментно-химического метода с использованием AГMT. Биосенсорный метод прост в использовании, требует только кислородный электрод и АО. Поскольку он подходит для непрерывного мониторинга содержания метанола в окружающей среде, его использование имеет большое будущее в химической, фармацевтической, промышленности, технологии очистки воды и сточных вод промышленных предприятий.

–  –  –

6. Разработка амперометрических биосенсоров на основе АО с использованием новых технологий.

В исследованиях по улучшению амперометрических биосенсоров использовали новые технологии:

иммобилизацию фермента на поверхности электрода путем электроосаждения в присутствии катодных/анодных полимеров;

дополнительное введение в структуру биоселективного слоя пероксидазы хрена;

включение в структуру электродного полимера осмий-содержащего переносчика.

Иммобилизация АО методом электроосаждения и изучение 6.1.

возможности использования АО в беспероксидазном биосенсоре. Использовали АО с удельной активностью 23 мкM.мин-1.мг-1. Биосенсоры конструировали в трех- электродной конфигурации. В качестве сравнительного электрода был использован Ag/AgCl/3М KCl (серебро-хлорид серебра), а в качестве дополнительного (вспомогательного) электрода был применен платиновый электрод, тогда как рабочий электрод был сформирован на основе графитового стержня. Матрицей для электроосаждения ферментов и химической "прививки" осмий-содержащего медиатора служили анодные и катодные полимеры.

6.2. Конструирование двухферментного биосенсора на основе АО и ПО. Изучена возможность введения в состав сенсорного элемента пероксидазы хрена (ПО). ПO в процессе пероксидазного восстановления перекиси водорода может принимать электроны от анода с участием медиатора, содержащего осмий. Образующаяся в результате оксидазной реакции H2O2 может негативно влиять на стабильность АО, поэтому важно было создать условия для быстрого разложения H2O2.

Оптимальная структура двухферментного электрода имела конфигурацию ПО/OsAР59//AO/СР9 и состояла из двух слоев: первый содержал пероксидазу хрена, введенную в состав полимера Os-АР59 путем электроосаждения, а второй (внешний) – алкогольоксидазу, иммобилизованную путем катодного электроосаждения в присутствии аминосодержащего полимера (СР9). Такая структура биоэлемента обеспечивает быстрый перенос электронов с поверхности электрода на окисленный активный центр ПО при участии осмий-содержащего полимера.

На рис. 15. показана схема конструкции двухферментного биосенсора на основе АО и ПО.

–  –  –

7. Мутантные формы AO H. polymorpha в качестве селективного элемента амперометрического биосенсора.

Выявление и количественное определение спиртов с высокой селективностью и точностью требуется в самых различных областях. Ферментативный и биосенсорный подходы относятся к числу наиболее подходящих аналитических методов в этой области.

Алкогольоксидаза дрожжей широко используется для количественного определения первичных спиртов и формальдегида, достигнут значительный прогресс в выборе оптимального трансдуктора, иммобилизации и стабилизации фермента. Однако, сродство АО к этанолу достаточно высокое, и прямое измерение целевого аналита на основе АО, например, этанола в реальных образцах вин, пива или бродильных культур, является сложным и экономически невыгодным из-за необходимости многократного трудоемкого разведения образцов. Для преодоления этого недостатка необходимо получение модифицированных форм АО со сниженным сродством к субстрату и широким диапазоном линейного отклика.

Нашей задачей была селекция штаммов метилотрофных дрожжей Н. polymorpha с уменьшенным сродством к этанолу, идентификация изменений в мутантных аллелях структурных генов АО у полученных штаммов, препаративное выделение мутантных форм белков, а также изучение возможности их использования в биосенсорных технологиях.

7.1. Мутагенез и селекция мутантных штаммов, скрининг мутантов по активности АО. Для выделения мутантов клетки исходного штамма дикого типа H.

polymorpha DL-1-356 культивировали в жидкой среде с глюкозой до середины логарифмической фазы роста, промывали дистиллированной водой, разводили до концентрации 106 клеток/мл и подвергали облучению УФ до 10%-ной выживаемости клеток.

Клетки после облучения высевали на агаризованную среду Беркхольдера, содержащую метанол (0,5%) и аллиловый спирт (0,3 мМ). Аллиловый спирт использовали в качестве селективного агента.

В случае окисления аллилового спирта алкогольоксидазой образуется токсичный для дрожжей акролеин. Это вещество вызывает гибель клеток с высокой активностью АО. С другой стороны, активность АО необходима для роста в среде с метанолом в качестве единственного источника углерода. Таким образом, среда, содержащая смесь метанола и аллилового спира, обеспечивает рост клеток с уменьшенной активностью АО и/или с уменьшенным сродством АО к спиртам. Путем разработанного нами метода селекции были получены три мутантных штамма - СА2, СА4 и СА5 с уменьшенным сродством АО к этанолу. Штамм СА5 обладал низкой активностью АО, поэтому в дальнейших исследованиях использовали штаммы СА2 и СА4.

Сродство АО к этанолу определяли путем кинетических исследований активности фермента в БЭ исходного (Shleev et al., 2006) и полученных мутантных штаммов H.

polymorpha СА2 и СА4 в присутствии различных концентраций этанола (0-100 мМ) используя реакцию окисления ABTS [2,2'-азинобис(3-этилобензотиазолинон-6-сульфонат)] пероксидазой. Было обнаружено, что мутантные штаммы CA2 и CA4 отличаются сродством к субстрату: значение КМ по отношению к этанолу для АО исходного и мутантных штаммов составляли, соответственно, 0,41; 1,95 и 1,00 мМ (таблица 7). Это показывает, что селекция клеток в соответствии с критерием устойчивости к акролеину позволяет получить мутанты дрожжей Н. polymorpha со пониженным сродством АО к субстрату.

Таблица 7. Значения KM по отношению к этанолу для АО исходного и мутантных штаммов Н.

polymorpha

–  –  –

7.2. Определение нуклеотидной последовательности мутантных аллелей структурных генов АО штаммов CA2 i CA4 H. рolymorpha и идентификация мутаций.

Мутантные аллели гена АО амплифицировали в реакции ПЦР с использованием праймеров:

5-LV1 (5'-CCC AAG CTT ATG GCC ATT CCT GAC GAA TTC-3'); 3-LV2 (5'-CCC AAG CTT TTA GAA TCT GGC AAG TCC G-3'), а также геномной ДНК, выделенной из H.

polymorpha DL-1-356 и из штаммов CA2 i CA4. Полученные в ПЦР-реакции продукты клонировали в составе плазмиды pUC57 и секвенировали. Последовательность нуклеотидов была транслирована в последовательность аминокислот и проведено сравнение со штаммом дикого типа. Обнаружено несколько замен аминокислот, которые отдельно или в совокупности, по-видимому, определяют уменьшенное сродство к субстрату – этанолу.

У обоих штамов отмечены изменения I V в позиции 21 и T S в позиции 527. Кроме того, в АО штамма CA2 произошли изменения аминокислот I V (45), E K (131), P L (148), K R (150), N D (306), F S (532) i W R (567). В мутантном белке штамма СА4 изменений аминокислот было меньше: кроме упомянутых это I V (232), P S (245), M V (246) i L P (602). Степень уменьшения сродства к субстрату коррелирует с общим количеством аминокислотных замещений, особенное значение могут иметь мутации в участках вблизи положений 20, 50, 150, 360 и 520-600 аминокислотных остатков.

У АО штамма СА2 выявлены 3 участка с незначительным изменением вторичной структуры (такое изменение касается только одного аминокислотного остатка: 148, 153, 366), 4 участка, где структурные изменения касаются 2 остатков (353-354, 531-532, 562-563, 569и один участок, где такие изменения охватывают 4 аминокислотных остатка (75-78).

Кроме того, можно выделить районы, где участки с измененной вторичной структурой находятся на расстоянии 4-11 аминокислотных остатков (148-153, 353-366, 562-570).

На основании анализа обоих мутантных форм АО можно сделать предположение, что изменения в эффективности связывания субстрата у этих форм не вызваны непосредственной заменой структуры субстрат-связывающего участка, а являются результатом модификации вторичной структуры, вследствие мутаций.

7.3. Выделение и очистка мутантных форм АО. Клетки мутантов H. polymorpha СА2 і СА4 выращивали на 1%-ном метаноле в качестве единственного источника углерода и энергии до середины логарифмической фазы роста (до концентрации 2,5 – 3,0 мг/мл). Далее использовали методику, аналогичную использованной ранее. Таким способом были получены препараты двух мутантних форм АО (м-АОСА2 и м-АОСА4) в количествах, близких 100 мг и удельной активностью 16 мкмольмин-1мг-1 белка. Средний выход хроматографически чистых препаратов АО составлял около 20% от исходной активности клеток. Гомогенность полученных белков подтверждена электрофоретически. Молекулярная масса мутантных белков, согласно данным электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, близка значениям, характерным для белка дикого типа.

7.4. Конструирование амперометрического биосенсора на основе мутантных форм АО. Иммобилизацию фермента АО дикого типа и его мутантной формы проводили методом электроосаждения на поверхности платинированного графитового электрода (как описано в разделе 4). Оптимальная структура двухферментного электрода имела конфигурацию ПО/Os-Ap59//AO/CP9. Характеристику ферментативных свойств мутантной АО (mAO) проводили с использованием для сравнения нормальной АО из штамма дикого типа (nAO). Типичный сенсорный ответ на этанол для биосенсоров на основе mАО и на основе nAO представлены на рис. 17.

На рис. 18 показаны линейные области ответа двухферментного сенсора со структурой ПО/Os-AP59//AO/CP59 для этанола и формальдегида. Как видно из представленных данных, для сенсора с мутантной формой АО имеет место расширенние диапазона линейности сигнала для обоих аналитов в связи с изменением величины кажущейся константы Михаэлиса для генетически модифицированной АО.

–  –  –

Поскольку АО не является высокоселективным ферментом и способна, кроме этанола и метанола, окислять также формальдегид, изучали зависимость амперометрического ответа биосенсоров, сконструированных на основе природной и мутантной форм фермента (nАО і m-АОСА4), от концентрации этанола и формальдегида (рис. 19). Установлено, что природная и мутантная формы АО отличаются величиной KM (в растворе): мутантный фермент mАОСА4 имеет повышенное значение константы Михаэлиса-Ментен (в 4 раза) и, соответственно, сниженное сродство к аналиту. Эта характеристика мутантного фермента расширяет линейный участок диапазона концентраций биосенсора.

–  –  –

Изучение операционной стабильности и кинетики инактивации сконструированных биосенсоров показало, что сенсоры на основе природной и мутантной форм АО очень похожи (рис. 20). Оба биосенсора сохраняли 50% активности после 5 часов непрерывной работы. Сконструированный амперометрический биосенсор на основе mAO (CА2) характеризуется сниженным сродством к анализируемым субстратам без изменения операционной стабильности работы сенсора.

–  –  –

Таким образом, предложена новая методика выделения мутантных форм АО и Время, мин их использование в качестве биоэлементов для биосенсорных технологий. На основании селекции с использованием аллилового спирта получены мутантные штаммы СА2 и СА4 метилотрофных дрожжей Н. polymorpha со сниженным сродством алкогольоксидазы к этанолу. Проведено секвенирование мутантных аллелей структурных генов АО из мутантных штаммов СА2 и СА4 Н. polymorpha, идентифицированы точечные мутации в гене АОХ, которые приводят к заменам аминокислот и к уменьшению сродства фермента к субстрату.

Изучены некоторые структурно-функциональные свойства мутантных форм АО.

Разработаны технологии иммобилизации ферментов на поверхности рабочего электрода при помощи электроосаждения, что использовано в конструировании биосенсоров на основе нативной и мутантной форм АО. Показано, что биосенсор на основе мутантной формы АО обладает расширенным диапазоном линейного ответа на аналиты по сравнению с сенсором на основе АО дикого типа.

Стабильность действия сенсора с mAO-иммобилизованным электродом не изменялась и оставалась подобной стабильности электрода с ферментом дикого типа. Описанная методика открывает возможность конструирования биосенсоров для точного, быстрого и дешевого анализа этанола в реальных образцах.

Для дальнейшего совершенствования применения mAO в качестве элемента биосенсора, могут быть использованы различные подходы: 1) прямое конструирование мутантных форм АО на основе результатов, полученных при помощи сайт-специфического мутагенеза; 2) эволюционная инженерия мутантных форм АО посредством непрерывного культивирования соответствующих штаммов в среде с увеличенными концентрациями аллилового спирта; 3) определение кристаллической структуры АО из H.

polymorpha, выяснение особенностей фермент-субстратного взаимодействия и последующей прямой модификацией характеристик фермента.

8. Биоаналитическое использование формальдегиддегидрогеназы.

Формальдегиддегидрогеназа, ключевой фермент метаболизма формальдегида у микроорганизмов, также может быть использован в биоаналитических исследованиях, но использованию ФАДГ в аналитической практике препятствует недостаточная активность коммерческих ферментных препаратов из Pseudomonas putida и Candida boidinii, а также высокая стоимость ферментов, выделенных из штаммов дикого типа.

В этой главе представлены результаты исследований, полученные при оптимизации условий культивирования сконструированного посредством генной инженерии штамма термотолерантных метилотрофных дрожжей H. polymorpha со сверхпродукцией ФАДГ, методики выделения термостабильного фермента из рекомбинантных клеток, характеристике очищенной ФАДГ, разработке основанного на ФАДГ метода определения ФА и использование этого метода для анализа промышленных стоков.

8.1. Оптимизация условий культивирования. Выделение и характеристика фермента. Стабильный рекомбинантный штамм H. polymorpha со сверхпродукцией ФдДГ получен в соответствии с описанной методикой (Demkiv et al., 2005). Для конструирования рекомбинантного штамма – сверхпродуцента ФАДГ, ген FLD1 из H. polymorpha с собственным промотором был вновь клонирован в LEU2-содержащей интегративной плазмиде pYT1, лишенной ARS, для использования в мульти-копийной интеграции гена в хромосоме реципиентного штамма NCYC 495 (leu1-1). После трансформации клеток линейной и циклической формами плазмиды были отобраны 50 клонов среди Leu+трансформантов с повышенной устойчивостью к ФА и определена активность ФАДГ штаммов. В качестве сверхпродуцента ФАДГ был выбран стабильный рекомбинантный штамм Tf 11-6 с наибольшей активностью фермента в бесклеточных экстрактах. Штамм Tf 11-6 обладал активностью ФАДГ в бесклеточных экстрактах (БЭ) до 4.0 мкмоль·мин-1·мг-1 белка. Для оптимизации условий культивирования с целью получения максимального количество фермента, изучали влияние состава среды на уровень ФАДГ у штамма Tf 11-6 (рис. 21). Как показано на рис. 21А, активность ФАДГ в БЭ зависит от источника углерода.

Культивирование на среде с 1% метанола приводило к максимальному уровню синтеза фермента у реципиентного штамма H. polymorpha leu 1-1 и штамма Tf 11-6 со сверхпродукцией ФАДГ. Добавление ФА к среде с метанолом стимулировало синтез ФАДГ.

Из рис 21B видно, что удельная активность ФАДГ в бесклеточном экстракте штамма Tf 11-6 при выращивании на среде с метанолом с добавлением 10 мМ ФА составляла 7,0 Ед./мл, что было в два раза выше по сравнению с культурами, выросшими на среде без добавления ФА.

Для выделения ФАДГ клетки штамма-сверхпродуцента выращивали в среде с 1% метанола с добавлением 5 мМ ФА. Характеристика процедуры очистки с двухступенчатой ионообменной хроматографией и осаждением сульфатом аммония приведена в таблице 8.

Молекулярная масса субъединицы ФАДГ, определенная при помощи электрофореза с SDS, составляла около 40 кДа, и имела такое же значение, как для фермента C. boidinii - 41 кДа.

Изучены некоторые физико-химические параметры выделенной ФАДГ. Оптимум рН находился в пределах 7,5 - 8,5; наивысшую стабильность ФАДГ наблюдали при рН 7,0 - 8,5.

Оптимальная температура для активности фермента – 50 °C. При 65 °C фермент сохранял 60% своей активности (время определения около 5 мин), что соответствовало уровню активности ФАДГ при 30 °C.

Активность фермента при 37 °C была в 1,6 раза выше по сравнению со стандартными условиями определения активности ФАДГ (25 °C).

Изучение термостабильности фермента показало, что активность полностью сохранялась после 10 мин инкубации при 40 °C, частично (дo 70%) при 55 °C, и в 25% - при 60°C. Полная инактивация имела место после инкубации при 70 °C в течение 5 мин. Такая высокая термотолерантность потенциально дает возможность использования ФАДГ в биоаналитических целях, в частности, для определения ФА в пищевых продуктах, промышленных сточных водах и лекарственых препаратах, а также для биотрансформации ФА до муравьиной кислоты.

–  –  –

*1 и 2 – Хроматография на DEAE-Toyopearl-650 M при различных pH (8.0 и 8.8)

8.2. Использование ФАДГ для ферментативного определения ФА. На основе проведенных исследований предложен метод ферментативного определения ФА с использованием ФАДГ. Разработанный метод основан на фотометрическом определении окрашенного продукта, формазана, который образуется из нитротетразолиевого голубого в реакции окисления ФА, катализируемого ФАДГ (рис. 22).

–  –  –

Исследования проводили в условиях неполного превращения аналита (около 10%) и ограниченной концентрации фермента (23 мЕд./мл). Такие условия позволяют снизить стоимость анализа. В условиях полного окисления ФА (фермент в избытке) порог чувствительности метода оценивается на 2,5 мкМ (в окончательной реакционной смеси) или 20 мкМ – в исследуемых пробах.

Надежность разработанного метода проверена на пробах промышленных сточных вод, содержащих ФА. Сравнение содержания ФА, полученного методом ФАДГ и двумя традиционными химическими методами (с использованием хромотроповой кислоты и МБТГ) показало хорошую корреляцию результатов, полученных различными методами (таблица 9).

Таблица 9. Сравнение результатов определения содержания ФА в пробах сточных вод различными методами

–  –  –

Для оценки возможного интерферирующего влияния реальных компонентов проб на определение ФА ФАДГ-методом и методом с хромотроповой кислотой, использовали метод стандартных добавок для пробы WW-A. Следует подчеркнуть, что использованные химические методы не свободны от потенциальных ошибок, вызванных, преимущественно, интерференцией загрязнений, содержащихся в пробах сточных вод, например, фенола, который присутствует в стоках наряду с ФА.

В наших опытах было показано, что химический метод является более чувствительным на интерферирующее воздействие компонентов промышленных сточных вод по сравнению с ферментативным методом:

значения наклона калибровочных кривых, полученных для водных растворов ФА, и для проб сточных вод (WW-A) отличаются на 24% (соответственно, 2,986 и 2,255). Подобные значения получены для ферментного метода – соответственно, 0,761 и 0,729, причем разница составляла только 4,2%, что находится в границах ошибки.

8.3. Использование ферментных и клеточных биосенсоров для анализа ФА в вакцинах. Существующие методы ферментного анализа ФА зачастую являются трудоемкими недостаточно селективным и точными, кроме того, до сих пор таких методов нет на мировом рынке. Для решения этой проблемы, мы разработали новые биосенсорные подходы по анализу ФА в вакцинах с использованием НАД+ - и глутатион- зависимой ФАДГ из рекомбинантных клеток дрожжей со сврхпродукцией этого фермента. В качестве биораспознающих элементов использовали рекомбинантный дрожжевой клон Tf 11-6, производный от реципиентных термотолерантных метилотрофных дрожжей H. polymorpha NCYC 495, и очищенную НАД+- и глутатион- зависимую ФАДГ, выделенную из сверхпродуцирующих ФАДГ рекомбинантных клеток. Оба сконструированных биосенсора были использованы для анализа содержания ФА в реальных вакцинах. Была показана хорошая корреляция результатов аналитических определений между разработанными методами и традиционными химическими методами.

Амперометрические биосенсоры на основе ФАДГ и рекомбинантных клеток с архитектурой 2CPOs-НАД+-ФАДГ-GSH-Нафион (ферментативный биосенсор) и 2CPOsНАД+-Tf11-6-GSH-Нафион (клеточный биосенсор) использовали для определения содержания ФА в реальных образцах вакцин. Результаты таких анализов представлены на рисунке 23 (клеточный биосенсор) и в таблице 10.

Перенос электронов между иммобилизованным ферментом и платинированным графитовым электродом осуществлялся при помощи положительно заряженного катодного электроосаждающего слоя, модифицированного Os-бис-N,N-(2,2'-бипиридил)-дихлоридом ([Os(bpy)2Cl2]). Вместо полимерного Os-содержащего медиатора, использованного в ферментном сенсоре, клеточный (микробный) сенсор на основе рекомбинантных клеток содержал свободно диффундирующий медиатор PMS.

Сконструированный безреагентный амперометрический биосенсор на основе ФАДГ с архитектурой 2CPOs-НАД+-ФАДГ-GSH-Нафион использовали для определения содержания ФА в различных вакцинах: ADT-М (против дифтерии и столбняка), антигеморрагической вакцине кроликов, противополиомиелитной вакцине Imovax Polio с использованием метода стандартных добавок.

Рис. 23. Калибровочные кривые, полученные методом стандартных

1) Кроличья вакцина 75 Rabbit vaccine добавок для клеточного биосенсора 70 n 10; C 41.9 mM 1

–  –  –

Интерферирующее влияние компонентов реальных образцов вакцин на определение ФА наблюдали для всех вакцин, но в разной степени. Для всех проанализированных вакцин наблюдали хорошую корреляцию между результатами определения ФА биосенсорным методом на основе фермента ФАДГ и химическими методами (с применением метода стандартных добавок).

Таблица 10. Содержание формальдегида в реальных образцах вакцин, полученное различными методами: химическими (МБТГ, Пурпальд, хромотроповая кислота) и с использованием биосенсоров (сенсоры на основе ФАДГ и на основе рекомбинантных клеток)

–  –  –

Полученные данные свидетельствуют о реальной возможности биоаналитического использования ФАДГ из стабильного рекомбинантного штамма H. polymorpha со сверхпродукцией фермента для определения токсичного ФА в пищевых продуктах, промышленных сточных водах и вакцинах.

9. Конструирование штаммов дрожей с увеличенной продукцией этанола.

В настоящее время этанол получают из сахара или крахмала с помощью дрожжей S.

cerevisiae. Между тем, имеющиеся количества исходного сырья не обеспечивают растущих потребностей в биоэтаноле, поскольку используется в пищу человека и для корма животным. Наиболее оптимальным и перспективным является получение топливного биоэтанола из возобновляемого и дешевого сырья, особенно из гидролизатов лигноцеллюлозных отходов сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности.

9.1. Kонструирование рекомбинанатного штамма дрожжей Pichia stipitis с улучшенной алкогольной ферментацией ксилозы. Среди основных сахаров лигноцеллюлозных гидролизатов, кроме гексоз, значительный процент (35-45%) составляют пентозы (ксилоза, арабиноза), которые сахаромицеты не способны метаболизировать.

Ферментировать пентозы способна ограниченная группа микрорганизмов, среди которых наибольший интерес вызывают дрожжи P. stipitis. Наши усилия были направлены на улучшение природных штаммов этого вида дрожжей с помощью современных методов метаболической инженерии. В данном разделе работы представлены результаты конструирования рекомбинантного штамма P. stipitis с усиленной экспрессией модифицированной формы ксилозоредуктазы (первого фермента катаболизма ксилозы), который характеризовался повышенной производительностью алкогольной ферментации ксилозы в составе лабораторных и полупромышленных питательных сред.

Брожение ксилозы у дрожжей начинается с восстановления до ксилита с помощью НАДФH(Н+)-зависимой ксилозоредуктазы (КР). Ксилит далее с помощью НАД-зависимой ксилитолдегидрогеназы (КДГ) окисляется до ксилулозы. В результате этих окислительновосстановительных реакций при ограниченной аэрации в процессе ферментации происходит накопление НАДФ+ и НАДH(Н+), что приводит к накоплению побочных продуктов и снижению количества синтезируемого этанола.

КР дрожжей P. stipitis использует как кофактор не только НАДФH(Н+), но и НАДH(Н+) (Verduyn et al., 1985). Однако сродство КР P. stipitis к НАДH(Н+) является низкой. Установлено, что уровень экспрессии гена XYL1, кодирующего КР при алкогольной ферментации ксилозы дрожжами P. stipitis, существенно повышается (Jeffries, Vleet, 2009). Учитывая дисбаланс нуклеотидных кофакторов, было предложено снизить сродство КР к НАДФH(Н+) и усилить экспрессию такой модифицированной формы КР в геноме дрожжей P. stipitis.

Используя сайт-специфический мутагенез, было осуществлено изменение кофакторного сродства КР P. stipitis, что привело к снижению сродства КР к НАДФН(H+).

Соответствующие фрагменты, а также сильный конститутивный промотор гена GAPDH P.

stipitis (кодирует глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу), были объединены при помощи праймеров IS62/IS313. Полученный фрагмент, содержащий ВРТ модифицированного гена XYL1 P. stipitis под контролем сильного конститутивного промотора GAPDH был обработан рестриктазой BamHI и клонирован в BamHI-линеаризованный и дефосфорилированный вектор p19L2 (Voronovsky et al., 2002). Сконструированная плазмида получила название p19L2+ prGAPDH+XYL1modPs (рис. 24).

B Sm K Sc RI H Sp P Sl B RI K prom. XYL1mod_Ps prGAPDH Ps lacZ bla ORI lacZ LEU2 Sc p19L2+prGAPDH+XYL1modPs ~ 7,0 т.п.н Рис. 24. Линейная схема плазмиды p19L2+prGAPDH+XYL1modPs; фрагмент, содержащий модифицированный ген XYL1 P. stipitis, обозначен черной полосой; фрагмент, содержащий промотор GAPDH P. stipitis, обозначен белой полосой; фрагмент, содержащий ген LEU2 S. cerevisiae, обозначен серой полосой; тонкой черной линией обозначена бактерийная часть вектора. Сайты рестрикции обозначены: H, HindIII; Sp, SphI; K, KpnI; RI, EcoRI; Sl, SalI; B, BamHI; Sm, SmaI; Sc, SacI.

SacI-линеаризованный вектор 19L2+prGAPDH+XYL1modPs трансформировали в штамм PLU20 (leu2, ura3) P. stipitis. Селекцию Leu+ - трансформантов проводили на минимальной среде YNB с урацилом. Стабильность Leu+-интегрантов проверяли путем поочередного культивирования на неселективной и селективной средах. Наличие в геноме сконструированных штаммов рекомбинантной конструкции prGAPDH-XYL1 P. stipitis проверяли с помощью ПЦР, используя соответствующую пару праймеров IS62/IS313.

Была определена эффективность алкогольной ферментации ксилозы отобранным стабильным трансформантом XYL1m9. Продуктивность алкогольной ферментации ксилозы сконструированным штаммом составляла 0,34 г/л/ч, превышая продуктивность исходного штамма в 1,3 раза (таблица 11). Максимальная концентрация синтезированного этанола составляла 33 г/л на четвертые сутки ферментации.

Проводилось определение эффективности алкогольной ферментации гидролизатов пшеничных отрубей. Производительность синтеза этанола рекомбинантным штаммом XYL1m9 составляла 0,15 г/л/ч, что превышает производительность синтеза этанола исходного штамма на 15% (см. таблицу 11). Максимальная концентрация синтезированного этанола составляла 10,8 г/л на вторые сутки ферментации. Общее содержание гексоз и пентоз в гидролизатах пшеничных отрубей в наших экспериментах составляло около 35 г/л.

Гидролизаты пшеничных отрубей содержали около 60% глюкозы, 37% ксилозы и 3% арабинозы. Известно, что наилучшими организмами, ферментирующими глюкозу, являются сахаромицеты. Однако, сахаромицеты неспособны ферментировать ксилозу, поэтому было предложено провести коферментацию, используя бинарную культуру: рекомбинантный штамм P. stipitis XYL1m9 и штамм дикого типа S. cerevisiae BY4742 в соотношении 1:1.

Производительность алкогольной коферментации гидролизатов пшеничных отрубей была выше чем производительность ферментации с использованием отдельных штаммов P. stipitis и S. cerevisiae и составила 0,25 г/л/ч против 0,16 г/л/ч и 0,11 г/л/ч, соответственно (см.

таблицу 11). Итак, производительность алкогольной коферментации была выше в 1,6 раза по сравнению с производительностью ферментации рекомбинантного штамма XYL1m9, а максимальная концентрация синтезированного этанола составляла 18 г/л.

Таблица 11. Продуктивность синтеза этанола штаммами P. stipitis и S. cerevisiae на различных средах

–  –  –

Также проводилась алкогольная ферментация полупромышленной среды на основе гидролизатов опилок. Продуктивность синтеза этанола рекомбинантным штаммом XYL1m9 составляла 0,15 г/л/ч, что превышает продуктивность синтеза этанола исходного штамма в 1,9 раза (см. таблицу 11). Максимальная концентрация синтезированного этанола составляла 10,5 г/л на третьи сутки ферментации.

Результаты представленных исследований были реализованы при разработке лабораторного и полупромышленного регламента получения этанола из гидролизатов растительной биомассы, что позволяет масштабировать процесс и начать производство этанола из вышеупомянутого сырья.

Сконструированный рекомбинантный штамм P. stipitis обладал повышенной в 1,3 раза продуктивностью алкогольной ферментации ксилозы. Введение в геном дрожжей P. stipitis гена XYL1mod, кодирующего модифицированную форму КР с пониженным сродством к НАДФH(H+) под контролем сильного конститутивного промотора гена GAPDH, обеспечило накопление повышенных количеств этанола при ферментации ксилозы. Параметры алкогольной ферментации гидролизатов лигноцеллюлозы (отруби и опилки) сконструированным штаммом также были увеличены. При ферментации гидролизатов пшеничных отрубей сконструированный штамм характеризовался повышенной продуктивностью этанола в 1,5 раза по сравнению со штаммом дикого типа дрожжей S.

cerevisiae. Установлено, что синтез этанола дополнительно может быть повышен в 1,6 раза путем одновременного использования смеси двух штаммов дрожжей - рекомбинантного штамма XYL1m9 P. stipitis и штамма дикого типа S. cerevisiae. Сконструированный штамм XYL1m9 P. stipitis также характеризовался повышенной производительностью алкогольной ферментации полупромышленной среды на основе кислотных гидролизатов опилок. Это дает возможность получения этанола из гидролизатов растительной биомассы в более широком масштабе и в перспективе начать промышленное производство этанола из вышеупомянутого сырья.

9.2. Улучшение параметров алкогольной ферментации глюкозы рекомбинантными штаммами дрожжей H. polymorpha и S. cerevisiae c увеличенным уровнем внутриклеточного глутатиона. Глутатион (GSH) является распространенным небелковым тиолом, присутствующим в большинстве живых клеток, от микроорганизмов до человека.

Он играет ключевую роль в стрессовой реакции, вызваной голоданием, тяжелыми металлами и ксенобиотиками. Известно, что этанол, продуцируемый в процессе спиртового брожения, индуцирует метаболический стресс, который, в свою очередь, может ухудшить продуктивность этанола. Однако, роль GSH в качестве основного фактора защиты от стресса в продукции этанола и толерантности к этанолу, до сих пор не изучали. Поиск надежных штаммов дрожжей, устойчивых к метаболическому стрессу и накапливающих повышенные количества этанола является важной биотехнологической задачей. Поэтому мы исследовали возможные взаимосвязи между внутриклеточным пулом GSH, продукцией этанола и устойчивостью к этанолу у пекарских дрожжей S. cerevisiae и метилотрофных дрожжей H.

polymorpha.

Для изучения корреляции между уровнем GSH и спиртовым брожением, мы проверили штаммы H. polymorpha с мультикопийной экспрессией генов, участвующих в биосинтезе GSH: GSH2 (гомолог гена GSH1 S. cerevisiae) и MET4 (гена участвующего в регуляции метаболизма серы), а также у мутантов, дефектных по генам, участвующим в синтезе и деградации GSH ( gsh2, ggt1). У S. cerevisiae мы изучали спиртовое брожение штамма дикого типа и рекомбинантных штаммов с мультикопийной экспрессией гена GSH1.

9.2.1. Ферментация глюкозы и ксилозы H. polymorpha в качалочных колбах и в ферментере.

Было установлено, что штаммы с мультикопийной интеграцией генов GSH2 и MET4 накапливают этанол в более высоких концентрациях по сравнению со штаммами дикого типа. Штамм дикого типа максимально накапливал около 1,5% этанола, штамм с гиперэкспрессией гена MET4 накапливал 3% этанола, тогда как концентрация этанола у штамма со сверхэкспрессией гена GSH2 достигла 4,5 %. Накопление повышенного уровня этанола сопровождалось повышением потребления глюкозы у соответствующих штаммов (таблица 12). Аналогичную картину наблюдали и во время ферментации этими штаммами в биореакторе в накопительной культуре при культивировании в среде с 4% глюкозы в условиях ограниченной аэрации при 37C (рис. 25, 26).

Штаммы с гиперэкспрессией генов GSH2 и MET4 и повышенным внутриклеточным уровнем GSH накапливали этанол очень быстро и продуцировали максимальное количество этанола после 30 часов инкубации, что в 3 раза выше по сравнению со штамами дикого типа.

После 30 ч инкубации уровень этанола уменьшался очень быстро, что может быть связано с полной утилизацией глюкозы клетками дрожжей. После 30 часов инкубации концентрация глюкозы в среде падала до нуля.

–  –  –

Мы также наблюдали увеличение накопления этанола несколькими другими мутантами, а именно, штаммом vps34 с дефектом в аутофагии и штаммом vps34 со сверхэкспрессией гена GSH2 (таблица 12). Штаммы с нарушенным синтезом глутатиона (gsh2) и с нарушенной деградацией GSH (ggt1) не отличались по накоплению этанола от родительского штамма дикого типа (табл. 12). Мутация в гене ggt1 не приводила к изменению содержания клеточного глутатиона и нарушение биосинтеза GSH у мутанта gsh2 уравновешивалось поступлением GSH из питательной среды в концентрации 0,1 мМ.

В отличие от ферментации глюкозы, мы не обнаружили существенных различий между штаммом дикого типа и испытанными рекомбинантными штаммами и мутантами по накоплению этанола при ферментации ксилозы (табл. 12). Однако количества накапливаемого этанола были двольно низкими по сравнению с опытами, где в качестве источника углерода использовали глюкозу.

9.2.2. Ферментация глюкозы штаммами S. cerevisiae в качалочных колбах и в биореакторах. Мы проанализировали ферментацию глюкозы штаммом S. cerevisiae дикого типа и рекомбинантным штаммом с мультикопийной интеграцией гена GSH1, который содержит увеличенный внутриклеточный пул GSH. Обнаружено, что, в отличие от штаммов H. polymorpha с повышенным пулом GSH, аналогичный штамм дрожжей S. cerevisiae не отличался от его родительского штамма дикого типа по накоплению этанола как при брожении в условиях встряхивания в колбах в полуаэробных условиях, так и в строго анаэробных условиях в биореакторе. Таким образом, влияние пула GSH на выход этанола и продуктивность этого процесса у S. cerevisiae и H. polymorpha различны.

9.2.3. Влияние сверхпродукции GSH на резистентность дрожжей S. cerevisiae и H.

polymorpha к этанолу. Мы также изучали резистентность указанных штаммов к экзогенному этанолу (рис. 27, 28). Установлено, что штаммы Н. polymorpha и S. cerevisiae с более высоким пулом глутатиона всегда были более восприимчивы к экзогенному этанолу по сравнению со штаммами дикого типа. Среди штаммов H. polymorpha наиболее чувствительным к этанолу был штамм vps34/pdd1, который не мог расти на 5% этаноле.

Таблица 12. Алкогольная ферментация клетками Н. polymorpha штаммов дикого типа, рекомбинантных и мутантных штаммов в зависимости от источника углерода в среде на 3 день культивирования при 100 об./мин (исходная биомасса OD ~ 10) и 37 С.

–  –  –

Штаммы H. polymorpha mcMET4 и mcGSH2 более чувствительны к экзогенному этанолу как на чашках с глюкозой (данные не показаны) так и с ксилозой, тогда как штаммы дикого типа толерантны к значительно более высоким концентрациям этанола (рис. 27).

Анализ жизнеспособности дрожжевых клеток, окрашенных двумя флуоресцентными красителями:

пропидиум иодидом (PI) и флуоресцин диацетатом (FDA) также подтвердил, что штаммы H.

polymorpha и S. cerevisiae со сверхэкспрессией генов биосинтеза глутатиона оказались менее толерантными к этанолу (рис. 28, 29).

–  –  –

Сверхпродукция GSH, как было установлено, вызывала сильное стимулирующее влияние на алкогольную ферментацию глюкозы у H. polymorpha, хотя не влияла на продукцию этанола из ксилозы. Однако, увеличение пула GSH у S. cerevisiae никаким образом не влияло на спиртовое брожение глюкозы как в полуанаэробных, так и в строго анаэробных условиях. Причины стимуляции продукции этанола из глюкозы у Н. polymorpha и отсутствие такого эффекта у S. cerevisiae неизвестны. S. cerevisiae и H. polymorpha – это различные виды по многим критериям. Особенности конкретного участия GSH в регуляции алкогольной ферментации у S. cerevisiae в сравнении с Н. polymorpha пока неизвестны, хотя мы предполагаем, что наблюдаемые различия зависят от упомянутых выше типов питания исследованных видов.



Pages:     | 1 || 3 |

Похожие работы:

«ПОПОВ Игорь Юрьевич ВЫМИРАНИЕ MARGARITIFERA MARGARITIFERA (L.) НА ЮГЕ АРЕАЛА В РОССИИ И МОДЕЛЬ ПРИРОДОХРАННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискания учёной степени доктора биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете Официальные оппоненты: Иешко Евгений Павлович, доктор биологических наук, Институт биологии Карельского научного центра РАН заведующий лабораторией паразитологии животных и...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток Работа выполнена в лаборатории экологии растительности Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт водных и экологических проблем Дальневосточного отделения Российской академии наук доктор биологических наук, старший научный сотрудник Научный...»

«МОРОЗОВА КСЕНИЯ ВЛАДИМИРОВНА ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ ДЕТОКСИКАЦИИ, АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И РЕПАРАЦИИ ДНК В ГЕНЕЗЕ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ 14.01.01 – акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова»...»

«ВЕДЕНИНА Варвара Юрьевна РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИ ДЕТЕРМИНИРОВАННЫХ АКУСТИЧЕСКИХ СИГНАЛОВ В МИКРОЭВОЛЮЦИИ САРАНЧОВЫХ (INSECTA, ACRIDIDAE, GOMPHOCERINAE) 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2014 Работа выполнена в лаборатории обработки сенсорной информации федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем передачи информации им. А.А. Харкевича Российской академии наук Официальные оппоненты:...»

«НЕЧАЕВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИМЕРНЫХ И ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК НА МИКРООРГАНИЗМЫ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ СОЗДАНИЯ НА ИХ ОСНОВЕ ИННОВАЦИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Саратов 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский...»

«Попов Игорь Олегович НАБЛЮДАЕМЫЕ И ОЖИДАЕМЫЕ КЛИМАТООБУСЛОВЛЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ IXODES RICINUS И IXODES PERSULCATUS НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ И СТРАН БЛИЖНЕГО ЗАРУБЕЖЬЯ Специальность 03.02.08 «Экология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой...»

«НОВИКОВ Александр Александрович МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛАБОРАТОРНЫХ БИОМАРКЕРОВ В ДИАГНОСТИКЕ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА 14.03.10 – Клиническая лабораторная диагностика Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении Научно-исследовательский институт ревматологии имени В.А. Насоновой Научный консультант: Александрова Елена Николаевна Доктор медицинских наук...»

«Шеламова Светлана Алексеевна НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТЕХНОЛОГИИ МОДИФИКАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ ДЛЯ ЖИРОВЫХ ПРОДУКТОВ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ Специальность 05.18.06 – Технология жиров, эфирных масел и парфюмерно-косметических продуктов АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Москва – 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» Научный консультант: доктор технических наук, профессор...»

«АНДРЕЕВА НАДЕЖДА МИХАЙЛОВНА МЕТОДИКА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДОРОЖНЫХ КАРТ ПРИ ЭЛЕКТРОННОМ ОБУЧЕНИИ СТУДЕНТОВ ИНФОРМАТИКЕ (на примере экономических и биологических направлений подготовки) 13.00.02 – Теория и методика обучения и воспитания (информатика, уровень профессионального образования) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Красноярск – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего...»

«Равашдех Шариф Халид Абдул-Азиз БИОЛОГИЯ, ВРЕДОНОСНОСТЬ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕР БОРЬБЫ ПРОТИВ ТОМАТНОЙ МОЛИ Tuta absoluta (Meyrick) В УСЛОВИЯХ ИОРДАНИИ 06.01.07 – защита растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2014 Работа выполнена на кафедре генетики, растениеводства и защиты растений Российского университета дружбы народов и на Сельскохозяйственной станции Дейр Алла (Королевство Иордания). Научный руководитель:...»

«Богданов Юрий Аркадьевич МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС И УРОВЕНЬ СПЕРМАЛЬНЫХ ПОЛИАМИНОВ У МУЖЧИН С БЕСПЛОДИЕМ 03. 02. 03 микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Пермь – 2015 Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом клинической лабораторной диагностики государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный медицинский университет имени...»

«УДК 572 ИВАНОВА Елена Михайловна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ ОСАНКИ ТЕЛА У ДЕТЕЙ И ВЗРОСЛЫХ 03.03.02 – «антропология» по биологическим наукам АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Научно-исследовательском институте и Музее антропологии имени Д.Н. Анучина Московского государственного университета имени М.В....»

«Кожин Михаил Николаевич ФЛОРИСТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ПУТИ ФОРМИРОВАНИЯ ОСТРОВНЫХ ФЛОР КАНДАЛАКШСКОГО ЗАЛИВА (на примере Порьей губы) 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2014 Работа выполнена на кафедре геоботаники биологического факультета ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова». Научный...»

«Лысков Дмитрий Федорович СИСТЕМАТИКА РОДА PRANGOS (UMBELLIFERAE, APIOIDEAE) И СБЛИЖАЕМЫХ ТАКСОНОВ: СОПОСТАВЛЕНИЕ МОРФОЛОГОАНАТОМИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ДАННЫХ Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва — 2015 Работа выполнена на биологическом факультете ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» Научный руководитель: Пименов Михаил Георгиевич доктор биологических наук,...»

«Шпанев Александр Михайлович БИОЦЕНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ФИТОСАНИТАРНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ АГРОЭКОСИСТЕМ ЮГО-ВОСТОКА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ КАМЕННОЙ СТЕПИ) Шифр и наименование специальности: 06.01.07 – защита растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург, 2013 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Российской академии сельскохозяйственный наук (ГНУ ВИЗР...»

«Порваткин Игорь Викторович ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ СПОРОГЕННЫХ ПРОБИОТИКОВ ПРИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ БОЛЕЗНЯХ ТЕЛЯТ 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Саратов 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургский государственный аграрный...»

«Гаряев Увш Эрдниевич ХОЗЯЙСТВЕННО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И КАЧЕСТВЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ МЯСА БЫЧКОВ КАЛМЫЦКОЙ ПОРОДЫ РАЗНЫХ ТИПОВ ТЕЛОСЛОЖЕНИЯ 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Элиста – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Калмыцкий государственный...»

«Рейф Ольга Юрьевна БИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕСУРСЫ ОРЕХА МАНЬЧЖУРСКОГО (JUGLANS MANDSHURICA MAXIM.) В ПРИМОРСКОМ КРАЕ 03.02.14 – биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Приморская государственная сельскохозяйственная академия». Научный руководитель: Гуков Геннадий Викторович, доктор...»

«НИКУЛИНА Неля Шамилевна ПРОДУКТИВНЫЕ КАЧЕСТВА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КОРОВ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОДЫ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ ДОБАВКИ «БИОГУМИТЕЛЬ-Г» 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Башкирский государственный аграрный...»

«ШАРОНОВА Ирина Николаевна ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ЭНДОГЕННЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ МОДУЛЯТОРОВ ИОНОТРОПНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В НЕЙРОНАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА 03.03.06 – нейробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2015 Работа выполнена в Отделе исследований мозга Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр неврологии» (г. Москва) Научный консультант: Скребицкий Владимир...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.