WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«БИОДЕСТРУКЦИЯ ДРОТАВЕРИНА ГИДРОХЛОРИДА АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА RHODOCOCCUS ...»

-- [ Страница 2 ] --

Экстремотолерантность родококов отмечена в работах многих авторов (Коронелли, 1996; de Carvalho, da Fonesca, 2005; Larkin et al., 2006; de Carvalho et al., 2009; de Carvalho, 2010, 2012). Показано, что родококки сохраняют высокую (70–90 %) жизнеспособность в условиях долгосрочного низкотемпературного (-85 °С) хранения (Каменских и др., 2010; Шляпина и др., 2011), способны расти в широком (4–37 оС) температурном и кислотном (pH 3–11) диапазоне (Ветрова и др., 2013; de Carvalho, 2012). Ряд работ указывает на их высокую галотолерантность (Пастухова и др., 2010; Егорова и др., 2013; Корсакова и др., 2013).

Важную роль в процессах выживания в неблагоприятных условиях среды и биодеструкции органических соединений имеет строение клеточной стенки родококков. Клеточная оболочка включает гидрофобный липидный слой, представленный ковалентно связанными цепочками миколовых кислот, по своим барьерным свойствам весьма сходный с пептидогликановым слоем грамотрицательных бактерий (Куюкина и др., 2000; Bell et al., 1998; Gibson et al., 2003). Присутствие различных токсичных соединений в ростовой среде родококков индуцирует изменение жирнокислотного состава липидов мембраны.

Происходящие изменения способствуют изменению текучести клеточной оболочки родококков. Способность родококков изменять жирнокислотный состав клеточной стенки является важным фактором в формировании резистентности к воздействию токсичных соединений (Соляникова, 2007; de Carvalho, da Fonseca, 2005; Martnkov et al., 2009). Среди родококков отмечена возможность к изменению суммарного заряда клеточной поверхности. Так, представители экологически значимого вида R. erythropolis изменяют отрицательный суммарный заряд на поверхности клетки на положительное значение при росте на длинноцепочечных н-алканах. Изменение суммарного клеточного заряда облегчает прикрепление бактериальных клеток к отрицательно заряженным поверхностям в окружающей среде, например, н-гексадекану (de Carvalho et al., 2009).

Физиолого-биохимические изменения, происходящие в клеточной стенке родококков при стрессовом воздействии, имеют морфологическое проявление, заключающееся в диссоциации клеточной популяции на несколько типов колоний. Гетерогенные колонии родококков чаще всего представлены и Основное морфологическое отличие диссоциантов S- R-формами.

S- и R-формы – шероховатость колоний. Так, колонии, представленные R-формой, имеют шероховатую, S-формой – гладкую поверхность.

В работе Е.С. Милько и С.Н. Егорова (1991) отмечено, что для родококков в R-форме характерна утолщенная клеточная стенка и наибольшее количество суммарных общих липидов, чем у клеток, находящихся в S-форме.

Электрокинетический потенциал родококков в R- и S-формах также имеет существенные различия. Для родококков в S-форме характерны высокие значения дзета-потенциала, в то время как R-диссоцианты имеют минимальный клеточный заряд. Установлено, что R-диссоцианты наиболее устойчивы к длительному хранению, способны выдерживать максимально высокие ( 40 оC) показатели температуры и pH среды (9,0), сохранять жизнеспособность при облучении ультрафиолетовым светом, проявлять высокую резистентность к воздействию антибиотиков. Родококки в S-форме устойчивы к воздействию низких (14 oС) температур и повышенных (6,5 %) концентраций хлорида натрия (Милько, Егоров, 1991).

Среди прочих механизмов, способствующих устойчивости родококков к воздействию стрессовых факторов, является изменение морфометрических показателей. Так, в работе Y. Veeranagouda с соавт. (2009) отмечено формирование мини-клеток при взаимодействии родококков с токсичными парами крезола. Формирование укороченных палочек наблюдается у клеток R. opacus PD630 как один из защитных механизмов бактерий на высушивание, при этом наблюдается агрегирование бактериальных клеток (Alvarez et al., 2004).

Согласно литературным данным, агрегирование клеток (формирование биопленок, клеточных конгломератов, флокул) также является защитной реакцией микроорганизмов при взаимодействии с токсичным субстратом (Николаев, 2004; de Carvalho, da Fonseca, 2005). Существование родококков в условиях недостатка влаги объяняется их способностью к образованию капсулоподобных структур и формированию в цикле развития клеток с цитологическими признаками, присущими спорам (Нестеренко и др., 1985;

Ившина, 1997; Solyanikova et al., 2011). Образование цистоподобных покоящихся клеток демонстрирует стратегию их “пассивной” адаптации к воздействию различных неблагоприятных факторов внешней среды.

Родококки способны не только сохранять жизнеспособность в экстремальных условиях среды, но и при этом являться активными биодеструкторами органических соединений (de Carvalho, da Fonseka, 2005; Larkin et al., 2006). Показано, что родококки способны использовать в качестве источника углерода и энергии алифатические, моноароматические и полиароматические углеводороды, а также труднодоступные для других микроорганизмов гетероциклические соединения – нитриламины и гербициды (Ветрова и др., 2013; Жуков и др., 2006; Walter et al., 1991; Bouchez et al., 1997;

Komang Ralebitso et al., 2002; de Carvalho et al., 2007). При этом присутствие легко деградируемых источников углерода не способствует снижению скорости в процессе детоксикации трудноразлагаемых соединений ввиду отсутствия у родококков катаболитной репрессии (de Carvalho et al., 2014). Следует отметить, что особый интерес вызывают представители экологически значимых видов R. erythropolis и R. rhodochrous из-за их широкой субстратной специфичности и высокой адаптируемости к экстремальным условиям среды обитания (de Carvalho et al., 2014).

Как показывает анализ литературных данных, родококки обладают исключительной экологической пластичностью, в основе которой обнаружен целый комплекс стратегических приемов выживания. Среди них наиболее важными являются популяционная гетерогенность родококков, широкий диапазон толерантности к абиотическим факторам, политрофия, образование капсулоподобных структур, широкая норма реакции в сочетании с толерантностью к повреждающим клетку воздействиям, склонность к клеточной агрегации. Все эти свойства делают родококков наименее зависимыми от внешней среды, обеспечивая тем самым их широкое распространение в природных экосистемах, а высокая метаболическая активность позволяет рассматривать представителей данного рода в качестве перспективных биодеструкторов многих органических соединений, в том числе лекарственных средств.

Согласно исследованиям, проведенным Е.В. Вихаревой (2009), представители экологически значимых актинобактерий рода Rhodococcus характеризовались высокой жизнеспособностью в присутствии фармацевтических соединений различного спектра действия. Для родококков показатели минимальной подавляющей концентрации (МПК) в отношении таких соединений как новокаин, папаверина гидрохлорид, тримекаин составили 5000 мг/л, в то время как для представителей родов Gordonia и Dietzia значения МПК на порядок ниже. Такое соединение как изониазид подавлял рост родококков при достаточно низкой (1 мг/л) концентрации, однако показатели МПК изониазида в отношении родококков были значительно выше таковых для микобактерий (Sutcliffe, 1998).

Изучение биокаталитической активности родококков выявило высокую способность их к разложению фармацевтических соединений различной химической структуры. На примере парацетамола показана возможность биодеструкции родококками (R. erythropolis ИЭГМ 767, R. ruber ИЭГМ 77) фармацевтических соединений, в состав химической молекулы которых входит фенольный гидроксил (Вихарева, 2009; Ившина и др., 2006, 2009). Биодеструкция парацетамола (2000 мг/л) происходила с образованием n-аминофенола, пирокатехина, гидрохинона, бензохинона и муконовой кислоты. При этом появление первого метаболита (n-аминофенола) обнаруживалось уже на первые сут культивирования родококков, пирокатехина – на третьи, гидрохинона – на пятые сут. В вышеуказанных работах отмечена возможность биодеструкции парацетамола в виде фармацевтической субстанции и в форме таблеток.

Максимальная убыль парацетамола в виде субстанции составила 86 % на 20 сут, а полное разложение парацетамола в таблетированной форме наблюдалось уже через 5 сут.

В работе H. Gauthier с соавт. (2010) R. rhodochrous ATCC 13808 использовали для биоразложения гетероциклических азотсодержащих фармацевтических соединений различного спектра действия – сульфаметизола (43,4 мг/л), сульфаметоксазола (32 мг/л), карбамазепина (9,5 мг/л). Показано, что биодеструкция этих соединений в качестве единственного источника углерода, азота и энергии крайне затруднена и была возможна только в присутствии глюкозы. В соокислительных условиях биодеградация сульфаметизола, сульфаметоксазола и карбамазепина составила 14, 20, 15 %, соответственно.

При этом продолжительность процесса биодеструкции для каждого препарата не превышала 36 сут. Метаболиты, образующиеся в процессе биодеструкции данных соединений, имели короткий период существования. Биодеструкции фармацевтических соединений, производных барбитуровой кислоты, метопролола (107,8 мг/л) в частности, в данных условиях не наблюдалась.

Взаимодействие родококков со стероидными соединениями (17 -эстрадиолом, в частности) исследовано в работе T. Yoshimoto с соавт.

Процесс биоразложения данного фармацевтического соединения (2004).

в концентрации 100 мг/л составил 24 ч в присутствии глюкозы. Рабочими культурами служили представители видов R. zopfii и R. equi. Наиболее активным оказался штамм R. zopfii Y 50158.

Представители видов R. erythropolis, R. equi и R. rhodochrous рассмотрены в качестве потенциальных деструкторов 17 -этинилэстрадиола (1,4 мг/л).

Наиболее активной оказалась культура, принадлежащая к R. erythropolis. Убыль 17 -этинилэстрадиола в качестве единственного источника углерода и энергии составила 10 % через 75 ч, в присутствии глюкозы – 47 % через 13 ч от начала эксперимента (OGrady et al., 2009). Согласно работе S. Larcher и V. Yargeau (2013), наиболее активным выбран штамм R. rhodochrous АТСС 13808, полностью утилизирующий 17 -этинилэстрадиол (5 мг/л) через 48 ч. Полное разложение тестостерона (1 мг/мл) в течение 2 сут оказалось возможным с использованием нерастущих клеток R. equi ATCC 14887. Биологическая деградация тестостерона протекала по двум путям: с образованием 9, 17 –дигидроксиандрост-4-ен-3-она и андрост-4-ен-3,17-диона, с дальнейшим их преобразованием в 9-гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона и 9-гидрокси-1,4-адростадиен-3,17-диона.

Среди конечных продуктов обнаружен 3-гидрокси-9,10-секоандроста-1,3,5 (10)триен-9,17-дион (3-HSA), деградируемый до СО2 и Н2О (Kim et al., 2007).

На настоящий момент известны работы по биодеструкции родококками фармацевтических соединений, основой химической структуры которых являются сложные эфиры. Показана возможность биодеструкции клофибриновой кислоты до клофибрата с использованием клеток R. rhodochrous (Evangelista et al., 2008).

В связи с тем, что в природе большинство микроорганизмов находится в состоянии естественной иммобилизации (адсорбция микроорганизмов на почвенных частицах, агрегация микробных клеток друг с другом, с частицами пыли, почвы или минералов), в некоторых работах показана роль иммобилизованных родококков в биодеструкции лекарственных соединений.

В биотехнологии ассортимент носителей для иммобилизации весьма широкий и включает как всевозможные поверхностные носители (древесные опилки, перья, ткань, керамику, стекло и др.), так и полимерные гелевые носители (желатин, альгинаты, агар, поливиниловый спирт и др.) (Демаков и др., 2008; Криворучко, 2007; Елькин и др., 2010; Понаморева и др., 2011). Отмечено, что в процессе взаимодействия клеток, иммобилизованных на инертном носителе, продолжительность процесса биодеструкции фармацевтических соединений значительно сокращалась. Так, родококки, иммобилизованные в матрицу поливинилового спирта, деструктировали парацетамол (2000 мг/л) в течение 3 сут, в то время как продолжительность процесса биодеструкции парацетамола свободными клетками составляла 20 сут (Ившина и др., 2006). Уровень биоконверсии 2-аминобензотиазола (0,5 мМ), используемого в химиотерапии при лечении раковых заболеваний, с использованием иммобилизованных в Ca-альгинат клеток R. rhodochrous OBT18, по истечении 100 ч составила 30 %, а биодеструкция данного соединения свободными клетками родококков не превышала 14 % (Chorao et al., 2009).

Таким образом, актинобактерии рода Rhodococcus можно рассматривать в качестве одних из наиболее активных природных агентов биодеструкции фармацевтических поллютантов. Родококки занимают доминирующее положение в экстремальных местообитаниях и обладают высокой экологической пластичностью. В последнее десятилетие появились единичные работы по биодеградации фармацевтических соединений с использованием родококков.

Однако в представленных работах не изучены в полном объеме вопросы взаимодействия “микроорганизм–фармполлютант”, необходимые для построения модели поведения фармацевтических поллютантов в природных экосистемах.

Малочисленна информация о метаболитах биологической деструкции фармполлютантов и их токсичности. Недостаточно представлены сведения о возможных путях разложения фармполлютантов в экосистемах.

В связи с этим важным является изучение нераскрытых вопросов, решение которых позволит не только составить прогнозную модель поведения фармполлютантов в окружающей среде, но и на ее основе разработать возможную технологию для детоксикации окружающей среды и сточных вод муниципальных очистных сооружений от фармполлютантов.

–  –  –

ИЭГМ 30, ИЭГМ 31, ИЭГМ 32, ИЭГМ 33, ИЭГМ 68, ИЭГМ 69, ИЭГМ 544, ИЭГМ 545, ИЭГМ 551, ИЭГМ 589 2.1.2. Химические реактивы Дротаверина гидрохлорид (ДГ) использовали в виде фармацевтической субстанции (светло-желтый с зеленоватым оттенком кристаллический порошок без запаха, чистота – 98,5 %, умеренно растворимый в воде, производства Ирбитского химико-фармацевтического завода, Россия), а также готовых лекарственных форм – таблеток Но-шпа или раствора для инъекций (Хиноин, Венгрия) (таблица 3).

Таблица 3.

–  –  –

ДГ вносили в среду культивирования из стерильного концентрированного раствора (0,1 %) до конечной концентрации 0,002 %. Использованные в экспериментах химические реагенты, в том числе ацетонитрил, хлороформ и этанол имели квалификацию х.ч., ч.д.а. или о.с.ч. (Россия; Merck, Германия;

Sigma-Aldrich, США).

2.2. Микробиологические методы 2.2.1. Определение минимальной подавляющей концентрации Минимальные подавляющие концентрации (МПК) ДГ в отношении исследуемых культур определяли методом микротитрования (Cuenca-Estrella et al., 2002) с использованием полистироловых планшетов стандартной конфигурации 8х12 (96) лунок. Инокулят в среду RS с ДГ добавляли в концентрации 2,3х107 клеток/мл. Бактерии инкубировали 3 сут при 28 оС с последующим окрашиванием клеток 0,2 водным раствором %-ным йоднитротетразолия хлорида (Sigma, США). Оценку жизнеспособности клеток проводили визуально по восстановлению красителя.

2.2.2. Условия культивирования актинобактерий В экспериментах по биодеструкции ДГ применяли минеральную среду RS (г/л): K2HPO4 2,0; KH2PO4 2,0; KNO3 1,0; (NH4)2SO4 2,0; NaCl 1,0;

MgSO4х7Н2О CaCl2х2Н2О FeСl3х7Н2О 0,2; 0,02; 0,001 В качестве источника углерода (www.iegm.ru/iegmcol/medium/med11.html).

и энергии использовали ДГ в концентрации 20 мг/л, а инокулята – отмытые дважды 50 мM фосфатным буфером (pH 7,0) клетки, предварительно выращенные в течение 3-х сут в мясопептонном бульоне (МПБ) (Оболенск, Россия), которые вносили в среду культивирования до конечной концентрации 2,3х107 клеток/мл.

В отдельных экспериментах культуры предварительно выращивали в МПБ в присутствии низких (2 мг/л) концентраций ДГ. Биодеструкцию ДГ исследовали также при дополнительном внесении энергетических косубстратов, в качестве которых использовали D-глюкозу (0,5 %), D-сахарозу (0,25 %), этанол (0,01 %) или глицерин (0,1 %).

В сравнительных экспериментах процесс биодеструкции ДГ вели при разных показателях температуры (18; 28; 35 оС), кислотности (pH 5,0; 6,0; 6,2; 6,4;

6,6; 6,8; 7,0), перемешивания среды культивирования (60, 160, 180 об/мин).

Показатели гидродинамического режима в отдельных экспериментах изменяли каждые 5 сут с чередованием 160 и 60 об/мин, непрерывно перемешивая среду на орбитальной качалке Cetromat IS (Sartorius, Германия).

2.3. Микроскопические методы 2.3.1. Фазово-контрастная микроскопия Микроскопические наблюдения в режиме фазового контраста проводили с использованием микроскопа Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия). Клеточные суспензии прокрашивали красителем LIVE/DEAD BacLight Kit (Molecular Probes Inc) для дифференциации живых и мертвых клеток. Фотодокументирование полученных изображений осуществляли с помощью фотокамеры Pixera (США) и компьютерной программы ВидеоТест, Размер 5,0 (Санкт-Петербург, Россия).

2.3.2. Атомно-силовая и конфокальная микроскопия Морфологию и рельеф клеток исследовали на базе Rhodococcus–центра Пермского государственного национального исследовательского университета с использованием интегрированной системы микрокопирования, состоящей из лазерного конфокального микроскопа Olympus FV1000 (Olympus Corporation, Япония) и атомно-силового микроскопа (АСМ) Asylum MFP-3D (Asylum Research, США). Сканирование препаратов проводили в полуконтактном режиме на воздухе с использованием кремниевого кантилевера AC240TS с резонансной частотой 5090 kГц и константой жесткости 0,54,4 N/m. Для этого предварительно выращенные в МПБ клетки центрифугировали при 3000 об.

в течение 15 мин и дважды отмывали фосфатным буфером (рН 6,8), ресуспендировали в том же буфере (ОП600 0,50,7). Суспензию клеток (20 мкл) наносили на предметное стекло, высушивали на воздухе при комнатной температуре и сканировали. При исследовании жизнеспособности клеток суспензии смешивали с таким же объемом красителя LIVE/DEAD.

Для возбуждения флуоресценции SYTO 9 и пропидиум иодида применяли аргоновый лазер (488 нм) и гелий-неоновый лазер ( 543 нм), соответственно.

Количественный морфометрический анализ полученных АСМ-изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопов FV10-ASW (Olympus Corporation, Япония) и Igor Pro 6.22A (WaveMetrics, США).

Объем и площадь клеток дополнительно рассчитывали согласно формулам, приведенным в работе G. Neumann с соавт. (2005), где объем клеток рассчитывали по формуле V = r2 h (мкм3) (1), площадь поверхности клетки a = 2r2 + rh (мкм2) (2), где r – ширины клетки, h – длина клетки, – 3,14.

2.4. Физико-химические и морфофизиологические методы 2.4.1. Определение гидрофобных свойств Степень гидрофобности бактериальных клеток определяли методом Solt Aggregation Test (Krepsky et al., 2003). Для этого на предметном стекле смешивали 10 мкл клеточной суспензии и 10 мкл раствора сульфата аммония в концентрациях от 0,2 до 2,0 М. Готовили препарат “раздавленная капля”.

Визуализацию контрольных (нативных) и агрегированных под действием 0,2–2,0 М сульфата аммония (в 0,001 М натрий-фосфатном буфере) клеток осуществляли с использованием светового микроскопа. Минимальную концентрацию раствора (NH4)2SO4, при которой наблюдалось образование клеточных агрегатов, принимали за условное значение степени гидрофобности клеточной стенки.

Оценку степени гидрофобности бактериальных клеток проводили по предложенной N. Krepsky с соавт. (2003) шкале: высокая гидрофобность

– показатель солености раствора сульфата аммония от 0 до 0,8 М; умеренная – от 1,0 до 2,0 М; слабая – от 2,2 до 3,8 М.

2.4.2. Определение поверхностного электрокинетического потенциала Измерение электрокинетического (дзета) потенциала бактериальных клеток проводили методом динамического светорассеяния с помощью анализатора ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания) с программным обеспечением Malvern ZetaSizer, v. 2,2. Выращенные в МПБ и минеральной среде в присутствии ДГ клетки отбирали в стационарной фазе роста, дважды отмывали и ресуспендировали в 0,1М KNO3 (pH 7,0) до достижения ОП600 0,2. Измерения проводили в U-образной кювете с позолоченными электродами при температуре 25 оС и pH 7,0.

2.4.3. Определение содержания липидов Сравнительное определение суммарных клеточных липидов в бактериальных клетках, выращенных в МПБ в течение 3 сут и клетках, выращенных в минеральной среде в присутствии ДГ в течение 5, 10 и 15 сут, проводили согласно методу, описанному в Большом практикуме по микробиологии (Ившина, 2014). Для этого 50 мг сухой клеточной биомассы выдерживали в течение 24 ч в 5 мл смеси следующего состава: дистиллированная вода (1мл) и хлороформ с метанолом (4 мл) в объемном соотношении 1:2.

По истечении 24 ч смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут.

Супернатант сливали в центрифужную пробирку. Полученный осадок экстрагировали повторно с использованием 5 мл смеси хлороформ-метанол-вода (1:2:0,8). Надосадочную жидкость объединяли с ранее полученным экстрактом, к которому добавляли 5 мл смеси хлороформ-вода (1:1) и центрифугировали.

В сухие, предварительно взвешенные круглодонные колбы, в равных количествах переносили хлороформенный слой и разбавляли эквивалентным количеством бензола. Полученную смесь упаривали на роторном испарителе (Heidolph, Германия) при 60 °С до постоянного веса. Количество общих липидов определяли гравиметрически, выражая количество в мг/г абсолютно сухого веса (АСВ).

2.4.4. Определение дыхательной активности Дыхательную деятельность клеток оценивали по скорости выделения и количеству СО2 с помощью 6-канального респирометра Micro-Oxymax® (Columbus Instruments, США). Эксперименты проводили в защищенных от света стеклянных флаконах Micro-Oxymax вместимостью 300 мл, с объемом минеральной среды RS 100 мл, содержащей 0,002 % ДГ, при постоянном перемешивании (400 об/мин) на многоместной магнитной мешалке RT 10 (Power IKAMAG, Германия). Измерение клеточного дыхания проводили при 25±2 оС каждые 42 мин в течение 48–153 ч. Оценивали скорость дыхания (мкл/мин), а также количество (мкл) выделяемого CO2.

2.5. Получение цистоподобных покоящихся клеток Получение длительно (7 мес) хранящихся цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) осуществляли согласно способу, описанному в работе А.Л. Мулюкина (2010). Родококки культивировали в минеральной среде SR1 с пятикратно сниженным источником азота, содержащей (г/л): глюкозу – 20,0;

КNО3 – 0,2 (в полноценной среде – 1,0); K2НРО4 – 0,5; MgSO4x7Н2О – 0,5;

NaCl – 0,5; CaCO3 3,0 или CaCl2 – 0,2; рН 7,2 – 7,4. Инокулят – 3- х сут культуру, выращенную в LB-бульоне при 28 °С, вносили в объеме 500 мкл на 50 мл среды.

Родококки выращивали в течение 7 сут, а затем выдерживали в течение 7 мес при комнатной температуре в статических условиях (без принудительной аэрации).

Под термином ЦПК неспорообразующих актинобактерий понимаем клетки, образующиеся в онтогенезе неспорулирующих микробных культур, не обладающие метаболической активностью и характеризующиеся повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам внешней среды.

Термоустойчивость ЦПК определяли как численность клеток, оставшихся жизнеспособными после прогревания клеточных суспензий (0,3 мл) при температурах от 55 до 90 оС в течение 10 мин.

2.6. Получение иммобилизованных клеток Иммобилизацию предварительно выращенных в присутствии низких концентраций ДГ родококков осуществляли по ранее разработанным способам с использованием различных носителей – адсорбента на основе древесных пород (опилки, 1–3 мм) из отходов деревообрабатывающего производства (Podorozhko et al., 2008) и гетерофазного криогеля на основе поливинилового спирта (ПВС) производства ПО “Азот”, Невинномысск, Россия (Kuyukina et al., 2006).

2.6.1. Иммобилизация клеток на адсорбенте на основе древесных пород Носитель на основе древесных пород гидрофобизовали (для повышения сродства поверхности адсорбента к бактериальным клеткам) с помощью олифы на основе льняного масла (Московский лакокрасочный завод “Оливеста”, Россия).

Схема иммобилизации бактериальных клеток на древесном носителе приведена на рисунке 11. Иммобилизацию отмытых клеток проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, в которые вносили 50 мл клеточной суспензии с оптической плотностью (ОП600) 1,0 в буферном растворе и 2 г гидрофобизованного носителя.

–  –  –

Смесь непрерывно перемешивали на орбитальном шейкере (130 об/мин, 28 оС) в течение 5 сут. Процесс адсорбции родококков контролировали нефелометрически (при ОП600) с помощью спектрофотометра Lambda EZ201

–  –  –

в гетерофазном криогеле (рисунок 12) бактериальную суспензию и раствор ПВС смешивали в соотношении 1:2 v/v, конечная концентрация клеток в растворе составляла при ОП600 0,2. Этапы замораживания и оттаивания осуществляли согласно указанной выше методике. Перед использованием полученный биокатализатор регидратировали в 0,5 растворе %-ном NaCl в течение 24 ч и добавляли в среду культивирования из расчета 100 гранул (2,3х107 клеток/мл) на 100 мл среды. Хранение полученных иммобилизованных клеток осуществляли при +5 оС.

–  –  –

Рисунок 12. Схема иммобилизации клеток родококков в криогеле поливинилового спирта (цит. по Елькин, 2011).

Периодическое культивирование свободных и иммобилизованных клеток проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с объемом среды RS 100 мл, содержащей 0,002 % ДГ, при постоянном перемешивании (160 об/мин) и 28 °С. Во избежание фотодеградации и фотоинициированного окисления ДГ содержимое колб защищали от действия света с помощью светонепроницаемого материала. В сравнительных экспериментах по биодеструкции ДГ использовали одинаковое количество планктонных и иммобилизованных бактериальных клеток. В качестве контролей использовали (1) стерильный раствор ДГ в минеральной среде RS (для оценки абиотической деструкции экотоксиканта);

(2) стерильный раствор ДГ в минеральной среде RS с инактивированными бактериальными клетками (для оценки степени адсорбции экотоксиканта на бактериальных клетках), при этом бактериальные клетки инактивировали автоклавированием при 1,0 атм. трехкратно в течение 20 мин;

(3) минеральную среду RS, содержащую глюкозу с бактериальными клетками, без ДГ (контроль для разграничения метаболитов, появляющихся в результате разложения экотоксиканта). В виду большой продолжительности лабораторных экспериментов во времени полученные значения корректировали с учетом поправки на испарение воды с помощью уравнений, приведенных в работе Н. Gauthier c соавт. (2010). Численность жизнеспособных бактериальных клеток в инкубационной среде определяли методом точечных высевов на МПА (Веслополова, 1995).

2.7. Аналитические методы 2.7.1. Количественный анализ дротаверина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Содержание ДГ в среде культивирования актинобактерий определяли методом жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием хроматографа LC Prominence 20А (Shimadzu, Япония), оборудованного хроматографической колонкой с обращенно-фазным сорбентом Discovery® HS С18 (250х4,6 мм, 5 мкм) и диодно-матричным детектором (SPD-M20A). Подобранные нами оптимальные условия хроматографического определения ДГ: подвижная фаза 0,1 %-ный раствор трифторуксусной кислоты–ацетонитрил, линейное возрастание доли ацетонитрила в элюенте с 30 до 80 об. % за 20 мин, расход подвижной фазы 1,2 мл/мин, температура колонки 40 С, объем вводимой пробы – 20 мкл; длина волны детектирования ДГ 246 нм. В описанных условиях время удерживания ДГ составляло 9,53±0,02 мин. Регистрацию и обработку хроматографической информации осуществляли с помощью программы LCSolution (v/1,25 rus).

Пробоподготовка культуральной жидкости для проведения хроматографического анализа. Аликвотную часть среды культивирования актинобактерий в количестве 2 мл, содержащую ДГ, продукты его биодеструкции, бактериальные клетки и продукты их жизнедеятельности, помещали в пробирку Эппендорфа и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Освобожденную от клеток и взвешенных частиц надосадочную жидкость фильтровали через мембранный шприцевой нейлоновый фильтр (Agilent Technologies, США) с диаметром пор 0,2 мкм.

2.7.2. Качественный анализ продуктов биодеструкции дротаверина методом газовой хроматографии Состав продуктов разложения ДГ анализировали методом газовой хроматографии в сочетании с хромато-масс-спектрометрией с использованием хромато-масс-спектрометрической системы Agilent 6890N/5973N (Agilent Technology, США), оборудованной капиллярной колонкой НР-5MS длиной 30 м, с внутренним диаметром 0,25 мм и работавшей в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ. В качестве газа-носителя использовали гелий, температура инжектора и интерфейса составляла 250 и 280 оС соответственно. Температура о колонки программировалась от 70 до 300 С с повышением температуры со скоростью 10 оС/мин. Ввод хлороформного экстракта культуральной жидкости (1 мкл) осуществляли без деления потока газа-носителя. Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 40 до 500 m/z. Полученные масс-спектры сравнивали с масс-спектрами библиотеки NIST 98 Mass Spectral Library with Windows Search Program (Версия 1,7) for Use with Microsoft ® Windows TM Users Guide.

Пробоподготовка для ГХ-МС-анализа. Подготовку проб осуществляли посредством экстрагирования 30 мл культуральной жидкости трехкратно равными (по 10 мл) объемами хлороформа. Объединенные экстракты сушили над Na2SO4, растворитель удаляли на роторном испарителе (Heidolph, Германия).

2.8. Определение токсичности продуктов биодеструкции дротаверина Острую токсичность определяли экспресс-методом В.Б. Прозоровского (1978) при однократном внутрибрюшинном введении белым беспородным мышам ДГ и смеси продуктов его биодеструкции на базе Пермской государственной фармацевтической академии.

Фитотоксичность в отношении овса обыкновенного Avensa sativa L.

проводили в соответствии с Методическими рекомендациями по обоснованию класса опасности отходов производства и потребления по фитотоксичности (2007). Согласно данному документу, токсичной концентрацией считали таковую исследуемого соединения, вызывающую угнетение морфометрических показателей (длина корней) растений 20 %. Схема определения фитотоксичности в отношении ДГ и продуктов его биодеструкции представлена на рисунке 13.

В экспериментах использовали семена, всхожесть которых составляла 98 %.

В отдельных экспериментах оценивали всхожесть семян овса, обрабатываемых раствором ДГ и смесью продуктов его биологической деструкции. Процент всхожести определяли по истечении 3 сут в результате проращивания семян в чашках Петри с фильтровальной бумагой, куда вносили дистилированную воду в объеме 5 мл. При определении фитотоксичности проросшие семена обрабатывали водным раствором исследуемого соединения. Степень фитотоксичности оценивали по истечении 7 сут. В качестве контролей в данном эксперименте использовали проросшие семена овса, обрабатываемые водой (абиотический контроль) и семена, обрабатываемые клеточной суспензией 2,3х107 родококков в концентрации клеток/мл для исключения их стимулирующего воздействия на рост растений (биотический контроль).

Рисунок 13. Схема определения фитотоксичности ДГ и продуктов его биодеструкции.

2.9. Математическое моделирование процесса биодеструкции В анализе экспериментальных данных использовали метод наименьших квадратов (Линник и др., 1962; Gill et al., 1981) и данные о динамике процесса биодеструкции ДГ клетками ИЭГМ 647. Кинетическое R. rhodochrous моделирование проводили на базе кафедры теоретической механики Пермского национального исследовательского политехнического университета (зав. кафедрой – д.т.н., профессор Няшин Ю.И.).

2.10. Статистическая обработка результатов Эксперименты проводили в 3-х и 8-ми кратной повторности. Обработку полученных данных осуществляли с помощью компьютерной программы Excel 2003 (Microsoft Inc., 2003), рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Биодеструкция дротаверина: поиск активных штаммовбиодеструкторов, подбор оптимальных условий процесса биодеструкции

–  –  –

ДГ 50–300 50–80 50–100 Представители экологически значимых видов родококков R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber характеризовались более выраженной (МПК200 мг/л) устойчивостью по отношению к ДГ (таблица 5). Наиболее устойчивыми к ДГ оказались штаммы R. erythropolis ИЭГМ 213, ИЭГМ 767 (МПК 200 мг/л), R. ruber ИЭГМ 326, ИЭГМ 343, ИЭГМ 345, ИЭГМ 348 (МПК 200 мг/л), R. rhodochrous ИЭГМ 608, ИЭГМ 647 (МПК 300 мг/л), ранее изолированные из сточных вод городских очистных сооружений и нефтезагрязненных почв и воды. Для дальнейших экспериментов были отобраны штаммы R. erythropolis ИЭГМ 767, R. rhodochrous ИЭГМ 608, ИЭГМ 647 и R. ruber ИЭГМ 326.

–  –  –

Таким образом, наиболее интенсивная убыль ДГ была отмечена в минеральной среде RS содержащей азот, что определило ее выбор для продолжения изучения процесса биодеструкции ДГ.

По нашим данным, процесс разложения ДГ в виде фармацевтической субстанции с использованием нативных бактериальных клеток протекал крайне медленно (более 90 сут), что свидетельствовало о высокой химической устойчивости молекулы исходного ксенобиотика (рисунок 14, линия 3).

Изменение плотности клеток оставалось низким для наблюдения, следовательно, в процессе разложения ДГ существенного роста родококков не наблюдалось.

В контроле абиотической деструкции исходная концентрация ДГ изменялась в пределах от 2 до 10 %. В контрольном варианте опыта с инактивированными клетками обнаруживалось незначительное (до 10–15 %) понижение исходной концентрации ДГ, что свидетельствовало о возможной биосорбции экотоксиканта.

–  –  –

Для повышения ДГ-деструктирующей способности родококков были использованы различные приемы: прединкубация клеток в присутствии низких концентраций метаболизируемого субстрата (Soudi, Kolahchi, 2011); введение в инкубационную среду энергетических косубстратов (Gauthier et al., 2010);

варьирование условий культивирования родококков (Debasmita, Rajasimman, 2013); иммобилизация бактериальных клеток на различных носителях (Cassidy et al., 1996); использование ЦПК в качестве инокулята (Solyanikova et al., 2011).

Применение родококков, предварительно выращенных в присутствии низких концентраций ДГ, позволяло сократить продолжительность процесса разложения экотоксиканта до 60 сут (рисунок 15). В данных условиях наблюдался незначительный прирост биомассы (от 2,3х107 до 6,8х107 клеток/мл) в течение первых 5 сут, после чего происходило резкое снижение (до 3,1х10 6 клеток/мл) численности родококков.

–  –  –

Рисунок 15. Биодеструкция ДГ в качестве единственного источника углерода прединкубированными клетками R. rhodochrous ИЭГМ 608 (3).

1 – абиотический контроль; 2 – контроль биосорбции.

Культивирование предварительно выращенных в присутствии низких концентраций ДГ родококков в минеральной среде с добавлением глюкозы позволяло сократить продолжительность процесса биодеструкции ДГ до 42 сут (рисунок 16). Количество биомассы достигало максимальных (9,1х108 клеток/мл) значений на 5 сут эксперимента. В присутствии других косубстратов роста (сахарозы, этанола, глицерина) биоконверсия ДГ была выражена в значительно меньшей степени.

–  –  –

Рисунок 16. Биодеструкция ДГ при внесении дополнительных источников углерода и энергии прединкубированными клетками R. rhodochrous ИЭГМ 608. 1 – абиотический контроль; 2 – контроль биосорбции; 3 – сахароза; 4 – этанол; 5 – глицерин; 6 – глюкоза.

Сравнительный анализ дыхательной активности родококков показал, что в присутствии глюкозы регистрируется наиболее высокая их метаболическая активность по отношению к ДГ (рисунок 17 А, линия 4). Расчетные средние показатели (12,91 мкл/мин) скорости выделения CO2 родококками в присутствии глюкозы на 6 сут эксперимента были в 1,28 раза выше таковых (10,10 мкл/мин) в присутствии ДГ в качестве единственного источника углерода.

Общее количество выделенного углекислого газа при этом составило 93617 мкл в процессе биодеструкции ДГ в качестве единственного источника углерода и 1198878 мкл в присутствии глюкозы (рисунок 17 Б). В контролях биотической деструкции расчетные показатели средней скорости выделения CO2 были значительно ниже таковых в опытных вариантах. Так, в минеральной среде RS максимальные значения скорости выделения CO2 родококками не превышали 1,2 мкл/мин, а в присутствии глюкозы – 2,9 мкл/мин, в то время как в опытных вариантах максимальные значения скорости выделения CO2 родококками

–  –  –

Рисунок 17. Скорость выделения CO2 (А) и его общее количество (Б) в процессе биодеструкции ДГ в качестве единственного источника углерода (3) и при внесении глюкозы (4) клетками R. rhodochrous ИЭГМ 608.

1 – абиотический контроль без внесения глюкозы, 2 – абиотический контроль с глюкозой.

При исследовании влияния температуры на ДГ-деструктирующую активность родококков выявлено, что наиболее высокие показатели убыли ДГ регистрировались при 28 °С (рисунок 18). Проведение биодеструкции ДГ при 18 °C приводило к незначительному снижению интенсивности разложения ДГ, тогда как увеличение показателей температуры до 35 °C приводило к практически полному ингибированию процесса.

–  –  –

Как видно из рисунка 19, оптимальный уровень кислотности для биодеструкции ДГ – pH среды 6,8. При этом остаточный уровень содержания ДГ на 15 сут эксперимента составлял 38,1 %. В кислых (рН 5,0; 6,0) условиях биодеструкция ДГ клетками R. rhodochrous ИЭГМ 647 не обнаруживалась.

Использование минеральной среды со значениями рН 7,0 и выше приводило к выпадению ДГ в хлопьеобразный осадок, ДГ становился труднодоступным для биоразложения.

–  –  –

Рисунок 20. Биодеструкция ДГ с использованием клеток R. rhodochrous ИЭГМ 647 (3) при разных показателях скорости перемешивания среды. 1 – абиотический контроль, 2 – контроль биосорбции. В эксперименте использовали прединкубированные клетки, выращенные в присутствии глюкозы.

Более высокий (180 об/мин) уровень гидродинамического режима, как и низкий (60 об/мин), не обеспечивали эффективную убыль ДГ. Чередование высоких (160 об/мин) и низких (60 об/мин) показателей скорости перемешивания среды культивирования родококков позволяло сократить продолжительность процесса биодеструкции ДГ до 15 сут (рисунок 20).

Как видно из рисунка 21, в экспериментах с использованием ДГ в виде готовых лекарственных форм (таблетках или растворах для инъекций) установлено, что присутствующие в них вспомогательные вещества не влияли на скорость процесса биодеструкции экотоксиканта.

–  –  –

Рисунок 21. Биодеструкция дротаверина гидрохлорида в виде различных лекарственных форм с использованием клеток R. rhodochrous ИЭГМ 647. 1 – таблетки; 2 – раствор для инъекций; 3 – фармацевтическая субстанция.

–  –  –

Глава 4. Определение дротаверина в культуральной жидкости родококков и кинетическое моделирование процесса его биодеструкции Выбор оптимальных условий определения ДГ в культуральной жидкости.

Поскольку публикации, посвященные определению ДГ в культуральной жидкости бактерий, отсутствуют, проведение экспериментов потребовало уточнения методических аспектов тестирования культуральной жидкости штаммов-биодеструкторов на присутствие данного фармполлютанта. В связи с этим была разработана методика определения ДГ в среде культивирования актинобактерий методом обращенно-фазной ВЭЖХ.

При выборе оптимальных условий определения ДГ в культуральной жидкости родококков методом обращенно-фазной ВЭЖХ учитывали влияние различных хроматографических параметров, наиболее значимыми из которых являлись природа неподвижной фазы, рН подвижной фазы, содержание ацетонитрила в элюенте и режим элюирования.

В качестве неподвижной фазы использовали обращенно-фазный сорбент из группы алкилсиликагелей, что позволяло достичь быстрого установления равновесия при изменении состава растворителей в режиме градиентного элюирования. В качестве подвижных фаз применяли водно-ацетонитрильные смеси, которые позволяли работать в широком УФ диапазоне спектрофотометрического детектора. В качестве элюентов были апробированы кислые и нейтральные подвижные фазы. Использование в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрил – фосфатный буферный раствор с рН 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 и 7,0 приводило к размыванию хроматографических пиков ДГ. При снижении рН элюента коэффициент асимметрии пика ДГ улучшается и достигает приемлемых значений при рН подвижной фазы 3,0, которая и выбрана в качестве оптимальной.

Поскольку исследованные объекты (образцы культуральной жидкости, содержащие ДГ, возможные продукты его биодеструкции, а также продукты жизнедеятельности бактериальных клеток и составляющие минеральной среды) являются сложными многокомпонентными системами, разделение их в изократическом режиме затруднено. Это объясняется большим различием хроматографических характеристик компонентов анализируемой смеси. Для решения данной задачи использовали градиентное элюирование. Оптимальны следующие условия хроматографического определения ДГ: подвижная фаза 0,1 %-ный раствор трифторуксусной кислоты – ацетонитрил, линейное возрастание доли ацетонитрила в элюенте с 30 до 80 об. % за 20 мин, расход подвижной фазы 1,2 мл/мин, температура колонки 40 °С, длина волны детектирования целевого соединения 246 нм (рисунок 22 А).

Рисунок 22. УФ – спектр ДГ (А) и хроматограммы культуральной жидкости R. rhodochrous ИЭГМ 647 после 6 сут эксперимента (Г).

Б – контроль среды (минеральная среда RS без ДГ), В – абиотический контроль (ДГ в минеральной среде RS).

В описанных условиях время удерживания ДГ составляло 9,53±0,02 мин.

Пики веществ, присутствующих в минеральной среде (рисунок 22 Б) и в среде с ДГ (рисунок 22 В, Г), а также пики веществ, образующихся в среде в процессе биодеструкции ДГ (рисунок 22 Г), не перекрываются, что свидетельствует о специфичности условий анализа.

Зависимость площади пика ДГ от концентрации раствора в диапазоне 0,0002 – 0,002 мас. % линейна и описывается уравнением S = 0,105х106хС, где S – площадь пика (усл. ед), С концентрация раствора ДГ (мкг/мл), с коэффициентом корреляции 0,999. Внутрилабораторная сходимость результатов количественного определения ДГ в среде культивирования родококков оценена при использовании трех уровней концентраций целевого вещества – 0,0005, 0,001, 0,002 масс. % (таблица 7). Относительное стандартное отклонение отдельного результата Sr не превышало 0,15, что согласно Руководству для промышленности (Guidance for Industry, 2001) допустимо для биоаналитических методик.

Таблица 7.

Внутрилабораторная сходимость результатов определения ДГ в культуральной жидкости R. rhodochrous ИЭГМ 647 (n = 6, p= 0,95)

–  –  –

0,001 0,00095 0,0000172 0,018 0,00002 0,002 0,00193 0,000027 0,014 0,00003 Точность методики оценивали по величине открываемости (R) определяемого вещества с использованием метода введенного в плацебо аналита. При анализе модельных смесей Sr не превышало 0,056, что свидетельствовало об открываемости ДГ, приемлемой для биоаналитических методик. Разработанную методику использовали для оценки содержания ДГ в культуральной жидкости родококков в процессе его биодеструкции.

Кинетическое моделирование процесса биодеструкции ДГ. С целью определения скорости процесса биодеструкции ДГ, анализа воспроизводимости и прогнозирования результатов применяли параллельное эксперименту кинетическое моделирование.

–  –  –

где k(t)=(/2)t+b – линейная функция времени процесса, х концентрация ДГ в момент времени t. Параметр b имеет размерность [1/время] и отвечает за скорость процесса биодеструкции, параметр имеет размерность [1/время2] отражает величину ускорения или замедления процесса биодеструкции во времени. Интегрируя выражение (3), получали выражение для изменения концентрации ДГ в процессе биологической деструкции

–  –  –

По первым трем результатам измерения концентрации ДГ производили расчет параметров “константы” скорости реакции и строили предварительную зависимость концентрации ДГ от времени – 1-ое приближение. Для последующих приближений процедуру расчетов повторяли с появлением каждой новой экспериментальной точки.

В качестве критерия времени окончания эксперимента выбрали достижение заданного предела различия по норме кинетических кривых на последнем (k+1) и предыдущем (k) этапе фиксирования полученных экспериментальных данных

–  –  –

где заданное положительное число.

При параллельном кинетическом моделировании параметр “константы” скорости реакции b принимал значения 0,5830; 0,4144 и 0,3773 сут-1, параметр а – значения -0,1312; -0,0308 и -0,0186 сут-2.

–  –  –

Рисунок 24. Сходимость рассчитанных кинетических кривых процесса биодеструкции ДГ клетками R. rhodochrous ИЭГМ 647 при кинетическом моделировании по трем (1), четырем (2) и пяти (3) экспериментальным точкам.

–  –  –

использования в лабораторных условиях при поиске штаммов-активных биодеструкторов ДГ. Установлено, что кинетическое моделирование, параллельное во времени проводимым экспериментам, позволяет оптимизировать планирование исследований по биодеструкции ДГ, сократить продолжительность эксперимента за счет теоретического прогноза, оценить воспроизводимость и определить время окончания процесса биодеструкции. Выявленные закономерности учитывались при постановке экспериментов по биодеструкции ДГ в различных условиях.

Глава 5. Физико-химические и морфофизиологические особенности родококков в присутствии дротаверина Воздействие ДГ на родококки сопровождалось изменением свойств их клеточной поверхности.

По сравнению с нативными клетками это выражалось в увеличении показателей электрокинетического заряда от -25,00±3,29 до -20,87±0,98 мВ (рисунок 25) и суммарных клеточных липидов от 17,1±1,80 до 72,6±8,02 мг/г АСВ (рисунок 26).

0 -5 -10 -15 -20 -25 -30

–  –  –

Рисунок 25. Электрокинетический заряд клеток R. rhodochrous ИЭГМ 647, выращенных в МПБ (1) и среде RS в присутствии ДГ (2).

Суммарные клеточные липиды, мг/г АСВ Рисунок 26. Содержание суммарных клеточных липидов клеток R. rhodochrous ИЭГМ 647, выращенных в МПБ (1) и среде RS в присутствии ДГ (2).

Согласно литературным данным, полученные нами результаты свидетельствовали о повышении степени гидрофобности родококков в присутствии экотоксиканта (Рубцова и др., 2012; Серебренникова и др., 2014). Увеличение степени гидрофобности родококков было также подтверждено методом агрегации клеток под действием раствора сульфата аммония (рисунок 27).

Б А

Рисунок 27. Микрофотографии клеточных агрегатов R. rhodochrous ИЭГМ 647, формируемых в растворах (NH4)2SO4).

1 – клетки, выращенные в МПБ; 2, 3 – клетки в процессе биодеструкции ДГ через 5 и 15 сут. А – контроль; Б – в присутствии (NH4)2SO4). Ув.1000.

Приведены данные при воздействии (NH4)2SO4) в концентрации 0,2 М.

Отмечено, что нативные клетки родококков в большинстве своем представлены S-формой, однако в присутствии ДГ происходил быстрый переход их в R-форму уже на начальном этапе инкубации (рисунок 28). Согласно литературным данным, процесс диссоциации является одной из форм адаптации бактериальных клеток к неблагоприятным факторам окружающей среды (Милько, Егоров, 1991).

А Б

–  –  –

Как видно из таблицы 9, присутствие ДГ в среде культивирования индуцировало изменение размеров клеток, в частности, уменьшение их длины и ширины, при этом отмечалось увеличение соотношения площади поверхности клетки к ее объему, что согласно G. Neumann c соавт. (2005), способствует более эффективному контакту клетки с субстратом.

Установлено, что ответной реакцией родококков на присутствие ДГ в среде культивирования в соокислительных условиях является формирование компактных клеточных агрегатов, насчитывающих до десяти и более жизнеспособных клеток (рисунок 29).

А Б Рисунок 29. АСМизображения клеток R. rhodochrous ИЭГМ 647, выращенных в течение 10 сут в среде RS в присутствии ДГ и при внесении глюкозы. А – амплитудное изображение; Б – трехмерная проекция.

Вероятно, нахождение клеток в составе агломератов позволяет популяции адаптироваться к условиям, при которых одиночные клетки не способны к биодеструкции ДГ. Характерной особенностью штамма R. rhodochrous ИЭГМ 647 в присутствии ДГ является также выраженное увеличение показателя среднеквадратичной шероховатости (от 141,93±5,20 до 160,28±7,60 нм) клеточной поверхности. В данных условиях нередко отмечается отслоение клеточной стенки (рисунок 30 А) и излитие внутриклеточного содержимого во внешнюю среду (рисунок 30 Б). Полученный результат, вероятно, косвенно подтверждает токсичное влиянии ДГ в отношении родококков.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Похожие работы:

«РОМАНЕНКО НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ АНЕМИЯ У БОЛЬНЫХ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ: ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕНЕЗА, МЕТОДЫ КОРРЕКЦИИ, КАЧЕСТВО ЖИЗНИ 14.01.21. – гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант – доктор медицинских наук, профессор...»

«УДК 5 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 «антропология» по биологическим наукам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор исторических наук, чл.-корр. РАН А.П. БУЖИЛОВА...»

«Труш Роман Викторович ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКАЙ-ФОРСА И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель Горшков Григорий Иванович заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Белгород – п. Майский 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ...»

«Серёгин Сергей Викторович Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович...»

«Максимова Ольга Владимировна «Оценка микробиоты кишечника у детей с аллергическими заболеваниями в зависимости от массы тела» 03.02.03. – Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Зверев Виталий Васильевич академик РАН, д.б.н., профессор Научный консультант: Гервазиева Валентина Борисовна д.м.н, профессор, заслуженный деятель науки РФ МОСКВА – 2015 Оглавление Список сокращений Введение Глава 1 Обзор литературы 1.1...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«Берко Татьяна Владимировна ПРОДУКТИВНОСТЬ И ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЕ КАЧЕСТВА ПТИЦЫ РОДИТЕЛЬСКОГО СТАДА КРОССА «ХАЙСЕКС КОРИЧНЕВЫЙ» ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В КОРМЛЕНИИ ТЫКВЕННОГО ЖМЫХА, ОБОГАЩЕННОГО БИОДОСТУПНОЙ ФОРМОЙ ЙОДА 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный...»

«Ксыкин Иван Валерьевич ВРЕДОНОСНОСТЬ СОРНЯКОВ И МЕРЫ БОРЬБЫ С НИМИ В ПОСЕВАХ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР НА СВЕТЛО-КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ВОЛГО-ДОНСКОГО МЕЖДУРЕЧЬЯ Специальность: 06.01.01 общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор...»

«МАКСИМОВА Юлия Геннадьевна ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: чл.-корр. РАН, профессор, доктор медицинских наук...»

«БАРИНОВА Ирина Владимировна Патогенез и танатогенез плодовых потерь при антенатальной гипоксии 14.03.02 – Патологическая анатомия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени доктора медицинских наук Научные консультанты: Заслуженный деятель науки РФ Доктор биологических наук, доктор медицинских наук, профессор профессор САВЕЛЬЕВ...»

«ВУДС ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА Фармакогенетические аспекты антиангиогенной терапии экссудативной формы возрастной макулярной дегенерации» 14.01.07 – Глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Будзинская Мария Викторовна кандидат биологических наук Погода Татьяна Викторовна Москва – 2015...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Кузнецов Василий Андреевич ПОЧВЫ И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПАРКОВО-РЕКРЕАЦИОННЫХ ЛАНДШАФТОВ МОСКВЫ Специальность 03.02.13-почвоведение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, И.М. Рыжова Москва-2015 Содержание Введение Глава 1. Влияние рекреации на лесные экосистемы (Литературный обзор) 1.1.Состояние проблемы 1.2....»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«Шемякина Анна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BETULA L. 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесникова Р.Д. Хабаровск – 20 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1.1 Общие...»

«САФИНА ЛЕЙСЭН ФАРИТОВНА Анафилактический шок на ужаления перепончатокрылыми насекомыми (частота встречаемости, иммунодиагностика, прогнозирование) 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.