WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |

«ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ...»

-- [ Страница 8 ] --

Керамзит/КВУ (3,63% С) Сибунит = ФАС Карбопон Урал ТМ-4 КВУ массивный Карбопон-В-актив Керамзит/графитоподобный слой. Таким образом, наилучшим адсорбентом, сочетающим в себе максимальные значения и n, был керамзит с синтезированным на поверхности слоем КВУ с содержанием С до 6,47 вес%. Такие адсорбенты, как активные угли БАУ, Norit PK 1-3, ФТД и неактивированный порошкообразный уголь-сырец как по значению, так и по значению n занимали промежуточное положение, что, наряду с анализом нагрузки этих адсорбентов клетками, подтверждает эффективность их использования в качестве носителей бактериальных клеток, обладающих гидрофобной клеточной стенкой. Наихудшие результаты, как по значению, так и по значению n были получены для керамзита с синтезированным на поверхности гладким графитоподобным слоем, что, в свою очередь, указывает на неэффективность такого адсорбента, по-видимому, обусловленную гладкой поверхностью и отсутствием макропор.

Факты увеличения ферментативной активности иммобилизованных клеток обсуждались в научной литературе неоднократно, но до сих пор не выработано единого мнения о причинах этого феномена. Высказываются идеи как о стрессовом состоянии иммобилизованных клеток, так и, наоборот, о менее стрессовых условиях прикрепленного образа существования. Так, к стрессовым воздействиям окружающей среды в данном случае можно отнести снижение активности воды и доступа кислорода, что приводит к компенсаторным изменениям в концентрации промежуточных метаболитов у иммобилизованных клеток, за которыми следует сдвиг в сторону альтернативных метаболических путей [360]. Вышеперечисленные эффекты наблюдаются у клеток, включенных в структуру геля. Наоборот, есть данные, свидетельствующие о снижении стрессовых факторов окружающей среды при прикреплении клетки, возможно, связанные с защитным микроокружением, которое создает носитель. Результаты изучения экспрессии стресс-зависимых генов HSP12 и SSA3 у дрожжей подтвердили, что иммобилизованные клетки в основном находятся в менее стрессовых условиях, чем свободносуспендированные. Также иммобилизация оказывает большое влияние на свойства плазматической мембраны, что может стать причиной изменений в ряде транспортных систем [230].

Изучение физиологии адгезированных бактериальных клеток в диссертационной работе затрагивало один из аспектов клеточного метаболизма – содержание внутриклеточного АТФ. Определение пула АТФ нацелено, главным образом, на определение количества жизнеспособных клеток [110], что особенно актуально в случае сессильных форм, когда другие способы оценки вызывают затруднение [102, 134]. Кроме того, содержание АТФ в клетке может служить индикатором ее метаболического статуса и позволяет оценить влияние различных факторов, в том числе, биоцидов [51], антибиотиков [104], температуры культивирования [267] и др. Определение концентрации АТФ в расчете на биомассу позволяло судить о метаболическом состоянии биопленок анаэробов в процессе роста [101]. В работе Е.Н. Ефременко для экспресс-оценки физиологического состояния гетерогенных биокатализаторов был предложен метод АТФ-метрии, основанный на люциферин-люциферазной реакции [16].

Изменение концентрации АТФ в клетке, как возрастание в результате разобщения энергетического и конструктивного обмена, так и падение, свидетельствует о стрессовом состоянии микробной клетки [62, 72], так, отмечено, что аккумуляция АТФ в клетке E. coli при воздействии антибиотиков была обусловлена ингибированием процессов потребления энергии [104]. По нашим данным, необратимая адгезия приводит к снижению пула АТФ в клетке, причем степень снижения зависит от носителя.

Рост бактерий в периодической культуре на жидких средах может быть представлен графически в виде классической кривой, которая начинается с лагфазы, характеризующейся адаптацией культуры к субстрату без нарастания биомассы [42]. Лаг-фаза на сегодняшний день является наименее изученной стадией развития микробной культуры. У серовар Salmonella enterica Typhimurium наблюдали статистически значимые изменения экспрессии 2657 генов (более чем половина генома) в клетках, взятых в одной временной точке лаг-фазы, по сравнению с инокулюмом стационарной фазы роста [264]. Данные, касающиеся уровня АТФ в клетках лаг-фазы периодической культуры микроорганизмов, в научной литературе представлены достаточно скудно. В работе Ю.К. Кудыкиной отмечается, что в процессах реактивации микобактерий в лаг-фазе вначале активируется аденилатциклаза, повышается уровень цАМФ, и, как следствие, в клетке начинается синтез нуклеиновых кислот и активация других звеньев метаболизма, что, в конечном счете, приводит к делению клетки [32].

У дрожжей отмечается гипераккумуляция цАМФ в клетках лаг-фазы [392]. В свою очередь, известно, что концентрация цАМФ в клетке обратно пропорциональна концентрации АТФ [54]. С.Ю. Митяшиной было показано, что введение в среду культивирования Desulfovibrio desulfuricans В-1388 5% окиси углерода приводит к снижению содержания АТФ в клетках в первые 5 часов роста, которые соответствуют лаг-фазе [39]. В работе Е.Б. Тихоновой с соавторами показано, что в первые часы роста Rhodococcus minimus происходит уменьшение пула АТФ в клетке одновременно с увеличением интенсивности дыхания, хотя выраженной лаг-фазы в данных экспериментах авторы не наблюдали [70].

Возможно, при адгезии происходит подобный процесс, когда клетка, прикрепившись к нерастворимому носителю, проходит стадию адаптации, которая характеризуется падением концентрации АТФ в клетке. Кроме того, для начальных стадий образования биопленки необходим синтез протеинов [311], что в свою очередь требует затрат энергии. Для адгезии живых организмов характерны специфичность, вовлечение органелл типа жгутиков и фимбрий и метаболический контроль. При этом затраты метаболического потенциала на процесс адгезии велики: синтез собственно адгезинов (белки или гликопептиды), антиадгезинов, сигнальных молекул [52]. Нами выдвинута гипотеза, по которой адгезия клеток бактерий на нерастворимом субстрате может быть приравнена к лаг-фазе периодической культуры, в процессе которой происходит перестройка микроорганизма в ответ на новые условия существования.

По-видимому, адгезию микроорганизмов не следует рассматривать как стрессовый фактор в классическом понимании этого слова, т.к. адгезия – естественный, присущий всем микроорганизмам процесс, не связанный с опасными для жизнедеятельности клетки воздействиями. Действительно, к стрессовым факторам, которые влияют на бактериальную клетку, могут быть отнесены такие явления, как голодание, высокая осмолярность, высокая или низкая температура, неоптимальный рН. Однако прикрепление к поверхности твердых тел является естественным механизмом адаптации, придающим клеткам большую устойчивость к различным факторам внешней среды.

Известно, что стринджент-ответ, представляющий собой согласованное торможение синтеза белка, РНК, ДНК и пептидогликана при сильных стрессорных воздействиях, связанных со значительным замедлением скорости роста при исчерпании источников питания в среде, вносит существенный вклад в регуляцию многих процессов, ассоциированных с ростом, вторичным метаболизмом, персистенцией, образованием биопленок. В настоящее время принято считать, что стринджент-ответ представляет собой универсальную реакцию клеток на любой вид стресса, сопровождающийся задержкой или полной остановкой роста, какова бы ни была ее причина, например, вступление клеток в стационарную фазу роста или лаг-фазу во время диауксического роста. Известно, что основной промотор rpoS (гена, кодирующего S-субъединицу РНКполимеразы) в 5–10 раз повышает транскрипцию при вступлении микроорганизмов в стационарную фазу, а трансляция уже существующей мРНК rpoS стимулируется, в том числе, в ответ на высокую плотность клеток в культуре [71]. Когда бактерии растут в периодической культуре на полноценной среде, внутриклеточная концентрация белка RpoS резко повышается в стационарной фазе роста и S-ассоциированная форма РНК-полимеразы становится основной формой РНК-полимеразы, активной на этой стадии роста [265]. При адгезии значительно повышается плотность клеток даже по сравнению с суспензией в стационарной фазе роста. Таким образом, адгезия клеток бактерий на нерастворимом субстрате приводит к запуску ряда адаптивных механизмов клетки. Эти реакции, в свою очередь, сопровождаются снижением внутриклеточного пула АТФ. В работе S.L. Kinniment и J.W.T. Wimpenny было показано, что биопленки P. aeruginosae, находящиеся в «квазистационарном»

состоянии (55 и 105 ч роста), характеризуются низким энергетическим зарядом, возрастающим от «дна» до поверхности биопленки, но в максимуме достигающим не более 0,6 едициц [244].

C2 – представитель грамотрицательных гаммаP. fluorescens протеобактерий, R. ruber gt1 – грамположительных актинобактерий, одно из основопологающих отличий которых обусловлено структурой клеточной стенки.

Известно, что процесс формирования биопленки зависит от многих факторов, среди которых состав среды, свойства носителя и самих микроорганизмов.

Разнообразие адгезионных механизмов у различных микроорганизмов обусловливается огромным числом вариантов взаимодействия этих факторов [19].

При исследовании мутантов таких грамотрицательных бактерий, как P.

aeruginosa, P. fluorescens и E. coli, была выявлена важная роль флагелл и пилей для ранних стадий развития биопленок. Кроме того, было установлено, что прикрепление клеток E. coli к абиотической поверхности вызывает важные изменения в составе внешних мембранных белков, причем уровень синтеза 17 белков возрастает, а 15 снижается [23]. В свою очередь, адгезия грамположительных бактерий обусловлена в основном гидрофобными взаимодействиями, а степень гидрофобности связана с содержанием клеточных липидов [64]. Как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий адгезию к твердым поверхностям обусловливают внеклеточные полимерные вещества [203], синтез которых возрастает при контакте с поверхностью [204].

Возможно, метаболические перестройки, направленные на образование внеклеточных полимерных веществ, не столь велики у псевдомонад, которые и в суспендированном состоянии характеризуются повышенным синтезом этих веществ. Скорее всего, на содержание внутриклеточного АТФ изученных штаммов влияют не только особенности, обусловленные структурой клеточной стенки, и, как следствие, различия адгезионных механизмов, но и особенности роста этих бактерий в периодической культуре. Так, P. fluorescens C2 по сравнению с R. ruber gt1 – быстрорастущий организм. Его стационарная фаза роста характеризуется значительным снижением жизнеспособности, о чем также можно судить по содержанию внутриклеточного АТФ (Таблица 24). При адгезии P. fluorescens C2 снижение пула АТФ в клетке менее резкое, чем у клеток R. ruber gt1, энергетическое состояние которых в суспензии стационарной фазы характеризуется бльшим количеством АТФ. Следует отметить, что объяснение влияния различных факторов (свойств носителей, клеточной стенки бактериальных клеток, особенностей роста микроорганизма) на содержание внутриклеточного АТФ при адгезии находится на стадии гипотез и требует дальнейшего детального изучения.

Рассмотрен другой тип гетерогенного биокатализатора – биопленки нитрилутилизирующих бактерий, выращенные в процессе культивирования в присутствии носителя. Показано, что биопленки нитрилгидролизующих родококков и псевдомонад могут являться эффективным биокатализатором трансформации алифатических и ароматических нитрилов в соответствующие амиды и карбоновые кислоты. Изучение микробных биопленок во многом ассоциировано с их негативной ролью в жизни и хозяйственной деятельности человека и подчинено разработке методов борьбы с ними. С другой стороны, в научной литературе с недавнего времени начало укрепляться мнение о биопленках как «рабочих лошадках промышленности» (“industrial workhorses”) [281], используемых в технологиях очистки окружающей среды и биокатализе.

Повсеместно применяемый метод биологической очистки сточных вод активным илом по своей сути является процессом, основанным на жизнедеятельности самоиммобилизующихся микроорганизмов [53, 66]. Процессы обработки сточных вод основаны на использовании трех типов микробных агрегатов: статические биопленки (например, в биофильтрах), биопленки в виде макрочастиц и флоккул (в активном иле) [294]. С другой стороны, понятие «биопленка-биокатализатор»

появилось относительно недавно [212, 281, 282], в подавляющем большинстве случаев относится к процессам ферментации и основано на главном преимуществе биопленок перед планктонным состоянием: их устойчивости по отношению к токсичным субстратам и продуктам, оказывающим негативное влияние на жизнеспособность. Нами был получен биокатализатор трансформации нитрилов и амидов на основе бактериальных биопленок, выращенных на углеродсодержащих волокнистых адсорбентах и полиэтилене высокой плотности.

Устойчивость биопленок родококков и псевдомонад к высоким концентрациям акриламида, акриловой кислоты и акрилонитрила была изучена двумя методами:

АТФ-метрией и качественным анализом жизнеспособности с помощью флюоресцентной метки LIVE/DEAD®. Эпифлуоресцентная и конфокальная лазерная микроскопия, позволяющая визуализировать биопленку с помощью окраски флюоресцентными маркерами, в настоящее время является одним из развивающихся способов изучения биопленок [95, 389]. В нашем случае визуализация жизнеспособных и мертвых клеток подтвердила данные АТФметрии: клетки биопленки не теряют своей жизнеспособности при воздействии высоких концентраций токсичных агентов. Так, инкубация в присутствии акриловой кислоты, обладающей не только токсичным эффектом, но и низкой рН, приводит к сдвигу окраски, но не нарушает морфологию клеток биопленки, тогда как в суспензии клетки почти не визуализируются, вероятно, из-за их лизиса.

Показано, что монопленки более эффективны для биокатализа нитрилов и амидов карбоновых кислот, тогда как смешанные биопленки, даже в случае отсутствия конкуренции за субстрат роста, не обладают такой же способностью к трансформации, как смешанная суспензионная культура тех же штаммов.

Возможно, это связано с разной адгезивной способностью различных штаммов при использовании определенного носителя, который оказывается предпочтительным только для одного микроорганизма.

Одним из направлений исследования явилось создание гетерогенного биокатализатора трансформации нитрилов и амидов на основе ферментных препаратов, представляющих собой бесклеточные экстракты грубой очистки, содержащие нитрилгидратазу, нитрилазу или амидазу. Ферментный препарат был иммобилизован различными способами – адсорбционным, методом ковалентной сшивки с носителем и методом создания поперечно-сшитых агрегатов фермента (ПСАФ). Для адсорбции нитрилгидролизующих ферментов впервые были использованы немодифицированные оксиды алюминия и углеродсодержащие носители на их основе, а также углеродные носители «Сапропель» и Сибунит.

Адсорбционная иммобилизация приводила к значительной потере ферментативной активности. Возможно, это связано с нарушением гидратной оболочки фермента, необходимой для функционирования активного центра [277, 377], которое происходит при контакте с гидрофобным носителем.

Действительно, потери активности при адсорбции на немодифицированных оксидах алюминия были меньшими, хотя величина адсорбции белка на углеродсодержащих носителях была выше. Стереоселективность адсорбированной амидазы также снижалась, вероятно, одной из причин этого была рацемизация полученного продукта при контакте с носителем.

При оценке различных методов и носителей для иммобилизации ферментов метаболизма нитрилов наиболее эффективным был признан метод ковалентной сшивки с активированным хитозаном. Натуральный полиаминосахарид хитозан – сополимер D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина – является перспективным носителем для иммобилизации ферментов, т.к. сочетает в себе такие характеристики, как гидрофильность, высокая аффинность к белкам, доступность функциональных групп для прямых реакций с ферментами и для химических модификаций [258]. За счет большого количества водородных связей, которые способен образовывать хитозан, он является универсальным сорбентом, который может связывать вещества органической и неорганической природы. Большое количество свободных аминогрупп в молекуле определяет его способность взаимодействовать с бифункциональными реагентами, образующими химические связи как с молекулой хитозана, так и с молекулой белка, что делает возможным ковалентную сшивку фермента с хитозаном [80].

Из научной литературы известны примеры успешной иммобилизации ферментов на модифицированном и немодифицированном хитозане. Так, липаза из Candida rugosa, иммобилизованная на модифицированных аминокислотами и активированных эпихлоргидрином хитозановых гранулах, сохраняла активность при хранении и многоцикловом использовании, а также могла функционировать при температуре 55С [415]. При иммобилизации на активированном хитозане у каталазы повышалась термостабильность, операционная стабильность и стабильность при хранении [152]. Иммобилизация аллиназы на хитозане, активированном ангидридом янтарной кислоты, приводила к повышению оптимума pH и температуры по сравнению с нативным ферментом и давала возможность многоразового использования фермента [419]. Преимущества иммобилизованной на хитозане -галактозадазы перед нативным ферментом было основано на расширении рН и температурного оптимума, более высокой термостабильности и возможности многократного применения [187].

По нашим данным, ковалентная сшивка нитрилгидратазы с хитозаном, активированным бензохиноном, дает возможность использовать фермент не менее чем в 50-и последовательных циклах конверсии акрилонитрила, повышает его термостабильность и расширяет рН оптимум активности, кроме того, появляется возможность функционирования фермента в кислой среде (до рН 3–4).

Ковалентная сшивка повышала термостабильность нитрилгидратазы при 40С и амидазы при 50С, тогда как при более высоких температурах – 50 и 60С для нитрилгидратазы и 60 и 70С для амидазы возрастание термоустойчивости было незначительно. Как хитозан, так и «Сапропель» повышают рН в микроокружении фермента, что приводит к сдвигу оптимума рН активности в сторону более низких значений и возможности работы фермента в кислой среде.

Разница в рН-профилях активности нативных и иммобилизованных ферментов, по-видимому, связана с различиями рН в микро- и макроокружении фермента [73] и обусловлена свойствами носителя. Основываясь на полученных нами результатах, можно сделать вывод, что иммобилизованный на хитозане и «Сапропеле» фермент находился в микроокружении, рН которого сдвинута в щелочную область по сравнению с реакционной средой. Хитозан – поликатион, который отталкивает протоны, а в составе «Сапропеля» присутствуют ионы Na+, K+, Ca2+ и Mg2+ (Рисунок 19). Однако в настоящее время появились сведения о возможности исследования внутренней среды биокатализатора в режиме “real time” [371]. Разработаны методы для определения рН и концентрации кислорода внутри частицы, основанные на применении опто-химических рН- и О2-сенсоров, которые доступны в разных модификациях (точечные, в виде слоев, оптоволоконные, частицы микро- и нанометрового размера) [138]. Также чтобы сделать возможным измерение внутри пористых носителей, разрабатываются методы иммобилизации люминесцентных красителей в твердый носитель, либо прямой конъюгации фермента с рН-чувствительным люминофором (например, флюоресцеин тиоизоцианат, FITC) [376]. Возможность охарактеризовать внутреннюю среду, окружающую иммобилизованный фермент, позволит оптимизировать процесс, провести скрининг подходящих методик иммобилизации и геометрии носителя, оценить кинетические параметры и массоперенос в гетерогенной системе.

Современной тенденцией в разработке иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов является создание CLEAs (cross-linked enzyme aggregates, или ПСАФ – поперечно-сшитые агрегаты ферментов) [368, 369]. Этот метод позволяет достичь стабилизации мультимерных энзимов, но аморфное состояние таких препаратов затрудняет их использование в колоночном и многоцикловом синтезе. В нашей работе были приготовлены ПСАФ амидазы с использованием бифункциональных реагентов – глутарового альдегида и бензохинона, и изучена их стереоселективность в реакции гидролиза рацемического лактамида. Действительно, этот метод позволил получить препараты фермента, проявляющие максимальную стереоселективность, превышающую таковую нативного фермента.

ПСАФ амидазы из R. rhodochrous 4полученные одновременной преципитацией сульфатом аммония и ковалентной сшивкой глутаровым альдегидом, проявили максимальную активность и стереоселективность в диапазоне температур от 40 до 60С. Совпадение максимумов активности и стереоселективности явилось преимуществом полученных препаратов. По литературным данным, у CLEAs нитрилазы, гидролизующих рацемический нитрил миндальной кислоты до (R)-миндальной кислоты, энантиоселективность увеличивалась при снижении температуры, тогда как скорость реакции при низкой температуре обычно снижается [242].

На стереоселективность реакции также влияет носитель, присутствующий в гетерогенной среде. Так, соотношение изомеров в реакции гидролиза фенилглицинонитрила адгезированными на углеродных носителях Сибунит и «Сапропель» клетками P. fluorescens C2 при протекании реакции в течение 24 ч было противоположным. Если через 1 ч реакции соотношение стереоизомеров в растворе было сдвинуто в сторону L-фенилглицина как у адгезированных, так и у суспендированных клеток, то к 24 ч выход L-изомера у биокатализатора на Сибуните уже составлял 98%, а на «Сапропеле» преобладал выход D-изомера.

При конверсии лактамида адсорбированной амидазой присутствие носителя Сибунита в реакционной смеси приводило к рацемизации раствора, «Сапропеля»

– к преобладанию D-изомера, тогда как фермент в растворе гидролизовал лактамид до L- и D-молочной кислоты с 78%-ным энантиомерным избытком последнего. Таким образом, нами впервые было показано влияние углеродных носителей на стереоселективность ферментативных реакций, протекающих в гетерогенной среде.

При сравнении функционирования в гетерогенной среде трех различающихся по активности ферментов как в изолированном состоянии, так и в бактериальной клетке, были выявлены следующие закономерности. Во-первых, удельная амидазная и нитрилазная активность, уступающая более чем на порядок нитрилгидратазной, зависит от концентрации клеток в растворе и в адгезированном состоянии при избытке субстрата и прочих равных условиях.

Факт преднамеренной избыточности субстрата в реакции позволяет предполагать, что обратная зависимость активности от концентрации биокатализатора является следствием не столько конкуренции за субстрат, сколько возникающих диффузионных затруднений. Следовательно, если скорость фермент-субстратных взаимодействий велика, что в нашем случае имеет место при функционировании нитрилгидратазы, то роль диффузии незначительна, и реакция протекает в кинетическом режиме. Таким образом, при создании иммобилизованного биокатализатора следует обращать внимание на исходную ферментативную активность. Относительно низкая ферментативная активность налагает ограничения на концентрацию иммобилизованных клеток и белкового препарата

– в этом случае следует отдавать предпочтение носителям, позволяющим создать монослой биокатализатора на поверхности, избегая полислойной адсорбции.

При сравнении гетерогенных биокатализаторов, полученных на основе бактериальных клеток и выделенных ферментов, возникает вопрос о целесообразности трудозатратной стадии выделения фермента, локализованного в цитоплазме клетки. Действительно, в большинстве случаев адгезированые бактерии, обладающие нитрилгидролизующей активностью, могут являться эффективным биокатализатором. Однако выделение внутриклеточного фермента и его стабилизация необходимы для повышения стереоселективности реакции, причем в данном случае более предпочтительна «иммобилизация без носителя», т.е. образование ПСАФ. Кроме того, выделение нитрилгидратазы и ее сшивка с хитозаном, активированным 0,1% бензохиноном, позволили получить препарат, обладающий максимальной операционной стабильностью из изученных гетерогенных биокатализаторов – он выдерживал не менее 50 циклов последовательной конверсии акрилонитрила, причем даже в 50-м цикле активность была в 3,5 раза выше, чем в первом.

Перспективы дальнейшей разработки темы затрагивают анализ протеома клеток нитрилгидролизующих бактерий в адгезированном состоянии и в состоянии биопленки на различных этапах ее формирования, что позволит углубить знания об экспрессии генов и физиологических изменениях бактериальных клеток при первичной адгезии и росте в виде биопленки.

Практическими перспективами работы является создание биофильтров для очистки воды от нитрильных загрязнений на основе адгезированных клеток и биопленок нитрилтрансформирующих бактерий, а также разработка биореакторов для осуществления непрерывного биокаталитического процесса трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот до соответствующих продуктов, которые могут найти применение в химической и фармацевтической промышленности.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что на адгезию бактериальных клеток на углеродных материалах наибольшее влияние оказывают гидрофобно-гидрофильные характеристики поверхностей клетки и носителя. Показана умеренная положительная связь (r=0,679; p=0,05) между гидрофобностью углеродных носителей и массой адгезированных клеток R. ruber gt1, обладающих гидрофобной клеточной стенкой (48–52% по BACH-тесту), а также сильная положительная связь между гидрофобностью поверхности клеток различных штаммов бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus и их адгезией на гидрофобных углеродных материалах: от r=0,884 до r=0,950 (p=0,05).

2. На основании анализа эффективности функционирования иммобилизованной системы () и операционной стабильности биокатализатора (n), изученных в процессе гидролиза акрилонитрила, выстроен интегративный ряд углеродных носителей, используемых для адгезии клеток R. ruber gt1, по убыванию этих характеристик:

Керамзит/КВУ (6,47% С) уголь-сырец порошкообразный БАУ ФТД Norit PK 1-3 «Сапропель» Керамзит/КВУ (3,63% С) Сибунит = ФАС Карбопон Урал ТМ-4 КВУ массивный Карбопон-В-актив Керамзит/графитоподобный слой.

3. Показано, что при выборе носителя для создания эффективного гетерогенного биокатализатора на основе адгезированных клеток необходимо учитывать адсорбцию продуктов трансформации материалом носителя: для гидролиза алифатических нитрилов и амидов адгезию бактериальных клеток предпочтительно осуществлять на активированных углеродных материалах, тогда как для гидролиза ароматических субстратов – на неактивированных.

4. Показано, что гетерогенный биокатализатор трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот может быть получен агрегацией клеток нитрилгидролизующих бактерий с многослойными углеродными нанотрубками. Агрегация родококков с неочищенными нанотрубками достоверно выше, чем грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas и Alcaligenes, и составляет 415–440 мг сухой биомассы на 1 г носителя.

Установлено, что ферментативная активность клеток, агрегированных с неочищенными нанотрубками, в 4–45 раз ниже, чем с очищенными, что обусловливает необходимость очистки углеродных нанорубок от технологических примесей.

5. Показано, что биопленки нитрилгидролизующих бактерий, полученные при культивировании в присутствии носителей, являются гетерогенным биокатализатором, проявляющим повышенную устойчивость к токсичным субстратам и продуктам трансформации нитрилов.

Максимальное количество акриламида (1047±113 мг) получено при 20минутной конверсии 1,3 М раствора акрилонитрила, никотиновой кислоты (126±6 мг) – при 24 ч конверсии 200 мМ раствора 3цианопиридина выращенными на 1 дм2 полиэтилена высокой плотности биопленками R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 соответственно.

6. Установлено, что стадия инициации образования биопленки – необратимая адгезия – характеризуется снижением пула АТФ в клетке, причем уровень снижения зависит от свойств носителя. Отмечено, что наибольшее снижение концентрации внутриклеточного АТФ происходит при адгезии R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 на носителе «Сапропель» – от 1,071 до 0,002 нМ/мг и от 0,144 до 0,006 нМ/мг соответственно.

7. Определено, что адсорбция нитрилгидролизующих ферментов на углеродсодержащих носителях приводит к снижению их активности, но увеличивает их устойчивость к высоким температурам. Ковалентная сшивка ферментов с хитозаном, активированным бензохиноном, повышает термостабильность, расширяет рН оптимум активности и увеличивает кислотоустойчивость, а также дает возможность многоциклового использования.

8. Установлено, что стереоселективность гидролиза рацемических нитрилов и амидов карбоновых кислот в гетерогенном процессе зависит от характеристик носителя, присутствующего в реакционной среде: 24часовая трансформация фенилглицинонитрила клетками P. fluorescens C2, адгезированными на носителе «Сапропель», приводила к накоплению в среде D-фенилглицина (ee=78%), на носителе Сибунит – L-фенилглицина (ee=96%). Определено, что наибольшую стереоселективность при гидролизе лактамида проявили поперечно-сшитые глутаровым альдегидом агрегаты амидазы, стабилизированные без носителя.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

НАК – нитрил акриловой кислоты (акрилонитрил) АА – акриламид АК – акриловая кислота 2-, 3-, 4-ЦП – 2-,3-,4-цианопиридин соответственно ПА – пиколинамид ПК – пиколиновая кислота НА – никотинамид НК – никотиновая кислота ИНА – изоникотинамид ИНК – изоникотиновая кислота ПАА – полиакриламид ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ГХ – газовая хроматография ОП – оптическая плотность АСБ – абсолютно сухая биомасса LB – среда Луриа-Бертани КВУ – каталитический волокнистый углерод МУНТ – многослойные углеродные нанотрубки АТФ – аденозинтрифосфорная кислота ДМСО – диметилсульфоксид ПСАФ – поперечно-сшитые агрегаты фермента CLEAs – cross-linked enzyme aggregates ее – энантиомерный избыток (enantiomeric excess)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Акрилонитрил / Russian Chemistry (Российская химическая энциклопедия) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.russianchemistry.ru/reagents/4146.

2. Активированный уголь, сорбенты – производство, применение, продажа.

Очистка воды, водоподготовка, очистка воздуха, фильтры, загрузки // Активированное нетканное полотно УВС "Карбопон-В-Актив" [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://carbo.e-stile.ru/uvs-polotno/.

3. Аликин, В.Н. Конверсия специальной технической химии. Пороха, топлива, заряды / В.Н. Аликин [и др.]. – Пермь: ПНЦ УрО РАН, 1999. – 176 с.

4. Биодеградация метилацетата и этилацетата иммобилизованными клетками Pseudomonas esterophilus / Н.В. Доронина, Н.М. Назаров, В.А. Ежов, Ю.А.

Троценко // Прикл. биохим. микробиол. – 2006. – Т. 42, № 1. – С. 52–54.

5. Биокатализаторы многофункционального назначения на основе ресурсного потенциала коллекции алканотрофов / И.Б. Ившина [и др.] // В кн.:

Инновационные биотехнологии в странах ЕвраАзЭС. – Минск: Беларуcкая навука, 2011. – С. 105–119.

6. Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 7: Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин [и др.]. – М.: Высшая школа, 1987. – 160 с.

7. Биссвангер, Х. Практическая энзимология / Х. Биссвангер // М.: БИНОМ.

Лаборатория знаний, 2010. – С. 96.

8. Боронин, А.М. Академик Георгий Константинович Скрябин / А.М. Боронин // Микробиология. – 1999. – Т. 68, № 6. – С. 809–815.

9. Варфоломеев, С.Д. Биокинетика: Практический курс / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. – М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. – 720 с.

10. Bлияние физико-химических свойств актинобактерий рода Rhodococcus на их адгезию к полистиролу и н-гексадекану / Е.В. Рубцова [и др.] // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 4. – С. 900–904.

11. Глубинное гетерофазное культивирование молочнокислых бактерий / Б.А.

Кареткин, Н.Г. Лойко, И.В. Шакир, В.И. Панфилов // Биотехнология. – 2013. – № 1. – С. 59–68.

12. Григорьева, Т.М. Зависимость уровня продукции гидролитических экзоферментов от способа культивирования бактерий Bacillus subtilis / Т.М.

Григорьева, В.М. Трехова, Р.Р. Азизбекян // Биотехнология. – 2010. – № 5. – С. 29–36.

13. Давиденко, Т.И. Угольные материалы – носители для иммобилизации ферментов и клеток микроорганизмов / Т.И. Давиденко. – Одесса: Изд-во ФХИ НАН Украины, 1995. – 36 с.

14. Дебабов, В.Г. Биокаталитический гидролиз нитрилов / В.Г. Дебабов, А.С.

Яненко // Обзорный журнал по химии. – 2011. – Т. 1, № 4. – С. 376–394.

15. Диксон, М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб // Пер. с англ. – М.: Мир. – 1966. – 816 с.

16. Ефременко, Е.Н. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты : дис. … д-ра биол. наук : 03.00.02, 03.00.23 / Ефременко Елена Николаевна. – М., 2009. – 433 с.

17. Ждан-Пушкина, С.М. Основы роста культур микроорганизмов. Учеб.

пособие / С.М. Ждан-Пушкина; под ред. В.П. Гончаровой. – Л.: Изд-во Ленингр. Ун-та, 1983. – 188 с.

18. Забазная, Е.Б. Отбор штаммов, трансформирующих акрилонитрил и акриламид в акриловую кислоту / Е.Б. Забазная, С.В. Козулин, С.П.

Воронин // Прикл. биох. микробиол. – 1998. – Т. 34, № 4. – С. 377–381.

19. Закономерности развития биопленки и особенности образования внеклеточных полимерных веществ штаммом Sphingomonas sp. / К.Г.

Ипполитов, А.С. Сироткин, С.А. Понкратова, М. Кюн // Биотехнология. – 2003. – № 3. – С. 3–11.

20. Земледелие от «А» до «Я». [Электронный ресурс]. – Режим доступа:

http://racechrono.ru/pochva-i-mikroorganizmy/3672-priroda-yavleniya-adgeziimikroorganizmov-chast-4.html.

21. Ившина, И.Б. Пропанокисляющие родококки / И.Б. Ившина, Р.А.

Пшеничнов, А.А. Оборин // УНЦ АН СССР: Свердловск, 1987. – 125 с.

–  –  –

23. Ильина, Т.С. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития / Т.С. Ильина, Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Генетика. – 2004. – Т. 40, № 11. – С. 1445–1456.

24. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов. – М.: Изд-во МГУ, 1994. – 288 с.

25. Исследование взаимодействия углеродных наноматериалов с клетками Escherichia coli методом атомно-силовой микроскопии / Д.Г.Дерябин [и др.] // Российские нанотехнологии. – 2010. – Т. 5, № 11–12. – С. 103–108.

26. Карнаухов, А.П. Адсорбция. Текстура дисперсных и пористых материалов / А.П. Карнаухов. – Новосибирск: Наука. Сибирское предприятие РАН, 1999.

– 470 с.

27. Каталитические свойства глюкоамилазы, иммобилизованной на углеродном носителе Сибуните / Г.А. Коваленко, Л.В. Перминова, Т.Г. Терентьева, Г.В.

Плаксин // Прикл. биохим. микробиол. – 2007. – Т. 43, № 4. – С. 412–418.

28. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous M8 / В.П. Вейко [и др.] // Биотехнология. – 1995. – № 5–6. – С. 3–5.

29. Коваленко, Г.А. Углеродминеральные носители для адсорбционной иммобилизации нерастущих бактериальных клеток / Г.А. Коваленко, Е.В.

Кузнецова, В.М. Ленская // Биотехнология. – 1998. – № 1. – С. 47–56.

30. Козлов, С.В. Биологическая характеристика бактериальных штаммов – активных продуцентов нитрилгидролизующих ферментов : дис. … канд.

биол. наук : 03.00.07 / Козлов Сергей Васильевич. – Пермь, 2007. – 139 с.

31. Кощеенко, К.А. Живые иммобилизованные клетки как биокатализаторы процессов трансформации и биосинтеза органических соединений / К.А.

Кощеенко // Прикл. биохим. микробиол. – 1981. – Т. 17, Вып. 4. – С. 477– 493.

32. Кудыкина, Ю.К. рН-Индуцируемое образование покоящихся форм микобактерий и роль аденилатциклазы в их реактивации : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.01.04 / Кудыкина Юлия Константиновна. – М., 2011. – 24 с.

33. Кузнецова, М.В. Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода

Rhodococcus – продуцентов нитрилгидратазы : дис. … канд. биол. наук :

03.00.07 / Кузнецова Марина Валентиновна. – Пермь, 2004. – 124 c.

34. Курдиш, И.К. Влияние глинистых минералов на рост фосфатмобилизующих бактерий Bacillus subtilis / И.К. Курдиш, З.Т. Бега // Прикл. биохим. микробиол. – 2006. – Т. 42, № 4. – С. 438–442.

35. Курдиш, И.К. Применение высокодисперсных материалов в технологии культивирования и получения гранулированных препаратов Agrobacterium radiobacter / И.К. Курдиш, Л.В. Титова // Прикл. биохим. микробиол. – 2001. – Т. 37, № 3. – С. 369–373.

36. Максимова, Ю.Г. Биотрансформация акрилонитрила иммобилизованными клетками актинобактерий рода Rhodococcus : дис. … канд. биол. наук :

03.00.07 / Максимова Юлия Геннадьевна. – Пермь, 2006. – 127 с.

37. Мартинек, К. Стабилизация ферментов – ключевой фактор при внедрении биокатализа в практику / К. Мартинек, И.В. Березин // Успехи химии. – 1980. – Т. XLIX, вып. 5. – С. 737–770.

38. Механизмы выживания бактерий / О.В. Бухарин, А.Л. Гинцбург, Ю.М.

Романова, Г.И. Эль-Регистан. – М.: Медицина, 2005. – 367 с.

39. Митяшина, С.Ю. Влияние окиси углерода на энергетический статус

Desulfovibrio desulfuricans B-1388 : автореф. дис. … канд. биол. наук :

03.00.07, 03.01.04 / Митяшина Светлана Юрьевна. – Казань, 1998. – 18 с.

40.Нагаев, В.В. Биологический метод регенерации активных углей / В.В.

Нагаев, А.С. Сироткин // Химия и технология воды. – 1998. – Т. 20, № 5. – С. 535–545.

41.Нестеренко, О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О.А.

Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. – Киев: Наукова думка, 1985. – 336 c.

42. Нетрусов, А.И. Микробиология: учебник для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, И.Б. Котова. – М.: Издательский центр «Академия», 2006. – 352 с.

43. Николаев, Ю.А. Биопленка – «город микробов» или аналог многоклеточного организма? / Ю.А. Николаев, В.К. Плакунов // Микробиология. – 2007. – Т. 76, № 2. – С. 149–163.

44. Николаев, Ю.А. Свойства адгезина и антиадгезина Pseudomonas fluorescens / Ю.А. Николаев, Дж.И. Проссер // Микробиология. – 2000. – Т. 69, № 2. – С. 237–242.

45. Никулин, С.М. Синтез многослойных углеродных нанотрубок и их применение в производстве композиционных материалов / С.М. Никулин, Д.А. Руденко // Перспективные материалы. – 2011. – №11. – С. 54–62.

46. Новая ациламидаза из TA37, способная Rhodococcus erythropolis гидролизовать N-замещенные амиды / К.В. Лавров, И.А. Залунин, Е.К.

Котлова, А.С. Яненко // Биохимия. – 2010. – Т. 75, вып. 8. – С. 1111–1119.

47. Ножевникова, А.Н. Использование микробного процесса анаэробного окисления аммония (анаммокс) для биотехнологической очистки стоков / А.Н. Ножевникова, М.В. Симанькова, Ю.В. Литти // Биотехнология. – 2011.

– № 5. – С. 8–31.

48. Олескин, А.В. Биосоциальность одноклеточных (на материале исследований прокариот) / А.В. Олескин // Журнал общей биологии. – 2009.

– Т. 70, № 3. – С. 225–238.

49. Олескин, А.В. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов / А.В. Олескин, И.В. Ботвинко, Е.А. Цавкелова // Микробиология. – 2000. – Т. 69, № 3. – С. 309–327.

50. Олонцев, В.Ф. Российские активные угли / В.Ф. Олонцев, Р.А. Безруков. – М.: Изд-во ГУ ВШЭ, 1999. – 90 с.

51. Определение биолюминесцентным методом минимальных ингибирующих концентраций веществ по отношению к бактериям, участвующим в биокоррозии / Е.Н. Ефременко [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. – 2005.

– Т. 41, № 4. – С. 429–434.

52. Паников, Н.С. Рост и адгезия Pseudomonas fluorescens в периодической культуре: кинетический анализ действия внеклеточных антиадгезинов / Н.С. Паников, Ю.А. Николаев // Микробиология. – 2002. – Т. 71, № 5. – С.

619–628.

53.Плакунов, В.К. Микробные биопленки: перспективы использования при очистке сточных вод / В.К. Плакунов, Ю.А. Николаев // Вода: химия и экология. – 2008. – № 2. – С. 11–13.

54.Плакунов, В.К. Основы динамической биохимии. Учебное пособие / В.К.

Плакунов, Ю.А. Николаев. – М.: Логос, 2010. – 213 с.

55. Потапов, В.М. Стереохимия / В.М. Потапов. – М.: Химия, 1988. 464 с.

56. Практическая химия белка / Ред. А.М. Дарбре. – М.: Мир, 1989. – С. 297– 298.

57. Приготовление и исследование алюмосиликатных носителей с синтезированным слоем каталитического волокнистого углерода. I. Синтез углеродных нановолокон на нанесенном Ni-катализаторе / Г.А. Коваленко [и др.] // Кинетика и катализ. – 2007. – Т. 48, № 5. – С. 800–807.

58. Приготовление и исследование алюмосиликатных носителей с синтезированным слоем каталитического волокнистого углерода. II. Синтез углеродных нановолокон на нанесенном Со-катализаторе / Г.А. Коваленко [и др.] // Кинетика и катализ. – 2007. – Т. 48, № 5. – С. 808–815.

59. Разработка и внедрение биокаталитического способа получения акриловой кислоты. I. Выделение штамма Alcaligenes denitrificans, трансформирующего акрилонитрил в акрилат аммония / С.В. Полтавская [и др.] // Биотехнология. – 2004. – № 1. – С. 62–70.

60. Разработка феноменологической модели кинетики бактериальной адсорбции на низкоэнергетических поверхностях / В.В. Федорович, С.В.

Калюжный, П. Ван дер Мирен, В. Верстрает // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2.

Химия. – 2002. – Т. 43, № 6. – С. 417–419.

61. Регуляция биосинтеза ферментов биодеградации нитрилов у Rhodococcus rhodochrous M0 / О.Б. Астаурова [и др.] // Биотехнология. – 1991. – N. 5. – С. 10–14.

62. Роль транспорта путресцина и калия в регуляции топологического состояния ДНК в процессе адаптации Escherichia coli к температурному стрессу / А.Г. Ткаченко, М.Р. Пшеничнов, О.Я. Салахетдинова, Л.Ю.

Нестерова // Микробиология. – 1998. – Т. 67, № 5. – С. 601–606.

63. Романова, Н.А. Сравнение методов экстракции внутриклеточного АТФ микроорганизмов различного типа для биолюминесцентного определения клеток микроорганизмов / Н.А. Романова, Л.Ю. Бровко, Н.Н. Угарова // Прикл. биохим. микробиол. – 1997. – Т. 33, № 3. – С. 344–349.

64. Рубцова, Е.В. Влияние условий культивирования на адгезивную активность родококков в отношении н-гексадекана / Е.В. Рубцова, М.С. Куюкина, И.Б.

Ившина // Прикл. биохим. микробиол. – 2012. – Т. 48, № 5. – С. 501–509.

65. Рымовская, М.В. Биосорбционная очистка сточной воды производства полимеров / М.В. Рымовская, Н.С. Ручай // Биотехнология. – 2008. – № 2. – С. 51–58.

66. Сироткин, А.С. Агрегация микроорганизмов: флокулы, биопленки, микробные гранулы / А.С. Сироткин, Г.И. Шагинурова, К.Г. Ипполитов. – Казань: Изд-во «Фэн» АН РТ, 2007. – 160 с.

67.Слабова, О.И. Иммобилизация олиготрофных бактерий на пористых носителях методом сорбции / О.И. Слабова, Д.И. Никитин // Микробиология. – 2005. – Т. 74, № 3. – С. 430–432.

68. Сорбция микроорганизмов крупнопористыми агарозными криогелями, содержащими привитые алифатические цепи разной длины / В.Г. Евтюгин [и др.] // Микробиология. – 2009. – Т. 78, № 5. – С. 667–673.

69. Сравнительный анализ штаммов, используемых в процессе получения акрилата аммония / С.А. Глинский [и др.] // Биотехнология. – 2010. – № 1. – С. 17–24.

70. Тихонова, Е.Б. Изменение пула АТФ в динамике периодического роста Rhodococcus minimus / Е.Б. Тихонова, И.Т. Ермакова, Е.Л. Головлев // Микробиология. – 1992. – Т. 61, вып. 4. – С. 591–597.

71. Ткаченко, А.Г. Молекулярные механизмы стрессорных ответов у микроорганизмов / А.Г. Ткаченко. – Екатеринбург: УрО РАН, 2012. – 268 с.

72. Ткаченко, А.Г. Роль энергетического статуса и транспорта путресцина в обеспечении гомеостаза внутриклеточного рН в процессе щелочных и кислотных шифтов у Escherichia coli / А.Г. Ткаченко, А.А. Чудинов, Т.Г.

Нагорских // Микробиология. – 1993. – Т. 62, Вып. 1. – С. 37–45.

73. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. – М.: Мир, 1983. – 213 с.

74. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов / Г.А.

Коваленко [и др.] // Биотехнология. – 2003. – № 4. – С. 52–62.

75. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов / Г.А.

Коваленко [и др.] // Биотехнология. – 2004. – № 6. – С. 34–45.

76. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов. 5.

Иммобилизация нерастущих клеток дрожжей и растущих клеток алканотрофных родококков / Г.А. Коваленко [и др.] // Биотехнология. – 2006. – № 1. – С. 76–83.

77. Халгаш, Я. Биокатализаторы в органическом синтезе / Я. Халгаш. – М.:

Мир, 1991. – 204 с.

78. Химик. Сайт о химии. [Электронный ресурс]. – Режим доступа:

http://www.xumuk.ru/encyklopedia/25.html.

79. Хитин и хитозан: природа, получение и применение / Под ред. A.P. de Abram. – Издано Российским Хитиновым Обществом, 2010. – 292 с.

80. Хитозан как перспективный носитель для иммобилизации липазы / Т.А.

Ковалева, А.С. Беленова, А.И. Сливкин, В.Л. Лапенко // Биотехнология. – 2010. – № 4. – С. 59–64.

81. Чеботарев, А.Ю. Стимулирующее влияние диоксида титана на рост бактерий / А.Ю. Чеботарев, И.К. Курдиш // Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2-6 июня 2008 г.). – С. 144–146.

82. Яхонтов, Л.М. Синтетические лекарственные средства / Л.М. Яхонтов, Р.Г.

Глушков // Под ред. А.Г. Натрадзе. – М.: Медицина, 1983. – 272 с.

83. 5-Cyanovaleramide production using immobilized Pseudomonas chlororaphis B23 / E.C. Hann [et al.] // Bioorg. Medicin. Chemistry. – V. 7. – 1999. – P.

2239–2245.

84.6-Aminopenicillanic acid production in stationary basket bioreactor with packed bed of immobilized penicillin amidase—Penicillin G mass transfer and consumption rate under internal diffusion limitation / D. Cacaval, M. Turnea, A.-I. Galaction, A.C. Blaga // Biochem. Eng. J. – 2012. – V. 69. – P. 113–122.

85. A comparison of the use of an ATP-based bioluminescent assay and image analysis for the assessment of bacterial adhesion to standard HEMA and biomimetic soft contact lenses / C.S. Andrews [et al.] // Biomaterials. – 2001. – V. 22. – P. 3225–3233.

86. A new enzymatic method of acrylamide production / Y. Asano [et al.] // Agric.

Biol. Chem. – 1982. – V. 46. – P. 1183–1189.

87.A new immobilization technique of whole cells and enzymes with colloidal silica and alginate / Y. Fukushima, K. Okamura, K. Imai, H. Motai // Biotechnol.

Bioeng. – 1988. – V. 32. – P. 584–594.

88.A new, mild cross-linking methodology to prepare cross-linked enzyme aggregates / C. Mateo [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 2004. – V. 86(3). – P.

273–276.

89.A novel honeycomb matrix for cell immobilization to enhance lactic acid production by Rhizopus oryzae / Z. Wang [et al.] // Biores. Technol. – 2010. – V. 101. – P. 5557–5564.

90. A novel thermostable nitrilase superfamily amidase from Geobacillus pallidus showing acyl transfer activity / H.S. Makhongela [et al.] // Appl. Microbiol.

Biotech. – 2007. – V. 75(4). – P. 801–811.

91. A novel thermostable nitrile hydratase / R.A. Pereira, D. Graham, F.A. Rainey // Extremophiles. – 1998. – V. 2. – P. 347–357.

92. A patch coating method for preparing biocatalytic films of Escherichia coli / O.K. Lyngberg [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 1999. – V. 62. – P. 44–55.

93. A propionitrile induced nitrilase of Rhodococcus sp. NDB 1165 and its application in nicotinic acid synthesis / S. Prasad [et al.] // World J. Microbiol. – Biotechnol. – 2007. – V. 23. – P. 345–353.

94. A proteomic approach to biofilm cell physiology / L. Coquet [et al.] // Methods in biotechnology: Immobilization of enzymes and cells. Ed. by J.M. Guisan.

Totowa, NJ: Humana Press Inc., 2006. – P. 403–414.

95. A standardized pre-treatment method of biofilm flocs for fluorescence microscopic characterization / O. Nosyk, E. ter Haseborg, U. Metzger, F.H.

Frimmel // J. Microbiol. Meth. – 2008. – V. 75. – P. 449–456.

96. An, Y.H. Handbook of bacterial adhesion: Principles, methods, and applications // Y.H. An, R.J. Friedman // Totowa, N.J.: Humana Press Inc., 2000. – 644 c.

97. An evaluation of the impact of multiwalled carbon nanotubes on soil microbial community structure and functioning / B. Shrestha [et al.] // J. Hazard. Mat. – 2013. – V. 261. – P. 188–197.



Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |

Похожие работы:

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«Кофиади Илья Андреевич ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ И ГЕНОДИАГНОСТИКА В БИОМЕДИЦИНЕ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ «03.03.03 – иммунология» диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва, 2013 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ 8 ВВЕДЕНИЕ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«ТРИФОНОВА Кристина Эдуардовна Особенности распределения штамма мезенхимальных стволовых клеток в условиях опухолевого роста после сингенной трансплантации мышам линии C57BL/6 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата...»

«ВУДС ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА Фармакогенетические аспекты антиангиогенной терапии экссудативной формы возрастной макулярной дегенерации» 14.01.07 – Глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Будзинская Мария Викторовна кандидат биологических наук Погода Татьяна Викторовна Москва – 2015...»

«МУХА (DIPTERA MUSCIDAE) КАК ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКА ДЛЯ ПТИЦ НА ВОСТОКЕ КАЗАХСТАНА 16.02.02 – кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук КОЖЕБАЕВ БОЛАТПЕК ЖАНАХМЕТОВИЧ Научный руководитель – доктор биологических наук профессор Ж.М. Исимбеков...»

«ЖЕСТКОВА ДАРЬЯ БОРИСОВНА СОСТАВ И СТРУКТУРА ТРАВЯНИСТОГО ПОКРОВА ПРИДОРОЖНЫХ ТЕРРИТОРИЙ АВТОМАГИСТРАЛЕЙ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА Специальность: 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Калинка Ольга Петровна ОЦЕНКА УЯЗВИМОСТИ АКВАТОРИИ КОЛЬСКОГО ЗАЛИВА И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЕГО БЕРЕГОВ ПРИ РАЗЛИВАХ НЕФТИ Специальность 25.00.28 – Океанология диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель кандидат технических наук Шавыкин Анатолий Александрович Мурманск, 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1....»

«Калинкин Дмитрий Евгеньевич ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ ГОРОДОВ В ЗОНЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРЕДПРИЯТИЙ АТОМНОЙ ИНДУСТРИИ 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание учной степени доктора медицинских наук Научный консультант: д-р мед. наук, профессор Тахауов Равиль Манихович Томск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Ксыкин Иван Валерьевич ВРЕДОНОСНОСТЬ СОРНЯКОВ И МЕРЫ БОРЬБЫ С НИМИ В ПОСЕВАХ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР НА СВЕТЛО-КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ВОЛГО-ДОНСКОГО МЕЖДУРЕЧЬЯ Специальность: 06.01.01 общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор...»

«ЗАУЗОЛКОВА Наталья Андреевна АГАРИКОИДНЫЕ И ГАСТЕРОИДНЫЕ БАЗИДИОМИЦЕТЫ ЛЕСОСТЕПНЫХ СООБЩЕСТВ МИНУСИНСКИХ КОТЛОВИН 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – кандидат биологических наук, И. А. Горбунова Абакан – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ... ГЛАВА 1....»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Приложения Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ПРИЛОЖЕНИЕ А...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«КОНОНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НОВЫХ СОРТОВ СТЕВИИ Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley ПРИ ВВЕДЕНИИ В КУЛЬТУРУ В ЦЕНТРАЛЬНОМ ПРЕДКАВКАЗЬЕ по специальности 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ГАБЫШЕВ Виктор Александрович ФИТОПЛАНКТОН КРУПНЫХ РЕК ЯКУТИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ТЕРРИТОРИЙ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ 03.02.10 – Гидробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант Доктор биологических наук Доцент Л.Г. Корнева Якутск 2015 Оглавление ВВЕДЕНИЕ Глава 1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 2. ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНА И ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Жабина Виктория Юрьевна Экспериментальная и производственная оценка элективных питательных сред и дезинфектантов при туберкулезе крупного рогатого скота 06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата...»

«Минаева Наталья Викторовна Отдаленные последствия высокодозной химиотерапии и аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами 14.01.21 – гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.