WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 |

«ЗНАЧЕНИЕ ИНДИКАЦИИ ДНК ПАРВОВИРУСА В19 В ОБЕСПЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

«КИРОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГИИ И

ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА»

На правах рукописи

Попцов Александр Леонидович

ЗНАЧЕНИЕ ИНДИКАЦИИ ДНК ПАРВОВИРУСА В19

В ОБЕСПЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ

ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ

14.01.21 – Гематология и переливание крови

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель кандидат медицинских наук И.В. Парамонов Киров - 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЕСПЕЧЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПЛАЗМЫ

ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ В ОТНОШЕНИИ ПАРВОВИРУСА В19 НА

СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ (обзор литературы)

1.1 Современное представление о возбудителе

1.2. Эпидемиологическое значение возбудителя для службы крови

1.3. Инфекционная безопасность плазмы для фракционирования

1.4. Методы диагностики B19V

1.4.1. Методы выявления возбудителя

1.4.2. Методы выявления генома возбудителя

1.4.3. Методы выявления антител и антигена возбудителя

1.4.4. Методы диагностики, используемые в службе крови

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Исследуемый материал

2.2. Молекулярно-биологический метод

2.3. Верификация методики выявления и количественного определения ДНК B19V в образцах плазмы для фракционирования

2.4. Выявление антител к В19V

2.5. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОЙ ЗНАЧИМОСТИ ДНК В19V.

.... 34

3.1. Верификация методики выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР в плазме для фракционирования с помощью тест-системы cobas TaqScreen DPX Test

3.2. Выявление ДНК В19V у доноров плазмы для фракционирования............... 39

3.3. Определение процента образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК B19V

3.3.1.Связь высокой вирусной нагрузки в плазме для фракционирования с выработкой антител к B19V

3.3.2.Связь выявления высокой вирусной нагрузки B19V в плазме для фракционирования с возрастом, полом доноров, регионом их проживания, а также фактором сезонности

ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕСТИРОВАНИЯ ПЛАЗМЫ

ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НА НАЛИЧИЕ ДНК В19V

4.1. Оценка риска контаминации производственных пулов

4.2. Клинико-экономическое обоснование внедрения в практику тестирования плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение 1

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

В настоящее время при совершенствовании оказания специализированной медицинской помощи лечебно-профилактическими учреждениями Российской Федерации наблюдается повышенная потребность в препаратах крови, которая усугубляется низкими объемами отечественного производства, дороговизной импортных препаратов, а также недостатком качественного и безопасного сырья для их производства - плазмы для фракционирования [20, 22, 23].

В стране достигнуты значительные успехи в обеспечении безопасности плазмы для фракционирования в отношении основных возбудителей гемотрансмиссивных заболеваний гепатитов В и С, вируса (вирусов иммунодефицита человека 1 и 2 типа, возбудителя сифилиса): проводится эпидемический мониторинг, разработан и законодательно утвержден алгоритм лабораторного обследования доноров и донорской крови (плазмы) на маркеры данных инфекций [17]. Вместе с тем, в отношении ряда вирусов, передающихся гемотрансмиссивным путем и представляющих угрозу в плане контаминации сырья для производства препаратов крови, задача не решена. Так, на современном этапе развития службы крови представляет научный интерес определение эпидемиологической значимости парвовируса В19 (B19V) при донорстве плазмы для фракционирования на территории Российской Федерации.

Актуальность изучения обусловлена биологическими свойствами возбудителя. Основными клетками-мишенями B19V являются эритробласты. В зависимости от состояния организма человека B19V способен вызывать различные по тяжести заболевания, начиная от инфекционной эритемы у детей и заканчивая тяжелыми формами апластической анемии, фульминантным гепатитом у лиц с иммунодефицитами [1, 6, 25]. Отмечается повсеместная распространенность вируса, а также высокая восприимчивость всех возрастных групп к данному возбудителю. Так, установлено, что к 70-летнему возрасту до 60населения имеют антитела к B19V [113] и, следовательно, перенесли парвовирусную инфекцию. Для возбудителя характерен гемотрансмиссивный путь передачи инфекции. При этом наиболее значимым фактором передачи являются препараты крови, в особенности препараты плазменных факторов свертывания крови VIII и IX. Показано, что 56 – 100 % партий препаратов фактора VIII, произведенных в Европе и США в период с 1993 по 1998 гг., были контаминированы ДНК B19V [61]. Это обусловлено высокой устойчивостью возбудителя к процедурам вирусинактивации. Кроме того, при острой фазе инфицирования, которая в 25 % случаев протекает бессимптомно, B19V может присутствовать в крови в очень высокой концентрации – до 1013 МЕ (международных единиц)/мл [6, 113, 130]. Таким образом, в процессе производства препаратов крови будет достаточно одного контейнера с плазмой для фракционирования, содержащей ДНК B19V в такой высокой концентрации, чтобы контаминировать весь производственный пул, который может включать до нескольких тысяч контейнеров с плазмой. Поэтому практический интерес представляет определение процента выявления плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой B19V - ведущего фактора контаминации сырья для производства препаратов крови [34, 39]. Основной группой риска при реализации гемотрансмиссивного пути передачи парвовирусной инфекции являются пациенты гематологических стационаров как основные получатели препаратов.

Уровень распространенности B19V по данным ГНЦ, в этой группе составляет 3,2 %, при этом основная доля инфицирования приходится на больных с острыми лейкозами [31].

В настоящее время в Европе и США на законодательном уровне принято положение об обязательном тестировании плазмы для фракционирования на наличие ДНК B19V методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), как профилактическая мера, направленная на снижение риска контаминации препаратов крови данным возбудителем. При этом концентрация ДНК B19V в производственном пуле не должна превышать 104 МЕ/мл [59, 89, 103].

Предъявляются требования и к выбору тест-систем. Они должны в обязательном порядке определять все три генотипа возбудителя [35].

Степень разработанности темы Многоцентровые исследования, проведенные в США, Германии и ряде других стран мира, показали, что частота выявления ДНК B19V в популяции доноров составляет 0,55 – 1,9 % [26, 31, 47, 67, 69, 72, 80, 111, 117]. При этом процент выявления образцов плазмы для фракционирования с высоким уровнем виремии B19V среди общего числа исследованных находится на уровне 0,001Вопрос выявления возбудителя в Российской Федерации практически не изучен [26, 31]. На сегодняшний день полностью отсутствуют данные по частоте выявления ДНК B19V среди доноров плазмы для фракционирования, неизвестен процент обнаружения ДНК B19V клинически значимого уровня в образцах плазмы для фракционирования. Вместе с тем, создание отечественных современных предприятий по производству препаратов крови [15] определяет злободневность установления данных показателей и вызывает практический интерес к разработке и обоснованию алгоритма рутинного исследования на наличие ДНК B19V больших объемов донорской плазмы, направляемой на фракционирование.

Цель исследования Установить значимость тестирования плазмы для фракционирования на наличие и количественное определение ДНК B19V для повышения инфекционной безопасности сырья, используемого в производстве препаратов крови.

Задачи исследования Определить частоту выявления ДНК B19V среди доноров плазмы для 1.

фракционирования.

Определить процент образцов c высокой концентрацией ДНК B19V 2.

(106 МЕ/мл и более) среди общего числа исследованных образцов плазмы для фракционирования.

Оценить взаимосвязь выявления высокой вирусной нагрузки B19V у 3.

доноров плазмы для фракционирования с полом, возрастом, местом проживания, а также фактором сезонности.

Разработать алгоритм исследования плазмы для фракционирования 4.

на наличие ДНК B19V и определить его экономическую эффективность.

Новизна исследования Впервые в Российской Федерации определена частота выявления ДНК B19V среди доноров плазмы для фракционирования и установлен процент образцов c высокой концентрацией ДНК B19V (106 МЕ/мл и более) среди общего числа исследованных образцов плазмы для фракционирования, как ведущего фактора возможной контаминации производственных пулов при выпуске препаратов крови. Проведена оценка выявляемости высокой вирусной нагрузки B19V у доноров плазмы для фракционирования с полом, возрастом, местом проживания, а также фактором сезонности. Впервые определен риск возможной контаминации производственных пулов плазмой для фракционирования с высокой концентрацией ДНК B19V.

Теоретическое и практическое значение исследования Предложена математическая модель расчета риска возможной контаминации производственных пулов образцами плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой B19V. Разработан алгоритм исследования плазмы для фракционирования на наличие и количественное определение ДНК B19V с помощью тест-системы cobas TaqScreen DPX Test в пулах из 96 образцов. Определены критерий выбраковки и тактика в отношении доноров плазмы для фракционирования. Показана лабораторно-экономическая эффективность алгоритма в исследовании больших объемов плазмы для фракционирования.

Личный вклад автора Автор принимал непосредственное участие в проведении исследований по изучению эпидемиологической значимости B19V при заготовке плазмы для фракционирования. Автором лично проведена статистическая обработка и анализ полученных данных. При непосредственном участии автора разработан и внедрен в практику алгоритм исследования плазмы для фракционирования на наличие ДНК B19V с помощью тест-системы cobas TaqScreen DPX Test в пулах из 96 образцов.

Методология и методы исследования

В работе использованы общенаучные методы: анализ (проспективный и ретроспективный), синтез (сравнительно-сопоставительный), частно-научные методы (лабораторные методы исследования), методы вариационной статистики.

Основные положения, выносимые на защиту Выявляемость высокой концентрации ДНК B19V (106 МЕ/мл и более) 1.

в плазме для фракционирования, заготовленной от российских доноров, составляет 0,003 %, что представляет угрозу контаминации от 0,8 до 25 % производственных пулов.

Тестирование плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V в 2.

пулах из 96 образцов тест-системой cobas TaqScreen DPX Test с целью отбора проб с высокой концентрацией ДНК возбудителя исключает риск критической контаминации производственных пулов (концентрация ДНК В19V более 104 МЕ/мл).

Внедрение в практику Разработанный алгоритм тестирования плазмы для фракционирования внедрен в практику работы лаборатории контроля качества (ЛКК) ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России, а также включен в пусковой регламент на производство субстанции «Плазма для фракционирования» ПУР 13691313-01-12 (согласован в установленном порядке ФГУ «ГИКиМП» 18.02.2013; утвержден и введен в действие генеральным директором ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России 19.02.2013).

Апробация работы

Материалы работы были доложены:

на Всероссийской научно-практической конференции с VIII международным участием «Молекулярная диагностика 2014», Москва, 2014;

на Всероссийской научно-практической конференции с III международным участием и инфекционная безопасность в «Инфекции гематологии и службе крови», С-Петербург, 2014.

Публикации По теме диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, из них 5 в журналах, включенных в перечень ВАК РФ.

Объем и структура работы Диссертация изложена на 87 страницах машинописного текста на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, содержащего 131 литературный источник, из них 31 отечественный и 100 иностранных.

Работа содержит 7 рисунков и 18 таблиц.

Работа выполнена на базе ЛКК ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России (генеральный директор – С.В. Тхай) при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта № 14-04-31292 «Исследование факторов биобезопасности препаратов крови».

ГЛАВА 1 ОБЕСПЕЧЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ

ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ В ОТНОШЕНИИ

ПАРВОВИРУСА В19 НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ (обзор литературы)

1.1 Современное представление о возбудителе B19V был открыт австралийским вирусологом Ивонн Кассарт в Лондоне в 1975 году при изучении сывороток «здоровых» доноров, которые при проведении исследований на поверхностный антиген вируса гепатита (HBsAg) проявляли необычную гемаглютинационную активность [51]. Вирус относится к семейству Parvoviridae, подсемейству Parvovirinae, роду Erythrovirus [121]. B19V является безоболочечным вирусом икосаэдрической симметрии. Размер вирусной частицы составляет 18 – 26 нм в диаметре (рисунок 1) [62, 113, 130].

Рисунок 1 - Вирусные частицы B19V в образце сыворотки крови [113].

Вирион состоит из 60 копий капсидного белка и включает одноцепочечную молекулу ДНК положительной или отрицательной полярности [130]. Отсутствие липидной оболочки делает вирус устойчивым во внешней среде. Он хорошо выдерживает замораживание, нагревание до 60 °С в течение одного часа [12].

Геном B19V имеет длину 5596 п.н. и состоит из кодирующей последовательности (4830 п.н.), ограниченной справа и слева терминальными последовательностями по 383 п.н. каждая [100]. Долгое время считалось, что геном B19V консервативен в плане возможной изменчивости. Но проведенный филогенетический анализ изолятов B19V позволил установить уникальную область генома вируса - NS1VP1u, состоящую из 858 п.н., и дал основание к выделению трех генотипов вируса [131]. У генотипа 3 возбудителя выделяют два подтипа. В настоящее время генотип 1 представлен штаммом pvbaua [115], генотип 2 – штаммами LaLi [64] и A6 [98], генотип 3а – штаммом V9 [97] и генотип 3b – штаммом D91.1 [112].

Капсид B19V представлен двумя структурными белками, VP1 и VP2, которые кодируются 3’- концевой половиной генома [12, 62, 113, 130]. Основным структурным белком является VP2, на долю которого приходится до 95 – 96 % от всего белка капсида [100]. Данный белок имеет молекулярную массу 58 кДа и кодируется последовательностью с 3125 по 4786 п.н. генома B19V [113, 130]. На другой структурный белок, VP1, приходятся остальные 4 – 5 % капсида. Он отличается от VP2 большей молекулярной массой (84 кДа) и удлиненной на 227 аминокислот рамкой считывания, которая располагается с 2444 по 4786 п.н. В настоящее время выделено несколько неструктурных белков. Основной неструктурный белок, NS1, имеет молекулярную массу 77 кДа и кодируется последовательностью от 435 до 2448 п.н. генома B19V [130, 131]. Предполагается, что NS1 способен связывать ДНК с однонитевыми разрывами, обладает АТФподобной, транскрипционной и хеликазной активностью, а также выраженной цитотоксичностью Белок содержит нуклеоизидтрифосфат [113]. NS1 связывающий домен, который необходим для различных биологических функций вируса. Мутации в этом домене вызывают потерю цитотоксической активности вируса. Кроме белка NS1, выделены и другие неструктурные белки: два белка с молекулярной массой 11 кДа и один - 7,5 кДа [113, 131]. О биологической функции данных протеинов в настоящее время пока ничего неизвестно. Однако установлено, что ген белка с молекулярной массой 11 кДа необходим для репликации B19V в культуре клеток [131].

B19V в процессе своего жизненного цикла проходит ряд последовательных этапов: связывание вируса с рецептором клетки хозяина, проникновение вируса в клетку хозяина посредством эндоцитоза, транслокацию ДНК вируса в ядро клетки хозяина, репликацию ДНК, транскрипцию ДНК, трансляцию белков, сборку капсида и упаковку генома вируса, высвобождение зрелых вирионов, сопровождаемое лизисом клеток хозяина (рисунок 2).

–  –  –

Уже при открытии вируса была выявлена его агглютинационная способность в отношении эритроцитов человека [51]. Позднее был обнаружен в крови специфический гемагглютинин - антиген группы Р (глобозид) [41], отвечающий за связь с B19V. Избыток Р-антигена либо наличие анти-Рмоноклональных антител в культуре клеток может защитить клеткипредшественники эритропоэза от заражения B19V [41]. Кроме того, лица, у которых генетически отсутствует P-антиген (1 из 200 тыс. человек), устойчивы к заражению B19V [44]. Р-антиген экспрессируется в клетках–предшественниках эритропоэза, что соответствует наблюдаемому тропизму вируса [113].

Цитопатический эффект, вызываемый B19V при инфицировании клетокпредшественников эритропоэза, как в естественных условиях, так и в условиях эксперимента, проявляется в образовании гигантских пронормобластов (рисунок 3) [130].

Рисунок 3 - Гигантские пронормобласты [62].

B19V распространен по всему миру. В большинстве выделенных проб обнаруживается вирус генотипа 1 [37]. Генотип 2 выявляется спорадически в Европе, США и Южной Америке [81, 109, 119]. Изучение биоптатов кожи показало, что генотип 2 был широко распространен в Финляндии до 40 годов XX века. Около 40 % позитивных проб на ДНК B19V содержат вирус генотипа 2.

Тем не менее, этот генотип в биоптатах от молодых пациентов (1975 года рождения и младше) обнаруживается крайне редко [99]. Генотип 3 в основном выявляется в Северной и Западной Африке [47], а также во Франции [130]. На территории Российской Федерации обнаруживается В19V генотипа 1 [27].

По данным проведенных исследований показано, что выявляемость антител с возрастом нарастает: IgG обнаруживаются у 2 - 20 % детей в возрасте от 1 до 5 лет, у 15 – 60 % детей и подростков в возрасте от 6 до 19 лет, у 30 – 60 % взрослого населения и у более, чем 85 % людей пожилого возраста [1, 6, 12, 53, 106, 113, 130]. Для возбудителя характерна сезонность инфицирования. В регионе с умеренным климатом (Европа) заражение B19V в основном приходится на конец зимы – весну. Эпидемические вспышки возникают с определенной цикличностью, каждые 3 – 4 года [12, 113, 130].

может передаваться воздушно-капельным, трансфузионным и B19V трансплацентарным путем [1, 6, 12, 130]. Описаны случаи внутрибольничной передачи инфекции [77, 88]. Кроме того, возможно заражение сотрудников лабораторий, работающих с нативным вирусом [116].

Сведения о развитии инфекционного процесса и иммунном ответе организма были получены при изучении случаев, как экспериментального заражения добровольцев, так и естественного инфицирования B19V (рисунок 4).

Рисунок 4 - Течение инфекции, вызванной B19V [62].

В течение первых 7 дней после инфицирования идет активная репликация вируса в клетках-мишенях с последующим выходом вирионов в кровь. При этом ДНК B19V обнаруживается в высокой концентрации (до 1013 МЕ/мл). С развитием гуморального ответа содержание вируса в крови быстро падает до концентрации менее геном-эквивалента/мл. Возбудитель может обнаруживаться и в последующие месяцы (в среднем до 12 месяцев).

При обследовании доноров в Японии низкая концентрация ДНК B19V наблюдалась до 3 лет после заражения [86]. Через неделю после интраназального введения B19V здоровым взрослым добровольцам возбудитель начинает обнаруживаться в крови и отделяемом слизистой носоглотки. Клинически начинает появляться следующая симптоматика: ощущение дискомфорта, миалгия, кожный зуд, повышение температуры тела. Лабораторно через 10 - 12 дней после инфицирования в крови появляются специфические иммуноглобулины класса М (IgM), на этот же период приходится пик вирусной нагрузки. IgM обычно сохраняется в крови до трех месяцев, но иногда может обнаруживаться в образцах сыворотки крови в течение длительного времени [50]. В отдельных случаях, в исследуемых образцах обнаруживаются специфические иммуноглобулины класса А (IgA). Вероятно, они участвуют в естественной защите против воздушно-капельной инфекции [54].

Специфические иммуноглобулины класса G (IgG) начинают появляться примерно через две недели после инфицирования и, предположительно, сохраняются на протяжении жизни, защищая от повторных заражений иммунокомпетентных лиц [49]. При виремии количество ретикулоцитов падает до неопределяемого уровня и восстанавливается спустя 7-10 дней. Это приводит к временному снижению уровня эритроцитов и гемоглобина в крови. Клинически незначительная лимфопения (пониженное содержание лимфоцитов в крови), нейтропения содержание нейтрофильных гранулоцитов в крови) и (уменьшенное тромбоцитопения (пониженное содержание тромбоцитов в крови) возникают 6дней спустя после инфицирования. Все гематологические показатели могут демонстрировать кратковременные отклонения, предшествующие стабилизации на преинкубационном уровне. Наблюдаемая иногда нейтропения, по-видимому, не имеет клинического значения [130].

У здоровых, инфицированных B19V людей, преобладает гуморальный иммунный ответ [62]. Ранний иммунный ответ, представленный антителами IgM, направлен против VP2 вируса, тогда как для зрелого иммунного ответа характерно повышенное сродство антител IgG к VP1 в качестве основной цели, несмотря на его меньшую представленность на поверхности вириона [54].

Клеточный иммунитет против B19V обусловлен классическим Th1 ответом на вирус, опосредованным СD4+ клетками, узнающими вирусные эпитопы в комплексе с антигенами гистосовместимости класса II [60].

В зависимости от состояния иммунной системы человека B19V вызывает различные по тяжести заболевания. Бессимптомная форма наблюдается в 25% случаев инфицирования взрослых и до 50 % случаев - детей [114, 120]. При заражении здоровых людей самыми частыми нозологическими формами парвовирусной инфекции являются инфекционная эритема у детей [6, 12, 62, 130] и артропатии у взрослых [62, 130]. Заражение B19V беременных может привести, особенно в первом и втором триместрах, к водянке плода, спонтанным абортам или внутриутробной гибели плода [2, 13]. При имеющейся сопутствующей патологии вирус, в значительной мере, утяжеляет состояние больных. B19V может стать причиной хронической анемии у пациентов с ослабленным иммунитетом, не способных вырабатывать нейтрализующие антитела [130]. У больных гемолитической анемией, инфицированных возбудителем, приводит к развитию транзиторного апластического криза [6, 56]. Также имеются данные, указывающие на то, что B19V может приводить к фульминантному гепатиту у лиц с иммунодефицитами [1, 32]. Редкими формами парвовирусной инфекции являются васкулит, гломерулонефрит и миокардит [62].

1.2. Эпидемиологическое значение возбудителя для службы крови

Распространенность B19V в популяции доноров соответствует уровню распространенности возбудителя в популяции населения в целом.

Распространенность вируса по странам Европы несколько различается. В скандинавских странах (преимущественно в Финляндии) распространенность B19V выше, чем в других европейских странах [92]. Уровень обнаружения вируса генотипов 2 и 3 в популяции доноров в настоящее время представляется весьма низким. При исследовании образцов, взятых с 2005 по 2007 год, генотип 2 был обнаружен только в одной из 232 исследованных единиц плазмы с высокой концентрацией ДНК B19V [76]. Распространенность генотипа 3 в настоящее время в европейской популяции также невелика.

Учитывая, что частота выявления антител к B19V в популяции 18 – 30-летних доноров составляет около 60 %, то всегда имеется риск возможного забора крови или ее компонентов у первично инфицированных лиц. На основании документированной доли инфицирования женщин B19V, можно оценить, что до 0,5 – 1 % доноров в год будут вновь инфицированы данным возбудителем [43, 123].

В настоящее время для учреждений службы крови и производителей плазмы для фракционирования в эпидемиологическом плане более важным является наблюдение за показателем выявления ДНК B19V в популяциях доноров.

Объясняется это особенностями инфицирования вирусом (см. более подробно п.1.1 настоящей главы). Частота выявления ДНК B19V среди доноров крови разных стран варьирует в пределах от 0,55 до 1,90 % (таблица 1).

–  –  –

ЮАР 3 360 2 0,55 [47] 2004 США 4 5020 44 0,90 [72] 2007

–  –  –

Прямое сравнение результатов данных эпидемиологических исследований затруднительно, потому что чувствительность методов исследования различается.

Кроме того, на конечный результат могут повлиять сезонные и локальные вспышки парвовирусной инфекции.

Принимая во внимание частоту выявления ДНК B19V среди доноров [26, 31, 47, 67, 69, 72, 80, 111, 117], а также уровень еще неинфицированных лиц в популяции населения, заражение через компоненты или препараты крови встречается относительно часто [37, 65]. Однако сообщения о данных случаях публикуются крайне редко. Вероятно, что заражение B19V через продукты крови почти никогда не обнаруживается, так как сопровождается неспецифическими клиническими симптомами по типу гриппоподобной инфекции. Анемия, или тромбоцитопения, или лейкопения, так или иначе, исчезают после переливания продуктов крови. Косвенным подтверждением инфицирования B19V является то, что встречаемость антител к возбудителю выше среди пациентов, получавших факторы свертывания крови, чем в контрольной группе [101]. Аналогичные данные были получены и при сравнении групп, получавших и не получавших препараты крови: IgG к B19V выявлялись в 1,7 раза чаще в группе получавших препараты крови [118].

Кроме того, следует учитывать уровень вирусной нагрузки в единице трансфузии (компоненте или препарате крови). В ретроспективном исследовании, проведенном в США были определены случая из [71], 24 12529 протестированных донаций, когда компоненты крови, позитивные по ДНК B19V, переливались восприимчивым реципиентам. Все донации были с низкой вирусной нагрузкой (ДНК B19V 106 МЕ/мл) и содержали вирус - специфичный Во всех случаях не было заражения (сероконверсии) реципиента.

IgG.

Аналогичные данные были получены в исследовании, проведенном в Германии [101]. Описана передача B19V посредством объединенной (пулированной) плазмы, обработанной сольвент/детергентом плазма) Хотя (SD – [42].

пулированная плазма содержит сравнительно постоянный уровень специфичных антител к B19V (около 40 МЕ/мл) [110], тем не менее, он не является достаточным, чтобы нейтрализовать полностью высокую вирусную нагрузку парвовируса. Показано, что высокая концентрация ДНК B19V (106 МЕ/мл и более), независимо от имеющегося уровня нейтрализующих антител (IgGантитела к B19V) в плазме, делает процесс нейтрализации возбудителя, как правило, не эффективным, а образующиеся иммунные комплексы нестабильными, что приводит к инфекционности таких доз плазмы [39]. В исследовании, проведенном в США, было показано, что передача парвовирусной инфекции посредством SD – плазмы возможна при концентрации ДНК B19V более 107 геном-эквивалента/мл. Концентрация в 103,5 геном-эквивалента/мл не приводила к передаче возбудителя [42]. В связи с этим FDA и Европейский директорат по качеству лекарственных средств (ЕДКЛС) установили предельную концентрацию ДНК B19V в отношении производственных пулов плазмы для фракционирования на уровне не более чем 104 МЕ/мл [59, 89].

Таким образом, определение уровня выявления высокой вирусной нагрузки B19V в продуктах крови, в частности, в плазме для фракционирования, имеет практический интерес для производственной трансфузиологии. В недавно опубликованных работах зарубежных авторов [73, 74, 110] высокая концентрация ДНК B19V выявлена в образцах плазмы на уровне 0,001 – 0,006 % от всего числа исследованных. Аналогичный показатель в Российской Федерации до настоящего времени не определен.

1.3. Инфекционная безопасность плазмы для фракционирования Основным сырьем для производства препаратов крови является плазма для фракционирования. Она представляет собой жидкую часть крови, отделенную от форменных элементов центрифугированием или методом афереза в присутствии антикоагулянта, полученную от здоровых доноров и предназначенную для объединения в производственный пул [29, 90]. Важным критерием качества плазмы для фракционирования является ее безопасность. В настоящее время выделяют несколько уровней инфекционной безопасности [55, 57, 58, 104, 128].

В каждой стране должна быть разработана национальная политика и стратегия обеспечения качества гемотрансфузий, а также созданы законодательные структуры, регулирующие процессы заготовки, тестирования, переработки, хранения и транспортировки плазмы, полученной от доноров, в том числе, в отношении плазмы для фракционирования [127].

В качестве одной из мер для обеспечения инфекционной безопасности препаратов крови при их производстве широко применяется инактивация вирусов. Этот технологический прием может быть введен в процесс производства на разных его этапах, а в ряде случаев, даже после разлива и укупорки готовых лекарственных форм [45, 85, 104]. Cовременный технологический процесс производства препаратов крови из плазмы для фракционирования должен включать, как минимум, одну эффективную стадию инактивации безоболочечных вирусов. В соответствии с рекомендациями ВОЗ и Европейского агентства по оценке медицинских продуктов, стадия считается эффективной, если она обеспечивает инактивацию вирусов в log10 4 и более раз [55, 126].

В настоящее время выделяют следующие методы вирусинактивации:

прогревание плазмы (обработка сухим теплом), пастеризация, нанофильтрация, обработка методом «растворитель (сольвент)/детергент» (смесь трибутилфосфата с холатом натрия), обработка каприловой кислотой или каприлатом натрия, экспозиция при низком значении рН (от 4,0 до 4,25 для иммуноглобулинов, от 4,0 до 5,0 для других препаратов), обработка гидролитическими ферментами (пепсином, папаином) [7, 9, 28, 79, 126, 127]. Также в последнее время, кроме лицензированных методов, появились новые походы с применением рибофлавина, псоралена, фотосенсибилизирующих веществ, аминокислот. Но их применение в производстве препаратов крови сдерживается недостаточными данными о возможном негативном воздействии на качество и клиническую переносимость препаратов [8, 68]. Однако эффективность их применения в отношении профилактики парвовирусной инфекции при производстве препаратов крови недостаточна. В настоящее время задокументированы случаи передачи реципиентам B19V посредством переливания препаратов крови, которые были произведены с использованием технологии вирусинактивации (таблица 2).

–  –  –

Кроме того, не все методы вирусинактивации применимы для обработки производственных пулов. В частности, метод облучения видимым светом плазмы, обработанной метиленовым синим, эффективно снижает вирусную нагрузку до log10 5 и более МЕ/мл от первоначальной концентрации [7], но одобрен ВОЗ только для использования в отношении обработки одной дозы плазмы [126].

Кроме того, данный метод невозможно использовать при производстве лабильных препаратов крови.

Показано снижение в исходном сырье в среднем на биологической активности факторов свертывания при обработке 25 % метиленовым синим в концентрации 300 мкг/л и двустороннем облучении в режиме 50000 люкс в течение одного часа [7]. Доказана чувствительность B19V к пастеризации (10 часов при температуре 60 °С), сухому пару, экспозиции при рН 4 (метод используется при производстве иммуноглобулинов) и ограниченная эффективность в отношении вируса при использовании нанофильтрации [9, 79, 94, 126, 127]. Для парвовируса свиней (экспериментальная модель B19V) показана эффективность метода облучения ультрафиолетом плазмы, обработанной рибофлавином, что может свидетельствовать об эффективности данного метода в отношении возбудителя. Но в то же время облучение ультрафиолетом плазмы, обработанной псораленом, не оказывает влияние на исходную концентрацию парвовируса свиней в исследуемом материале [94]. Зафиксированные случаи передачи парвовирусной инфекции через плазму, обработанную сольвент/детергентом, показали эффективность данного метода в отношении B19V только в случае низкой концентрации возбудителя в исходном сырье [82].

Таким образом, в связи с биологическими свойствами вируса, возможности применения вирусинактивации при производстве препаратов крови имеют на практике незначительную эффективность в случае попадания в производственный пул дозы плазмы с высокой концентрацией ДНК B19V. При выпуске лабильных препаратов крови ситуция усугубляется технологическими особенностями, ограничивающими выбор методов виусинактивации в отношении возбудителя, поэтому значение приобретает диагностика B19V, как профилактическая мера, направленная на обеспечение инфекционной безопасности сырья для производства препаратов крови.

1.4. Методы диагностики B19V 1.4.1. Методы выявления возбудителя Данную группу методов можно условно разделить на две подгруппы. К первой относятся методы диагностики, направленные на выявление самого B19V.

Сюда относятся электронная микроскопия и ее различные модификации [62, 130].

Данные методы имеют ряд недостатков. Во-первых, идентификация B19V затруднительна из-за малых размеров вирусных частиц. Во-вторых, данные методы имеют малую диагностическую чувствительность, т.к. могут выявлять только образцы с высоким уровнем виремии. В-третьих, эти методы совершенно неприменимы в службе крови.

Ко второй подгруппе относится цитологический метод. Он основан на цитопатологическом действии вируса на эритроидные клетки организма хозяина с образованием гигантских пронормобластов Данный метод имеет [62].

вспомогательное значение в клинической практике. Обнаружение гигантских пронормобластов в пунктате костного мозга или мазке периферической крови хотя и указывает на наличие B19V, но не является единственным критерием для установки диагноза. Эти клетки часто отсутствуют у пациентов с хроническими инфекциями, в частности при наличии ВИЧ-инфекции. Кроме того, данный метод абсолютно неприменим для использования в службе крови.

1.4.2. Методы выявления генома возбудителя Различные молекулярно-биологические методы диагностики надежно выявляют ДНК B19V. Кроме того, создание количественных методов позволяет определить концентрацию генома вируса в исследуемом материале. К ним относятся прямая гибридизация, обычно в формате слот-блот или дот-блот, а также полимеразная цепная реакция (ПЦР), как правило, в режиме реального времени. Для метода прямой гибридизации используют полноразмерную или клонированную вирусную ДНК, меченую Р32, дигоксигенином или биотином [33, 91]. Предел обнаружения при использовании метода гибридизации составляет примерно 105 геном-эквивалентов/мл. Неоспоримым преимуществом данного метода диагностики является возможность определения конкретного генотипа вируса.

Более чувствительным молекулярно-биологическим методом диагностики является ПЦР, которая позволяет выявлять ДНК B19V в образцах крови и биоптатах тканей, хотя при этом существует вероятность ложноположительных реакций Создание международного стандарта Всемирной [39, 49, 74].

Организации Здравоохранения (ВОЗ) ДНК B19V позволило в значительной мере стандартизировать и унифицировать методику проведения исследования [36], а также официально утвердить соотношение единиц измерения, которые используются в разных лабораториях. Соотношение между международными единицами (МЕ) и геном-эквивалентом установлено от 1 : 0,6 до 1 : 0,8 [108].

Выявление в исследуемых образцах высокой концентрации ДНК B19V (более 106 МЕ/мл) указывает на острый инфекционный процесс. В то время как низкий уровень вирусной нагрузки (ДНК B19V менее 104 МЕ/мл) – на хроническую инфекцию или острую инфекцию в более поздней фазе развития. Однако было показано, что ДНК B19V может обнаруживаться в течение длительного времени в сыворотке крови, а в определенных тканях (коже, печени) может определяться пожизненно [48, 83, 84]. Таким образом, использование при диагностике парвовирусной инфекции только результатов молекулярно-биологических методов исследования не может свидетельствовать об остроте инфекционного процесса.

1.4.3. Методы выявления антител и антигена возбудителя Диагностика B19V у иммунокомпетентных лиц с инфекционной эритемой или артропатией осуществляется путем выявления специфических антител. В связи с неспособностью B19V эффективно воспроизводиться в культуральных системах, вирусные капсиды изначально были выделены из сывороток с высокой концентрацией вируса и использовались для тестов на антитела [34]. Антиген B19V может быть экспрессирован в бактериях, в клеточных линиях [34, 38], и синтезирован в виде коротких пептидов. Однако в настоящее время большинство антигенов для промышленных целей производится на клеточных линиях насекомых с рекомбинантным бакуловирусом [78].

Тесты на IgM достоверно определяют текущую или недавнюю инфекцию у иммунокомпетентных лиц [12, 26, 130]. Таким образом, у более 85% пациентов с инфекционной эритемой или апластическим кризисом, вызванным B19V, в течение 2-3 месяцев после инфицирования определяются антитела класса IgM [84]. Тесты, основанные на непрямом методе обнаружения IgM, менее пригодны для диагностирования из-за низкой специфичности и чувствительности. IgG обычно появляются спустя 2 недели после инфицирования и сохраняются всю жизнь. Титры IgG как правило падают со временем [62, 130].

Важность выявления NS1-специфичного иммуноглобулина G постоянно обсуждается и оспаривается, поскольку этот иммуноглобулин, предположительно, связан с характером заболевания [122]. Сообщается, что NS1специфичный иммуноглобулин G чаще обнаруживается у пациентов с артритом или хронической инфекцией B19V [70, 122]. Большинство исследователей полагают, что независимо от характера заболевания, NS1-специфичный IgG проявляется поздно (6 недель), и поэтому тест на антитела против NS1 может быть использован для того, чтобы исключить острую инфекцию у пациентов с неясной серологией [87, 122].

Вирусная частица B19V обладает гемагглютинирующей активностью [51]. В связи с этим был разработан тест, основанный на методе пассивной гемагглютинации, для выявления антигена [63, 107]. Использование данного метода ограничено только образцами с высоким уровнем виремии (примерно 108 – 109 геном-эквивалентов/мл). Также результат теста будет отрицателен, если в крови имеются антитела к B19V. Следовательно, гемагглютинационный тест подходит для обнаружения высоковиремичных образцов в фазе серологического окна.

1.4.4. Методы диагностики, используемые в службе крови Обследование доноров или компонентов крови, предназначенных для клинического применения, на наличие B19V в настоящее время не предписано нормативными документами. Плазма для фракционирования, предназначенная для производства объединенной вирус – инактивированной плазмы или анти-Dиммуноглобулина, должна быть протестированы на наличие ДНК B19V методом ПЦР, при этом концентрация ДНК в производственном пуле не должна быть выше 104 МЕ/мл [89].

Тестированием на обнаружение вирус-специфичных антител к парвовирусу (IgG) может быть охвачена доля иммунных доноров. Отвод доноров при обнаружении IgG от донации крайне нежелателен потому, что плазма таких доноров с высокой вероятностью не заразна и может быть использована в качестве сырья для производства иммуноглобулина. Теоретически можно использовать тест на выявление антител на этапе карантинизации для выявления образцов плазмы, содержащих возбудитель. На практике, однако, разрабатываются [25, 30, 75] и применяются [47, 67, 69, 73, 75, 80, 93] чаще тестсистемы для выявления ДНК B19V. В отдельных случаях, из-за крайне высокой концентрации ДНК B19V в отдельном образце плазмы, важны эффективные меры во избежание перекрестного загрязнения. В случае получения положительного результата для протестированного мини-пула, отдельный образец плазмы с высоким уровнем виремии может быть определен посредством B19V дальнейшего исследования. Внедрение стандарта ВОЗ для ДНК B19V в последние годы значительно улучшило сопоставимость NAT-результатов [36, 108]. Так как генотипы 2 и 3 были отнесены к B19V, и показали аналогичную патогенность [38], Европейский директорат по качеству лекарственных средств (ЕДКЛС) потребовал, чтобы эти редкие генотипы также определялись методом ПЦР [35, 36].

Гемагглютинационный тест был проверен в банках крови Японии и Германии [63, 107, 124]. Принципиально он подходит для определения образцов плазмы с высоким уровнем виремии B19V, его чувствительность ограничена концентрацией возбудителя 108 геном-эквивалента/мл. Даже небольшое количество антител ведет к подавлению гемагглютинации, поэтому образцы с антителами и/или концентрацией ДНК B19V менее 108 геном-эквивалента/мл не обнаруживаются.. Кроме того, была описана передача B19V через SD-плазму, содержащую ДНК возбудителя в концентрации 107 геном-эквивалента/мл [52].

Отсюда существует некая неоднозначность: определяет ли гемагглютинационный тест фактически все контаминированные образцы плазмы. В настоящее время в большинстве учреждений службы крови предпочитают ПЦР гемагглютинационному тесту. В последние годы проводится испытание улучшенного ИФА-теста для определения антигена вируса. Этот тест показывает меньшую интерференцию специфических антител к B19V, чувствительность также ограничена геном-эквивалента/мл. Антиген-тест должен обнаруживать все три генотипа [50]. Таким образом, только отдельные образцы плазмы, а не мини-пулы, могут быть проверены этим методом.

Особая роль в обеспечении профилактики парвовирусной инфекции принадлежит тестированию плазмы, предназначенной для дальнейшего фракционирования и используемой в производстве препаратов крови (плазмы для фракционирования), на наличие ДНК B19V. Принимая во внимание, что отдельные образцы плазмы могут содержать ДНК B19V в концентрации до 1013 геном-эквивалента/мл, то контаминация такой плазмой производственного пула, обычно включающего от 1000 до 10000 донаций [19], приведет к вирусной нагрузке пула в 109 – 1010 геном-эквивалента/мл. Исследование пулов плазмы, у которых исходный материал не был протестирован на B19V, показало, что 60 % всех пулов плазмы содержали ДНК B19V и из них 35 % в высокой концентрации (106 – 108 геном-эквивалента/мл) [125].

Высокое вирусное загрязнение не удаляется обычными методами очистки белков, какие применяются для препаратов плазмы. Контаминация B19V была показана посредством выявления ДНК B19V в препаратах плазмы (факторы свертывания крови, иммуноглобулин, альбумин) [34, 84, 125]. Самый высокий уровень контаминации был определен в препаратах свертывания крови: 56-100 % от проверенных партий препаратов содержали ДНК парвовируса с максимальными значениями до 107 геном-эквивалента/мл. Максимальный уровень контаминации иммуноглобулина (до 104 геном-эквивалента/мл) и альбумина (до 103 геном-эквивалента/мл) был ниже за счет дополнительных стадий очистки [34, 84]. В связи с этим тестирование исходного материала (плазмы для фракционирования) и конечных продуктов было введено многими производителями вначале на добровольной основе [103], а затем принято к исполнению в обязательном порядке регуляторными органами США [59] и Европы [89].

В настоящее время Российская Федерация относится к числу стран, где тестирование на ДНК B19V не осуществляется. Кроме того, работ посвященных изучению распространенности B19V как среди населения в целом, так и среди доноров в частности, крайне мало [26, 31]. Вместе с тем создание крупного современного производства препаратов крови [15] требует решения этой задачи.

При этом используемая методика выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР должна в обязательном порядке пройти процедуру верификации в соответствии с требованиями нормативной документации [4, 18].

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

–  –  –

фракционирования, заготовленной в период с января 2012 года по декабрь 2014 года от 27610 доноров ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России, проживающих на территориях ряда субъектов Приволжского и Северо-Западного Федеральных округов Российской Федерации.

Молекулярно-биологический метод 2.2.

Исследование образцов проводили методом ПЦР в режиме реального времени с помощью коммерческого набора реагентов cobas TaqScreen DPX Test (далее по тексту – тест DPX) (Roche Diagnostics, США), предназначенного для выявления и количественного определения ДНК B19V и выявления РНК вируса гепатита А, согласно инструкции производителя [105]. Для проведения ПЦР в режиме реального времени использовали автоматизированный комплекс cobas s201 (Roche Diagnostics, Швейцария), включающий в себя раскапывающую станцию для формирования пулов Hamilton MICROLAB STAR IVD Pippetor, прибор для пробоподготовки и выделения нуклеиновых кислот cobas AmpliPrep и автоматический анализатор cobas TaqMan.

Образцы тестировали в мини-пулах, состоящих из 96 образцов. Контроль качества проводился для каждой постановки. В качестве контрольного материала применяли набор контролей cobas TaqScreen DPX Control Kit (Roche Diagnostics, США), который включает в себя отрицательный контроль DPX (-)C, двойной положительный контроль DPX D (+)C (положительный контроль на РНК вируса гепатита А, содержащий неинфекционную, синтетическую РНК и положительный контроль на ДНК B19V, содержащий неинфекционную синтетическую ДНК в диапазоне концентраций 1,21 х 102 – 1,21 х 103 МЕ/мл) и положительный контроль на B19V DPX H(+)C, содержащий неинфекционную, синтетическую ДНК в диапазоне концентраций х х МЕ/мл.

2,43 – 2,42 Автоматизированное формирование мини-пулов и раскапывание контрольного материала проводили с помощью раскапывающей станции Hamilton MICROLAB STAR IVD Pippetor.

Выделение нуклеиновых кислот из исследуемоего материала осуществляли в автоматизированном режиме на приборе для пробоподготовки и выделения нуклеиновых кислот cobas AmpliPrep с лизирующего реагента и стеклянных магнитных частиц, входящих в состав теста DPX.

Автоматизированную амплификацию и количественную детекцию ДНК B19V проводили на анализаторе cobas TaqMan с помощью реагента MasterMix, входящего в состав теста DPX.

Для определения содержания ДНК B19V в образцах исследование проводилось по следующему алгоритму. В случае обнаружения мини-пулов, содержащих ДНК B19V, тестирование образцов повторяли в мини-пулах из 12 образцов (суб-пулы), а затем образцы из суб-пулов, в которых была выявлена ДНК возбудителя, исследовали в режиме индивидуального тестирования.

Верификация методики выявления и количественного определения 2.3.

ДНК B19V в образцах плазмы для фракционирования Провели верификацию методики выявления и количественного определения ДНК В19V в плазме для фракционирования с помощью теста DPX путем оценки следующих аналитических характеристик: аналитическая чувствительность, воспроизводимость, точность, возможность определения всех генотипов возбудителя, робастность и перекрестное заражение. В качестве критериев приемлимости использовали показатели, установленные производителем [105].

Аналитическую чувствительность теста DPX для ДНК B19V оценивали путем установления предела определения (LOD) при уровне доверительной вероятности 95 % (95 % LOD). Определение 95 % LOD проводили путем исследования разведений 2-го Международного стандарта ВОЗ ДНК B19V для исследований методом ПЦР, код NIBSC 99/802 (Международный стандарт), который подготовили к работе согласно инструкции по применению [96]. Затем (100,5) приготовили серийные десятикратные разведения в степени 0,5 Международного стандарта, получив образцы, содержащие ДНК B19V от 100 до 0,1 МЕ/мл. В качестве разбавителя использовали пулированную плазму человека, которая содержала антикоагулянт и не содержала маркеры ACD-A гемотрансмиссивных инфекций (поверхностный антиген ВГВ, антитела к ВГС, антитела к Tr. pallidum, антиген ВИЧ-1, антитела к ВИЧ-1/ВИЧ-2, нуклеиновые кислоты ВГА, ВГВ, ВГС, ВИЧ-1/ВИЧ-2, B19V). По 8 образцов каждого уровня ДНК B19V исследовали с помощью теста DPX на протяжении 3 дней. Таким образом, количество исследованных образцов для каждого уровня концентрации в ходе исследования составило по 24 образца.

Для оценки воспроизводимости тестировали образцы, полученные путем разведений Международного стандарта до уровня концентрации ДНК B19V log10 4,0 МЕ/мл, по 8 образцов в течение 3 дней.



Pages:   || 2 | 3 |

Похожие работы:

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«КУЖУГЕТ ЕЛЕНА КРАССОВНА «Хозяйственно-биологические особенности крупного рогатого скота, разводимого в разных природно-климатических зонах Республики Тыва» 06.02.10. Частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«МУСТАФАЕВ РОВШАН ДЖАЛАЛ ОГЛЫ «СОВРЕМЕННЫЕ ЛАЗЕРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ЛЕЧЕНИИ ПЕРИТОНИТА» (Экспериментально-клиническое исследование) Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности–14.01.17 хирургия Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Гейниц А.В. Москва 2014 СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Приложения Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ПРИЛОЖЕНИЕ А...»

«ГОРБУНОВА Анна Николаевна ГИДРОЛИЗ РАЦЕМИЧЕСКИХ АМИДОВ ФЕРМЕНТАМИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Максимов А. Ю. Пермь – 201 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»

«БАБЕШКО Кирилл Владимирович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОЧТЕНИЯ СФАГНОБИОНТНЫХ РАКОВИННЫХ АМЕБ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ГИДРОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА БОЛОТ В ГОЛОЦЕНЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Цыганов...»

«РОМАНЕНКО НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ АНЕМИЯ У БОЛЬНЫХ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ: ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕНЕЗА, МЕТОДЫ КОРРЕКЦИИ, КАЧЕСТВО ЖИЗНИ 14.01.21. – гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант – доктор медицинских наук, профессор...»

«Трубилин Александр Владимирович СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАПСУЛОРЕКСИСА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФАКОЭМУЛЬСИФИКАЦИИ КАТАРАКТЫ НА ОСНОВЕ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ И МЕХАНИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Калинка Ольга Петровна ОЦЕНКА УЯЗВИМОСТИ АКВАТОРИИ КОЛЬСКОГО ЗАЛИВА И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЕГО БЕРЕГОВ ПРИ РАЗЛИВАХ НЕФТИ Специальность 25.00.28 – Океанология диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель кандидат технических наук Шавыкин Анатолий Александрович Мурманск, 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1....»

«Мухутдинова Анна Наилевна БИОДЕСТРУКЦИЯ ДРОТАВЕРИНА ГИДРОХЛОРИДА АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА RHODOCOCCUS 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна, доктор фармацевтических наук Вихарева Елена...»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«Кузнецов Василий Андреевич ПОЧВЫ И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПАРКОВО-РЕКРЕАЦИОННЫХ ЛАНДШАФТОВ МОСКВЫ Специальность 03.02.13-почвоведение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, И.М. Рыжова Москва-2015 Содержание Введение Глава 1. Влияние рекреации на лесные экосистемы (Литературный обзор) 1.1.Состояние проблемы 1.2....»

«НОВИЧКОВ АНДРЕЙ СЕРГЕЕВИЧ Молочная продуктивность и качество молока коз русской породы в условиях техногенного загрязнения Саратовской агломерации 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.В. Забелина Саратов 2015 СОДЕРЖАНИЕ...»

«Проскурякова Лариса Александровна НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ СОХРАНЕНИЯ ЗДОРОВЬЯ...»

«Зубенко Александр Александрович СИНТЕЗ И ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНЫХ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ В РЯДУ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук г. Новочеркасск – 2015 Содержание ВВЕДЕНИЕ.. 6 1.Обзор литературы..19 1.1. Проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов и пути её преодоления..19 1.2. Проблема...»

«ХУДЯКОВ Александр Александрович ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT В РАЗВИТИИ АРИТМОГЕННОЙ КАРДИОМИОПАТИИ НА МОДЕЛИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор...»

«Калинкин Дмитрий Евгеньевич ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ ГОРОДОВ В ЗОНЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРЕДПРИЯТИЙ АТОМНОЙ ИНДУСТРИИ 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание учной степени доктора медицинских наук Научный консультант: д-р мед. наук, профессор Тахауов Равиль Манихович Томск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.