WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 |

«БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ ФЕНОЛА И ЕГО ХЛОРИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

МАРКУШЕВА ТАТЬЯНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ ФЕНОЛА И ЕГО

ХЛОРИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

03.02.03 – «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Уфа – 201

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт

биологии Уфимского научного центра РАН

Научный консультант:

Еникеева Светлана Ахметовна доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Вахитов Венер Абсатарович доктор биологических наук, профессор Алимова Фарида Кашифовна доктор биологических наук, профессор Кураков Александр Васильевич доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН

Защита состоится «___»_____________2011 г. в _______часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Автореферат разослан «___»_______________2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Лукманова К.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Известно, что в современной биосфере микроорганизмы играют важную роль в вовлечении синтетических производных в естественный обмен веществ и энергии. Микробные клетки способны осуществлять ассимиляцию разнообразных химических субстанций, в ходе которых они выполняют процессы конверсии молекул ксенобиотиков до экологически безопасных продуктов. Именно поэтому в настоящее время применение микроорганизмов рассматривается как основа наиболее выгодных способов поддержания качества окружающей среды.

Существенную роль в конверсии синтетических органических соединений играют бактерии. Это связано с тем, что важной особенностью бактериальных клеток является их высокая приспособляемость к изменяющимся факторам среды, из-за которой они приобретают возможность использовать в качестве источников питания и энергии большое число антропогенных производных, включая и опасные по отношению к другим живым системам.

Значительную часть стойких токсичных экотоксикантов составляют хлорорганические производные, входящие в категорию крупнотоннажных продуктов, производимых для нужд сельского хозяйства, химической, лакокрасочной, деревообрабатывающей промышленности, целлюлознобумажного производства, нефтеперерабатывающей и коксохимической отраслей. Источниками эмиссии поллютантов этой группы являются зоны производства, сточные воды и отходы, а также термические установки по их сжиганию, часто производящие еще более токсичные полихлордиоксины (Винокуров С.В. и др., 1995; Майстренко В.Н., Клюев Н.А., 2004;

Шамсутдинова Л.Р. и др., 2010). Реальную опасность представляют собой и места складирования. Например, к настоящему времени на территории «Уфахимпром» – накоплено 412,14 тыс.м3 отходов в 8 шламонакопителях и тонн высокотоксичных отходов (в т.ч. хлорфенолов), условия хранения которых по оценкам специалистов не соответствуют санитарным и экологическим нормам (Шамсутдинова Л.Р. и др., 2010). Появление в окружающей среде токсикантов связано также с недостаточным качеством очистки промышленных стоков. По сведениям о работе очистных сооружений, приведенным в Государственном докладе «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2001 году», из биологических очистных сооружений в проектном режиме функционировали 19, остальные – работали неэффективно. Даже в ситуации, когда сброс стоков в поверхностные водные объекты снизился, в водной среде обнаруживаются все химические соединения, которые вырабатываются заводами химического профиля.

В питьевой воде г. Уфы идентифицировано более 100 химических соединений-загрязнителей, в т.ч. фенол, бензол, безапирен, ряд пестицидов, включая 2,4-Д, ДДТ, изомеры гексациклогексана, летучие галогенсодержащие углеводороды, 1,2-дихлорэтан, диоксины. Суммарное содержание опасных веществ в отдельные периоды года достигает критических значений (Винокуров С.В. и др., 1995; Ильин В.Г. и др., 1995).

Критические концентрации загрязнителей ароматического ряда обнаружены в Стерлитамаке, Кемерово, Славгороде, Перми, Дзержинске, Чапаевске, Волгограде и Павлодаре. В связи с высоким уровнем объемов накопленных отходов хлорорганического синтеза в 2010 году была организована инвентаризация и учет опасных объектов РФ с целью разработки мер по ликвидации экологического ущерба и определением механизмов их реализации, включая пилотные проекты отработки технологий утилизации загрязнителей (Хизбуллин Ф.Ф. и др., 2011).

Вместе с тем, анализ работ по проблеме утилизации синтетических соединений, показывает, что, несмотря на то, что современный этап исследований биологического воздействия на хлорированные производные характеризуется выраженным практическим интересом к изучению микроорганизмов-деструкторов, число изученных бактериальных культур ограничено. Данные, раскрывающие особенности биологической конверсии фенола и его производных, чаще всего касаются представителей рода Pseudomonas, несколько меньше известно о представителях родов Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus и Sphingomonas (Козловский C. и др., 1993; Lang E. et al., 1996; Prieto M. et al, 2002; Rehfuss М. et al, 2005; Gouda М., 2007; Agarry S. et al., 2008; Liu Y. et al., 2008; Wang C., 2008; Wasi S. et al., 2008; Плотникова Е., 2010).

В настоящее время отсутствие системных исследований микробных деструкторов является сдерживающим фактором развития безопасных и экономически выгодных технологий для решений частных задач рационального использования и охраны природных ресурсов. Следует подчеркнуть, что биотехнологии примерно в 50 раз дешевле традиционных методов, при этом конверсию загрязнителей можно провести без накопления вредных или токсичных веществ, что позволяет исключить вторичную контаминацию среды.

Кроме этого, появляется возможность решения проблемы уничтожения значительных объемов накопленных отходов и невостребованных препаратов.

Вместе с тем, изучение микроорганизмов, способных ассимилировать молекулы экотоксикантов, имеет не только большое практическое значение, но и является одним из фундаментальных направлений микробиологии, раскрывающим новые особенности роли микробов в круговороте веществ. Это направление связано с исследованием теоретических основ жизнедеятельности микроорганизмов в техносфере. Оно охватывает вопросы биоразнообразия, генетической изменчивости, механизмов метаболических взаимоотношений с факторами трансформированной среды, раскрывает процессы адаптации и (микро)эволюции живых систем в условиях сильного антропогенного пресса, включая и случаи прямого их уничтожения.

Познание и освоение потенциала прокариот, обладающих особыми свойствами, а именно, способностью осуществлять контроль над содержанием загрязнителей в окружающей среде и представляющих собой в этом смысле ценный микробиологический ресурс, – важная часть исследований современной биологии в целом.

Цель работы Выявление новых природных бактерий-деструкторов фенола и его хлорированных производных, их сравнительный анализ и определение возможности практического применения.

Задачи исследования 1 Выделить новые бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных из образцов смешанных популяций микроорганизмов техногенной экосистемы.

2 Идентифицировать штаммы-деструкторы в соответствии с культуральноморфологическими, физиолого-биохимическими и молекулярными критериями систематики.

3 Исследовать пути метаболизма молекул ксенобиотиков и получить количественные и качественные характеристики процессов их конверсии.

4 Изучить роль экстрахромосомных элементов в генетическом контроле этапов ассимиляции хлорароматических производных.

5 Выявить уровень гомологии ДНК геномов изучаемых штаммов с ранее изученными генетическими системами конверсии хлорфеноксикислот бактерий.

6 Определить возможности практического применения вновь выделенных штаммов - деструкторов.

Научная новизна исследования Выделены новые штаммы бактерий-деструкторов фенола, 2,4дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5трихлорфеноксиуксусной кислот.

Филогенетическое положение штаммов определено в соответствии с результатами исследования культурально-морфологических, физиологобиохимических признаков, сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК и белкового профилирования. Согласно филогенетической обособленности штаммы Citrobacter sp. 36 4CPA, Stenotrophomonas sp. 33Т и Xanthomonas sp. 33DCP дифференцированы как новые виды гамма-подкласса протеобактерий родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

Впервые выделены бактерии-деструкторы фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

Впервые установлено, что бактерии родов Agrobacterium, Achromobacter, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas выполняют оригинальные реакции ассимиляции хлорфеноксикислот с образованием феноксиуксусной кислоты с последующим раскрытием ароматического кольца.

Выявлено, что генетические системы, детерминирующие метаболизм хлорфеноксиуксусных кислот у штаммов родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas, располагаются на плазмидах.

Методом ДНК-ДНК гибридизации и ПЦР-анализа с применением олигонуклеотидных праймеров установлено, что системы генетического контроля катаболизма молекул хлорфеноксикислот имеют существенные отличия от известных кластеров tfd- и tft-генов штаммов Cupriavidus necator JMP134 и Burkholderia cepacia AC1100.

Теоретическое и практическое значение работы Получены новые данные о разнообразии природных штаммовдеструкторов фенола и его хлорированных производных. Данные о деструкторах внесены в Консолидированный каталог культур микроорганизмов Российских немедицинских коллекций (Сonsolidated Catalogue of Microbial Cultures Held in Russian Non-medical Collections / Edit. L.V. Kalakoutskii Vol. I.

Bacteria, 2001.Р. 3915-4077. Режим доступа: http://www.vkm.ru/eCatalogue.htm/).

Последовательности генов 16S рРНК вновь выделенных штаммов депонированы в международную базу нуклеотидных последовательностей данных GenBank (GenBank accession numbers: HQ877451, HQ891021, HQ891022, DQ333356).

Установлены оригинальные пути ассимиляции моноароматических галогенидов и локализованы генетические элементы их контроля.

Показана принципиальная возможность применения новых штаммовдеструкторов в области защиты среды обитания человека.

Сведения о деструкторах, культуры деструкторов, а также их генетические элементы доступны для использования в научных и практических целях.

Результаты работы используются в образовательном процессе в курсах общебиологических дисциплин БГПУ им. М.Акмуллы и УГАТУ (биология, микробиология, экология, биохимия, генетика и биотехнология), а также при подготовке спецкурсов для магистров и бакалавров.

Практические рекомендации Штаммы-деструкторы рекомендуются для очистки водной среды и почвы в условиях предприятий нефтехимического профиля.

Штаммы-деструкторы Bacillus subtilis (Патент РФ № 1742226), Arthrobacter globiformis (Патент РФ № 2076523), Agrobacterium tumefaciens (Патент РФ № 2077575) и Serratia marcescens (Патент РФ № 2074254) рекомендуются для ремедиации объектов окружающей среды с целью утилизации фенолов в стоках нефтехимических предприятий Северного промузла Республики Башкортостан.

Штаммы-деструкторы Bacillus cereus (Патент РФ № 2129605), и Gluconobacter oxydans (Патент РФ №2130067) рекомендуются для утилизации фенолов и его хлорированных производных в почве.

Генетические ресурсы штаммов-деструкторов рекомендуются для создания новых штаммов с заданными свойствами in vitro (Патенты РФ №№ 2064501, 2130074 и 2125263).

Основные положения, выносимые на защиту 1 В составе почвенной биоты, подвергавшейся воздействию химических факторов промышленного производства, присутствуют бактериидеструкторы фенола и его хлорированных производных.

2 Деструкторами хлорфеноксикислот являются представители родов Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

3 Ассимиляция хлорфеноксикислот у культур деструкторов происходит через процессы дегалогенирования ароматического кольца с последующим его раскрытием.

4 Штаммы-деструкторы обладают оригинальными генетическими кластерами, детерминирующими катаболизм молекул хлорфеноксикислот и их можно применить для создания новых штаммов-деструкторов in vitro.

5 Генетические детерминанты, контролирующие процессы катаболизма хлорфеноксикислот в клетках бактерий-деструкторов, могут располагаться на плазмидах.

6 Вновь выделенные бактерии-деструкторы рекомендуется использовать в качестве действующих элементов технологий очистки водной среды и почвы от фенола и его хлорированных производных, включая 2,4дихлорфенол, 4-хлорфеноксиуксусную, 2,4-дихлорфеноксиуксусную и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоту.

Апробация работы Результаты исследований докладывались и обсуждались на международных научных мероприятиях, в частности, на Экологическом Конгрессе (Япония, 1990), I Конгрессе европейских микробиологов (Словения, 2000), симпозиумах ELSO (Германия, 2003, Франция, 2004), Сахаровских чтениях (Республика Беларусь, 2006, 2009); на 1 Международном конгрессе «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), II С.Петербургском международном экологическом форуме (2008); съездах: ХVI Менделеевском (1998), Всероссийского общества генетиков и селекционеров (2000, 2004, 2008), Биохимического общества (Москва, 2002), Общества биотехнологов (Москва, 2006); в ходе работы в научно-практических конференций, направленных на решение экологических проблем:

«Экологический императив сельского хозяйства РБ» (Уфа, 1998), «Реновация:

отходы-технологии-доходы» (Уфа, 2004), «Актуальные экологические проблемы» (Уфа, 2007), «Проблемы безопасности и защиты населения и территорий от чрезвычайных ситуаций» (Уфа, 2009), а также в рамках профильных конференций: «Микробиологические методы защиты окружающей среды» (Пущино, 1988), «Научные аспекты экологических проблем России» (Москва, 2001), «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и его сопредельных территорий» (Оренбург, 2001), «Наука–Бизнес–Образование»

(Пущино, 2005), «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), «Микробное разнообразие» (Пермь, 2008), «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010), «Факторы экспериментальной эволюции» (Киев, 2010). Материалы исследований были обсуждены на межлабораторном научном семинаре Института биологии Уфимского научного центра и расширенном заседании диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Уфа, 2011).

Публикации Основные научные результаты диссертации изложены в 136 печатных работах, в том числе: 14 публикациях, указанных в Перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК Министерства науки и образования РФ, 9 патентах, в 1 работе, депонированной в ВИНИТИ, в 1 монографии, 7 публикациях в научных электронных изданиях, 32 работах в научных сборниках и 72 - в материалах всероссийских и международных конференций.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 296 страницах, содержит 62 рисунка и 20 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы. Библиография включает 417 источников (89 - отечественных и 318 - зарубежных).

В приложении размещены последовательности нуклеотидов генов 16S рРНК, депонированные в международной базе данных GenBank, описания физико-химических свойств фенола и его хлорированных производных, использованных в исследованиях, акты испытаний, а также сведения о ранее изученных штаммах-деструкторах фенола и его хлорированных производных.

Связь работы с крупными научными программами Работа выполнена в соответствии с планами НИР ИБ УНЦ РАН, а именно, в рамках научно-исследовательских тем «Механизмы деградации хлорароматических соединений у прокариот» (№ гос. регистрации 012 00607440) и «Биоразнообразие природных микроорганизмов-деструкторов хлорароматических производных» (№ гос. регистрации 01200903470).

Исследования поддерживались научно-техническими программами Академии наук Республики Башкортостан, в том числе, «Биотехнология Башкортостана»

(1993-1995), «Проблемы физико-химической биологии в области медицины, сельского хозяйства и технологии живых систем в РБ» (1999-2001), РФФИАгидель № 02-04-97911, а также ГНТП «Экологически безопасные процессы химии и химической технологии» (1992-1993), ГНТП РФ «Приоритетные направления генетики» (1993-1995), ФЦНТП «Исследования науки и техники гражданского назначения» (1999-2001). В настоящее время НИР проводятся при содействии Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (2006-2011).

Благодарности Автор выражает искреннюю благодарность и признательность коллегам по работе: к.б.н. Журенко Е.Ю., к.х.н. Галкину Е.Г., к.б.н. Коробову В.В., к.б.н.

Жариковой Н.В., к.б.н. Ясакову Т.Р., м.н.с. Анисимовой Л.Г. и сотрудникам Центра «Биоинженерия» РАН к.б.н. Колгановой Т.В. и к.б.н. Кузнецову Б.Б., за сотрудничество, а также коллективу Института биологии УНЦ РАН за многолетнюю поддержку и всестороннюю помощь в проведении исследований.

Автор искренне признателен профессору Kazuhito Itoh (Shimane University, Япония) и профессору Sabine Kleinsteuber (Centre for Department of Environmental Microbiology, Германия) за образцы штаммов бактерий, любезно предоставленные для сравнительного анализа.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования являлись штаммы бактерий, выделенные из образцов смешанных микробных популяций почв Северного промышленного узла города Уфы, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства, включая действие ряда высокотоксичных и канцерогенных синтетических производных ароматического ряда.

Штамм Burkholderia sp. M38-VN3-2W был получен от профессора К. Itoh (Shimane University, Япония). Культура Cupriavidus necator JMP13 предоставлена профессором S. Kleinsteuber (Centre for Department of Environmental Microbiology, Германия).

Чистые культуры штаммов-деструкторов выделяли по методу Коха (Теппер Е.З. и др., 1976) с небольшими модификациями.

Визуализацию клеток бактерий осуществляли с помощью электронного микроскопа Н-300 фирмы Hitachi (Япония) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) на сканирующем зондовом микроскопе Solver PRO-M фирмы NT-MDT (Россия). При АСМ-микроскопии сканирование препаратов на подложке из слюды типа мусковит вели в контактном режиме по методу постоянной силы с использованием кантилеверов CSG01 фирмы NT-MDT c радиусом кривизны зонда 10 нм по методике, рекомендованной изготовителем.

Идентификацию изолятов проводили по результатам сравнительного анализа культурально-морфологических, морфометрических и физиологобиохимических признаков в соответствии с критериями дифференциации бактерий, предложенными в 9-м издании руководства «Определитель бактерий Берджи» (1997), а также согласно принципам молекулярного типирования клеток прокариот.

При амплификации гена 16S рРНК использовали универсальные для большинства прокариот олигонуклеотидные праймеры (Edwards U. et al., 1989) и амплификатор Bio-Rad MJMini (США). Определение последовательности гена 16S рРНК производили с применением секвенатора Avant 3150 (Applied Biosystems, США) со стандартным набором реактивов по методикам, рекомендованным производителем.

Для генетического анализа использовали базу данных нуклеотидных последовательностей GenBank и возможности Ribosomal Database Project.

Выравнивание последовательностей осуществляли с использованием редактора BIOEDIT с помощью программы CLUSTALW v 1.75. Построение деревьев осуществляли в формате пакета программы TREECON. Достоверность ветвления филогенетических деревьев просчитывалась в программе MEGA4.

Протеомные профили клеток бактерий были изучены с помощью времяпролетного масс-спектрометра Microflex (Bruker Daltonic, Германия).

Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона m/z (отношение массы к заряду) от 2000 до 20000. Анализ данных проводился в программном пакете Biotyper 2.0 (Seng P. et al., 2009; Szabados F. et. al., 2010).

Плазмидный статус штаммов исследовали с применением метода щелочного лизиса с небольшими модификациями (Маниатис Т. и др., 1984).

Элиминацию плазмид проводили по стандартной методике с небольшими модификациями (Герхард Ф., 1990). В качестве элиминирующего агента применяли этидиум бромид или акридиновый оранжевый.

При конъюгации клеток бактерий пользовались указаниями, изложенными в руководстве «Методы общей бактериологии» (Герхард Ф., 1990). Суспензии клеток донора и реципиента засевали в свежую среду МПБ и проводили наращивание смешанной культуры в течение 8-12 ч при +30°С. По окончании инкубации в суспензию добавляли селективные агенты (2,4-Д и 2,4,5- Т) и инкубировали клетки в течение 1-2 часов в условиях аэрации. Далее клетки рассевали на МПА. Контролем чистоты эксперимента служил посев клеток штаммов донора и реципиента на МПА с селективными агентами.

Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК осуществлялась при модификации стандартного метода (Маниатис Т. и др., 1984). В ходе проверки компетентности проводили трансформацию клеток E.coli HB 101 с применением препарата плазмиды pBR322, несущей ген устойчивости к ампициллину. В качестве контроля чистоты эксперимента выполняли посев клеток без трансформации на среду того же состава.

Фракционирование препаратов ДНК осуществляли путем электрофореза в 1%-м агарозном геле в камере для Bio-Rad Wide mini-sub Cell GT (США) при напряжении электрического поля 6 В/см 25В. После окрашивания фрагментов ДНК гель фотографировали в проходящем УФ-свете при помощи системы документации (Biometra, Германия).

В анализе последовательностей, гомологичных tfd-генам, применяли метод дот-блот гибридизации препаратов ДНК на нитроцеллюлозном фильтре.

Для этого получали препарат плазмиды pJP4 штамма Cupriavidus necator JMP134 методом щелочного лизиса с небольшими модификациями (Маниатис Т. и др., 1984). Метку в препараты ДНК вводили методом замещения нуклеотидов с использованием набора Nick-Translation System (Promega, США).

При приведении сравнительного анализа tft-генов ДНК-матрицы для ПЦРреакций получали по методике N.L. Huong с коллегами (Huong N.L. et al., 2007) с незначительными модификациями. Амплификацию гена tftA осуществляли с использованием препарата ДНК штамма Burkholderia sp. M38-VN3-2W в качестве положительного контроля (Huong N.L. et al., 2007).

Ферментативный гидролиз препаратов ДНК и ПДРФ-анализ проводили по стандартным методикам с учетом рекомендаций производителя (Fermentas, Литовская Республика). Определение размеров фрагментов ДНК осуществляли относительно набора маркерных фрагментов ДНК фага с использованием программы Gel Analysis.

Для определения чувствительности штаммов к антибиотикам использовали метод диффузии в агар с применением дисков (Лабинская А.С., 1978).

Рост культур осуществляли в термостатированных установках УВМТ-12при 115-120 об/мин. Контроль биомассы выполнялся путем измерения значений оптической плотности клеточной суспензии с использованием фотоколориметра КФК-2 (Россия) при длине волны 590 нм и чувствительности равной 2.

Анализ содержания фенола и хлорфенола проводили согласно стандартному фотометрическому методу с применением 4-аминоантипирина (Губен-Вейль И., 1963). Количество фенолов определяли по градуировочному графику, построенному в стандартных условиях определения. Содержание хлорфеноксикислот в культуральной жидкости контролировали согласно руководству «Методы определения микроколичеств пестицидов» (Клисенко М.А., 1984). Идентификацию интермедиатов осуществляли на хромато-массспектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360.

Все эксперименты проведены не менее чем в трех повторностях. В ходе обработки данных определялась средняя арифметическая, стандартное отклонение и доверительный интервал. Обработка результатов проводилась с использованием программы Excel 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Из образцов почвенной биоты, подвергавшейся воздействию факторов нефтехимического производства, были выделены изоляты, способные к росту в условиях использования фенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот в качестве единственного источника углерода и энергии.

1. Идентификация микроорганизмов-деструкторов Выявленные культуры были идентифицированы согласно совокупности культурально-морфологических, морфометрических, физиологобиохимических признаков, а также в соответствии с принципами молекулярного типирования прокариот как штаммы Achromobacter xyloxidans 33P, Agrobacterium tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP, Arthrobacter globiformis 17S, Azospirillum irakense 38D, Bacillus cereus 33T, Bacillus subtilis 16, Brenneria salcis 38P, Citrobacter sp. 36 4CPA, Enterobacter asburia 33D, Enterobacter cloacae 34 4CPA, Gluconobacter oxydans 2T, Pantoea agglomerans 36P, Pseudomonas aeruginosa 36DCP, Pseudomonas fluorescens 39D, Pseudomonas kilonensis 34T, Pseudomonas putida 19S, Raoultella planticola 33 4CPA, Raoultella planticola 36D, Raoultella planticola 36T, Rhodococcus rubropertinctus 5D, Serratia marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP.

Рисунок 1 – АСМ – изображения клеток Azospirillum irakense 38D (1), Stenotrophomonas sp. 33Т (2,3), Citrobacter sp. 36 4CPA (4), Rhodococcus rubropertinctus 5D (5), Pseudomonas fluorescens 39D (6), Gluconobacter oxydans 2T (4). Изображения клеток Xanthomonas sp. 33DCP при разрешении 6000Х (7), Gluconobacter oxydans 2T при разрешении 24000Х (8), полученные с использованием электронной микроскопии. Стрелкой обозначены жгутики бактерий.

Основные диагностические морфологические и морфометрические характеристики микробных клеток были получены с использованием методов электронной и АСМ-микроскопии (рис. 1).

В ходе исследования физиолого-биохимических признаков были выявлена устойчивость изолятов 2T, 33 4CPA, 36D, 36T, 22S к антибиотикам (тетрациклину, хлорамфениколу, канамицину, биомицину) и ионам тяжелых металлов (кобальта, кадмия, серебра). В клетках нескольких культур, в частности, 36 4CPA, 34Т, 22S, 33Т и 33DCP были обнаружены экстрахромосомные элементы.

Сравнительный анализ последовательностей 16S рРНК позволил установить филогенетические кластеры, в которые входили обнаруженные штаммы, и определить наиболее близкие им виды, представленные в базе данных нуклеотидных последовательностей GenBank.

–  –  –

А Б Рисунок 2 – Филогенетическое положение штаммов 36 4CPA, 22S (А) и 33 4CPA (Б). Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" – анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50).

В ходе типирования бактерий с учетом молекулярных маркеров было установлено, что культуры 36 4CPA и 22S принадлежат к филогенетической подгруппе энтеробактерий (рис. 2А).

Штамм 36 4CPA был отнесен к филогенетической подгруппе гетерогенного рода Citrobacter. Уровень сходства последовательностей генов 16S рРНК штамма 36 4CPA с последовательностями различных видов этой подгруппы составлял 97,6 – 98,8%, что оказалось заметно ниже внутривидового уровня для типовых видов C. koseri и C. farmery (99,4%). Внутри филогенетического кластера, составленного этими видами, штамм 36 4CPA образовывал самостоятельную ветвь (рис. 2А). Согласно полученным данным был сделан вывод о том, что штамм 36 4CPA представляет новый вид филогенетической подгруппы рода Citrobacter и он был обозначен как Citrobacter sp. 36 4CPA.

Штамм 22S входил в кластер, образованный несколькими штаммами Serratia marcescens, включая типовой. Уровень сходства последовательностей 16S рРНК изучаемого штамма со штаммами кластера Serratia marcescens оказался очень высоким и составил 99,4 – 99,8%. Этот уровень соответствовал внутривидовому для вида S. marcescens (98,8%). Уровень сходства последовательностей с другими видами рода Serratia был заметно ниже – 98,3 рис. 2А). Результаты анализа сходства последовательностей генов 16S рРНК позволили отнести изучаемый штамм к роду Serratia и виду marcescens.

Сравнительный анализ последовательностей генов 16S рРНК штаммов 33 4CPA, 36D и 36Т показал, что последовательности генов 16S рРНК этих штаммов идентичны и входят в филогенетический кластер видов рода Raoultella planticola, Raoultella ornithinolytica и Raoultella trevisanii (рис. 2Б).

При этом наиболее близким к ним является типовой штамм вида Raoultella planticola (99.8%) (рис. 2Б). Такой уровень сходства соответствует внутривидовому для R. planticola (99,8%), что позволило однозначно идентифицировать штаммы 33 4СРА, 36D и 36Т как Raoultella planticola.

На основании анализа последовательности 16S рРНК было показано, что штамм 33Т входит в филогенетический кластер рода Stenotrophomonas с уровнем сходства 98 – 99%, что ясно свидетельствовало о том, что штамм 33Т является представителем рода Stenotrophomonas. При этом наиболее близкими видами к штамму 33Т являлись Stenotrophomonas maltophilia LMG 958T и Stenotrophomonas africae LMG 22072 (рис. 3А).

Вместе с тем, принимая во внимание то, что согласно АСМизображениям у клеток штамма 33Т было обнаружено наличие двух полярно расположенных жгутиков (рис. 1, изображения 2 и 3), в то время как для вида Stenotrophomonas maltophilia описано перитрихиальное жгутикование (Определитель бактерий Берджи, 1997), было сделано заключение о том, что штамм Stenotrophomonas sp. 33Т не может быть классифицирован как Stenotrophomonas maltophilia и близкий к нему Stenotrophomonas africae, и его следует классифицировать как новый вид рода Stenotrophomonas.

Достоверность классификации штамма 33Т была проверена в ходе протеомного фингерпринтинга. По результатам анализа профиля белковых масс было установлено, что штамм Stenotrophomonas sp. 33Т близок к штамму Stenotrophomonas sp. 109 Neb28 NFI. Значение логарифмического показателя вероятности идентификации, составляло 2,005. Это убедительно указывало на то, что штамм 33Т следует идентифицировать как новый вид рода Stenotrophomonas.

–  –  –

0.005 Рисунок 3 – Филогенетическое положение штаммов 33Т (А), 33DCP (Б) и 34Т (В). Масштаб показывает эволюционное расстояние последовательности гена 16S рРНК, соответствующее 5 нуклеотидным заменам на каждые 1000 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap"–анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50).

По данным типирования штамма 33DCP с использованием последовательности 16S рДНК было установлено, что штамм принадлежит к филогенетическому кластеру, образованному представителями рода Xanthomonas. Уровень сходства последовательностей 16S рДНК изучаемого штамма и различных видов рода Xanthomonas составлял более 99%. На основании этих данных было сделано заключение, что штамм 33DCP является представителем рода Xanthomonas.

Исследование белковых профилей штамма 33DCP не обнаружило достоверную близость ни с одним бактериальным штаммом, поэтому этот штамм был дифференцирован как штамм нового вида рода Xanthomonas (рис.

3Б).

Из рис. 3В видно, что изолят 34Т принадлежит филогенетически гетерогенному роду Pseudomonas. Уровень гомологии последовательности гена 16S рРНК штамма 34Т и близких ему видов превышал 99%. Наиболее близкими к нему видами являлись P. thivervalensis CFBP 11261T, P. corrugata DSM 7228T и P. kilonensis DSM 13547T.

Анализ профиля белковых масс клеток данного штамма выявил, что онимеет наибольшее сходство со штаммом Pseudomonas kilonensis DSM 13647T HAM. Значение логарифмического показателя вероятности идентификации, равное 2,045, подтверждало достоверность таксономического определения этого штамма. На основании полученных данных штамм 34Т был идентифицирован как Pseudomonas kilonensis 34Т (рис. 3Б).

Согласно совокупности результатов филогенетического анализа было установлено, что в составе смешанных популяций присутствовали 4 штамма рода Pseudomonas, а именно, P. aeruginosa 36DCP, P. fluorescens 39D, P.

kilonensis 34T и P. putida 19S, 3 штамма рода Raoultella – R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D и R. planticola 36T и по два деструктора родов Enterobacter – E. asburia 33D и E. cloacae 34 4CPA, а также Bacillus – B. cereus 33T и B. subtilis 16.

Таким образом, было обнаружено, что в составе биоты техногенной экосистемы присутствовали деструкторы фенола и его хлорированных производных нескольких таксонов протеобактерий, а именно родов:

Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

Данные таксономические группы протеобактерий были представлены штаммами альфа-подкласса (A. irakense 38D и G. oxydans 2T), бета-подкласса (A. xyloxidans 33P) и гамма-подкласса (A. tumefaciens 21SG, B. salcis 38P, Citrobacter sp. 36 4CPA, E. asburia 33D, E. cloacae 34 4CPA, P. agglomerans 36P, P. aeruginosa 36DCP, P. fluorescens 39D, P. kilonensis 34T, P. putida 19S, R.

planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36T, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T, Xanthomonas sp. 33DCP), а также группой актиномицетов (Agromyces sp. 34DCP, A. globiformis 17S и R. rubropertinctus 5D). Кроме этого были обнаружены представители бациллярной линии (B.

cereus 33T и B. subtilis 16).

Следует отметить, что ряд исследователей обнаруживал среди деструкторов представителей бактерий родов Achromobacter (Vedler E. et al., 2000; Quan X. et al, 2004), Bacillus (Gurujeyalakshmi G. et al., 1989; Козловский C. и др., 1993; Kim I., Oriel P., 1995; Gunther K. et al., 1995; Lang E. et al., 1996.;

Li D.-Y. et al., 2006; Matafonova G. et al., 2006; Herrera Y. et al., 2008; Wang C. et al., 2008; Liu D.-Y. et al., 2008; Singh S. et al., 2008; Tallur P. et al., 2006; Kirchner U. et al., 2003; Satchanska G. et al., 2006), Citrobacter (Martinez M.et. al., 2000;

Narde K. et al., 2004) и Rhodococcus (Hensel J. et al., 1983; Горлатов C. и др., 1989; Janke D. et al., 1989; Мальцева O. и др., 1991; Stoecker M. et al., 1994;

Briglia M. et al., 1996; Lang E. et al., 1996; Моисеева O. и др., 1999; Соляникова И. и др., 1999; Финкельштейн З. и др., 2000; Prieto M. et al, 2002; Ferraroni M. et al, 2003; Rehfuss M. et al, 2005; Goswami M. et al, 2005; MargesinR. et al, 2005;

Плотникова E. и др., 2006; Pamukoglu M., Kargi F. 2008; Gouda M. et al., 2007).

Принимая во внимание то, что ранее не были выделены бактериидеструкторы фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas, следует сделать вывод о том, что способности представителей указанных таксономических групп вовлекать в обмен веществ и энергии галогенсодержащие производные ароматического ряда выявлены впервые на примере вновь выделенных штаммов A. tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP A. irakense 38D, B. salcis 38P, E. asburia 33D, E. cloacae 34 4CPA, G. oxydans 2T, P. agglomerans 36P, R.

planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36T, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP.

2. Сравнительный анализ особенностей конверсии хлорфеноксиуксусных кислот Исследование динамики использования вновь выделенными изолятами фенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот в качестве источников углерода и энергии показало, что накопление биомассы культур в модельных системах коррелировало с убыванием субстратов (рис. 4).

Сравнительный анализ значений остаточного содержания фенола, 2,4ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т обнаружил различия в уровнях утилизации указанных источников питания (Табл. 1).

Наиболее существенное снижение фенола, до 97% – 99%, наблюдалось для культур A. irakense 38D, B. cereus 33T, R. planticola 36T и S. marcescens 22S.

Меньший уровень использования субстрата – до 93% – 95%, был обнаружен для P. kilonensis 34T и Stenotrophomonas sp. 33T.

В периодической культуре 2,4-дихлорфенол активно утилизировали, до 85% – 70%, штаммы Agromyces sp. 34DCP, B. subtilis 16, P. aeruginosa 36DCP и R. planticola 33 4CPA. Вместе с тем, данный субстрат не метаболизировали культуры A. xyloxidans 33P, A. tumefaciens 21SG, B. cereus 33T, B. salcis 38P, G.

oxydans 2T, P. kilonensis 34T, R. planticola 36T, R. planticola 36D, R.

rubropertinctus 5D и Stenotrophomonas sp. 33T.

По отношению к 4-ХФУК наиболее активными оказались P. agglomerans 36P (90%), Xanthomonas sp. 33DCP (78%) и P. fluorescens 39D (81%).

Культуры B. cereus 33T, P. fluorescens 39D и Stenotrophomonas sp. 33T утилизировали до 82% – 88% 2,4-Д от начальной концентрации.

0,7

–  –  –

0,6 0,9 0,8 0,5 0,7 0,4 0,6 0,5 0,3 0,4 0,2 0,3 0,2 0,1 0,1

–  –  –

1,1 0,9 0,8 0,9 0,7 0,8 0,6 0,7 0,6 0,5 0,5 0,4 0,4 0,3 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1

–  –  –

Рисунок 4 – Графики динамики зависимости значений оптической плотности клеточной суспензии от времени инкубации штаммов бактерий в условиях использования 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии в периодической культуре. Штаммы сгруппированы по месту обитания.

Таблица 1 – Остаточное содержание субстратов в среде культивирования

–  –  –

Наиболее активными по отношению к 2,4,5-Т являлись G. oxydans 2T, A.

tumefaciens 21SG и A. globiformis 17S, утилизировавшие примерно 82%-84% хлорфеноксикислоты. Довольно высокий уровень конверсии 2,4,5-Т показали культуры Citrobacter sp. 36 4CPA (76%) и B. subtilis 16 (78%).

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что для большинства штаммов была характерна полисубстратная активность, при этом фенол и 4ХФУК метаболизировали все изоляты, а наиболее трудно подвергался ассимиляции 2,4-ДХФ. Штаммы А. oxidans 33P, A. tumefaciens 21SG, B. cereus 33T, B. salcis 38P, G. oxydans 2T, P. kilonensis 34T, R. planticola 36D, R. planticola 36T, R. rubropertinctus 5D и Stenotrophomonas sp. 33T не использовали 2,4-ДХФ в качестве источника углерода и энергии.

Ранее было обнаружены представители рода Achromobacter (Quan X. et al., 2004; Vedler E. et al., 2000), Arthrobacter (Sandman E. et al., 1988; Karigar Ch.

et al., 2006; Margesin R. et al., 2004), Bacillus (Gunther K. et al., 1995; Kim I.C., Oriel P.J., 1995), Citrobacter (Narde K. et al., 2004; Martinez M. et al., 2000) и Pseudomonas (Bhat M.A. et al., 1994; Radjendirane V. et al., 1991; Friedrich B. et al., 1983; Herrmann H. et al., 1995) способные к конверсии фенола и его хлорированных производных.

Вместе с тем, сравнивая обсуждаемые данные с исследованиями других авторов, можно сделать вывод о том, что на примере вновь выделенных и исследованных бактерий впервые показана способность к ассимиляции (хлор)ароматических субстратов для некоторых видов бактерий.

В частности, впервые установлена конверсия фенола, 4-ХФУК и 2,4,5-Т для вида Achromobacter xyloxidans на примере штамма A. xyloxidans 33P, а также метаболизм фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК и 2,4,5-Т для вида Arthrobacter globiformis на примере штамма A. globiformis 17S.

При изучении представителей бациллярной линии, а именно, штамма B.

subtilis 16 для представителей рода Bacillus впервые обнаружен катаболизм фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т, а на примере B. cereus 33T – установлено участие представителей данного вида в конверсии фенола, 2,4-Д, 4-ХФУК и 2,4,5-Т.

Исследование штамма Сitrobacter sp. 36 4CPA впервые выявило, что штамм данного рода способен катаболизировать фенол, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5Т.

Для представителей рода Рseudomonas на примере Р. fluorescens 39D описана реализация реакций конверсии 4-ХФУК и 2,4,5-Т, а также деструкция 2,4-ДХФ, 4-ХФУК и 2,4,5-Т для вида P. putida на примере штамма P. putida 19S. Кроме этого, показана возможность участия штаммов вида P. aeruginosa в ассимиляции 4-ХФУК, 2,4,5-Т и 2,4-ДХФ на примере штамма P. aeruginosa 36DCP и установлена способность P. kilonensis вовлекать в обмен веществ фенол, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т.

На примере вновь выделенного штамма R. rubropertinctus 5D установлено, что 4-ХФУК и 2,4,5-Т доступны для бактерий вида Rhodococcus rubropertinctus.

–  –  –

В ходе анализа интермедиатов, появлявшихся в культуральной жидкости в условиях использования молекул ксенобиотиков в качестве единственных источников углерода и энергии, были идентифицированы ключевые молекулы конверсии A. tumefaciens 21SG, A. xyloxidans 33P, Citrobacter sp. 36 4CPA, B.

subtilis 16, G. oxydans 2T, P. kilonensis 34T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36Т, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP (табл. 2).

В частности, 2,4-дихлорфеноксиукусная кислота была идентифицирована среди метаболитов G. oxydans 2T и Citrobacter sp. 36 4CPA.

Метилированное производное 2,4-дихлорфеноксиукусной кислоты, а именно, 2,4-дихлор-6-метилфеноксиукусная кислота, была выявлена у A.

tumefaciens 21SG и S. marcescens 22S.

Кроме этого, в культуральной жидкости A. xyloxidans 33P, G. oxydans 2T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D и R. planticola 36Т была обнаружена 4хлорфеноксиуксусная кислота, а ее метилированное производное, 4-хлор-6метилфеноксиуксусная кислота, присутствовала в периодической культуре Citrobacter sp. 36 4CPA.

Среди промежуточных продуктов B. subtilis 16 отмечены 5-гидрокси-2,4дихлорфеноксиукусная, 2-хлорфеноксиукусная и 2,3-дихлорфеноксиукусная кислоты.

В культуральной жидкости нескольких штаммов, а именно, A. xyloxidans 33P, G. oxydans 2T, P. kilonensis 34T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R.

planticola 36Т, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp.

33DCP, наблюдались молекулы феноксиуксусной кислоты.

P. kilonensis 34T, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP образовывали 2-гексеналь.

3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновая кислота присутствовала у культур G.

oxydans 2T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D и R. planticola 36Т, а 2гидрокси-2-гексендионовая кислота образовывалась в ходе инкубации A.

tumefaciens 21SG, Citrobacter sp. 36 4CPA и S. marcescens 22S.

Присутствие среди метаболитов 2,4-дихлорфеноксиукусной, 4хлорфеноксиуксусной, феноксиуксусной кислот и их производных позволяет сделать вывод, о том, что изучаемые бактерии способны выполнять реакции конверсии хлорфеноксикислот через последовательное дегалогенирование ароматического кольца до стадии его расщепления (рис. 5).

Следует заметить, что штамм B. subtilis 16, являющийся представителем бациллярной линии грамположительных протеобактерий, реализует реакции гидроксилирования ароматического кольца с последующей миграцией и отрывом ионов хлора.

Наличие 2-гидрокси-2-гексендионовой кислоты (производного муконата) в культуральной жидкости штаммов A. tumefaciens 21SG, Citrobacter sp. 36 4CPA и S. marcescens 22S указывает на то, что у данных штаммов раскрытие ароматического кольца происходило по орто- пути, для которого при расщеплении ароматического субстрата характерно образование цис, цис-муконата и его производных, в дальнейшем метаболизируемых до

–  –  –

Рисунок 5 – Схема деградации хлорфеноксикислот вновь выделенных штаммов-деструкторов.

кетоадипата (так называемый -кетоадипатный путь). Такой путь типичен для конверсии (хлор)ароматических соединений у бактерий.

Образование 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеноновой кислоты (кетаизомера полуальдегида 2-гидроксимуконовой кислоты) указывает на то, что у штаммов G. oxydans 2T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D и R.

planticola 36Т расщепление ароматического кольца происходило не по орто-, а по мета - пути.

Обнаружение 2-гексеналя в качестве интермедиата процесса деградации хлорфеноксиуксусных кислот для штаммов P. kilonensis 34T, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP также свидетельствует в пользу реализации мета - пути конверсии хлорароматиков для этих культур, когда ароматическое кольцо раскрывается таким образом, что образуются муконовые полуальдегиды, дальнейший метаболизм которых, как правило, ведет к образованию пирувата, муравьиной кислоты и ацетальдегида, вступающих затем в основной обмен (цикл Кребса).

Такой характер образования промежуточных продуктов был установлен для ограниченного числа микроорганизмов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот. Штамм Pseudomonas sp. CBS3 (Klages U., Markus A. and Lingens F., 1981) осуществлял мета - расщепление ароматического кольца ключевого метаболита деградации 4-ХФУК – 3,4дигидроксифенилуксусной кислоты. Из деструкторов 2,4-Д только у штамма Azotobacter chroococcum (Balajee S., Mahadevan A., 1990) было мета - расщепление, обнаружено которое присутствовало как альтернативный (к -кетоадипатному) путь конверсии субстрата. Для бактерий, выполняющих диссимиляцию 2,4,5-Т, мета - путь ранее описан не был.

Таким образом, на примере A. xyloxidans 33P, G. oxydans 2T, P. kilonensis 34T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36Т, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP впервые описан мета - путь ассимиляции 2,4,5-Т.

Результаты сравнительного анализа показали, что на примере вновь выделенных штаммов-деструкторов родов Agrobacterium, Achromobacter, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas впервые для представителей данных таксонов описаны реакции ассимиляции хлорфеноксиуксусных кислот.

3. Сравнительный анализ генетических детерминант катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот

3.1. ПЦР-анализ ДНК геномов штаммов-деструкторов с применением геноспецифических праймеров гена tftA Burkholderia cepacia AC1100 Ранее для Burkholderia cepacia AC1100 были описаны особенности генетического контроля пути деструкции 2,4,5-Т, ключевыми особенностями которого являются отрыв остатка уксусной кислоты и образование 2,4,5

–  –  –

По результатам проведенного анализа можно сделать вывод об отсутствии ПЦР-продуктов в случае использования в качестве матриц геномной ДНК исследуемых штаммов, а, следовательно, об отсутствии последовательностей гена tftA в геномах Citrobacter sp. 36 4CPA, R. planticola 36T и P. aeruginosa 36DCP.

Аналогичные результаты были получены для штаммов A. xyloxidans 33P, A. tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP, A. globiformis 17S, A. irakense 38D, B.

cereus 33T, B. subtilis 16, B. salcis 38P, E. asburia 33D, E. cloacae 34 4CPA, G.

oxydans 2T, P. agglomerans 36P, P. fluorescens 39D, P. kilonensis 34T, P. putida 19S, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R.rubropertinctus 5D, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP.



Pages:   || 2 | 3 |

Похожие работы:

«ДЕЙЧ УЛЬЯНА ЮРЬЕВНА РАЗВИТИЕ БУХГАЛТЕРСКОГО УЧЕТА ФИНАНСОВЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ОТ БИОТРАНСФОРМАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ АКТИВОВ В ПТИЦЕВОДСТВЕ Специальность 08.00.12 – Бухгалтерский учет, статистика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Нижний Новгород – 2015 Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева» Научный руководитель: Хоружий Людмила Ивановна, доктор...»

«Рейф Ольга Юрьевна БИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕСУРСЫ ОРЕХА МАНЬЧЖУРСКОГО (JUGLANS MANDSHURICA MAXIM.) В ПРИМОРСКОМ КРАЕ 03.02.14 – биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Приморская государственная сельскохозяйственная академия». Научный руководитель: Гуков Геннадий Викторович, доктор...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия...»

«Потапова Анна Викторовна ВЛИЯНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ТРОФИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ ТЯЖЁЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ И ХЛОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ НА КАЧЕСТВО ЛОСИНОГО МОЛОКА 03.02.08 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2015 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Костромской государственный университет им. Н. А. Некрасова» Научный руководитель: доктор биологических наук, Баранов Александр Васильевич Официальные оппоненты: Марзанов Нурбий...»

«СЕЛИФОНОВА Жанна Павловна СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКОСИСТЕМ ЗАЛИВОВ И БУХТ ЧЕРНОГО И АЗОВСКОГО МОРЕЙ (РОССИЙСКИЙ СЕКТОР) Специальность 25.00.28 – Океанология Д 002.140.01 Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Мурманск, 2015 Работа выполнена в ФГБУН Мурманском морском биологическом институте КНЦ РАН и ФГБОУ...»

«НИКИТИНА ЕКАТЕРИНА ГЕННАДЬЕВНА ПАТТЕРН ЭКСПРЕССИИ микроРНК ПРИ ПРЕДОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И РАКЕ ГОРТАНИ 14.01.12 – онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Томский научно-исследовательский институт онкологии» и Национальном исследовательском Томском государственном университете Научный руководитель: доктор биологических наук Литвяков Николай...»

«Гуляева Анастасия Юрьевна ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ИНТРАЦИСТЕРНАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ НА ОСНОВЕ ЭНРОФЛОКСАЦИНА И КЕТОПРОФЕНА 06.02.03 ветеринарная фармакология c токсикологией АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2014 Работа выполнена в отделе качества и стандартизации фармакологических лекарственных средств федерального государственного бюджетного учреждения...»

«Потапов Антон Михайлович КОЛЛЕМБОЛЫ В ТРОФИЧЕСКИХ СЕТЯХ ЛЕСНЫХ ПОЧВ: СПЕЦИАЛИЗИРОВАННАЯ МИКРОБОФАГИЯ специальность 03.02.03 – микробиология и специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2014 Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В....»

«Курбидаева Амина Султановна Изучение роли гена ICE2 Arabidopsis thaliana в контроле устойчивости растений к холоду Специальность 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., профессор Ежова Т.А. Москва – 2015 Работа выполнена на кафедре генетики биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 эпидемиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2014 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки « Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, профессор, доктор медицинских наук Ющенко...»

«УЛАНОВСКАЯ ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА Биоморфологические особенности Hemerocallis hybrida hort. коллекции Никитского ботанического сада Специальность 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ялта – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении Республики Крым «Ордена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический сад – Национальный научный центр» Научный руководитель доктор биологических наук, профессор...»

«УДК 639.2.055: 639.2.053.7 БУЛГАКОВА Татьяна Ивановна РЕГУЛИРОВАНИЕ МНОГОВИДОВОГО РЫБОЛОВСТВА НА ОСНОВЕ МАТЕМАТИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ Специальность– 05.18.17 –промышленное рыболовство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Москва – 2009 г. Работа выполнена в лаборатории Системного анализа промысловых биоресурсов Всероссийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП ВНИРО) Официальные оппоненты: доктор...»

«Хатков Эдуард Магометович МИКРОБИОЦЕНОЗ КОЖИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ АКНЕ НИОСОМАЛЬНЫМ АНТИМИКРОБНЫМ ГЕЛЕМ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный руководитель: Базиков Игорь...»

«ЩЕПИТОВА НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕКАЛЬНЫХ ИЗОЛЯТОВ ЭНТЕРОКОККОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ЖИВОТНЫХ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа –2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургский государственный аграрный...»

«САГИТОВА МИНЗИЛЯ ГАБДУЛХАЕВНА ГИГИЕНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДА «ГРАМО» В ПТИЦЕВОДСТВЕ 06.02.05 ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2015 Работа выполнена в условиях кафедры зоогигиены федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанская государственная академия...»

«Красная Юлия Владимировна ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТОГЕННОСТИ ЕNTEROCOCCUS FAECALIS В УСЛОВИЯХ ДИСБАЛАНСА РЕДОКС-СИСТЕМЫ У ЖЕНЩИН С УРОГЕНИТАЛЬНЫМ ХЛАМИДИОЗОМ 03.02.03 – Микробиология 14.01.10 – Кожные и венерические болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск – 2015 Работа выполнена на кафедре общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии и на кафедре инфекционных и кожно-венерических заболеваний Федерального...»

«Богданов Юрий Аркадьевич МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС И УРОВЕНЬ СПЕРМАЛЬНЫХ ПОЛИАМИНОВ У МУЖЧИН С БЕСПЛОДИЕМ 03. 02. 03 микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Пермь – 2015 Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом клинической лабораторной диагностики государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный медицинский университет имени...»

«КУРТАНОВ Харитон Алексеевич ОКУЛОФАРИНГЕАЛЬНАЯ МИОДИСТРОФИЯ И ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ЛОКУСА ОФМД В ПОПУЛЯЦИЯХ ЯКУТИИ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Томск – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» и в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем» Научный...»

«ФЕДИН АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИНОСИНУСИТОВ 14.03.09. – аллергология и иммунология 14.01.03. – болезни уха, горла и носа АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Пенза – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения...»

«УДК 572 ЛАПШИНА Наталья Евгеньевна ТЕМПЫ СТАРЕНИЯ МУЖЧИН И ЖЕНЩИН СТАРШЕ 60 ЛЕТ В СВЯЗИ С МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ И НЕКОТОРЫМИ ГЕНЕТИЧЕСКИМИ ОСОБЕННОСТЯМИ 03.03.02 – «антропология» по биологическим наукам Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2014 Работа выполнена на кафедре антропологии биологического факультета Московского государственного...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.