WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 |

«ЗНАЧЕНИЕ ИНДИКАЦИИ ДНК ПАРВОВИРУСА В19 В ОБЕСПЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Точность теста DPX определяли на уровне концентрации log10 4,0 МЕ/мл (уровень принятия решения). Исследовали 40 образцов, содержащих ДНК B19V в концентрации log10 4,0 МЕ/мл и полученные путем разведения Международного стандарта. Тестирование проводили на протяжении 5 дней, т.е. по 8 образцов в день.

Для проверки возможности определения всех генотипов возбудителя использовали 1-ю Международную Референсную панель ВОЗ генотипов В19V для ПЦР исследований (код NIBSC 09/110), содержащую образцы всех трех генотипов B19V, и образец плазмы, не содержащий ДНК B19V. Образцы панели разморозили и исследовали с помощью теста DPX.

Для оценки робастности использовали образцы с признаками гемолиза и хилеза, содержащие и не содержащие ДНК B19V. Для приготовления гемолизированных образцов использовали пулированную плазму человека, которая не содержала маркеры гемотрансмиссивных инфекций (поверхностный антиген ВГВ, антитела к ВГС, антитела к Tr. pallidum, антиген ВИЧ-1, антитела к ВИЧ-1/ВИЧ-2, нуклеиновые кислоты ВГА, ВГВ, ВГС, ВИЧ-1/ВИЧ-2, B19V). К аликвотам плазмы добавляли лизированную цельную кровь для получения окончательных концентраций 1; 2.5; 5; 10 и 20 % (об/об). Затем к части полученных гемолизированных образцов добавляли материал, содержащий ДНК B19V, доводя до конечного уровня 45 МЕ/мл. Для этой цели использовали свежеприготовленные разведения Международного стандарта. В результате было приготовлено в общей сложности по двум группам 30 гемолизированных образцов, которые затем исследовали с помощью теста DPX. Аналогично были сформированы две группы образцов с хилезом (уровень триглицеридов выше 11,3 ммоль/л): не содержащие и содержащие ДНК B19V на уровне 45 МЕ/мл. Изза сложности отбора плазмы с хилезом общее число образцов по двум группам составило 10, которые далее исследовали с помощью теста DPX.

Для оценки перекрестного заражения в одну постановку включали 8 образцов плазмы, не содержащей ДНК B19V, и 8 образцов плазмы, содержащей ДНК B19V на уровне 106 МЕ/мл. Исследование проводили на протяжении двух рабочих дней. Суммарно исследовали 16 отрицательных и 16 положительных образцов плазмы.

На завершающем этапе оценки данной методики проверяли практическое удобство примения теста DPX по показателю «процент невалидных результатов».

За невалидный принимали результат исследования, который требовал проведения лабораторного исследования повторно вследствие сбоев в работе оборудования, программного обеспечения аналитического комплекса или наличия критических отклонений при проведении методики исследования образцов плазмы для фракционирования на наличие ДНК B19V.

Выявление антител к В19V 2.4.

Исследование образцов проводили методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора реагентов «SERION ELISA classic Parvovirus B19 IgG» (Virion/Serion, Германия) в соответствии с инструкцией производителя [66].

Далее измеряли оптическую плотность в лунках при длине волны 405 нм в течение 60 минут против бланка по субстрату. Референтная длина волны в диапазоне 620 – 690 нм. Определение концентрации антител проводили по методу логистической логарифмической модели с 4 параметрами (4PL).

Статистическая обработка результатов 2.5.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием методов описательной статистики. Статистическое вычисление 95 % LOD проводили методом максимального правдоподобия (probit анализ) с использованием STATISTICA 6.0 for Windows. Установление взаимосвязей выявления высокой вирусной нагрузки В19V с полом, возрастом доноров, регионом проживания, а также фактором сезонности проводили с помощью корреляционого анализа методом Спирмена. О статистической значимости различий судили по показателю р 0,05.

ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОЙ ЗНАЧИМОСТИ ДНК В19V

3.1. Верификация методики выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР в плазме для фракционирования с помощью тест-системы cobas TaqScreen DPX Test Первый этап настоящего исследования предусматривал выбор тест-системы для выявления и количественного определения ДНК В19V с последующим ее использованием в методике исследования образцов плазмы для фракционирования на выявление и количественное определение ДНК В19V методом ПЦР. При этом учитывали, наряду с аналитическими характеристиками тест-систем, международные отраслевые требования [35, 103], а также пользовательские свойства, позволяющие применять выбранную тест-систему для обследования больших объемов плазмы для фракционирования.

Исходя из вышесказанного, установили следующие критерии выбора тестсистемы для выявления и количественного определения ДНК В19V:

1. Тип исследуемого материала тест-система должна позволять

– использовать в качестве исследуемого материала плазму для фракционирования.

2. Высокая аналитическая чувствительность тест-системы, позволяющая проводить обследование плазмы в мини-пулах, включающих от 96 образцов.

Возможность тест-системы выявлять все три генотипа В19V с 3.

определением вирусной нагрузки [35, 103].

4. Коммерческая доступность – тест-система должна быть зарегистрирована в установленном порядке для клинического применения на территории Российской Федерации.

При анализе рынка подобрали следующие тест-системы: «РеалБест ДНК Parvovirus B19» (Вектор Бест, РФ), «ДНК Parvovirus B19» (НПФ ДНКТехнология, РФ), «Амплисенс Parvovirus B19-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ) и cobas TaqScreen DPX Test (Roche Molecular Systems, США).

Провели сравнительную оценку характеристик тест-систем на основе данных, заявленных производителями (таблица 3).

–  –  –

Примечание: НД – нет данных.

По итогам проведенного анализа выбрали тест DPX, как отвечающий критериям выбора, для предполагаемого в дальнейшем использования в методике исследования образцов плазмы для фракционирования для выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР.

На втором этапе настоящего исследования провели процедуру верификации методики в соответствии с требованиями действующей нормативной документации [4, 18]. Оценку аналитических характеристик проводили путем сравнения с критериями приемлемости, заявленными производителем теста [105].

Аналитическую чувствительность оценивали по показателю LOD с использованием Международного стандарта ДНК B19V (таблица 4).

–  –  –

Установленное нижнее значение доверительного интервала (ДИ) показателя аналитической чувствительности примерно в 2 раза ниже уровня, заявленного Roche и приведенного в инструкции к тест-системе. Это объясняется особенностями дизайна настоящего исследования: меньшей выборкой (по 24 образца) и большим шагом разведения ДНК B19V (около 3,16 раза). Для сравнения, в исследовании Roche используется по 189 образцов каждого уровня ДНК B19V, а шаг разведения в 2 раза меньше [105]. Данное объяснение подтверждается сравнениями показателей полученными в разных LOD, лабораториях, при соблюдении аналогичного дизайна исследования.

Установленный в ходе настоящего исследования показатель соотносится с ранее полученными данными и входит в диапазон от 11,48 до 22,85 МЕ/мл [75, 105].

Результаты оценки воспроизводимости представлены в таблице 5.

–  –  –

При исследовании 24 образцов, содержащих ДНК В19V в концентрации log10 4,0 МЕ/мл (104 МЕ/мл), среднее значение составило log10 4,09 МЕ/мл (95 % ДИ log10 4,07 - log10 4,12 МЕ/мл) со стандартным отклонением (СО) log10 0,05 МЕ/мл (коэффициент вариации (СV) 1,22 %), что показывает высокую воспроизводимость теста. Полученные показатели с учетом размера выборки соответствуют результатам ранее проведенных исследований [75, 105].

При исследовании 40 образцов, содержащих ДНК В19V в концентрации log10 4,00 МЕ/мл, среднее значение составило log10 4,07 (СО = 0,071) МЕ/мл (таблица 6).

–  –  –

Таким образом, 95 % ДИ составил диапазон от log10 4,00 до log10 4,14 МЕ/мл, включающий заданную концентрацию (log10 4,00 МЕ/мл) с незначимым отклонением log10 0,07 МЕ/мл, что доказывает высокую точность при выполнении исследований образцов плазмы для фракционирования с целью выявления и количественного определения ДНК B19V.

Результаты тестирования Международной референсной панели с помощью теста DPX показали правильность выявления и количественного определения всех трех генотипов В19V, а также оценки контрольного образца (отрицательной плазмы), входящих в состав панели, в условиях ЛКК ФГБУ РМНПЦ «Росплазма»

ФМБА России (таблица 7).

–  –  –

Полученные результаты доказали соответствие теста DPX международным отраслевым требованиям к тест-системам для выявления и количественного определения ДНК B19V [35, 103].

При исследовании 30 образцов плазмы, содержащих ДНК В19V и имеющих уровень гемолиза до 20 % (об/об), были получены положительные результаты, а при исследовании 30 гемолизированных образцов, не содержащих ДНК В19V, отрицательные результаты. Аналогичные данные получены при исследовании двух групп по 10 образцов, имеющих признаки хилеза. В совокупности, это показывает достаточную робастность теста DPX, заявленную производителем [105], что доказывает возможность на практике проводить исследование образцов плазмы для фракционирования, в том числе имеющих признаки гемолиза до 20 % (об/об) и/или хилеза, без влияния на конечный результат исследования.

По результатам проведенной верификации случаи перекрестного заражения отсутствовали, что доказывает надежность методики, исключающую возможность контаминации образцов плазмы для фракционирования в процессе проведения исследования и, как следствие, снижает риск получения ложноположительных результатов.

Результаты оценки рутинного применения теста DPX в методике выявления и количественного определения ДНК B19V в плазме для фракционирования представлены в таблице 8.

–  –  –

Все невалидные результаты (10,9 % от общего числа полученных результатов) связаны с ошибками в работе оборудования. Отсутствие невалидных результатов, связанных с реагентами, подтверждают результаты ранее проведенного исследования [93]. Высокий процент невалидных результатов, полученный в нашем исследовании, объясняется, прежде всего, большим объемом выборки и более продолжительным периодом наблюдения.

Итак, полученные результаты соответствуют критериям приемлемости [105] и соотносятся с данными, полученными ранее в ведущих лабораториях мира [75], что свидетельствует об успешном проведении верификации методики исследования образцов плазмы для фракционирования для выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР. Таким образом, доказали возможность использования данной методики в алгоритме лабораторного исследования больших объемов плазмы, направляемой на фракционирование.

Выявление ДНК В19V у доноров плазмы для фракционирования 3.2.

Исследовали 16841 образец плазмы, заготовленной в период с января 2012 по апрель 2012 года от 6154 доноров плазмы для фракционирования, проживающих на территории ряда субъектов Российской Федерации.

В 42 образцах плазмы, заготовленной от 34 доноров, была выявлена ДНК В19V на уровне от 7,82 х 101 до 6,56 х 105 МЕ/мл (медиана 3,97 х 102 МЕ/мл). Для оценки количественных результатов область значений концентрации ДНК В19V, выявленной среди доноров плазмы для фракционирования, разбили на три диапазона:

–  –  –

ДНК В19V в целом выявили у 0,55 % (34/6154) доноров плазмы для фракционирования от числа всех обследованных. Из них, у 79 % (27/34) доноров выявлена низкая вирусная нагрузка возбудителя (ДНК В19V менее 104 МЕ/мл). И только у 21 % (7/34) доноров ДНК В19V обнаруживалась на уровне 104 – 106 МЕ/мл. Доноров плазмы для фракционирования с концентрацией ДНК В19V равной или более 106 МЕ/мл выявлено не было, что объясняется, прежде всего, малым периодом наблюдения. Во-вторых, по-видимому, оказали влияние на конечный результат сезонные колебания выявления ДНК В19V [62, 73, 130].

Провели анализ данных по выявлению ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания (таблица 10).

Таблица 10 – Частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания Субъект РФ Количество Доноры, у которых Доноры, у которых выявлена доноров, абс. выявлена ДНК В19V, абс. ДНК В19V, %

–  –  –

Из представленных в таблице 10 данных видно, что частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания составила от 0,27 до 3,92 %. Разница в полученных результатах может объясняться, прежде всего, вариацией количества обследованных доноров, проживающих на определенных территориях. Так, в случае сравнения числа обследованных доноров по Кировской области и республике Чувашия отличие доходит до 53,5 раз. Тем самым каждый новый случай выявления ДНК В19V у донора плазмы для фракционирования на малом объеме выборки в значительной мере влияет на конечный результат, приводя к различию уровня выявляемости ДНК В19V до 14,5 раз. Вместе с тем, в случае оценки сопоставимых по размеру выборок отмечается различие данного показателя в зависимости от региона проживания доноров плазмы для фракционирования. Например, частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования, проживающих в Нижегородской области, выше в 1,9 раза, чем среди доноров Костромской области.

Определенная в настоящем исследовании частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования сопоставима с аналогичным показателем (0,55 – 1,90 %) для популяций доноров крови разных стран мира (таблица 11).

–  –  –

Вместе с тем, обращает на себя внимание более низкая частота выявления в Российской Федерации ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования по сравнению с донорами крови [31], что может объясняться следующими причинами. Во-первых, выборка доноров в ранее проведенном исследовании невелика, а именно в 4 раза ниже по сравнению с настоящим исследованием.

Поэтому выявление в данной работе каждого нового положительного образца значительно влияет на конечный результат. Во-вторых, авторы ранее проведенного исследования отмечают факт обнаружения локального повышения уровня инфицированности В19V, что необходимо учитывать при анализе популяционных данных [31]. В-третьих, по-видимому, следует также учитывать сезонные колебания выявления ДНК В19V [62, 130]. Если в ранее проведенном исследовании период наблюдения приходился на ноябрь – декабрь [31], то в настоящем исследовании оценивался другой период: январь – апрель.

Таким образом, показано, что частота выявления ДНК В19V среди российских доноров плазмы для фракционирования составила 0,55 %.

Установленный показатель соответствует уровню в других странах мира, что подтверждает повсеместный характер распространения парвовирусной инфекции [31, 47, 69, 113, 130] и делает актуальной для Российской Федерации проблему обеспечения инфекционной безопасности плазмы для фракционирования в отношении В19V.

–  –  –

Полученные нами данные по выявляемости образцов с высокой вирусной нагрузкой В19V (0,002 - 0,005 %) при заготовке плазмы для фракционирования в Российской Федерации сопоставимы с результатами ранее проведенных исследований. По данным зарубежных авторов, процент образцов плазмы для фракционирования с концентрацией ДНК B19V 106 МЕ/мл и более составляет 0,006 [73, 74]. Обращает на себя внимание подъем в 2,5 раза выявления образцов с высокой концентрацией ДНК В19V в 2014 году по сравнению с аналогичным показателем 2012 – 2013 гг., что, вероятно, связано с подъемом заболеваемости парвовирусной инфекции, для которой характерны вспышки с цикличностью в 3 года [130].

Таким образом, за весь период наблюдения процент образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V (106 МЕ/мл и более) составил в среднем Определенный показатель имеет важное 0,003.

эпидемиологическое значение для предприятий по заготовке и переработке плазмы, т.к. именно высокий уровень вирусной нагрузки B19 и определяет инфекционность плазмы для фракционирования в плане возможной контаминации производственных пулов [26, 39, 73, 103].

3.3.1. Связь высокой вирусной нагрузки в плазме для фракционирования с выработкой антител к B19V Образцы плазмы для фракционирования (n=9), содержащие ДНК В19V клинически значимой концентрации (106 МЕ/мл и более), исследовали методом ИФА на присутствие антител (иммуноглобулинов классов G и M). В восьми из девяти образцов антитела к В19V не были обнаружены. В одном образце выявили только IgG – антитела на уровне 7,5 МЕ/мл. Полученные результаты, вероятно, связаны с образованием иммунных комплексов, препятствующих обнаружению антител методом ИФА [40]. Кроме того, высокая вирусная нагрузка B19V, независимо от имеющегося уровня антител к B19V в плазме, делает процесс нейтрализации возбудителя, как правило, неэффективным, а образующиеся иммунные комплексы нестабильными, что приводит к инфекционности такой плазмы [39]. Показано, что высокие титры специфических антител, содержащиеся в компоненте или препарате крови, не защищают от инфицирования серонегативных реципиентов при уровне вирусной нагрузки более 108 копий/мл [52].

С учетом этого, результаты настоящего исследования свидетельствуют о низкой диагностической значимости метода ИФА для оценки образцов плазмы с высокой вирусной нагрузкой возбудителя и косвенно подтверждают значимость исследования плазмы для фракционирования на наличие ДНК B19V.

–  –  –

«Росплазма ФМБА России преимущественно от кадровых доноров и, как Росплазма»

следствие естественным механизмом старения донорских ресурсов следствие, механизмо ресурсов.

Распределение доноров в зависимости от пола представлено на рисунке 6.

–  –  –

Рисунок 6 – Распределение доноров плазмы для фракционирования в зависимости от пола пола.

В динамике распределение доноров плазмы для фракционирования составило для мужчин 53,4 – 54,2 %, для женщин – 45,8 – 46,5 %, что позволяет говорить о приблизительно равном соотношении полов доноров за весь период наблюдения.

наблюдения Это в свою очередь характеризует оптимальный состав выборки характеризует доноров плазмы для фракционирования для последующей статистической обработки данных с целью оценки взаимосвязи выявления высокой вирусной нагрузки с полом донора.

донора Основная масса обследованных доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания пришлась на Кировскую область (таблица при аблица 13).

–  –  –

Это объясняется организационными причинами - размещением в данном субъекте РФ девяти из 15 плазмоцентров ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России. Вместе с тем, в динамике отметили сокращение доли доноров, проживающих в Кировской области, от общего числа доноров плазмы для фракционирования с 55,42 % в 2012 году до 51,90 % в 2014 году за счет увеличения числа доноров в других субъектах РФ.

Сформированный за трехлетний период наблюдения объем выборки (9 доноров плазмы для фракционирования с высоким уровнем виремии В19V) представлен в таблице 14.

–  –  –

Высокая вирусная нагрузка возбудителя выявлена в основном у доноров первой возрастной группы (18 – 27 лет). На неё пришлось 66,7 % (6/9) от всех выявленных доноров с высоким уровнем виремии В19V. Распределение по остальным возрастным группам следующее: 22,2 % (2/9) доноры 28 – 37 лет (вторая возрастная группа) и один донор в возрасте 54 лет (четвертая возрастная группа). Полученные результаты объясняются особенностями эпидемиологии возбудителя: восприимчивостью к инфицированию всех возрастных групп, но с пиком заболеваемости в детском и юношеском возрасте и постепенным снижением в старших возрастных группах [12, 62, 130]. При статистической обработке данных коэффициент Спирмена равен минус () 0,775.

Функциональная связь между признаками обратная, сила связи по шкале Чеддока высокая. Зависимость признаков статистически незначима (р 0,05).

Связи выявления высокой концентрации ДНК В19V с полом доноров установлено не было. У мужчин- и женщин-доноров высокая виремия В19V выявлялась в равной мере. Полученные результаты соответствуют данным зарубежных исследователей [73].

В зависимости от региона проживания доноров плазмы для фракционирования высокая концентрация ДНК B19V чаще всего выявлялась у доноров республики Татарстан – в 55,5 % случаев (5/9). Кроме того, высокая виремия В19V была обнаружена у доноров Кировской области (2/9), республики Чувашия (1/9) и Костромской области (1/9). При статистической обработке данных коэффициент Спирмена () равен минус 0,914. Функциональная связь между признаками обратная, сила связи по шкале Чеддока весьма высокая.

Зависимость признаков статистически незначима (р 0,05). Полученные данные следует принять во внимание при планировании заготовки плазмы для фракционирования на данных территориях.

С учетом фактора сезонности доноры плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V наиболее часто выявлялись весной - 77,8% (7/9) доноров от общего числа выявленных доноров, с пиком в мае – 55,6% (5/9) доноров. При статистической обработке данных коэффициент Спирмена () равен минус 0,650. Функциональная связь между признаками обратная, сила связи по шкале Чеддока заметная. Зависимость признаков статистически значима (р 0,05). Полученные результаты соответствуют данным зарубежных авторов [73].

Таким образом, результаты исследования показывают, что у доноров плазмы для фракционирования, независимо от пола, в возрасте от 18 до 27 лет высокая концентрация ДНК B19V (106 МЕ/мл и более) в образцах плазмы может обнаруживаться значительно чаще, чем в старших возрастных группах. При этом высокий уровень виремии B19V будет выявляться чаще весной, с пиком в мае.

ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕСТИРОВАНИЯ

ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НА НАЛИЧИЕ ДНК В19V

Оценка риска контаминации производственных пулов 4.1.

Процент образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой В19V (таблица 12) использовали для оценки риска возможной контаминации производственных пулов в математической модели, специально разработанной для выполнения этой задачи. Исходное количество контейнеров с плазмой для фракционирования приняли за 1000000. Расчет риска проводили в несколько этапов:

Определили количество контейнеров с плазмой для 1.

фракционирования, входящее в объем производственного пула. При этом за предполагаемый объем производственного пула приняли 5000 л плазмы, как отвечающий требованиям современного производства препаратов крови, основанном на принципе крупномасштабного фракционирования плазмы [15, 19].

Объем плазмы для фракционирования, содержащейся в одном контейнере, установили на уровне 0,6 л в соответствии с требованием отечественного законодательства по максимальному объему одной плазмодачи [17]. Расчет проводили по формуле:

П (1), К где:

– количество контейнеров с плазмой для фракционирования

– объем производственного пула

– объем плазмы для фракционирования в 1 контейнере.

Количество контейнеров с плазмой для фракционирования (n) составило 8333 ед. на производственный пул. Таким образом, для заготовки данного количества контейнеров с плазмой для фракционирования с целью последующего формирования производственного пула объемом 5000 л необходимо провести 8333 плазмодачи. При этом число сформированных производственных пулов (b),

–  –  –

где:

– частота выявления образцов плазмы для фракционирования, содержащих высокую концентрацию ДНК В19V 106 МЕ/мл и более, на 1000000 донаций;

х – количество образцов плазмы для фракционирования, в которых выявлена ДНК В19V клинически значимой концентрации (106 МЕ/мл и более);

- количество исследованных образцов плазмы для фракционирования за год;

–коэффициент для расчета частоты выявления высокой концентрации ДНК В19V на 1000000 донаций.

Частота выявления образцов плазмы для фракционирования, содержащих высокую вирусную нагрузку возбудителя, в 2012 году составила 20,8 на 1000000 донаций, в 2013 году – 21,0 на 1000000 донаций и в 2014 г. – 51,8 на 1000000 донаций. В среднем частота выявления за период наблюдения равнялась 31,2 на 1000000 донаций. Исходя из рассчитанных показателей, установлено, что на каждый 1000000 донаций будет приходиться в среднем 31,2 (20,8 - 51,8) контейнеров с плазмой для фракционирования (а), содержащей критический уровень вирусной нагрузки В19V.

Определили риск (R) возможной контаминации производственного 3.

пула плазмой для фракционирования, содержащей высокую вирусную нагрузку возбудителя, согласно общепринятой методике расчета с учетом [11] поправочного коэффициента. Введением данного коэффициента учитывали вероятность попадания контейнеров с контаминированной плазмой в производственный пул: от благоприятного для производства варианта распределения (все контейнеры с контаминированной плазмой попадают в один производственный пул) до негативного (равномерное распределение по одному контейнеру с контаминированной плазмой в каждый производственный пул).

Рассчет проводили по формуле:

(3), где:

– риск возможной контаминации производственного пула плазмой для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V, %;

– количество контейнеров с плазмой для фракционирования, в которой выявлена ДНК В19V клинически значимой концентрации (106 МЕ/мл и более);

число сформированных производственных пулов плазмы для

– фракционирования, объемом 5000 л;

– поправочный коэффициент, равный в случае благоприятного для производства варианта распределения k = 1/a, в случае негативного варианта k =1.

Вычислили максимальный (Rmax), средний (Rср) и минимальный (Rmin) риски возможной контаминации производственного пула плазмой для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V (106 МЕ/мл и более), учитывая определенные ранее частоты выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой возбудителя. Результаты оценки риска представлены в таблице 15.

–  –  –

Полученные результаты свидетельствуют об увеличении риска возможной контаминации производственных пулов в 2,5 раза с повышением частоты выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой (ДНК В19V 106 МЕ/мл и более) за отчетный период. В среднем риск составил 0,8 – 25 %, что автоматически может привести к контаминации до 25 % выпускаемых препаратов крови. Полученные результаты соотносятся с ранее проведенными исследованиями. Установлено, что без должных профилактических мер до 56 – 100 % партий препаратов фактора VIII будут контаминированы ДНК B19V [61].

Таким образом, результаты настоящего исследования указывают на необходимость принятия действенных мер, направленных на предотвращение контаминации В19V производственных пулов. Прежде всего - это внедрение в практику алгоритма тестирования сырья с целью исключения из процесса производства плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V.

4.2. Клинико-экономическое обоснование внедрения в практику тестирования плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V В соответствие с требованиями отечественного законодательства [16, 17] в настоящее время тестирование плазмы для фракционирования методом ПЦР проводится только в отношении нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС, ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в режиме мини-пулов. На международном уровне с начала 2000-х годов в качестве действенной профилактической меры, обеспечивающей повышение безопасности сырья для производства препаратов крови, введено тестирование плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V. Главной задачей данного тестирования является выявление и последующее исключение из технологической цепочки доз плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой В19V, при попадании которых в производственный пул, может быть превышена критическая концентрация - 104 МЕ/мл [59, 89, 103]. Зарубежные

–  –  –

Рисунок 7 – Алгоритм тестирования плазмы для фракционирования на наличие ДНК ВВ19V Тестирование на наличие ДНК В19V согласно выработанному алгоритму проводили на втором этапе лабораторного обследования плазмы для фракционирования, после проведения исследования на наличие нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС и ВИЧ-1, ВИЧ-2. В качестве исследуемого материала использовали остаточный объем образца плазмы для фракционирования, отбираемой в одноразовую пластиковую пробирку из заготовленного контейнера непосредственно в плазмоцентре, до этапа заморозки (исходный объем отбираемого материала составляет 4 мл). Критерием выбраковки явилось обнаружение в исследуемом образце плазмы для фракционирования ДНК В19V на уровне 106 МЕ/мл и более. Это с учетом мини-пула из 96 образцов позволяет исключить возможность попадания плазмы с высокой вирусной нагрузкой в производство и, как следствие, обеспечивает соблюдение международного требования по уровню виремии В19V в производственном пуле не более 104 МЕ/мл.

Наблюдение за донорами в динамике показало снижение концентрации ДНК В19V при контрольном обследовании (при следующем обращении донора в плазмоцентр) ниже порогового значения во всех случаях, за исключением одного, когда донор не явился для повторного обследования (таблица 16).

–  –  –

Полученные результаты подтверждают то, что для острой парвовирусной инфекции характерна короткая фаза активной репликации (в среднем не более 7 – 14 дней), которая сопровождается высокой виремией [130]. Одновременно это свидетельствует и об отсутствии необходимости даже во временном отводе доноров плазмы для фракционирования, в случае выявления у них ДНК В19V в концентрации 106 МЕ/мл и более.

Для оценки экономической эффективности выбрали методологический подход «анализ выгоды стоимости» [10]. Целью данного подхода является определение размера выгоды от внедрения лабораторного исследования.

Первоначально определили затраты на проведение исследования на наличие ДНК В19V в плазме для фракционирования, т.е. себестоимость. В нашей стране себестоимость лабораторного исследования рассчитывается в соответствии с нормативной документацией [14] по формуле:

S = V + Aм +Э +М + П (4), где:

S – себестоимость исследования V – оплата труда Aм - амортизационные отчисления на оборудование Э – эксплуатационные расходы на содержание оборудования и инвентаря

- материальные затраты (затраты на реактивы, лабораторное стекло, М пластмассовые изделия и т.д.) П – прочие расходы.

С учетом того, что исследование плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V проводится на одном и том же лабораторном оборудовании (аналитическом комплексе cobas s201), тем же персоналом, что и тестирование на наличие нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС, ВИЧ-1 и ВИЧ-2, при расчете себестоимости анализа учитывали только прямые расходы, т.е. стоимость реагентов и расходных материалов, а также официально прогнозируемый уровень инфляции в 5,5 % (индекс - дефлятор 1,055) [21]. В итоге расчет проводили по модифицированной формуле:

S = (М1 + М2 +М3 + … + Мi) * 1,055 (5), где:

S – себестоимость исследования Мi – материальные затраты (суммарные затраты на i-количество реактивов, пластмассовых изделий и т.п.) 1,055 – индекс – дефлятор.

Себестоимость исследования одного образца плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V в мини-пулах из 96 образцов в ценах по состоянию на конец 2014 года составила 111,42 руб. (таблица 17).

–  –  –

Тест имеет достаточные аналитические характеристики DPX (чувствительность при выявлении ДНК B19V составляет менее 102 МЕ/мл), поэтому теоретически возможно применение этого теста и с большим количеством образцов в мини-пуле (до 480) без увеличения риска пропуска образцов плазмы с высокой концентрацией ДНК В19V [105].

Для оценки экономической целесообразности использования мини-пулов большего объема был сделан сравнительный анализ расхода теста DPX (на него приходится 52 % от себестоимости исследования) при использовании пулов из 96 и 480 индивидуальных доз плазмы. Результаты расчета, выполненные с учетом технологических особенностей применяемого лабораторного оборудования, приведены для анализа 960 образцов, в числе которых содержится один образец с концентрацией ДНК В19V 106 МЕ/мл или более (таблица 18).

–  –  –

Из данных, представленных в таблице 18, видно, что в случае отсутствия в исследуемой группе образцов плазмы с высокой концентрацией парвовируса, при исследовании мини-пулов из 480 образцов расход теста DPX снижается в 2,8 раза по сравнению с мини-пулом из 96 образцов. В случае выявления хотя бы одной контаминированной пробы расход теста DPX одинаков. Кроме этого, при расшифровке первично-реактивного мини-пула из 480 образцов увеличивается расход других материалов, прежде всего, контрольных материалов, на которые приходится 21,5 % от себестоимости исследования.

Полученные данные о частоте выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V (в среднем 31,2 образца на 1000000 донаций или 1 : 32051), позволяют сделать заключение о том, что при использовании мини-пулов из 480 образцов первично-реактивные пулы будут встречаться с частотой около 1 : 67. При такой частоте использование мини-пула из 480 образцов представляется перспективным, но требует углубленного анализа и обязательной верификации методики.

Исходя из установленной себестоимости исследования индивидуальной дозы плазмы (контейнера плазмы для фракционирования) на наличие ДНК B19V можно оценить затраты, необходимые для тестирования (таблица 18), производственного пула, состоящего из 5000 л (или 8333 контейнеров плазмы).

При себестоимости исследования одного образца плазмы (т.е. контейнера плазмы для фракционирования), равного руб., стоимость исследования 111,42 производственного пула составит 928463 руб. Если плановая мощность предприятия составляет, например, 600 000 л плазмы в год, то обследовать необходимо как минимум 120 производственных пулов. В этом случае общие затраты составят более 111 млн. рублей.

Для оценки доли этих затрат в общей стоимости сырья для фракционирования можно исходить из средней стоимости 1 л плазмы для фракционирования на международном рынке, которая составляет около 100€ [46] или 7000 руб. (при курсе 1€ = 70 руб). В этом случае производственный пул из 5000 л плазмы будет стоить ориентировочно 35 млн. рублей, а 120 таких пулов – 4200 млн. рублей. Соответственно, дополнительные прямые затраты на выявление возбудителя в этих объемах плазмы составят около 2,6% от общей стоимости сырья. Учитывая то, что риск критической контаминации B19V производственных пулов плазмы для фракционирования в среднем может достигать 25 % (таблица 15), эти затраты представляются экономически оправданными.

Предлагаемый алгоритм исследования плазмы для фракционирования с помощью теста DPX позволяет одновременно проводить лабораторный контроль сырья и в отношении вируса гепатита А. Ранее нами был описан клинически подтвержденный случай выявления РНК вируса гепатита А у донора плазмы для фракционирования. При этом затраты на обследование плазмы для фракционирования в отношении вируса гепатита А равны нулю, что еще раз подчеркивает экономическую эффективность предлагаемого нами алгоритма.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что алгоритм исследования на наличие ДНК В19V больших объемов плазмы для фракционирования с использованием теста DPX в режиме мини-пулов, состоящих из образцов, позволяет гарантированно предотвратить критическую контаминацию В19V производственных пулов сырья и является экономически целесообразным. Выполненные исследования показали принципиальную возможность использования указанного теста в формате мини-пулов, состоящих из 480 образцов плазмы. Указанный подход может существенно (в 2,8 раза) снизить прямые затраты на данный вид исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Потребность лечебно-профилактических учреждений в препаратах крови имеет в последнее время тенденцию к увеличению, что в свою очередь, сопровождается недостатком качественного и безопасного сырья для их производства - плазмы для фракционирования [20, 22, 23]. Открытие в последнее время ряда вирусов, передающихся гемотрансмиссивным путем, стало серьезным испытанием для производителей препаратов крови на основе человеческой плазмы. Среди открытых возбудителей особое положение занимает B19V.

Отмечается повсеместная распространенность вируса, а также высокая восприимчивость всех возрастных групп к данному возбудителю. Установлено, что к 70-летнему возрасту 60-70 % населения имеют антитела к B19V [6, 113].

Благодаря особенностям строения, вирус поражает в основном эритробласты, нарушая их дифференцировку после инфицирования, что в конечном итоге приводит к снижению количества эритроцитов в кровенном русле, и как следствие, к развитию различных клинических форм заболевания, начиная от инфекционной эритемы у детей и заканчивая тяжелыми формами апластической анемии, фульминантным гепатитом у лиц с иммунодефицитами [6, 62, 113, 130].

В трансфузиологической практике наиболее значимым фактором передачи возбудителя являются препараты крови на основе человеческой плазмы, в особенности препараты плазменных факторов свертывания крови VIII и IX.

Показано, что 56 – 100 % партий препаратов фактора VIII, произведенных в Европе и США в период с 1993 по 1998 гг., были контаминированы ДНК В19V [61]. Объясняется это, с одной стороны, безоболочечной структурой вируса [62, 113, 130], что в значительной мере повышает устойчивость к процедурам вирусинактивации (в частности, к стерилизующей фильтрации), а с другой стороны, технологическими особенностями производства данных препаратов крови, ограничивающими в значительной мере выбор процедур, снижающих вирусную нагрузку В19V.

С начала 2000-х годов в качестве профилактической меры, обеспечивающей повышение безопасности сырья для производства препаратов крови, на отраслевом международном уровне введено добровольное тестирование плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V [103]. Основной целью данного исследования является ограничение вирусной нагрузки производственного пула не выше определенного уровня. Так, на территории Евросоюза с 2004 года законодательно установлено, что в отношении сырья для производства вирусинактивированной пулированной человеческой плазмы концентрация ДНК В19V не должна превышать 104 МЕ/мл [89]. Считается, что при большей вирусной нагрузке возбудитель может ускользать от методов вирусинактивации, используемых при фракционировании плазмы. Аналогичное требование на сегодняшний день имеется и в США [59]. Кроме того, ряд банков крови Австрии, Германии, США и ряда других стран осуществляют тестирование донорской крови на ДНК В19V [69, 72, 111].

После введения обязательного тестирования было установлено, что чатота выявления ДНК возбудителя среди обследованных доноров в разных странах составляет 0,55 – 1,9 % [26, 31, 47, 67, 69, 72, 80, 111, 117]. Процент образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК B19V среди общего числа исследованных находится на уровне 0,001-0,006 [73, 74, 110].

Вопрос выявляемости возбудителя в Российской Федерации практически не изучен [26, 31]. Вместе с тем, создание отечественного современного производства препаратов крови [15] делает данную задачу чрезвычайно актуальной. В связи с этим целью настоящего исследования стало установление значимости тестирования плазмы для фракционирования на наличие и количественное определение ДНК для повышения инфекционной B19V безопасности сырья, используемого в производстве препаратов крови, прежде всего, с точки зрения обоснования алгоритма исследования больших объемов донорской плазмы, направляемой на фракционирование.

Объектом исследования стали образцов плазмы для фракционирования, заготовленной методом автоматического плазмафереза, в период с января 2012 года по декабрь 2014 года от 27610 доноров, проживающих на территории ряда субъектов Приволжского и Северо-Западного Федеральных округов Российской Федерации. Отбор образцов осуществляли в одноразовые вакуумные пробирки в объеме 4 мл непосредственно в плазмоцентрах, сразу же после заготовки плазмы. Отобранные образцы замораживали и при температуре минус 18 °С доставляли в лабораторию. Перед проведением исследования образцы размораживали и центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут.

Исследование образцов проводили методом ПЦР в режиме реального времени с помощью коммерческого теста DPX (Roche Diagnostics, США), предназначенного для количественного определения ДНК B19V и качественного выделения РНК вируса гепатита А, согласно инструкции производителя [105].

Для проведения ПЦР в режиме реального времени использовали автоматизированный комплекс cobas s201 (Roche Diagnostics, Швейцария), включающий в себя раскапывающую станцию для формирования пулов Hamilton MICROLAB STAR IVD Pippetor, прибор для пробоподготовки и выделения нуклеиновых кислот cobas AmpliPrep и автоматический анализатор cobas TaqMan.

Образцы тестировали в мини-пулах, состоящих из 96 проб. Каждая постановка сопровождалась контролем качества исследований. Для определения концентрации ДНК B19V в положительных образцах исследование проводилось по следующему алгоритму. В случае обнаружения мини-пулов, содержащих ДНК B19V, тестирование образцов повторяли в мини-пулах из 12 образцов (суб-пулы), а затем образцы из положительных суб-пулов исследовали в режиме индивидуального тестирования.

Исследование образцов с целью выявления и количественного определения антител к B19V проводили методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора реагентов «SERION ELISA classic Parvovirus B19 IgG/IgM»

(Virion/Serion, Германия) в соответствии с инструкцией производителя [66].

В рамках верификации методики выявления и количественного определения ДНК B19V в плазме для фракционирования с помощью теста DPX провели оценку следующих характеристик: аналитической чувствительности, точности, воспроизводимости, робастности, возможности выявления всех генотипов возбудителя и устойчивости к возможности перекрестного заражения.

Полученные результаты соответствовали критериям приемлимости – показателям, заявленным производителем теста. Тем самым установлено, что данная методика может быть использована для решения поставленных задач. В частности, показатель аналитической чувствительности (LOD) на уровне 21,83 МЕ/мл (95 % ДИ 14,29 – 45,24 МЕ/мл) доказал возможность тестирования плазмы для фракционирования в мини-пулах из 96 образцов, исключая риск пропуска проб плазмы с критическим уровнем вирусной нагрузки В19V.

Собственные исследования показали, что проблема обеспечения инфекционной безопасности плазмы для фракционирования в отношении В19V актуальна для Российской Федерации. Частота выявления ДНК В19V среди российских доноров плазмы для фракционирования составил 0,55%, что коррелирует с данными ранее проведенных исследований [26, 31, 47, 67, 69, 72, 80, 111, 117]. При этом в эпидемиологическом плане наиболее важным показателем является процент образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой В19V МЕ/мл и более), определяющей (ДНК инфекционную опасность в плане риска контаминации производственных пулов при выпуске препаратов крови [39, 61, 73]. По результатам исследований, данный показатель в 2012 – 2014гг. находился в среднем на уровне 0,003 % (диапазон 0,002 – 0,005 %), что соответсвует данным зарубежных исследователей [73].

При исследовании образцов плазмы для фракционирования с высокой вирузной нагрузкой только в одном из девяти образцов обнаружили IgG – антитела к В19V на уровне 7,5 МЕ/мл, что, вероятно, связано с образованием иммунных комплексов, препятствующих их обнаружению методом ИФА [40].

Ранее показано, что высокая вирусная нагрузка (ДНК B19V 106 МЕ/мл и более), независимо от имеющегося уровня нейтрализующих антител (IgG-антитела к B19V) в плазме, делает процесс нейтрализации возбудителя, как правило, не эффективным, а образующиеся иммунные комплексы нестабильными, что приводит к инфекционности образцов плазмы [39]. С учетом этого, полученные результаты подтверждают важность выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой В19V методом ПЦР.

При оценке взаимосвязи высокой вирусной нагрузки возбудителя с возрастом донора плазмы для фракционирования установили, что ДНК В19V в критическом уровне (106 МЕ/мл и более) выявлялась чаще в возрасте от 18 до 27 лет (66,7 % от всех выявленных образцов). В то же время взаимосвязь с полом донора отсутствует: образцы плазмы для фракционирования с высоким уровнем виремии В19V, заготовленной от доноров-женщин и доноров-мужчин, обнаруживались в равной мере. С учетом фактора сезонности 77,8 % от всех выявленных образцов плазмы с высокой вирусной нагрузкой В19V пришлось на весенний период, с пиком выявления в мае месяце (до 55,6 % от всех обнаруженных образцов). Полученные результаты объясняются эпидемиологическими особенностями возбудителя [62, 113, 130] и соотносятся с данными зарубежных исследователей [73].

В зависимости от региона проживания образцы с высокой концентрацией ДНК В19V выявлялись в 55,6 % случаев у доноров плазмы для фракционирования республики Татарстан, несколько реже - у доноров Кировской области (22,2 %), республики Чувашия и Костромской области (по 11,1 %). Полученные результаты следует принимать во внимание при планировании работы по заготовке плазмы для фракционирования в данных субъектах Российской Федерации.

С целью оценки риска возможной контаминации производственных пулов плазмой для фракционирования с высоким уровнем вирусной нагрузки В19V разработали математическую модель, основанную на классической методике расчета риска [11] и модифицированную путем добавления в формулу поправочного коэффициента. Это позволило математически учесть вероятность попадания контаминированной плазмы для фракционирования в производственный пул: от благоприятного для производства варианта распределения (все контаминированные дозы попадают в один производственный пул) до негативного (по 1 контаминированной дозе в производственный пул).

Вычислили максимальный (Rmax), средний (Rср) и минимальный (Rmin) риски контаминации производственного пула плазмой для фракционирования с концентрацией ДНК В19V 106 МЕ/мл и более, учитывая определенные ранее частоты выявления ДНК В19V. В среднем риск составил 0,8 – 25 %, что автоматически может привести к контаминации до 25 % выпускаемых препаратов крови. Это соотносится с ранее проведенными исследованиями [61]. Результаты настоящего исследования указывают на необходимость принятия действенных мер, направленных на предотвращение контаминации В19V производственных пулов. Прежде всего - это разработка и внедрение в практику отечественных производителей тестирования сырья с целью исключения из процесса производства плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V.

Для выполнения этой задачи разработали алгоритм тестирования плазмы для фракционирования на выявление и количественное определение ДНК B19V с помощью теста DPX в мини-пулах из 96 образцов. При его разработке исходили из международных отраслевых требований [35], аналитических характеристик используемой тест-системы, размера производственного пула и данных, отражающих частоту встречаемости плазмы с высокой вирусной нагрузкой В19V, при заготовке сырья от определенной популяции доноров.

Критерием выбраковки определили обнаружение в исследуемом образце плазмы для фракционирования ДНК В19V на уровне 106 МЕ/мл и более. Это с учетом мини-пула из 96 образцов позволяет исключить возможность попадания плазмы с высокой вирусной нагрузкой в производство и, как следствие, обеспечивает соблюдение международных требований по уровню виремии В19V в производственном пуле не более 104 МЕ/мл [59, 89, 103]. Результаты наблюдения за донорами в динамике показали снижение уровня ДНК В19V при контрольном обследовании ниже порогового значения, что доказывает отсутствие необходимости в отводе доноров, от которых была заготовлена плазма для фракционирования с высоким уровнем вирусной нагрузки.

Экономическую эффективность разработанного алгоритма оценивали с помощью методологического подхода «анализ выгоды стоимости» [10].

Проведенный анализ показал, что прямые затраты внедрения алгоритма в практику предприятия по фракционированию плазмы с плановой мощностью 600 000 л плазмы в год составят 111 млн. рублей в ценах на конец 2014 года или около 2,6 % от общей стоимости сырья – плазмы для фракционирования.

Принимая во внимание, что установленный риск возможной контаминации производственных пулов плазмой с концентрацией ДНК В19V 106 МЕ/мл и более составил данные затраты представляются экономически 0,8 – 25 %, оправданными.



Pages:     | 1 || 3 |

Похожие работы:

«Гуляева Анна Федоровна ТРАВЯНЫЕ МЕЛКОЛИСТВЕННЫЕ ЛЕСА КУЗНЕЦКОЙ КОТЛОВИНЫ: СИНТАКСОНОМИЯ, ЭКОЛОГИЯ, ГЕОГРАФИЯ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., ст.н.с. Н.Н. Лащинский Новосибирск 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОСТИ...»

«Артеменков Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Брук...»

«Усов Николай Викторович Сезонная и многолетняя динамика обилия зоопланктона в прибрежной зоне Кандалакшского залива Белого моря в связи с изменениями температуры воды 25.00.28 – океанология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Руководители: доктор биологических наук, главный научный сотрудник А.Д. Наумов доктор биологических наук, ведущий...»

«СИМАНИВ ТАРАС ОЛЕГОВИЧ ОПТИКОМИЕЛИТ И ОПТИКОМИЕЛИТ-АССОЦИИРОВАННЫЕ СИНДРОМЫ ПРИ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ 14.01.11 – Нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук М. Н. Захарова Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Обзор литературы Оптиконевромиелит Аквапорины и их биологическая функция 13 Патогенез...»

«Труш Роман Викторович ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКАЙ-ФОРСА И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель Горшков Григорий Иванович заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Белгород – п. Майский 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ...»

«МУХАМЕТОВ ИЛЬЯС НИАЗОВИЧ Палтусы прикурильских вод: биология, состояние запасов, перспективы промысла 03.02.06 – ихтиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н. А.М. Орлов Южно-Сахалинск – 2014 г. СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ОКЕАНОГРАФИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ РАЙОНА 3. ИССЛЕДОВАНИЙ ОСОБЕННОСТИ...»

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«Галкин Алексей Петрович ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Специальность 03.02.07 – генетика диссертация на соискание учной степени доктора биологических наук Научный консультант: Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....»

«Шершнева Анна Михайловна ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ: ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА, ПРИМЕНЕНИЕ Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Шишацкая Екатерина Игоревна...»

«БАРИНОВА Ирина Владимировна Патогенез и танатогенез плодовых потерь при антенатальной гипоксии 14.03.02 – Патологическая анатомия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени доктора медицинских наук Научные консультанты: Заслуженный деятель науки РФ Доктор биологических наук, доктор медицинских наук, профессор профессор САВЕЛЬЕВ...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ И ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск...»

«ХУДЯКОВ Александр Александрович ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT В РАЗВИТИИ АРИТМОГЕННОЙ КАРДИОМИОПАТИИ НА МОДЕЛИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор...»

«ВОРОБЬЕВА Ольга Вадимовна СРАВНИТЕЛЬНЫЙ И ИСТОРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕТОДИЧЕСКОГО ПРОГРЕССА В АЛЛЕРГОЛОГИИ: АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент...»

«УДК: 576.315:591.465.12 КИСЕЛЁВ Артм Михайлович Состав ядерных доменов и динамика слитого белка Y14-Myc в ооцитах жука Tribolium castaneum 03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор...»

«ПЛОТНИКОВ ВАДИМ АЛЕКСЕЕВИЧ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ПТИЦ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 03.02.02 вирусология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководительдоктор биологических наук, профессор Алипер Т. И. Москва-20 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Зубенко Александр Александрович СИНТЕЗ И ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНЫХ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ В РЯДУ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук г. Новочеркасск – 2015 Содержание ВВЕДЕНИЕ.. 6 1.Обзор литературы..19 1.1. Проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов и пути её преодоления..19 1.2. Проблема...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Горовой Александр Иванович БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ И ШИШЕК PINUS KORAIENSIS (ПОЛУЧЕНИЕ, СОСТАВ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тагильцев Ю. Г. Хабаровск – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр Введение.. 4 Глава 1 Обзор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.