WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |

«МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТИМУСА В УСЛОВИЯХ ПОСТУПЛЕНИЯ МЕЛАТОНИНА ...»

-- [ Страница 2 ] --

Созревание тучных клеток, их фенотип и функции находятся в непосредственной зависимости от микроокружения, которое оказывает выраженное влияние на их способность к распознаванию и реагированию на различные стимулы путем выброса ряда биологически активных медиаторов [261]. Изменение общего количества клеток, выброс гранул с медиаторами – это стереотипная реакция тучных клеток на различные воздействия. В норме полностью дегранулированные тучные клетки сохраняют свою жизнеспособность, и через некоторое время восстанавливают пул медиаторов, а при патологии любого генеза характерно снижение общего числа тучных клеток, их дегрануляция, а в тяжелых случаях возможно замещение нормальной популяции тучных клеток незрелыми клетками с совершенно другими цитофизиологическими признаками [47].

Таким образом, биогенные амины и тучные клетки играют важную роль в модуляции функций иммунокомпетентных клеток, участвуя в регуляции процессов нейроиммунноэндокринной системы.

1.2. Роль мелатонина в организме 1.2.1. Физиологическая роль мелатонина Мелатонин (N–ацетил–5–метокситриптамин) представляет собой производное биогенного амина серотонина, который образуется, главным образом, в эпифизе у большинства млекопитающих и человека [139, 328]. Эпифиз (шишковидное тело, пинеальная железа) – небольшое овальное железистое образование, которое относится к промежуточному мозгу и располагается в неглубокой борозде между верхними холмиками среднего мозга и над таламусом [5]. В шишковидной железе серотонин превращается в мелатонин через двухступенчатый ферментативный процесс, захватывающий N-ацетилирование с последующим О-метилированием [220].

Мелатонин характеризуется высокой растворимостью в воде и липидах, что обеспечивает легкое его прохождение через мембраны клеток [284]. Гормон обнаруживается в слюне, моче, спинномозговой жидкости, преовуляторных фолликулах, сперме, околоплодных водах и грудном молоке. Плазменная концентрация гормона четко отражает секретирующую функцию эпифиза [298].

Мелатонин секретируется преимущественно в темноте, ночью [145], независимо от суточной активности животного, естественного или искусственного ритма [364]. На свету, в утренние и дневные часы выработка мелатонина резко угнетается. Яркий свет мгновенно подавляет синтез гормона, в то время как в постоянной темноте сохраняется суточный ритм выброса, который поддерживается периодической активностью супрахиазматического ядра (СХЯ).

В связи с этим максимальный уровень содержания мелатонина в эпифизе и в крови человека выявляется в ночные часы, а минимальный – в утренние и дневные [5, 10, 11, 177].

Циклические изменения уровня мелатонина в крови определяют циркадные и сезонные ритмы организма. Было доказано, что мелатонин действует на органы и ткани как эндогенный синхронизатор, который универсален для всех животных [289] и растений [119, 137].

Известно, что нахождение в условиях постоянного освещения, приводит к десинхронозу, из-за подавления синтеза мелатонина [19]. В условиях постоянной темноты синтез мелатонина эпифизом усиливается, однако световая депривация индуцирует стрессовое состояние организма [40, 124]. В работе Узенбаевой Л. Б.

и др. (2006) продемонстрировано раннее возрастное снижение количества лимфоцитов и увеличение количества нейтрофилов в крови крыс, длительно находившихся в условиях постоянной темноты. В то же время в ряде исследований показано положительное действие световой депривации на эстральную функцию [57] и канцерогенез [4], что обусловлено гиперпродукцией мелатонина.

Информацию об освещенности эпифиз получает по сложному нервному пути, ключевая роль в котором принадлежит супрахиазматическим ядрам гипоталамуса. Световые сигналы от сетчатки через зрительный нерв попадают в СХЯ, затем они идут через гипоталамус по проводящим путям вдоль ствола головного мозга в шейный отдел спинного мозга, откуда через нервы верхнего шейного симпатического ганглия идут к эпифизу [269]. В темноте, когда большинство нейронов СХЯ не проявляет активности, эти нервные окончания выделяют норадреналин, который через b1-адренорецепторы инициирует в клетках эпифиза синтез ферментов, необходимых для образования мелатонина [333]. Также продукция гормона зависит от содержания триптофана [367], фолиевой кислоты [179], пиридоксина [248].

Основным источником синтеза мелатонина является эпифиз. Однако, выявлены экстрапинеальные источники синтеза гормона в тимусе, желудочнокишечном тракте, гонадах, соединительной ткани [3, 11, 65] сетчатке, коже, тромбоцитах, тучных клетках, эозинофилах, натуральных киллерах [157, 260], костном мозге [132, 140, 242, 332]. Считается, что синтез экстрапинеального мелатонина определяется самим эпифизом и не имеет собственной фотопериодичности [17].

Количество мелатонина имеет тенденцию к изменению в течение всей жизни. Секреция гормона начинается на 3-м месяце развития ребенка, и его концентрация достигает максимума в первые годы жизни – до 5 лет. До половой зрелости синтез мелатонина сохраняется на постоянном и высоком уровне, затем его количество резко уменьшается и продолжает снижаться еще в течение 5 лет.

После этого изменений в синтезе гормона не происходит до 40–45 лет, а затем его количество начинает неуклонно уменьшаться, что совпадает по времени с наступлением менопаузы, и в дальнейшем этот процесс продолжается до конца жизни человека [65].

У млекопитающих, в том числе и человека, действие мелатонина опосредуется через специфические высокоафинные рецепторы – МТ1, МТ2, МТ3 [146, 301]. Два клона рецепторов мелатонина М1 и М2 являются мембранными, имеют 7 мембранных доменов и относятся к суперсемейству рецепторов ассоциированных с G-белками [167]. Эти рецепторы передают хронобиологические сигналы от СХЯ, МТ1 рецепторы подавляют нейрональную передачу, а МТ2 – индуцируют её. МТ1 и МТ2 рецепторы экспрессируются также на периферических органах и клетках: сетчатке, позвоночных и периферических артериях, почках, поджелудочной железе, коре надпочечников, яичках, желудочно-кишечном тракте, клетках иммунной системы [17, 166]. Мелатонин через рецепторы воздействует на эффекторную систему, которая включает в себя аденилатциклазу, фосфолипазу С, фосфолипазу А2, калиевые каналы и гуанилатциклазу [190]. Первоначально описанный как МТ3 рецептор представляет собой хиноновую редуктазу 2 [278], которая обеспечивает защиту от окислительного стресса путем предотвращения реакций переноса электронов с хинонов [178].

Известно, что мелатонин является сильным антиоксидантом [99, 169].

Действует гормон повсеместно, так как проникает через все биологические барьеры и обнаруживается во всех структурах клеток, в том числе в митохондриях [300] и ядре [46]. В исследованиях было показано, что мелатонин обладает большей антиоксидантной активностью в защите от процессов перекисного окисления липидов и инактивации активных свободных радикалов, чем известные антиоксиданты [188], существенным протективным эффектом в отношении свободно-радикального повреждения, возникающего при воздействии ионизирующей радиации [217, 227, 320, 321, 322, 347], ультрафиолетового облучения [192], сезонного окислительного стресса [197], при диабете [215].

Мелатонин также проявляет онкостатические свойства. Действие гормона опосредуется через увеличение уровня глутатиона [126], а также запуска апоптоза в опухолевых клетках [310]. В ряде исследований мелатонин показал своё онкостатическое действие в отношении различных опухолей: рака яичников [286], карциномы эндометрия [216, 240], рака молочной железы [219], увеальной меланомы [208], рака простаты [189], плоскоклеточного рака полости рта [159] и опухолях кишечника [104, 240], глиомы [363].

Известна роль гормона в регуляции репродуктивной функции млекопитающих, которая опосредуется путем подавления синтеза половых гормонов [5]. Гормон циклически регулирует экспрессию генов гонадотропинрилизинг гормона, оказывая свое действие через МТ1 и МТ2 рецепторы [305].

Обнаружение мелатониновых рецепторов в репродуктивных органах [180, 325], а также рецепторов к половым гормонам в эпифизе [308] говорит о важной взаимосвязи мелатонина и половых стероидов.

1.2.2. Применение мелатонина в клинической практике Одним из основных свойств мелатонина является снотворный эффект, ввиду чего гормон получил широкое распространение. Прием мелатонина восстанавливает ночной сон и препятствует инсомнии [65, 210], причем чем грубее были нарушения сна, тем выраженее эффект гормона [5]. В клинических исследованиях Я. И. Левина (2005) выявлена высокая эффективность мелатонина (препарат «Мелаксен») у больных с нарушениями сна, возникшими в острейший и острый периоды инсульта.

Мелатонин улучшает процессы восприятия, в работах Арушаняна Э. Б. и Ованесова К. Б. (1999) показано, что двухнедельный прием гормона оптимизирует свето- и цветоразличительную способность глаза. Показано положительное влияние мелатонина на сон и когнитивные функции мозга у пациентов с болезнью Альцгеймера [117, 348].

Мелатонин вводится в схемы терапии онкологических заболеваний. Так, одновременное применение мелатонина (20 мг/сут в вечернее время) с комбинацией Этопозид + Цисплатин увеличивало выживаемость и качество жизни у пациентов с метастатической формой немелкоклеточного рака легкого [241], комбинация мелатонина (20 мг/день) с радиотерапией (60 Грей) увеличивала однолетнюю выживаемость у пациентов с мультиформной глиобластомой [238]. Так же в исследованиях показано, что мелатонин снижает миелотоксическое и лимфоцитопеническое действие цитостатиков [80].

В ряде работ продемонстрировано выраженное антидепрессивное действие мелатонина [295]. Мелатонин назначают как седативное, анксиолитическое [103] и анальгетическое средство [329].

Исследования, проведенные на людях, показывают влияние мелатонина на сердечно-сосудистую систему [336]. Гормон снижает артериальное давление у лиц с гипертензией, что подтверждается рядом исследований [211]. Также гормон проявляет способность регулировать частоту сердечных сокращений и снижать агрегацию тромбоцитов [118].

Мелатонин находит также применении в лечении заболеваний желудочнокишечного тракта. Гормон успешно вводится в схемы терапии язвенной болезни и синдрома раздраженной кишки [17].

1.2.3. Иммуномодулирующее действие мелатонина Большое внимание уделяется вопросам взаимодействия между мелатонином и иммунной системой [170, 256, 318, 358]. Мелатонин оказывает двойственное влияние на иммунную систему [112]. Гормон может как угнетать, так и стимулировать иммунный ответ, поэтому речь идет об иммуномодулирующей роли мелатонина [17, 235].

В основе иммуномодуляции лежит несколько механизмов: прямое воздействие на мелатониновые рецепторы МТ1, МТ2, МТ3 и на функцию клеток лимфоидных органов и крови [120], опосредованное воздействие через опиоидные механизмы, а также модификацию продукции кортикостероидных гормонов надпочечников [17, 271]. Мелатониновые рецепторы обнаружены на лимфоцитах [135], моноцитах [187] и нейтрофилах человека [245], и лимфоцитах, нейтрофилах и иммунокомпетентных клетках тимуса и селезенки лабораторных и диких животных [294] и Т-хелперах костного мозга крыс (Мaestroni G. J., 1995).

В иммунных органах мышей МТ1 и МТ2 рецепторы обнаружены только в тимусе, также МТ1 рецепторы выявляются на гранулоцитах. МТ3 рецепторы идентифицируются в тимусе, селезенке, костном мозге, лимфатических узлах, макрофагах, дендритных клетках, гранулоцитах [146]. В селезенке кур обнаруживаются рецепторы к мелатонину 1-го типа: МТ1а и MT1c в красной пульпе, МТ1b – периартериолярных лимфоидных муфтах [195].

Мелатонина оказывает влияние на неспецифическую иммунную защиту человека: моноциты-макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, тучные клетки и естественные киллеры [157]. Так, гормон, взаимодействуя с рецепторами клеток моноцитарно-макрофагального происхождения, стимулирует деление клеток-предшественниц гранулоцитов и макрофагов КОЕ-ГМ [253, 254, 255, 282]. Влияние мелатонина на деление моноцитов может быть частично обусловлено его прямым действием на мелатониновые рецепторы или, возможно, за счет увеличения чувствительности моноцитов к стимуляторам, таким как IL-3, IL-4, IL-6 или к КОЕ-ГМ [158, 253]. В исследованиях на грызунах было выявлено повышение активности моноцитов/макрофагов при введении мелатонина [218].

Гормон восстанавливает сниженное общее количество лейкоцитов у пинеалэктомированных животных [296]. Экзогенный мелатонин увеличивает количество NK-клеток и моноцитов как в костном мозге, так и в селезенке через 7 и 14 дней введения [158].

Хроническое введение мелатонина увеличивает количество циркулирующих NK-клеток и их спонтанную активность, что частично опосредовано увеличением продукции цитокинов (IL-2, IL-6, IL-12 и -IFN) Тхелперами под действием гормона [158, 185, 186, 240]. Активируя моноциты, мелатонин увеличивает продукцию IL-1, IL-6, IL-12, альфа-ФНО и активных форм кислорода [273]. Повторная стимуляция Т-хелперов в присутствии IL-12 приводит к дифференцировке их в Th-1 клетки, которые вырабатывают IL-2 и IFN, что особенно эффективно в иммунных реакциях с участием макрофагов и других фагоцитов. Мелатонин увеличивает продукцию -IFN Th-1 клетками [186], а непосредственно сам -IFN стимулирует синтез и секрецию мелатонина в моноцитах и макрофагах периферической крови [176], и в эпифизе [357].

Напротив, в других работах показано снижение выработки -IFN и IL-2 Th-1 клетками [317], -IFN активированными макрофагами [293] при введении мелатонина. Причем вводимый в культуру клеток мелатонин в дозе 12-50 мкг/мл приводил к максимуму пролиферативного потенциала Т-клеток, а более высокие дозы уже оказывали супрессирующее действие. Максимальное подавление продукции -IFN наблюдалось при дозе вводимого мышам мелатонина 50 мг/кг.

Wang H. с соавт. (2005) продемонстрировали, что мелатонин снижает выработку провоспалительных цитокинов клетками Купфера крыс, таких как IL-1 и - IFN.

Интраперитонеальное введение крысам мелатонина ежедневно в дозе 50 мг/кг подавляло экспрессию мРНК IL-6, IL-1 и -IFN [214]. В работе Ozkanlar S. с соавт. (2015) показано снижение плазменного уровня IL-1, общего количества лейкоцитов, соотношения площади коркового вещества к площади мозгового вещества в тимусе, количества положительных на эстеразу тучных клеток в селезенке, тимусе и лимфатических узлах крыс, страдающих диабетом, после внутрибрюшинного введения мелатонина в дозе 10 мг/кг в течение 15 дней.

В ряде работ выявлено, что введение мелатонина приводит к увеличению выработки антител как у здоровых, так и ослабленных мышей [256], а пинеалэктомия вызывает угнетение синтеза антител лимфоцитами [191]. В неонатальном периоде пинеалэктомия приводит к значительному снижению количества эритроцитов, лейкоцитов и лимфоцитов, а также увеличивает риск инфицирования мозга золотистым стафилококком [122]. В экспериментах, где мышей содержали при постоянном освещении или вводили бета-адреноблокатор, произошло снижение массы и клеточности селезенки и тимуса [250, 251]. У старых мышей введение мелатонина приводит к увеличению количества тимоцитов [340] за счет подавления синтеза глюкокортикоидов [339, 342]. Yu Q. и другие (2000) показали, что мелатонин, вводимый перорально, способствует выживанию предшественников В-лимфоцитов в костном мозге.

Castrillon P. и др. (2000) продемонстрировали в своей работе увеличение количества CD4-позитивных и снижение CD8-позитивных лимфоцитов в подчелюстных лимфатических узлах под влиянием мелатонина. Остается пока не до конца выясненным, влияет ли мелатонин только на Th-1 клетки, или также на Th-2 клетки, баланс соотношения которых (Th-1/Th-2) имеет большое значение для иммунных реакций [256]. По данным Raghavendra V. и др. (2001) мелатонин поддерживает продукцию анти-CD3 антител только в присутствии антигенпрезентирующих клеток и цитокинов, вырабатываемых Th2-клетками.

В тоже время, ряд исследований показывает, что экзогенный мелатонин может не иметь влияния на клетки иммунной защиты. Так, длительное введение мелатонина не оказывало влияния на количество NK-клеток у крыс с опухолями молочных желез [306]. В работе Provinciali M. с соавт. (1997) мелатонин вводился мышам с возраста 17-18 месяцев в дозе 40-50 мкг/сут на животное в течение 8 месяцев. Гормон не восстанавливал ни эндогенную, ни IL-2-индуцированную активность NK-клеток старых мышей, не влиял на их количество, а также не оказывал влияния на сниженную возрастную пролиферативную активность лимфоцитов селезенки.

При гиперчувствительности мелатонин ингибирует Th1-зависимый иммунный ответ за счет снижения выработки -IFN и IL-12 антигенпрезентирующими клетками [257]. Длительное введение мелатонина (6 недель) в дозе 10 мг на 100 мл питьевой воды крысам со спонтанной гипертензией снижает на 40-60% инфильтрацию почечной ткани лимфоцитами и макрофагами [276]. Konakchieva R. (1995) с соавт. сообщили, что мелатонин ингибирует конканавалин А-индуцированные включения в лимфоцитах миндалин и периферической крови человека.

Основываясь на иммуносупрессивных свойствах мелатонина, гормон исследовался как пролонгатор выживаемости трансплантатов островков поджелудочной железы. У мышей, получавших мелатонин ежедневно в дозе 200 мг/кг, среднее время выживаемости островков увеличилось с 7 до 17 дней, что сопровождалось сокращением числа Th1-клеток, снижением пролиферации Тклеток и спленоцитов, увеличением продукции иммуносупрессивного цитокина IL-10 [235]. В работе Jung F. J. c соавт. (2004) сердечный аллотрансплантат пересаживали крысам. Мелатонин вводили в дозе 20 мг/кг/сут и 200 мг/кг/сут.

Было показано, что введение высоких доз мелатонина (200 мг/кг/сут) значительно продлевает жизнь трансплантата, снижает уровень аллоиммунных IgM и пролиферативную активность лимфоцитов. Вводимый мелатонин в дозе 20 мг/кг/сут значительно не продлевал срок жизни трансплантата, а на 10-е сутки введения отмечалось повышение аллоиммунных IgM.

Таким образом, анализ научной литературы показывает, что в последние десятилетия объем экспериментальных и клинических исследований, посвященных вопросам метаболизма, физиологической активности, а также иммуномодулирующим свойствам мелатонина значительно возрос. Это обусловлено тем, что действие гормона на иммунную систему не является однозначным в связи с локализацией различных типов рецепторов к нему на многих видах клеток, а также с зависимостью синтеза этого гормона от таких компонентов нейроиммуноэндокринной системы, как биогенные амины, вегетативные нервные волокна, состояние центральных органов иммунной системы.

Иммуномодулирующее действие мелатонина зависит от исходного состояния организма, дозы, длительности введения и условий освещения.

Поэтому необходимы дальнейшие исследования гормона на экспериментальных моделях перед широким применением в клинике.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Организация эксперимента Научные опыты были проведены в 2008 – 2015 гг. в лаборатории кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н.

Ульянова» согласно государственному плану по теме «Гистохимия биогенных аминов в морфофункциональном состоянии органов и тканей в норме и эксперименте (№ 0120.0851887 от 10.09.2008 г.)». Эксперименты проводились в осенне-зимний период – с ноября по январь.

Все исследования проводились при одобрении этического комитета медицинского факультета Чувашского государственного университета имени И.

Н. Ульянова.

Объектом гистологического исследования служил тимус 160 половозрелых белых нелинейных мышей-самцов 2-х месячного возраста и одинаковой массы (20-22 г). Животные были распределены на 8 групп:

1-я контрольная (n = 20) – животные, которые содержались в течение 2 недель эксперимента в обычных условиях вивария (естественное освещение;

продолжительность светового дня 7 – 9 часов; освещенность на уровне клеток в утренние часы 50 – 150 люкс, днем в пасмурный день – до 500 люкс, в ясный день

– до 1000 люкс, вечером 100 – 200 люкс; свободный доступ к питьевой воде и корму);

1-я опытная (n = 20) – животные получали препарат мелаксен (синтезированный мелатонин, Unipharm, Inc., США) в концентрации 4 мг/литр с питьевой водой течение 2 недель и находились в условиях естественного освещения (продолжительность светового дня 7 – 9 часов; освещенность на уровне клеток в утренние часы 50 – 150 люкс, днем в пасмурный день – до 500 люкс, в ясный день – до 1000 люкс, вечером 100 – 200 люкс);

2-я контрольная (n = 20) – животные находились в условиях постоянного затемнения (клетки затемнялись черной тканью, непропускающей свет, освещенность в клетках в течение дня составляла 0 – 0,5 люкс) в течение 2 недель и получали питьевую воду и корм без ограничений;

2-я опытная (n = 20) – животные получали препарат мелаксен в концентрации 4 мг/литр с питьевой водой в течение 2 недель и находились в условиях постоянного затемнения (клетки затемнялись черной тканью, непропускающей свет, освещенность в клетках в течение дня составляла 0 – 0,5 люкс);

3-я контрольная (n = 20) – животные, которые содержались в обычных условиях вивария в течение 4 недель эксперимента (естественное освещение;

продолжительность светового дня 7 – 9 часов; освещенность на уровне клеток в утренние часы 50 – 150 люкс, днем в пасмурный день – до 500 люкс, в ясный день

– до 1000 люкс, вечером 100 – 200 люкс; свободный доступ к питьевой воде и корму);

3-я опытная (n = 20) – животные получали препарат мелаксен в концентрации 4 мг/литр с питьевой водой в течение 4 недель и находились в условиях естественного освещения (продолжительность светового дня 7 – 9 часов; освещенность на уровне клеток в утренние часы 50 – 150 люкс, днем в пасмурный день – до 500 люкс, в ясный день – до 1000 люкс, вечером 100 – 200 люкс; влажность воздуха 50 – 70%);

4-я контрольная (n = 20) – животные находились в условиях постоянного затемнения (освещенность в клетках в течение дня составляла 0 – 0,5 люкс) в течение 4 недель и получали питьевую воду и корм без ограничений;

4-я опытная (n = 20) – животные получали препарат мелаксен в концентрации 4 мг/литр с питьевой водой в течение 4 недель и находились в условиях постоянного затемнения (освещенность в клетках в течение дня составляла 0 – 0,5 люкс).

Поскольку других источников жидкости опытные животные не имели, они потребляли воду с мелатонином, что фиксировалось. В среднем одна мышь потребляла 6 мл воды в сутки, что в пересчете составило 25 мкг мелатонина в день на одно животное.

Тимус у животных забирался после декапитации на 14-е и 28-е сутки (1500 1700).

эксперимента во второй половине дня – Все действия, предусматривавшие контакт с лабораторными животными, осуществлялись с учетом требований «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» («Приказ МЗ РФ от 19.06.2003 г. №267) и в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях».

2.2. Гистологические методы исследования В ходе проведения исследования были применены следующие методы окраски:

1) окраска срезов гематоксилином и эозином для проведения общегистологической характеристики структур тимуса [71];

2) окраска полихромным толуидиновым синим по Унна – для контроля состояния тканевых мукополисахаридов и гепарина в тучных клетках [20, 26].

Голубую -ортохромную окраску гранул дает несульфатированный (незрелый) гепарин; -метахроматичную (чернильно-фиолетовую) – более сульфатированный (созревающий); -метахроматичную (пурпурную) – сульфатированный (зрелый) гепарин [26, 101].

2.3. Люминесцентно-гистохимические методы исследования

1) метод Фалька-Хилларпа в модификации Е. М. Крохиной применялся для избирательного выявления катехоламинов и серотонина [52, 173]. Срезы исследуемых органов инкубировались в параформальдегидной камере в течение 60 минут при температуре 80оС. Метод основан на конденсации моноаминов с формальдегидом с образованием флуоресцирующих соединений, при котором происходит цепь химических реакций: сначала катехоламины превращаются в 6,7-диокси-1,2,3,4-тетраизогидрохинон и 4,5,6-триокси-тетрагидроизохинолин, которые в результате дегидрирования превращаются в 3,4-дигидроизохинолины.

Кето-таутомеры продуктов реакции образуют люминесцирующий комплекс, дающий изумрудно-зеленую флюоресценцию при облучении видимым синефиолетовым светом. 3,4–дигидро––карболин, который в подобных реакциях образуется из серотонина, дает желтое свечение. Полученные препараты рассматривались под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ–4 с длиной волны возбуждающего света 360 нм. Интенсивность люминесценции катехоламинов и серотонина замерялась с одного поля зрения, но с использованием разных светофильтров.

2) метод Кросса, Эвена, Роста для выявления гистаминсодержащих структур [153]. Метод определения гистамина в тканях основан на реакции паров ортофталевого альдегида с гистамином, в ходе которой образуются флюоресцирующие производные имидазолилэтиламина. По мнению авторов данного метода, при исследовании срезов под люминесцентным микроскопом образующийся комплексный продукт дает при большом содержании лимонножелтое, при среднем – зеленное, при малом – голубое свечение. Срезы обрабатывались в предварительно разогретой камере парами ортофталевого альдегида в термостате при температуре 100оС в течение 10 секунд. Затем срезы при той же температуре на 2 минуты помещались в другую камеру, содержащую пары воды. Далее срезы высушивались в термостате при температуре 70оС в течение 5 минут. Полученные препараты рассматривались под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ–4А с длиной волны возбуждающего света 360 нм.

3) метод цитоспектрофлуориметрии для идентификации и количественного измерения содержания катехоламинов, серотонина и гистамина в исследуемых структурах тимуса [41]. Для этого на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ–4 была установлена дополнительная насадка ФМЭЛ-1А с выходным напряжением 900 В. Для определения серотонина использовался светофильтр №8 с длиной волны 525 нм, для гистамина – №7 с длиной волны 515 нм и для катехоламинов – фильтр №6 с длиной волны 480 нм. Показания снимались с табло усилителя У-5 в условных единицах флюоресценции (у. е.).

2.4. Иммуногистохимические методы исследования

1) метод выявления CD57-позитивных клеток,

2) метод выявления CD68-позитивных клеток.

Для проведения исследования были использованы anti-CD57 и anti-CD68 моноклональные антитела [228]. Исследование проводилось на базе Республиканского центра МЗРТ «Современные технологии в морфологической диагностике» с применением МКАТ и реактивов согласно рекомендации фирмыизготовителя «Дако» (Дания). После фиксации в 10% растворе нейтрального формалина материал обезвоживали в этаноле постепенно возрастающей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм готовились на парафиновом ротаторном микротоме МПС-2 и после депарафинирования и регидратации в этаноле нисходящей концентрации срезы органов погружали в восстанавливающий цитратный буфер (pH 6,0). Затем проводили высокотемпературную обработку прогреванием на водяной бане при 90 – 95С в течении 30 минут с целью демаскировки искомых антигенов в тканях. После ингибирования эндогенной пероксидазы 3% раствором перекиси водорода на метаноле проводили иммуногистохимическую реакцию методом трехэтапного непрямого иммуноферментного анализа с использованием первичных моноклональных антител (МКАТ) к гликопротеину CD57 (Clone NK-1) и к антигенному маркеру CD68 (Clone KP1) в разведении 1:50 согласно рекомендации фирмы-изготовителя (Dako, Дания). Визуализацию связавшихся первичных МКАТ проводили стандартным биотин-стрептавидин-пероксидазным методом с использованием набора LSAB-2 (Labeled Streptavidin Biotin System Peroxidase) [48].

Для оценки специфичности иммунного окрашивания в каждом случае делали отрицательный контроль (обработка вместо первичных моноклональных антител контрольными антителами), результатом чего было отсутствие специфического иммунного окрашивания.

3) метод выявления CD1а-позитивных клеток,

4) метод выявления CD3-позитивных клеток.

Исследование проводилось на базе БУ «Республиканский клинический онкологический диспансер» МСЗР и ЧР. Использовались поликлональные антитела к CD1а и CD3 клеточным мембранным маркерам [164, 265], иммуногистохимическая реакция ставилась в соответствии рекомендациями фирмы-изготовителя (Santa Cruz, USA).

Парафиновые срезы толщиной 5 мкм наносились на предметные стекла, которые были предварительно обработаны L-polysine. В последующем срезы органа подвергались сушке при комнатной температуре в течение 24 часов. Окраска препаратов происходила с помощью иммуногистохимических автоконтейнеров AUTOSTAINER-360 (THERMO, Великобритания) и Leica BOND-MAX (Германия).

После ингибирования эндогенной пероксидазы охлажденным 3% раствором перекиси водорода в течение 10 минут, проводили высокотемпературную обработку прогреванием на водяной бане при 95С в течение 20 минут в 0,01 М цитратном буфере (pH 6,0) с целью восстановления антигенов в тканях. Инкубация с первичными антителами (анти-CD1a и анти-CD3) производилась при комнатной температуре в течение 60 минут. Визуализацию связавшихся продуктов реакции проводили биотин-стрептавидин-пероксидазным методом с использованием набора LSAB+Kit, HRP [48], в качестве красящего вещества использовали диаминобензидин. Для фонового окрашивания применяли гематоксилин.

Отрицательным контролем служили срезы, при окраске которых исключались первичные антитела.

2.5. Метод морфометрии Производился подсчет клеток в 50 полях зрения микроскопа Микмед-5 (ОАО Ломо, Россия) при увеличении 400 и 1000 с помощью программы «Image G».

Измерение площадей коркового и мозгового вещества долек тимуса производилось с применением демо-версии программы «Sigma Scan Pro 5.0».

2. 6. Математические методы исследования 1) корреляционный анализ применялся для выявления достоверной взаимосвязи между интенсивностью люминесценции биогенных аминов в структурах тимуса. Корреляционным анализом взаимосвязь между показателями считали достоверой при критерии значимости менее 0,05. Коэффициент корреляции рассчитывался по программе SPSS Statistics 17.0 (2008). Связь между количествами клеток считали слабой при значении коэффициента корреляции r = менее 0,3, умеренной при значении коэффициента корреляции r = 0,31 – 0,69 и сильной при значении коэффициента корреляции r = 0,7 – 1,0 [50, 91].

2) статистический анализ обработки полученных цифровых данных проводился с использованием пакета программ Microsoft Оffice® Excel 2007 и SPSS Statistics 17.0 (2008) [68]. В случае нормального распределения данных использовали параметрический критерий – t-критерий Стьюдента для независимых выборок. Если распределение отличалось от нормального, то использовали тест Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считались значимыми при критерии p 0,05 [64].

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Структурно-функциональное состояние тимуса мышей при поступлении мелатонина в различных световых условиях

3.1. Морфологическая характеристика тимуса В связи с тем, что в нашем исследовании рассматриваются разные сроки воздействия при неодинаковых условиях поступления гормона в организм мышей, нами был определен следующий порядок изложения фактического экспериментального материала: сравнение результатов при поступлении мелатонина в течение 2-х недель в условиях естественного освещения и постоянного затемнения, сравнение результатов при поступлении мелатонина в течение 4-х недель в условиях естественного освещения и искусственного затемнения, сравнение результатов для разных световых условий и сроков воздействия мелатонина на тимус мышей.

При окраске гематоксилином и эозином гистологических срезов тимуса мышей контрольных и опытных групп хорошо визуализируется окружающая его соединительнотканная капсула, от которой отходят тонковолокнистые перегородки, не полностью разделяющие ткань органа. В тимусе определяются дольки с темным корковым веществом и более светлым мозговым веществом, в котором выявляются тельца Гассаля.

У экспериментальных животных всех контрольных групп, а также мышей, получавших мелатонин в течение 2 недель в различных световых условиях, визуально корковое вещество долек тимуса значительно преобладает над мозговым веществом. При просмотре препаратов тимуса мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель и находившихся в условиях естественного освещения или постоянного затемнения, отмечается увеличение площади мозгового вещества долек (Рисунок 1).

а б в г Рисунок 1 – Тимус экспериментальных мышей. Окраска гематоксилином и эозином. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10.

а – тимус мыши контрольной группы, находившейся 4 недели в условиях естественного освещения, б – тимус мыши, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях естественного освещения, в – тимус мыши контрольной группы, находившейся 4 недели в условиях постоянного затемнения, г – тимус мыши, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения.

1 – мозговое вещество дольки, 2 – корковое вещество дольки.

Анализируя результаты морфометрических показателей тимусной дольки контрольных мышей, содержавшихся в условиях затемнения в течение 2 недель, не отмечено статистически значимых отличий площади коркового вещества и мозгового вещества, общей площади дольки по сравнению с контрольной группой животных, находившейся в условиях естественного освещения. Однако наблюдается незначительная тенденция к снижению соотношения Sк.в./Sм.в. с 4,81±0,12 до 4,41±0,08 (p 0,05). Условия постоянного затемнения в течение 4 недель способствуют незначительному уменьшению общей площади дольки тимуса контрольных животных с 0,29±0,02 до 0,25±0,02 мм2 (p 0,05) и площади коркового вещества с 0,24±0,01 до 0,21±0,01 (p 0,05) по сравнению с контрольной группой мышей, содержавшейся в естественных световых условиях в течение 4 недель. Соотношение Sк.в./Sм.в. при этом увеличилось до 5,11±0,12 (против 4,74±0,14, p 0,05).

Поступление мелатонина лабораторным мышам в условиях естественного освещения или постоянного затемнения в течение 2 недель не отражается на морфологических показателях тимусной дольки (Таблица 1).

Однако эффекты мелатонина, вводимого в течение 2 недель, проявляются в снижении соотношения площади коркового вещества к площади мозгового вещества по сравнению с контрольными группами (3,84±0,11 и 4,81±0,12, p 0,001, в условиях естественного освещения, 3,35±0,10 и 4,41±0,08, p 0,001, в условиях постоянного затемнения). Изменение этого параметра напрямую связано с тенденцией к угнетению площади коркового вещества дольки под воздействием мелатонина.

Морфометрические показатели тимуса экспериментальных мышей при поступлении в различных световых условиях мелатонина в течение 4 недель приведены в таблице 2.

Обращает на себя внимание существенное увеличение площади мозгового вещества долек тимуса при поступлении мелатонина в течение месяца, независимо от условий освещения.

Таблица 1 – Морфометрические показатели тимуса экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 2 недель в различных световых условиях (M±m) Группы экспериментальных мышей

–  –  –

Таблица 2 – Морфометрические показатели тимуса экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 4 недель в различных световых условиях (M±m) Группы экспериментальных мышей

–  –  –

Так, у мышей, получавших гормон в условиях естественного освещения, площадь мозгового вещества долек тимуса увеличивается в 2,0 раза (p 0,001), а в условиях постоянного затемнения – в 2,3 раза (p 0,001).

Кроме того, у опытных групп (срок эксперимента 4 недели) значительно уменьшается площадь коркового вещества долек тимуса по сравнению с животными контрольных групп: в 1,5 раза (p 0,001) в условиях естественного освещения, и в 1,4 раза (p 0,001) в условиях постоянного затемнения. В связи с этим изменяется и показатель соотношения площадей коркового и мозгового вещества долек тимуса. Он составляет 4,74±0,14 и 5,11±0,12 у мышей контрольных групп в условиях естественного освещения и условиях постоянного затемнения соответственно, а у мышей, получавших мелатонин, 1,77±0,07 (p 0,001) и 1,83±0,10 (p 0,001) соответственно.

В тимусе доля мозгового вещества и коркового вещества по отношению к общей площади дольки составляет 37,16±0,76% (p 0,001) и 62,84±0,67% (p 0,001) у мышей, получавших мелатонин в течение месяца в условиях естественного освещения, а у контрольных мышей – 17,77±0,41% и 83,03±0,61%.

У животных, получавших гормон в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения, также отмечается увеличение доли мозгового вещества до 37,10±0,94% (против 16,76±0,41% у контрольных мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения, p 0,001) и снижение доли коркового вещества до 62,90±0,99% (против 83,24±0,71%, p 0,001).

Анализируя полученные данные, необходимо отметить, что изменение площади коркового вещества и площади мозгового вещества в дольках тимуса экспериментальных мышей, получавших мелатонин в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения, напрямую связано со сроками поступления мелатонина и более выражено через 4 недели поступления гормона. Световые условия не оказывают значимого влияния на абсолютные и относительные значения площади коркового вещества и площади мозгового вещества долек тимуса мышей, получавших мелатонин в течение 2 или 4 недель в различных световых условиях.

Отметим, что более длительное поступление в организм мышей мелатонина приводит к значимым изменениям нескольких морфометрических параметров.

Если после 2 недель поступления мелатонина, независимо от условий освещения, значимо изменялось только соотношение площадей коркового и мозгового вещества долек тимуса, то после 4 недель поступления гормона наблюдается и статистически значимое снижение абсолютной и относительной площади коркового вещества, увеличивается абсолютная и относительная площадь мозгового вещества.

Таким образом, поступление мелатонина в организм экспериментальных мышей отражается на морфометрических параметрах долек тимуса, и эти изменения более выражены при поступлении гормона в течение 4 недель. Кроме того, условия освещения не оказывают дополнительного влияния на эффект действия мелатонина.

3.2. CD1а-позитивные клетки тимуса

CD1а – мембранный маркер кортикальных тимоцитов (дубль-позитивных лимфоцитов), отсутствует на зрелых Т-клетках, необходим для развития Тлимфоцитов [244].

При анализе гистологических препаратов тимуса мышей опытных и контрольных групп, обработанных моноклональными антителами к маркеру CD1а, клетки, экспрессирующие данный антиген имеют коричневую окраску цитоплазматических мембран. Клетки, не несущие данный маркер, окрашиваются в сине-голубой цвет.

CD1а-позитивные клетки имеют округлую или овальную форму и располагаются в корковом веществе долек тимуса непосредственно под капсулой органа (Рисунки 2, 3).

а б Рисунок 2 – Тимус мышей, находившихся в условиях естественного освещения. Иммуногистохимическая реакция к CD1а. Микроскоп МИКМЕД-5.

Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 1 – CD1a-позитивные клетки.

в г Рисунок 3 – Тимус мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения. Иммуногистохимическая реакция к CD1а. Микроскоп МИКМЕД-5.

Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 1 – CD1a-позитивные клетки.

Изменение количества CD1а-позитивных клеток в поле зрения (при увеличении 1000) в корковом веществе дольки тимуса опытных мышей под влиянием гормона и различных условий освещения представлено в Таблице 3.

–  –  –

Полученные данные демонстрируют, что поступление мелатонина в различных световых условиях не вызывает статистически значимых изменений по количеству CD1а-позитивных клеток в тимусе, что составляет при содержании животных в условиях естественного освещения 47,46±2,74 и 46,68±2,54 клеток в поле зрения у контрольных, 46,80±1,60 и 51,60±2,09 клеток в поле зрения у опытных мышей (2 и 4 недели эксперимента соответственно).

Содержание мышей в условиях постоянного затемнения и поступление мелатонина на этом фоне также не вызывает статистически значимых различий по количеству CD1апозитивных клеток, что составляет 41,50±1,97 и 40,16±2,49 клеток в поле зрения у контрольных, 43,20±2,36 и 44,30±2,47 клеток в поле зрения у опытных мышей (2 и 4 недели эксперимента соответственно).

Таким образом, ни поступление мелатонина (в течение 2 или 4 недель), ни световые условия не оказывают влияния на количественные показатели CD1апозитивных клеток коркового вещества дольки тимуса экспериментальных животных.

3.3. CD3-позитивные клетки тимуса CD3 – это высокоспецифичный маркер Т-лимфоцитов [45, 154, 350].

При обработке срезов тимуса мышей контрольных и опытных групп, обработанных моноклональными антителами к маркеру CD3, клетки, несущие данный антиген имеют коричневую окраску цитоплазматических мембран.

Окружающие клетки, не несущие данный маркер, окрашиваются в сине-голубой цвет. CD3-позитивные клетки имеют округлую или овальную форму и располагаются во всех морфофункциональных зонах дольки тимуса, с более плотным распределением в корковом веществе (Рисунки 4 – 7).

а б Рисунок 4 – CD3-позитивные клетки коркового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель.

Иммуногистохимическая реакция к CD3. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок.

10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина).

а б Рисунок 5 – CD3-позитивные клетки коркового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель.

Иммуногистохимическая реакция к CD3. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок.

10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина).

а б Рисунок 6 – CD3-позитивные клетки мозгового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель.

Иммуногистохимическая реакция к CD3. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок.

10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина).

а б Рисунок 7 – CD3-позитивные клетки мозгового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель.

Иммуногистохимическая реакция к CD3. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок.

10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина).

Визуально, при просмотре препаратов тимуса мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях естественного освещения и постоянного затемнения, отмечается снижение плотности CD3-позитивных клеток в корковом и мозговом веществе дольки по сравнению с контрольными животными.

Представление о количественном распределении CD3-позитивных клеток дает подсчет их в поле зрения при увеличении 1000 (Таблица 4).

Как видно из таблицы, стистически значимых различий по количеству CD3позитивных клеток в различных зонах долек тимуса контрольных мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 2 или 4 недель, по отношению к данным показателям мышей, находившихся в условиях естественного освещения, не выявлено.

–  –  –

Поступление гормона в течение 2 недель в условиях естественного освещения и искусственного затемнения приводит к снижению количества CD3позитивных клеток, что составляет в корковом веществе дольки 415,02±9,24 (против 548,06±11,79 клеток у мышей 1-й контрольной группы, p 0,001) и 426,96±13,07 (против 516,12±8,20 клеток у мышей 2-й контрольной группы, p 0,001) клетки в поле зрения соответственно, в мозговом веществе дольки 357,30±6,49 (против 414,18±10,20 клеток у мышей 1-й контрольной группы, p 0,001) и 334,40±8,26 (против 390,12±8,16 клеток у мышей 1-й контрольной группы, p 0,001) клетки в поле зрения соответственно.

На границе коркового и мозгового вещества дольки также отмечается снижение плотности расположения CD3-позитивных клеток после 2-х недельного поступления мелатонина с водой в условиях естественного освещения с 166,20±2,78 до 128,16±3,10 клеток в поле зрения (p 0,001), в условиях постоянного затемнения с 149,02±4,29 до 132,76±4,17 клеток в поле зрения (p 0,05).

При поступлении гормона в течение 4 недель в различных условиях освещения, изменения количественных показателей CD3-позитивных клеток начинают носить более выраженный характер.

Так, у мышей, получавших мелатонин в условиях естественного освещения, количество клеток в поле зрения снизилось в корковом веществе дольки в 1,8 раза (p 0,001), в мозговом веществе дольки – в 1,7 раза (p 0,001), на границе коркового и мозгового вещества – в 1,4 раза (p 0,001). В условиях постоянного затемнения поступление мелатонина также приводит к снижению CD3позитивных клеток в поле зрения в корковом веществе в 1,6 раза (p 0,001), в мозговом веществе дольки – в 1,7 раза (p 0,001), на границе коркового и мозгового вещества – в 1,4 раза (p 0,001).

Таким образом, поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в организм опытных мышей независимо от условий освещения снижает количество CD3-позитивных клеток в корковом и мозговом веществе дольки тимуса, на границе коркового и мозгового вещества. Наиболее выраженное снижение количества CD3-позитивных клеток необходимо отметить у животных, получавших гормон в течение 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения.

3.4. CD57-позитивные клетки тимуса По данным ряда авторов CD57 – это мембранный антиген, который является маркером терминальной дифференцировки NK-клеток [314, 356, 365].

При обработке срезов тимуса мышей опытных и контрольных групп моноклональными антителами к маркеру CD57, клетки, экспрессирующие этот антиген имеют яркую красно-коричневую окраску цитоплазматических мембран, контрастируя на сине-голубом фоне клеток, не экспрессирующих данный антиген. CD57-позитивные клетки имеют различную форму (округлую, овальную, вытянутую) и располагаются во всех морфофункциональных зонах дольки тимуса, преимущественно в корковом веществе (Рисунки 8, 9).

а б Рисунок 8 – Корковое вещество дольки тимуса экспериментальных животных, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель. Иммуногистохимическая реакция к CD57. Микроскоп МИКМЕД-5. Об.

100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 1 – CD57-позитивные клетки.

а б Рисунок 9 – Корковое вещество дольки тимуса экспериментальных животных, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель.

Иммуногистохимическая реакция к CD57. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок.

10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 1 – CD57-позитивные клетки.

Подсчет CD57-позитивных клеток при увеличении 1000 дает представление об их количестве в поле зрения (Таблица 5).

Как видно из таблицы, пребывание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения приводит к изменению количественных показателей CD57-позитивных клеток, в зонах тимусной дольки. Так, у контрольных мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 2 недель, в мозговом веществе дольки отмечается увеличение количества CD57-позитивных клеток в 2 раза (p 0,05), а у мышей, находившихся в условиях постоянной темноты в течение 4 недель, количество CD57-позитивных клеток в мозговом веществе дольки увеличивается в 1,7 раза (p 0,05) по сравнению с контрольными мышами, находившимися в естественном световом режиме.

У мышей 1-й опытной группы, получавших мелатонин в течение 2 недель в условиях естественного освещения, максимальная плотность CD57-позитивных клеток, наблюдаемая в корковом веществе долек тимуса, составляет 9,54±0,89 штук в поле зрения, что в 4,7 раза превышает количество этих клеток у мышей 1-й контрольной группы (p 0,001).

–  –  –

В мозговом веществе дольки тимуса количество CD57-позитивных клеток составляет 0,96±0,18 штук в поле зрения, что в 5 раз выше показателя 1-й контрольной группы животных (p 0,001). На границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса отмечается трехкратное увеличение количества CD57позитивных клеток в поле зрения (p 0,05) по сравнению с таковым показателем у мышей, находившихся в течение 2 недель в условиях естественного освещения.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |

Похожие работы:

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент И.В. КИСЕЛЕВА Санкт-Петербург – ОГЛАВЛЕНИЕ Раздел 1....»

«Иртегова Елена Юрьевна РОЛЬ ДИСФУНКЦИИ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ И РЕГИОНАРНОГО ГЛАЗНОГО КРОВОТОКА В РАЗВИТИИ ГЛАУКОМНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ 14.01.07 – глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ И ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск...»

«КУЖУГЕТ ЕЛЕНА КРАССОВНА «Хозяйственно-биологические особенности крупного рогатого скота, разводимого в разных природно-климатических зонах Республики Тыва» 06.02.10. Частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Гилёв Андрей Николаевич ЛАТЕРАЛИЗАЦИЯ ФУНКЦИЙ ПЕРЕДНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ У СУМЧАТЫХ (MAMMALIA: MARSUPIALIA) 03.02.04 – Зоология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Е. Б. Малашичев Санкт-Петербург – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»

«Савельева Наталья Николаевна Генетический потенциал исходных форм яблони для создания устойчивых к парше и интенсивных колонновидных сортов 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Мичуринск-наукоград РФ, 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«КОПИЙ ВЕРА ГЕОРГИЕВНА УДК 574.587 (252.5) СООБЩЕСТВА МАКРОЗООБЕНТОСА ПЕСЧАНОЙ ПСЕВДОЛИТОРАЛИ У ЧЕРНОМОРСКИХ БЕРЕГОВ КРЫМА Специальность 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель Заика Виктор Евгеньевич член-корреспондент НАН Украины, доктор биологических наук, профессор Севастополь 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 РАЗДЕЛ 1. СОСТОЯНИЕ ИЗУЧЕННОСТИ...»

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«Мамалова Хадижат Эдильсултановна БИОЛОГИЧЕСКАЯ И ХОЗЯЙСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВНЫХ СОРТОВ ЯБЛОНИ В УСЛОВИЯХ ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ специальность: 06.01.08 – Плодоводство, виноградарство диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель, доктор сельскохозяйственных наук, доцент Заремук Римма...»

«БАБЕШКО Кирилл Владимирович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОЧТЕНИЯ СФАГНОБИОНТНЫХ РАКОВИННЫХ АМЕБ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ГИДРОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА БОЛОТ В ГОЛОЦЕНЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Цыганов...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«СОЛОВЬЕВ Альберт Николаевич КЛИМАТОГЕННАЯ И АНТРОПОГЕННАЯ ДИНАМИКА БИОТЫ В МЕНЯЮЩИХСЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ ВОСТОКА РУССКОЙ РАВНИНЫ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Киров Оглавление Введение Глава 1. Обзор состояния проблемы климатогенной...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«СИНЕЛЬЩИКОВА Александра Юрьевна Ночная миграция дроздов рода Turdus в юго-восточной Прибалтике Специальность 03.02.04 – Зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник К.В. Большаков Санкт-Петербург Оглавление Введение... 3 Глава 1. Особенности миграции...»

«Калинкин Дмитрий Евгеньевич ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ ГОРОДОВ В ЗОНЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРЕДПРИЯТИЙ АТОМНОЙ ИНДУСТРИИ 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание учной степени доктора медицинских наук Научный консультант: д-р мед. наук, профессор Тахауов Равиль Манихович Томск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.