WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«БИОДЕСТРУКЦИЯ ДРОТАВЕРИНА ГИДРОХЛОРИДА АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА RHODOCOCCUS ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО

ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Мухутдинова Анна Наилевна

БИОДЕСТРУКЦИЯ ДРОТАВЕРИНА ГИДРОХЛОРИДА

АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА RHODOCOCCUS

03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна, доктор фармацевтических наук Вихарева Елена Владимировна Пермь – 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………….... 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………...... 12 Глава 1. Фармацевтические вещества – новый класс экополлютантов…… 12

1.1. Распространенность и частота встречаемости фармацевтических азотсодержащих гетероциклических соединений в экосистемах……………..... 15

1.2. Дротаверина гидрохлорид – фармацевтический экополлютант…………… 30

1.3. Актинобактерии рода Rhodococcus как потенциальные биодеструкторы фармполлютантов………………………………………………………………….. 34 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ……………………………………………….. 43 Глава 2. Материалы и методы исследования………………………………….. 43

2.1. Объекты исследования………………………………………………………... 43 2.1.1. Рабочая коллекция бактериальных культур……………………………….. 43 2.1.2. Химические реактивы……………………………………………………...... 44

2.2. Микробиологические методы……………………………………………….... 45 2.2.1. Определение минимальной подавляющей концентрации………………... 45 2.2.2. Условия культивирования актинобактерий……………………………….. 45

2.3. Микроскопические методы…………………………………………………… 46 2.3.1. Фазово-контрастная микроскопия………………………………………….. 46 2.3.2. Атомно-силовая и конфокальная микроскопия………………………….... 46

2.4. Физико-химические и морфофизиологические методы …………………… 47 2.4.1. Определение гидрофобных свойств………………………………………... 47 2.4.2. Определение поверхностного электрокинетического потенциала………. 47 2.4.3. Определение содержания липидов…………………………………………. 48 2.4.4. Определение дыхательной активности…………………………………… 48

2.5. Получение цистоподобных покоящихся клеток…………………………… 49

2.6. Получение иммобилизованных клеток……………………………………… 49 2.6.1. Иммобилизация клеток на адсорбенте на основе древесных пород……... 50 2.6.2. Иммобилизация клеток в криогеле на основе поливинилового спирта…………………………………………………………

2.7. Аналитические методы………………………………………………………... 52 2.7.1. Количественный анализ дротаверина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии……………………………………………………….. 52 2.7.2. Качественный анализ продуктов биодеструкции дротаверина методом газовой хроматографии…………………………………………………………..... 53

2.8. Определение токсичности продуктов биодеструкции дротаверина……….. 54

2.9. Математическое моделирование процесса биодеструкции дротаверина….. 55

2.10. Статистическая обработка результатов…………………………………….. 55 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ…………………….. 56 Глава 3. Биодеструкция дротаверина: поиск активных штаммовбиодеструкторов, подбор оптимальных условий процесса биодеструкции……………………

Глава 4. Определение дротаверина в культуральной жидкости родококков и кинетическое моделирование процесса его биодеструкции 65 Глава 5.

Физико-химические и морфофизиологические особенности родококков в присутствии дротаверина……………………………................. 72 Глава 6. Биодеструкция дротаверина иммобилизованными и покоящимися клетками…………………………………

Глава 7. Возможные пути биодеструкции дротаверина.

Токсичность продуктов его биодеструкции…………………………………………………… 89 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………….. 97 ВЫВОДЫ………………………………………………………………………....

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………...

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………….....

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время остро стоит проблема загрязнения окружающей среды фармполлютантами – высокостабильными соединениями с разнообразной химической структурой и выраженной биологической активностью.

Они обнаруживаются в почве, донных осадках водоемов, сточных, грунтовых водах и даже питьевой воде (Баренбойм, Чиганова, 2012; Гетьман, Наркевич, 2013; Celiz et al., 2009; Nikolaou, 2013). Известно, что аккумуляция фармполлютантов в природных экосистемах и их долговременное воздействие на живые организмы может сопровождаться развитием раковых клеток и нарушением функций работы почек у млекопитающих, снижением репродуктивной активности у рыб, а также другими патологическими изменениями (Bessems, Vermeulen, 2001; Lalumera et al., 2004; Triebskom et al., Загрязнение объектов природной окружающей среды отходами 2004).

фармацевтической промышленности обусловлено тотальным применением лекарственных средств населением и в различных отраслях хозяйственной деятельности человека, неэффективностью способов их утилизации (сжигание, слив в промышленную канализацию, размещение на санитарных полигонах), а также несовершенством методов очистки сточных вод от фармполлютантов (озонирование, хлорирование, сорбирование углем и др.) (Цхе и др., 2013; Bedner, Maccrehan, 2006; Zweiner, 2007).

Понимание процессов, происходящих с фармполлютантами в окружающей среде, требуют поиска эффективных способов нейтрализации данных опасных соединений, выяснения взаимосвязи между систематической принадлежностью микроорганизмов и их способностью деградировать лекарственные средства, изучения степени биодоступности и токсического действия новых соединений на микроорганизмы-деструкторы, особенностей начальных этапов их разложения и кометаболизма.

Вопросы взаимодействия “фармполлютант – микроорганизм” привлекают все большее внимание исследователей (Quintana et al., 2005; de Gusseme et al., 2011; Santos et al., 2012). Среди экологически значимых групп микроорганизмов, способных чутко реагировать на изменения в среде обитания и инициировать соответствующие адаптивные реакции, особое место занимают актинобактерии рода Rhodococcus. Алкано- и олиготрофный образ жизни родококков, широкая норма реакции в сочетании с толерантностью к повреждающим клетку воздействиям, высокая сопротивляемость конкурентам, склонность к клеточной агрегации, способность к росту на минимальных средах с усвоением различных ксенобиотиков, высокая катаболическая активность в экстремальных условиях внешней среды свидетельствуют об исключительной пластичности их генома (Ившина, 1997; 2012; Larkin et al., 2006; de Carvalho et al., 2014). Эти свойства родококков делают их наименее зависимыми от внешней среды и обеспечивают широкое распространение в природе, сохранение относительно стабильной численности особей в занимаемой экологической нише и приуроченность к специфическим местообитаниям. Однако примеры биодеструкции фармполлютантов с использованием актинобактерий рода Rhodococcus пока не многочисленны (Yoshimoto et al., 2004; Ившина и др., 2006; Kim et al., 2007;

Gauthier et al., 2010).

Среди фармполлютантов, детектируемых в окружающей среде, большое число представлено азотсодержащими гетероциклическими соединениями, в том числе изохинолинового ряда (Duca, Boldescu, 2001). На настоящий момент накоплен значительный экспериментальный материал по биодеструкции водными и почвенными бактериями хинолиновых и изохинолиновых соединений, не являющихся лекарственными препаратами (Zhu et al., 2008; Li et al., 2010;

Wang et al., 2010). При этом имеется лишь немногочисленная информация о биодеструкции лекарственных соединений данной группы (Niknam et al., 2010;

Zhao et al., 2011).

Одним из распространенных устойчивых фармполлютантов изохинолинового ряда является дротаверина гидрохлорид (C24Н31NO4, CAS:

985-12-6, 1-(3,4-диэтоксибензилиден)-6,7-диэтокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин в форме гидрохлорида, син. Но-шпа), обладающий спазмолитическим, миотропным и сосудорасширяющим действием. Ежегодное потребление его в развитых странах составляет сотни тонн, что неизбежно приводит к попаданию и аккумуляции дротаверина в природной окружающей среде (Duca, Boldescu, Есть данные, указывающие на эмбриоTiwari et al., 2011).

и общетоксическое действие дротаверина гидрохлорида в отношении млекопитающих (Демушкин и др., 2011; Endreffy, Boda, 1983).

Цель настоящей работы – исследование возможности использования актинобактерий рода Rhodococcus для направленной биодеструкции дротаверина гидрохлорида.

Основные задачи исследования

1. Исследовать каталитическую активность коллекционных культур актинобактерий в отношении дротаверина гидрохлорида. Отобрать штаммы – активные биодеструкторы дротаверина. Разработать оптимальные условия процесса биодеструкции дротаверина.

2. Определить условия тестирования культуральной жидкости штаммовбиодеструкторов на присутствие данного фармполлютанта. Исследовать динамику процесса биодеструкции дротаверина родококками методом кинетического моделирования.

3. Изучить физико-химические и морфофизиологические характеристики родококков в условиях биодеструкции дротаверина.

4. Сравнить дротавериндеструктирующую активность свободных и иммобилизованных родококков.

5. Определить основные продукты и возможные пути разложения дротаверина.

Научная новизна. Впервые показана способность актинобактерий рода к использованию дротаверина гидрохлорида в качестве Rhodococcus единственного источника азота, углерода и энергии. Посредством респирометрического метода подтверждена дыхательная активность родококков в отношении дротаверина. Установлено, что представители видов R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber характеризуются наиболее выраженной (МПК200 мг/л) толерантностью к дротаверину и демонстрируют различные способности к его разложению в зависимости от используемого инокулята, температуры и присутствия глюкозы в качестве дополнительного энергетического субстрата.

Подобраны оптимальные условия биодеструкции 20 мг/л дротаверина (28 oС, pH 6,8, внесение 5 г/л глюкозы, чередование скорости механического перемешивания культуральной жидкости 160 и 60 об/мин, использование родококков, предварительно выращенных при низких (2 мг/л) концентрациях дротаверина).

Экспериментально обосновано, что иммобилизованные на твердом носителе (адсорбенте на основе древесных пород) родококки характеризуются наиболее высокой метаболической активностью и устойчивостью к токсическому воздействию дротаверина по сравнению с таковыми свободных клеток и клеток, иммобилизованных в гелевом носителе (криогеле на основе поливинилового спирта). В сравнительных исследованиях каталитической активности вегетативных и дормантных клеток при биодеструкции дротаверина установлена возможность повышения (более чем в 3 раза) деструктирующего потенциала родококков с использованием цистоподобных покоящихся клеток при неоптимальной (35±2 оС) температуре. В условиях воздействия дротаверина выявлены характерные изменения физико-химических (повышение дзетапотенциала и степени гидрофобности клеток) и морфофизиологических (увеличение шероховатости, изменение размеров и агрегация клеток) характеристик родококков. Определены возможные пути разложения дротаверина гидрохлорида. Установлено, что биологическое превращение дротаверина сопровождается образованием простых ароматических соединений – производных протокатеховой кислоты, не обладающих выраженной токсичностью по сравнению с таковой дротаверина.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биодеструктирующей способности актинобактерий рода Rhodococcus и их возможном вкладе в деконтаминацию природных экосистем от фармполлютантов. В результате проведенных исследований отобраны штаммы R. erythropolis ИЭГМ 767, R. rhodochrous ИЭГМ 608, ИЭГМ 647 и R. ruber ИЭГМ 326 – активные биодеструкторы дротаверина. Впервые разработана методика хроматографического определения дротаверина в культуральной жидкости актинобактериальных штаммов в процессе его биодеструкции, пригодная для использования в лабораторных условиях при поиске новых штаммов-биодеструкторов.

Создана кинетическая модель процесса биодеструкции дротаверина, позволяющая оптимизировать планирование исследований по биодеструкции фармполлютанта, сократить продолжительность эксперимента за счет теоретического прогноза, оценить воспроизводимость и определить время окончания процесса биодеструкции дротаверина. Способ биодеструкции дротаверина свободными и иммобилизованными клетками штамма R. rhodochrous ИЭГМ 608, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ АС-1931, защищен Патентом РФ 2496866. Среди промежуточных продуктов биодеструкции дротаверина детектировано соединение предполагаемой структуры 1-оксо-6,7диэтокси-1,2,3,4-тетрагидро-изохинолин (m/z=235,2), являющееся структурным аналогом производных изокарбостирила. Замещенные 1(2Н)-изохинолоны перспективны в синтезе веществ с различной биологической активностью.

Результаты исследований используются в лекционном курсе “Биоразнообразие и систематика микроорганизмов” для магистрантов Пермского государственного национального исследовательского университета Информация (ПГНИУ).

о наиболее активных штаммах-биодеструкторах дротаверина гидрохлорида включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для использования в сети Интернет (http://www.iegm.ru/iegmcol/strain).

Основные положения, выносимые на защиту Актинобактерии рода способны к использованию 1. Rhodococcus дротаверина гидрохлорида в качестве единственного источника азота, углерода и энергии. Наиболее выраженной (МПК200) толерантностью к дротаверину характеризуются представители экологически значимых видов R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber. Полное разложение 20 мг/л дротаверина родококками достигается в присутствии глюкозы в течение 15 сут при предварительном выращивании родококков в условиях низких (2 мг/л) концентраций дротаверина, 28 оС, pH 6,8 и чередовании скоростей (160 и 60 об/мин) механического перемешивания культуральной жидкости.

2. Разработанная методика количественного определения дротаверина в культуральной жидкости родококков методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии пригодна для изучения динамики разложения фармполлютанта. Кинетическое моделирование, параллельное во времени проводимым экспериментам, позволяет сократить продолжительность процесса за счет теоретического прогноза и определить время окончания процесса биодеструкции дротаверина.

3. Характерной особенностью родококков, выращенных в присутствии дротаверина, является повышение дзета-потенциала и степени гидрофобности клеток, их шероховатости, а также формирование клеточных агрегатов разных размеров.

4. Родококки, иммобилизованные на твердом носителе (адсорбенте на основе древесных пород), характеризуются наиболее высокой метаболической активностью и устойчивостью к токсическому воздействию дротаверина по сравнению с таковыми свободных клеток, а также иммобилизованных в гелевом носителе (криогеле на основе поливинилового спирта). Использование цистоподобных покоящихся клеток в качестве инокулята способствует повышению (более чем в 3 раза) дротавериндеструктирующего потенциала родококков при неоптимальной (35±2 оС) температуре.

5. Биодеструкция дротаверина с использованием родококков сопровождается образованием устойчивых метаболитов, среди которых детектируются простые ароматические соединения – производные 3,4-диоксибензойной (протокатеховой) кислоты, не обладающие выраженной токсичностью по сравнению с таковой дротаверина гидрохлорида.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учных “Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии”, Пермь, 2011; XVI и XVII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология – наука ХХI века”, Пущино, 2012, 2013; V и VII Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов “Симбиоз – Россия”, Тверь, 2012, Екатеринбург, 2014; Российской научно-практической конференции студентов и молодых ученых “Современные проблемы фармацевтической науки”, Пермь, 2012–2014; VII Студенческом конкурсе научных проектов по программе УМНИК, Пермь, Региональной научно-практической конференции 2013;

“Междисциплинарные исследования”, Пермь, 2013; Международной научнопрактической конференции “Проблемы развития биотехнологии в аграрной сфере”, Екатеринбург, 2013; 5th Congress of European Microbiologists (FEMS), Leipzig, 2013.

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе в 3 изданиях, входящих в утвержденный ВАК перечень рецензируемых научных изданий (Вестник Уральской медицинской академической науки, Журнал аналитической химии, Фундаментальные исследования) и 2 изданиях, входящих в международную систему научного цитирования Scopus (World Journal Microbiology and Biotechnology, Current Microbiology). Способ биодеструкции дротаверина гидрохлорида свободными и иммобилизованными клетками R. rhodochrous ИЭГМ 608 защищен Патентом РФ 2496866.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 48 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 200 наименований работ, в том числе 61 отечественных и 139 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме “Изучение функционального и видового разнообразия микроорганизмов, полезных для экоценозов и практической деятельности человека” (номер госрегистрации 01201353247). Работа поддержана грантами Президента РФ “Ведущие научные школы” (НШ-5589.2012.4), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН (проект № 12-П-4-1044, номер госрегистрации 01201256869) и молодежным научным грантом по программе УМНИК (номер договора 685 ГУ/2013).

Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора. Суспензии покоящихся форм родококков предоставлены д.б.н. Мулюкиным А.Л. (старший научный сотрудник лаборатории выживаемости микроорганизмов ФГБУН Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН). Математическое моделирование процесса биодеструкции дротаверина выполнено на базе кафедры теоретической механики Пермского национального исследовательского политехнического университета (зав. кафедрой – д.т.н., профессор Няшин Ю.И.).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Фармацевтические вещества – новый класс экополлютантов В последние годы обозначилась новая экологическая проблема загрязнения природной окружающей среды фармполлютантами (“квазилекарства”, “emerging pollutants”, “emerging contaminants”) – высокостабильными соединениями с разнообразной химической структурой и выраженной биологической активностью.

Фармацевтические вещества обнаруживаются в почве, донных осадках водоемов, поверхностных, сточных, грунтовых водах и даже питьевой воде (Гетьман, Наркевич, 2013; Celiz et al., 2009; Mompelat et al., 2009; Monteiro, Boxall, 2009; Shalini et al., 2010; Singh et al., 2011; Wu et al., 2012; Nikolaou, 2013;

Chvre, 2014).

Первое упоминание о присутствии лекарственных соединений в сточных водах приводится в 1965–1976 гг. в статьях E. Stumm-Zollinger и G. Fair, C.H. Keith (цит. по Snyder, Benotti, 2010; Narvaez, Jimenez, 2012). Вопрос о токсичности и биодеградабельности данных соединений впервые был поднят в работе M.L. Richardson с соавт. (1985). С конца 1990-х гг. присутствие фармполлютантов в природных экосистемах начали рассматривать как новую экологическую проблему (Ternes, 1998; Babu et al., 1999). В последнее десятилетие к данному вопросу проявляется пристальное внимание специалистов во многих странах мира, в том числе России (Баренбойм, Чиганова, 2012;

Гуринович и др., 2012; Самойленко, Ермакович, 2013; Kolpin et al., 2002;

Bu et al., 2013; Rodriguez-Navas, Bjrklund, 2013).

Интерес к проблеме загрязнения окружающей среды фармполлютантами связан с развитием аналитических методов, позволяющих детектировать и идентифицировать широкий спектр фармацевтических соединений в довольно низких концентрациях (на уровне нг/л и мкг/л). Среди существующих методов обнаружения следовых количеств лекарственных средств центральное место занимают хроматографические методы – газовая хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография совместно с массспектрометрией (Яшин, Яшин, 2012; Boyd et al., 2003; Koutsouba et al., 2003;

Selimi et al., 2004).

Основные причины попадания фармполлютантов в природные экосистемы тотальное применение лекарственных средств, не только населением, но и в различных отраслях хозяйственной деятельности человека (ветеринария, рыбоводческие фермы, птицефабрики и др.); выбросы и отходы фармацевтических предприятий, образующиеся в результате интенсивного развития фарминдустрии (рисунок 1).

Рисунок Пути попадания лекарственных препаратов 1.

в экосистемы.

Количество фармацевтических отходов в развитых странах мира составляет 3,2 кг/сутки, в России – до 5 кг/сутки, при этом их доля составляет 7 % от общего числа отходов (Клунко, 2012). Загрязнение объектов природной окружающей среды отходами фармацевтической промышленности обусловлено неэффективностью способов их утилизации (сжигание, слив в промышленную канализацию, размещение на санитарных полигонах) и несовершенством методов (озонирование, хлорирование, сорбирование углем и др.) очистки сточных вод от фармполлютантов. Так, использование метода хлорирования для нейтрализации фармполлютантов способствует образованию еще более токсичных продуктов, чем исходное соединение. Озонирование на сегодняшний день является дорогостоящим методом очистки. Более того, использование озона придает воде специфический запах и приводит к коррозии труб. Ультразвуковая обработка требует дорогостоящего оборудования и высоких энергетических затрат (Цхе и др., 2013; Bedner, Maccrehan, 2006; Zweiner, 2007).

Присутствие фармацевтических препаратов в экосистемах представляет токсикологический интерес ввиду мобильности данных веществ и их высокой биологической активности. Содержание некоторых фармполлютантов, детектируемых в природных объектах, превышает расчетные показатели максимально допустимого остаточного уровня (Баренбойм, Чиганова, 2012;

Segura et al., 2009; Snyder, Benotti, 2010), при этом большинство из них являются чрезвычайно опасными (I класс) и высоко опасными (II класс) для природной окружающей среды (Вихарева, 2009).

Известно, что аккумуляция фармполлютантов в экосистемах и их долговременное воздействие на живые организмы может сопровождаться развитием раковых клеток и нарушением функций работы почек у млекопитающих, снижением репродуктивной активности у рыб и другими патологическими изменениями (Bessems, Vermeulen, 2001; Lalumera et al., 2004;

Triebskom et al., 2004). В связи с этим приоритетными остаются исследования, направленные на обнаружение и идентификацию лекарственных препаратов в окружающей среде, клинические испытания малых концентраций данных соединений в отношении человека и других живых организмов, в том числе экологически значимых групп микроорганизмов, при контакте с которыми осуществляется детоксикация фармполлютантов в экосистемах.

Таким образом, ввиду тотального использования, аккумулятивной способности и высокой биологической активности фармацевтические соединения, детектируемые в природной окружающей среде, можно отнести к новому классу экополлютантов.

–  –  –

фармацевтических субстанций (Mompelat et al., 2009; Wols et al., 2013). Тотальное потребление лекарственных препаратов неизбежно приводит к попаданию их в открытые экосистемы. Согласно Рамочной программе Евросоюза в области развития технологий и инноваций, в процессе анализа природных водных образцов, полученных в 22 странах мира, найдено лекарственных препаратов и их метаболитов 178 наименований (Гетьман, Наркевич, 2013). Фармакологически активным (действующим) веществом многих детектируемых лекарственных средств являются разнообразные азотсодержащие гетероциклические соединения (таблица 1). При этом большинство из них по терапевтическому воздействию представлены противомикробными препаратами широкого спектра действия (линкомицин, офлоксацин сульфаметоксазол и др.), противоэпилептическими и психотропными препаратами (диазепам, карбамазепин, оксазепам и др.), а также препаратами анальгезирующего спектра действия (дротаверина гидрохлорид, папаверина гидрохлорид, кодеин и др.).

Как видно из таблицы 1, противомикробное средство сульфаметоксазол (из группы сульфамидов) детектировано в образцах речных вод сразу нескольких стран мира – Швеции (р. Хойе) (20–70 нг/л), Кении (р. Найроби) (10000–30000 нг/л), а также пробах морской воды (Желтое море) Китая (8,3 нг/л) и сточных водах (2000 нг/л) больничных учреждений США (Bendz et al., 2005;

Gorsalitz, 2012; Koreje et al., 2012; Zhang et al., 2013).

Исследование образцов сточных вод Южной Кореи выявило присутствие (7,4–8092 нг/л) как самого сульфаметоксазола, так и его метаболита N-ацетилсульфаметоксазола. При этом концентрация исходного (“родительского”) препарата на порядок превышала уровень содержания продукта разложения (Lee et al., 2013).

–  –  –

Исследование образцов сточных вод о. Тайвань позволило определить наличие в них цефалексина (рисунок 3 А) – антибиотика из группы цефалоспоринов. При этом значения концентраций данного соединения варьировали от 1536 до 28889 нг/л (Lin et al., 2010). Антибиотик линкомицин (рисунок 3 Б), принадлежащий к группе линкозамидов, обнаружен в диапазоне концентраций от 3,13 до 248,90 нг/л в р. По и р. Ламбро (Италия). Известно, что линкомицин вызывает снижение репродуктивной активности веслоногих рачков Daphnia magna, а также способен ингибировать нитрифицирующую активность микроорганизмов, входящих в состав активного ила (Calamari et al., 2003; Carucci et al., 2006).

Среди антибактериальных препаратов, детектируемых в окружающей среде, широко представлены соединения группы хинолонов и фторхинолонов (рисунок 4). Офлоксацин, норфлоксацин и ципрофлоксацин обнаружены в образцах сточных вод Италии, осадке сточных вод Эстонии и США (Zuccato et al., 2006; Lillenberg et al., 2010). Их концентрации составляли от 0,12 до 426 мкг/кг.

–  –  –

Рисунок 3. Структурные формулы цефалексина (А) и линкомицина (Б).

Токсичность антибиотиков группы фторхинолонов (левофлоксацина, ломефлоксацина офлоксацина, цинофлоксацина, ципрофлоксацина, энрофлоксацина и флумекина) исследована в отношении различных групп живых организмов сообщества поверхностных вод. Микроорганизмы (цианобактерии были чувствительны к данным соединениям Microcystis aeruginosa) в концентрации 1 мкг /л. Среди растений наиболее чувствительными оказались ряска Lemna minor и микроводоросли Pseudokirchneriella subcapitata. При этом токсичными концентрациями антибиотиков для ряски выявлены показатели от 53 до 2470 мкг/л, зеленых водорослей – от 1100 до 22700 мкг/л. В отношении беспозвоночных организмов (рачков Daphnia magna) и позвоночных (рыб Pimephales promelas) токсичная концентрация антибиотиков превышала значения 10 мг/л (Robinson et al., 2005).

–  –  –

Рисунок 5. Структурные формулы метронидазола (А), хлорохина (Б) и триметоприма (В).

Антибактериальные препараты разнообразной химической структуры детектированы в концентрации от 2 до 17 нг/г в ряде сельскохозяйственных культур – кукурузе Zea mays L., капусте Brassica oleracea L., зеленом луке Allium cepa L. и др. При этом отмечена зависимость частоты использования того или иного антибиотика в различных отраслях хозяйственной деятельности человека от его концентрации, детектированной в овощах (Кumar et al., 2005).

Очевидно, что попадание антибиотиков в экосистемы обусловлено их тотальным использованием (по данным американского агентства Associated Press, в 2008 г. в США было использовано около 15 млн. кг антибиотиков), высоким (30–90 %) уровнем экскреции данных лекарственных препаратов из организма и их низкой биодеградабельностью в экосистемах (Баренбойм, Чиганова, 2012; Гетьман, Наркевич, 2013; Bowe, 2008).

Согласно литературным данным (Ingerslev, Halling-Srensen, 2001; Ingerslev et al., 2001), период полураспада молекулы метронидазола в поверхностных водах составлял от 14 до 104 сут, в почве – от 13,1 до 26,9 сут. Уровень биологической деструкции офлоксацина, сульфаметоксазола, триметоприма (см. рисунок 5 В) с помощью активного ила не являлся высоким (0,5–18 % через 4 сут) (Vakov, 2010; Gorsalitz et al., 2012).

Нерешенной остается проблема изменения генетического пула микроорганизмов под действием антибиотических веществ и развития антибиотикорезистентности. Резистентность микроорганизмов к данным соединениям не только затрудняет борьбу с инфекциями, но и приводит к нарушению биоразнообразия в экосистемах (Хамидуллина, Гимадутдинов, 2008;

Narvaez, Jimenez, 2012).

Соединения противоэпилептического и психотропного действия – диазепам, оксазепам, примидон, карбамазепин (рисунок 6) детектированы в поверхностных и сточных водах муниципальных очистных сооружений Германии, Италии, Румынии и Японии (см. таблицу 1). Концентрации одного и того же вещества в разных странах существенно различались. Например, концентрация карбамазепина в водных образцах из Германии составляла 1075 нг/л, в то время как в водах Японии не превышала 270 нг/л (Heberer et al., 2002; Nakada et al., 2006). Среди основных причин, обусловливающих частоту встречаемости и разный уровень обнаружения фармполлютантов в природной окружающей среде разных стран мира, можно выделить особенности производства лекарственных средств, их маркетинг, употребление, а также устройство очистных сооружений, направленных на нейтрализацию токсического действия данных соединений (Duca, Boldescu, 2001).

В работе V. Calisto и I. Esteves (2009) отмечено, что препараты психотропного действия (диазепам, в частности) приводят к нарушениям регенерации полипов гидры Hudra vulgaris, при этом концентрация вещества, вызывающего токсический эффект, не превышает 10 мкг/л.

–  –  –

В работе С.G. Daughton (2011) указано, что диазепам детектируют в печени рыб в концентрации от 23 до 110 нг/г. Это свидетельствует о потенциальной опасности диазепама для животных и человека, которые подвергаются его нетерапевтическому воздействию в результате потребления рыбы и прочих организмов, в тканях которых данное соединение аккумулируется (de Lorenzo, Fleming, 2008; Daughton, 2011).

О высокой стабильности химической структуры фармацевтических соединений противоэпилептического и психостимулирующего действия свидетельствуют результаты их биологического разложения. Так, при использовании активного ила убыль диазепама и оксазепама через 60 сут не превышала 10 и 80 %, соответственно. Среди продуктов биодеструкции выявлялись соединения 1,4-бензодиазепин, 2-енол или 3-енол нордиазепам, труднодоступные для микроорганизмов (Rajenovic et al., 2007; Redshaw et al., 2008).

–  –  –

Рисунок 7. Структурные формулы циметидина (А) и омепразола (Б).

Так, например, в образцах морских вод Испании обнаружено от 14 до 18 нг/л данных соединений, тогда как в пресных водах до 38514 нг/л омепразола и 115 нг/л циметидина, в частности (Rodriguez-Navas, Bjklund, 2013). Несмотря на то, что циметидин отнесен к группе препаратов со средней устойчивостью химической молекулы, период его полураспада в окружающей среде составляет не менее 40 сут (Benotti, Brownawell, 2009).

Особое внимание обращает на себя тот факт, что в окружающей среде лекарственные препараты представлены несколькими группами единовременно.

Присутствие смеси фармацевтических соединений в экосистеме способно вызывать различные ответные реакции организма, в том числе на разных уровнях его организации. Комбинация из 11 препаратов, среди которых значительную часть составляли азотистые гетероциклы (карбамазепин, сульфапиридин, триметоприм, сульфаметоксазол, кофеин), вызывала сублетальный и терратогенный эффект в отношении гидры Hydra attenuate (Quinn et al., 2009).

Присутствие фармполлютанов в высоких концентрациях в водных объектах потенциально опасно ввиду легкости их переноса с водотоком в почвы.

Исследованию данной проблемы посвящены работы P. Drillia с соавт. (2003), B. Chefetz c соавт. (2008), S. Jodeh и L. Awartani (2011). По коэффициентам адсорбции азотсодержащие гетероциклические фармполлютанты могут быть распределены в следующий ряд: офлоксацин карбамазепин сульфаметоксазол. Отмечено, что даже в условиях постоянной мелиорации вымывания многих фармполлютантов из почвы не происходило (Kinney et al., 2006; Xu et al., 2009).

Присутствие в природной окружающей среде препаратов анальгезирующего действия регистрируется практически повсеместно. Для стран Западной Европы (Германии, Греции, Швеции), а также для Северной Америки (США, Канады) и некоторых азиатских стран (Южная Корея, Япония) большинство анальгезирующих препаратов, детектируемых в экосистемах, являются производными пропионовой и фенилуксусной кислот (Boyd et al., 2003; Koutsouba et al., 2003; Quintana, Reemtsma, 2004; Bendz et al., 2005). В России и некоторых странах Восточной Европы среди наиболее часто назначаемых и используемых анальгезирующих препаратов являются соединения, по химической структуре представляющие собой производные изохинолинового ряда.

Это такие фармацевтические препараты, действующими веществами которых являются дротаверина гидрохлорид, папаверина гидрохлорид и кодеин (рисунок 8).

–  –  –

В Рисунок 8. Структурные формулы кодеина (А), дротаверина гидрохлорида (Б) и папаверина гидрохлорида (В).

Сведения о судьбе фармпрепаратов данной группы в окружающей среде малочисленны. Следует особо отметить, что вопросы токсического воздействия наиболее полно изучены лишь в отношении соединений изохинолинового и хинолинового ряда, которые не являются лекарственными препаратами.

По данным J.J. Liccione с соавт. (2001), соединения изохинолиновой и хинолиновой структуры обладают канцерогенным эффектом и способствуют ранней смертности млекопитающих из-за разрыва сосудов и пролиферации желчных протоков (Liccione et al., 2001). В отношении лекарственных препаратов изохинолинового ряда эти сведения немногочисленны. Так, дротаверина гидрохлорид имеет эмбриотоксическое и нейротоксическое воздействие на млекопитающих (Демушкин и др., 2011; Endreffy, Boda, 1983); папаверин как алкалоид способен вызвать острое отравление и провоцировать нарушение кровообращения (Zhao et al., 2011). Также выявлено токсичное воздействие папаверина гидрохлорида в отношении клеток печени крыс (Davila et al., 1990).

На настоящий момент накоплен значительный экспериментальный материал по биодеструкции водными и почвенными бактериями хинолиновых и изохинолиновых соединений, не являющихся лекарственными препаратами.

Известно несколько путей аэробной деградации хинолиновых соединений и их производных. Наиболее часто в литературе упоминаются пути деградации хинолина через 5,6-дигидрокси-2(Н)-изохинолинон, 7,8-дигидрокси-2(Н)изохинолон, антранилат и через 8-гидроксикумарин (Fetzner, 1998).

Так, в работе S-n. Zhu с соавт. (2008) показана возможность использования хинолина клетками Rhodococcus sp. QL2 в диапазоне концентраций от 60 до 360 мг/л в качестве единственного источника азота, углерода и энергии, а также в условиях кометаболизма. Более высокие концентрации хинолина ингибировали рост родококков. Продолжительность процесса биодеструкции при этом составляла от 5 до 12 ч. Биодеструкция хинолина протекала с образованием 2-гидроксихинолина, 2,6-дигидроксихинолина и 8-гидроксикумарина.

Биодеградация хинолина, изохинолина и 2-метилхинолина возможна при использовании активного ила. Среди промежуточных продуктов биодеструкции обнаружены 2-метил-4-хинолинол, 2-метилхинолина 1,2,3,4-тетрагидро-2метилхинолин, 2,6-диэтиланилина, 4-бутиланилина, N,N-диэтиланилин и 4-этилбензоламин. Большинство из них к концу эксперимента были преобразованы, однако такое соединение как 1,2,3,4-тетрагидро-2-метилхинолин сохранялось до конца эксперимента (Wang et al., 2010). Хинолин и изохинолин были преобразованы путем гидроксилирования в 2(1Н)-хинолинон и 1(2Н)изохинолинон, соответственно. К концу эксперимента хинолин был полностью минерализован, в то время как убыль изохинолина из среды не превысила 92 %.

1(2Н)-изохинолинон не претерпевал дальнейших изменений (Li et al., 2010).

Биодеградация изохинолина в аэробных условиях с использованием бактерий рода Acinetobacter протекала с образованием 1-гидроксиизохинолина, дальнейшие продукты распада не описаны (Aislabie et al., 1989). В работе P. Rger с соавт.

(1995) показана возможность биодеструкции изохинолина в качестве единственного источника углерода, азота и энергии штаммом Pseudomonas diminuta 7. Клетки метаболизировали изохинолин до 1-oксо-1,2-дигидроизохинолина, дальнейшая биодеструкция которого в анаэробных условиях даже в присутствии дополнительных источников углерода (ацетата или пропионата) протекала крайне медленно (более 90 сут) (Liu, Kuo, 1996).

Необходимо отметить, что вопросы биодеструкции фармполлютантов изохинолинового ряда изучены незначительно. Наиболее исследованным в этом отношении фармацевтическим соединением является кодеин. Установлена возможность биодеструкции кодеина клетками Pseudomonas putida (Niknam et al., 2010). Однако его биоразложение протекало с образованием еще более токсичных для окружающей среды продуктов ацетилкодеина, оксикодона, норкодеина и морфина. Аналогичная ситуация описана в статьях D.A. Kunz с соавт. (1985) и K.M. Madyastha с соавт. (1998), в которых биодеструкцию кодеина проводили с использованием бактерий родов Bacillus и Streptomyces. Среди продуктов биодеструкции идентифицированы 14-гидроксикодеинон и 14-гидроксикодеин.

Ряд научных публикаций посвящен биодеструкции папаверина гидрохлорида (Haase-Aschoff, Lingens, 1979; Hauer et al., 1982; Zhao et al., 2011).

Биодеструкцию папаверина в качестве единственного источника углерода и энергии проводили с использованием бактерий рода Nocardia, грибов родов и В данных работах отсутствуют сведения, Aspergillus Cuningamella.

подтверждающие факт раскрытия изохинолинового цикла папаверина.

Использование грибов рода Phanerochaete позволило в течение 4 сут полностью деструктировать папаверина гидрохлорид в присутствии в среде дополнительного источника азота. Продукты биодеструкции папаверина с использованием клеток Phanerochaete chrysosporium ATCC 34541 не описаны (Zhao et al., 2011). Следует особо отметить, что биологическую деструкцию дротаверина гидрохлорида ранее не исследовали.

Как видно из представленных литературных данных, фармпрепараты изохинолинового ряда являются устойчивыми микрозагрязнителями окружающей среды. В большинстве описанных случаев в результате их биологической деструкции раскрытия изохинолинового кольца не происходит. Это требует проведения дальнейших экспериментов, направленных на разрушение изохинолиновой структуры фармполлютантов с целью детоксикации соединений данной химической группы. Особого внимания требует изучение тех фармацевтических препаратов, которые являются наиболее востребованными на фармацевтическом рынке и неизбежно попадают в окружающую среду.

1.2. Дротаверина гидрохлорид – фармацевтический экополлютант Одними из повсеместно используемых фармацевтических соединений изохинолинового ряда в современной медицинской практике в России и странах Восточной Европы представлены лекарственные препараты, действующим веществом которых является дротаверина гидрохлорид (C24Н31NO4; CAS (Chemical

Abstract

Services): 985-12-6; (1-[(3,4-диэтоксифенил)метилен]-6,7диэтокси-1,2,3,-тетра-гидроизохинолин в форме гидрохлорида). Дротаверина гидрохлорид синтетический аналог папаверина гидрохлорида, обладающий более сильным и продолжительным анальгезирующим действием. Согласно анатомо-терапевтической классификации дротаверина гидрохлорид относится к группе синтетических спазмолитиков и холиноблокаторов (А 03). Остается стабильным при воздействии света, высокой температуры и влажности, умеренно растворим в воде. Соединение разработано в 1961 г. (Vargay et al., 1980).

В торговый оборот препарат запущен в 1963 г. с торговым наименованием Ношпа®. Сегодня Но-шпа зарегистрирована в 56 странах Европы и Азии. По данным корпорации “Sanofi” (2013), основными рынками препарата являются Россия и Польша. Дротаверина гидрохлорид является действующим веществом фармацевтических препаратов с торговыми наименованиями: Беспа, Биошпа, Веро-Дротаверин, Дротаверина гидрохлорид, Дротаверин МС, ДротаверинАКОС, Дротаверин-КМП, Дротаверин-НС, Дротаверин-УБФ, Дротаверин-ФПО, Дротаверин-форте, Спазмол, Спаковин. На фармацевтическом рынке представлены не только однокомпонентные, но и комплексные препараты дротаверина: Никошпан (никотиновая кислота, дротаверина гидрохлорид), Кварелин (анальгин, кофеин, дротаверина гидрохлорид), Но-шпалгин (парацетамол, кодеин, дротаверина гидрохлорид).

Объем продаж препаратов, содержащих дротаверина гидрохлорид, увеличивается с каждым годом. Лидирующую позицию среди данных соединений занимает Но-шпа (рисунок 9) (Степанова и др., 2008; Ушкалова, 2008; Черкасова и др., 2013).

Рисунок 9. Рейтинг препаратов-спазмолитиков в натуральном выражении за 2010–2011 гг.

, Россия (цит. по Черкасова и др., 2013).

Максимальное количество потребления Но-шпы в России приходится на Северо-Западный (28 %) и Южный Федеральные округа (21 %). По данным корпорации “Sanofi” (2013), в остальных регионах потребление Но-шпы не превышает 16–18 %. В последние годы широкомасштабное и повсеместное потребление Но-шпы привело к наиболее частой фальсифицируемости препарата.

Партии поддельной Но-шпы изъяты в России (2003 г.) (http://www.ivanovonews.ru/ Израиле (2007 г.) news/detail.php?id=42027), (http://www.remedium.ru/ pda/news/world/detail.php?ID=29503), Украине (2012 г.) (http://www. novostimira.

com.ua/ news_34538.html). Непригодные к использованию лекарственные средства требуют обязательной утилизации.

–  –  –

Г Д Е Рисунок 10. Продукты биодеструкции дротаверина гидрохлорида в организме человека.

А – 4-дезэтилдротаверин; Б – 6-дезэтилдротаверин; В – 4-дезэтилдротавералдин; Г – глюкоронид 6-дезэтилдротаверина;

Д – глюкоронид 4`-дезэтилдротаверина; Е – глюкоронид 4`-дезэтилдротавералдина.

Необходимо отметить, что дротаверина гидрохлорид имеет высокую химическую устойчивость молекулы. По данным Е.В. Вихаревой (2009), анализ препаратов дротаверина с истекшим сроком годности (1988–2009 гг.) показал практически полную сохранность содержания действующего вещества.

В организме человека полного разложения молекулы дротаверина гидрохлорида не происходит (Данилюк, 2013). Как видно из рисунка 10, в организме человека дротаверин претерпевает гепатобиотрансформацию через О-дезэтилирование с последующей конъюгацией полученных метаболитов с глюкуроновой кислотой (Vargay et al., 1980). В результате О-дезэтилирования происходит отщепление этильной группы с окислением метиленового звена бензильной группы. При этом образуются три основных метаболита:

4-дезэтилдротаверин, 6-дезэтилдротаверин, 4-дезэтилдротавералдин (рисунок 10, А–В). В процессе последующей конъюгации метаболитов с глюкуроновой кислотой образуются соединения, среди которых идентифицированы глюкоронид глюкоронид глюкоронид 6-дезэтилдротаверина; 4-дезэтилдротаверина;

4-дезэтилдротавералдина (рисунок 10, Г–Е).

Согласно нормативным документам (Закон РФ № 52 от 12.03.1999 “О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения” и “Методическим указаниям 4.1.1697-03”), дротаверина гидрохлорид имеет второй класс опасности (ПДК 0,2 мг/куб.м, ОБУВ 0,005 мг/куб.м). Установлено эмбриотоксическое и нейротоксическое действие дротаверина в отношении млекопитающих (Демушкин и др., 2011; Endreffy, Boda, 1983). По данным S. Nair c соавт. (2002), дротаверина гидрохлорид в концентрации мг/кг, введенный 38,37 внутримышечно, вызывал летальный исход у белых крыс. При изучении острой токсичности дротаверина в отношении белых мышей концентрации составляли 19; 95; 1000 мг/кг при внутривенном, подкожном и пероральном введении, соответственно.

Следует отметить, что если вопросы терапевтического воздействия дротаверина на организм человека и позвоночных животных изучены достаточно полно, то в отношении прокариотных организмов экологически значимых групп они практически не исследованы. Знания о бактериальных метаболитах дротаверина гидрохлорида необходимы для оценки “поведения” (“экологической судьбы”) данного соединения и его структурных аналогов в окружающей среде.

Среди экологически значимых групп микроорганизмов, способных чутко реагировать на изменения в среде обитания и инициировать соответствующие адаптивные реакции, особое место занимают актинобактерии рода Rhodococcus.

1.3. Актинобактерии рода Rhodococcus как потенциальные биодеструкторы фармполлютантов Актинобактерии рода – эколого-трофическая группа Rhodococcus микроорганизмов, способных окислять природные и антропогенные органические соединения (Коронелли, Юферова, 1990; Ившина, 1997; Oldfield et al., 1998;

Chauvaux et al., 2001; Soudi, Kolahchi, 2011; Vesel et al., 2012). Согласно современной классификации, родококки относятся к семейству Nocardiaceae, порядку Actinomycetales, классу Actinobacteria. На настоящий момент род Rhodococcus включает 37 видов, официально признанных и имеющих валидное наименование. Каждый год список пополняется новыми видами, в тоже время совершенствование генетических методов позволяет исключить некоторых представителей, ранее отнесенных к данному роду (Yassin, Schaal, 2005; Grtler, Seviour, 2010).

Родококки имеют широкое (практически повсеместное) распространение в природе. Они обнаружены в различных климатических зонах – от южных до северных широт (Ившина, 2012). Источниками выделения родококков являются разнообразные водные бассейны, в том числе морские акватории, сточные воды муниципальных очистных сооружений и заводов, почвы различного состава и даже организмы животных (Бабошин и др., 2005; Colquhoun et al., 1998; Whyte et al., 1999; Yassin, 2005; Manage et al., 2009; Grtler, Seviour, 2010; Tncsics et al., 2014). Среди основных источников выделения отмечены биотопы, загрязненные нефтью и газом или связанные с их месторождением (Коронелли, Нестерова, 1990; Ившина, 2012).

Широкое распространение актинобактерий рода Rhodococcus в окружающей среде, в том числе экстремальных местообитаниях, обусловлено их высокой степенью толерантности к экстремальным абиотическим факторам.

Актинобактерии рода Rhodococcus грамположительные, аэробные, неподвижные, не образующие спор бактерии с трехстадийным морфогенетическим циклом развития. Клетки в молодой (6–15 ч) культуре палочковидные, нитевидные или ветвящиеся. Через 16 ч мицелий распадается на палочковидные фрагменты. В возрасте 48–110 ч в культуре преобладают кокковидные клетки (Ившина и др., 2007; Егорова и др., 2010). Одной из важных особенностей бактерий данной группы является способность к синтезу розового и оранжевого пигментов (Ившина и др., 1987; Mayilraj et al., 2006). Известно, что пигментированным актинобактериям свойственна повышенная жизнеспособность при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды (Костина, 2010).

Родококки являются Нестерова, 1990), K-стратегами (Коронелли, по способу питания – олиго-, нитро-, алкано- политрофами (Ившина, 2012).

Они способны использовать в качестве источника энергии рассеянные источники питания и низкие концентрации органического субстрата (Ившина, 1997), могут длительное время находиться в почве в условиях голодания (Bell et al., 1998;

de Carvalho et al., 2014). Одна из важных биологических особенностей родококков заключается в том, что они способны использовать не только жидкие углеводороды, но и высшие газообразные гомологи метана. Наличие одного только данного свойства уже делает родококков наименее зависимыми от внешней среды и позволяет существовать в условиях, неблагоприятных для других микроорганизмов (Ившина, 1997).



Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Похожие работы:

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«ШАРАВИН Дмитрий Юрьевич IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А.И. Саралов Пермь – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СТР. ВВЕДЕНИЕ.. 4...»

«ТУРТУЕВА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ 14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор НИКОЛАЕВА ГАЛИНА ГРИГОРЬЕВНА Улан-Удэ – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«УДК 5 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 «антропология» по биологическим наукам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор исторических наук, чл.-корр. РАН А.П. БУЖИЛОВА...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Рагимов Александр Олегович ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПОЧВ В ФОРМИРОВАНИИ УРОВНЯ БЛАГОПОЛУЧИЯ НАСЕЛЕНИЯ ВЛАДИМИРСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«КУЗЬМИЧЕВА ЕВГЕНИЯ АНДРЕЕВНА ДИНАМИКА РАСТИТЕЛЬНОСТИ И КЛИМАТА ГОР БАЛЕ (ЭФИОПИЯ) В ГОЛОЦЕНЕ ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.08 — экология Научный руководитель доктор биологических наук Савинецкий Аркадий Борисович Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...4 ГЛАВА 1. Физико-географическая...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«НОВИЧКОВ АНДРЕЙ СЕРГЕЕВИЧ Молочная продуктивность и качество молока коз русской породы в условиях техногенного загрязнения Саратовской агломерации 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.В. Забелина Саратов 2015 СОДЕРЖАНИЕ...»

«Толмачева Алла Викторовна УДК 633.34:551.АГРОКЛИМАТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА УСЛОВИЙ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ СОИ В УКРАИНЕ 11.00.09 – метеорология, климатология, агрометеорология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: Полевой Анатолий Николаевич, доктор географических наук, профессор Одесса – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ РАЗДЕЛ І. БИОЛОГИЧЕСКИЕ...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«ЖЕСТКОВА ДАРЬЯ БОРИСОВНА СОСТАВ И СТРУКТУРА ТРАВЯНИСТОГО ПОКРОВА ПРИДОРОЖНЫХ ТЕРРИТОРИЙ АВТОМАГИСТРАЛЕЙ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА Специальность: 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«БОЛОТОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И МИГРАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЭКОСИСТЕМАХ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность: 03.02.08. Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«ВОРОБЬЕВА Ольга Вадимовна СРАВНИТЕЛЬНЫЙ И ИСТОРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕТОДИЧЕСКОГО ПРОГРЕССА В АЛЛЕРГОЛОГИИ: АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент...»

«ГОРБУНОВА Анна Николаевна ГИДРОЛИЗ РАЦЕМИЧЕСКИХ АМИДОВ ФЕРМЕНТАМИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Максимов А. Ю. Пермь – 201 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.