WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 10 |

«ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ...»

-- [ Страница 7 ] --

Определены константы термоинактивации иммобилизованной нитрилгидратазы и фермента в растворе (Таблица 26). Показано, что ковалентно иммобилизованная нитрилгидратаза более термостабильна, чем находящаяся в растворе (Рисунок 67). Наиболее вероятно, что увеличение термостабильности связано с тем, что ковалентная сшивка фермента с носителем предотвращает диссоциацию фермента на субъединицы, происходящую при повышении температуры, а также усиливает общую жесткость молекулы фермента, приводя к его стабилизации [205].

Таблица 28 – Каталитические свойства свободной и иммобилизованной нитрилгидратазы

–  –  –

Рисунок 66 – Зависимость активности (%) нитрилгидратазы от температуры: 1– иммобилизованная на активированном хитозане; 2 – в растворе. Количество белка в растворе – 0,5, иммобилизованного – 0,8–1,5 мг в 10 мл реакционной смеси.

100% – максимальная активность иммобилизованной и свободной нитрилгидратазы соответственно

–  –  –

Рисунок 67 – Термоинактивация (%) нитрилгидратазы при 40 (а), 50 (б) и 60С (в):

1 – иммобилизованной на активированном хитозане; 2 – в растворе. Количество белка в растворе – 0,3–0,7, иммобилизованного – 1,4–3,7 мг в 10 мл реакционной смеси. 100% – активность нитрилгидратазы при 22С

–  –  –

Показано, что нитрилгидратаза, иммобилизованная на хитозане, проявляет активность при более низких значениях рН, чем фермент в растворе, который инактивируется при рН4,0 (Рисунок 68).

Рисунок 68 – Зависимость активности (%) свободной и иммобилизованной нитрилгидратазы от рН: 1 – иммобилизованной на активированном хитозане; 2 – в растворе. 100% – максимальная активность иммобилизованной и свободной нитрилгидратазы соответственно Оптимум рН для нитрилгидратазы в растворе более узкий и находится в нейтральной области, тогда как ковалентно связанный фермент проявляет активность, близкую к максимальной, в более широком диапазоне рН – от 5,0 до 7,0. В щелочном диапазоне рН10,0 инактивируется и свободный, и иммобилизованный фермент. Подобный эффект влияния рН на активность иммобилизованной нитрилгидратазы можно объяснить природой носителя – хитозана. В данном случае рН в макроокружении фермента, где происходят измерения, отличается от рН микроокружения фермента, на которое оказывает воздействие носитель. Большое количество свободных аминогрупп в молекуле хитозана определяет его свойство связывать ионы водорода и приобретать избыточный положительный заряд [80, 258]. Т.к. поликатионы обычно отталкивают протоны, то вблизи фермента рН будет выше, чем в свободном растворе, следовательно, рН-диапазон работы фермента расширится в сторону более низких значений.

По данным научной литературы, рН оптимум работы нитрилгидратаз лежит в нейтральной или слабощелочной (7,7–7,8) области (Таблица 1). Оптимум рН активности нитрилгидратазы, иммобилизованной на DEAE-целлюлозе, был немного ниже, чем свободного фермента (6,5 против 7) [222], иммобилизованной на Eupergit®C оставался равным таковому фермента в растворе (рН 7) [158], а процент конверсии нитрила миндальной кислоты нитрилгидратазой, иммобилизованной на носителе ПВС/хитозан-глутаровый альдегид, был максимален при рН 8, что связано с особенностями конверсии этого субстрата [322]. Преимуществом полученного нами иммобилизованного препарата нитрилгидратазы, ковалентно сшитой с активированным хитозаном, явилась возможность работы фермента в широком диапазоне рН с расширением оптимума в кислую сторону, что не было отмечено у описанных в литературе иммобилизованных нитрилгидратаз.

Операционная стабильность нитрилгидратазы, иммобилизованной на активированном хитозане При проведении последовательных циклов конверсии акрилонитрила была выявлена высокая операционная стабильность иммобилизованной нитрилгидратазы (Рисунок 69). Во втором и нескольких последующих (до 6) циклах реакции было отмечено возрастание нитрилгидратазной активности в 18 раз по сравнению с первым циклом, затем постепенное снижение активности, которая в 50 цикле была в 3,5 раза выше, чем в первом. Стабильность иммобилизованного фермента при повторном многократном использовании можно объяснить жестким фиксированием его молекулы на носителе, предотвращающим диссоциацию гетеромера и потерю структуры субъединиц.

Вымывание фермента из носителя также не происходило благодаря ковалентным связям, образованным между его молекулой, бифункциональным реагентом и хитозаном.

Для объяснения эффекта возрастания нитрилгидратазной активности были проведены эксперименты по адсорбции продукта реакции – акриламида на активированном хитозане с иммобилизованным на нем белком. Определено, что из 1%-ного (вес/об.) раствора акриламида адсорбируется 25% вещества. Из этого можно сделать вывод, что повышение концентрации акриламида во втором цикле реакции в некоторой степени связано не с повышением активности, а со снижением величины адсорбции продукта за счет взаимодействия с амидом части реакционноспособных групп хитозана и активатора в предыдущем цикле. Т.к. для объяснения 18-кратного возрастания активности с 1 по 6 цикл этого недостаточно, можно высказать предположение, что дробное введение субстрата в реакционную среду вызывало адаптацию каталитического центра фермента к данному субстрату, приводя к увеличению скорости фермент-субстратных взаимодействий.

При многоцикловой конверсии акрилонитрила определено, что иммобилизованный ферментный препарат в количестве 1,4 мг (по белку) за 8,3 ч образует 60 ммоль акриламида. Иммобилизованная на активированном хитозане нитрилгидратаза проявила самую высокую операционную стабильность по сравнению с данными, представленными в научной литературе: при проведении 8 последовательных циклов конверсии 3-цианопиридина нитрилгидратаза, иммобилизованная на Eupergit®C, теряла 10% активности [158]; конверсия нитрила миндальной кислоты нитрилгидратазой, иммобилизованной на ПВС/хитозане с ковалентной сшивкой глутаровым альдегидом, составляла лишь 10% после 9 последовательных циклов реакции [322].

Из клеток P. fluorescens C2 был получен частично очищенный препарат нитрилазы, который иммобилизовали методом адсорбции на углеродном носителе «Сапропель». Была определена величина адсорбции нитрилазы на этом носителе.

Установлено, что величина адсорбции белка на «Сапропеле» возрастает с увеличением его концентрации в среде. Так, при исходной концентрации белка 0,55 мг/мл адсорбировалось 2,11 мг белка на 1 г носителя, а при 9 мг/мл – 16 мг/г соответственно. При этом концентрация белка в растворе выше 9 мг/мл приводила к резкому повышению величины адсорбции, что свидетельствует о процессах полислойной адсорбции молекул фермента при достижении данных концентраций (Рисунок 70). По своему типу изотерма адсорбции была близка к изотерме БЭТ (Брунауэра, Эммета, Теллера) [26, 79].

Величина адсорбции, мг/г Рисунок 70 – Зависимость величины адсорбции нитрилазы на «Сапропеле» от исходной концентрации белка. Время адсорбции 120 ч 16 Величина адсорбции, мг/г

–  –  –

Рисунок 71 – Изменение величины адсорбции нитрилазы на «Сапропеле» в зависимости от продолжительности адсорбции. Исходная концентрация белка 9 мг/мл Величина адсорбции фермента возрастала при увеличении времени контакта раствора белка с носителем. При исходной концентрации фермента 9 мг/мл величина адсорбции после 80 ч нарастала незначительно, а через 144 ч достигала наибольшего значения – 11,5 мг на 1 г адсорбента (Рисунок 71).

Каталитические параметры реакции трансформации акрилонитрила адсорбированной нитрилазой Изучена зависимость скорости реакции, катализируемой свободной и иммобилизованной нитрилазой, от концентрации субстрата в реакционной среде (Рисунок 72). Концентрации раствора НАК варьировали в диапазоне от 0,07 до 1,36 М. По графику Лайнуивера-Берка, построенному на основе полученных данных с использованием двойных обратных величин, были вычислены Vмакс. и КМ для растворенного фермента и адсорбированного на «Сапропеле», которые у свободной нитрилазы составили 4 мкмоль/мг/мин и 0,4 моль/л соответственно, у иммобилизованной – 0,4 мкмоль/мг/мин и 1,1 моль/л соответственно.

–  –  –

1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2

–  –  –

При проведении 40 мин трансформации 0,59 М раствора НАК при различной температуре (10–80С) максимальная активность нитрилазы в растворе была отмечена при 50С, а к 70С происходила полная инактивация фермента.

Активность фермента, иммобилизованного на «Сапропеле», достигала максимума при 60С, при этом нитрилаза сохраняла около 20% активности даже при 80С (Рисунок 73).

Нитрилазы так же, как нитрилгидратазы, имеют субъединичную структуру, но в отличие от последних представляют собой гомоолигомультимеры. Первым этапом инактивации также является диссоциация на субъединицы, которая увеличивается при повышении температуры. В этом случае адсорбция на нерастворимом носителе оказывает защитное действие на фермент, стабилизирует его структуру и позволяет ферменту функционировать при более высоких температурах.

0.8

–  –  –

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

–  –  –

Рисунок 73 – Влияние температуры на активность нитрилазы в растворе (1) и иммобилизованной на «Сапропеле» (2). 100% – максимальная активность иммобилизованной и свободной нитрилазы соответственно Нитрилазы – более термостабильные ферменты, чем нитрилгидратазы (Таблица 3). Нитрилазы из различных источников характеризуются широким диапазоном температурного оптимума активности, от 30С у R. erythropolis ZJBи R. rhodochrous NCIMB 11216 [218] до 65С у Acidovorax facilis 72W [347] и Bacillus pallidus Dac521 [105] и даже 80С у архей Pyrococcus abyssi GE5 [164]. Нитрилаза из P. fluorescens C2 даже в свободном состоянии имеет высокий температурный оптимум активности – 50С, который при адсорбции на углеродсодержащем носителе повышается еще на 10С, что делает иммобилизованный препарат перспективным для гидролиза нитрилов в широком диапазоне температур.

–  –  –

Рисунок 74 – Влияние рН на активность нитрилазы в растворе (1) и иммобилизованной на «Сапропеле» (2). 100% – максимальная активность иммобилизованной и свободной нитрилазы соответственно При изучении зависимости активности нитрилазы от рН реакционной среды отмечено, что нитрилаза в растворе при рН 3 была неактивна, а максимум активности наблюдался при рН 10. Нитрилаза, адсорбированная на «Сапропеле», сохраняла 15% активности при рН 3, а максимум активности приходился на рН 8.

В сильнощелочной реакционной среде при рН выше 12,5 активность и растворенной, и иммобилизованной нитрилазы была минимальной (Рисунок 74).

Сдвиг активности иммобилизованной нитрилазы в кислую сторону, возможно, связан с разницей рН микро- и макроокружения фермента. Можно выдвинуть предположение, что носитель «Сапропель», являющийся карбонизированными органическими иловыми осадками пресных озер, защелачивает микроокружение, в котором находится адсорбированный фермент, за счет присутствия ионов Na+, Mg2+, Ca2+ в составе носителя (Рисунок 19), в результате чего сдвиг рН макроокружения в кислую сторону не оказывает ингибирующего воздействия на нитрилазу.

Известные нитрилазы имеют различные рН-оптимумы активности (Таблица 3). Так, есть нитрилазы, для которых оптимальны нейтральные и слабощелочные среды, реже кислые (рН 5,5 для нитрилазы из R. rhodochrous K22 [341]) или щелочные (рН 9–9,2 для нитрилазы из P. fluorescens DSM 7155 [266], Pseudomonas sp. 13 [413] и Klebsiella ozaenae [378]). Нитрилаза P. fluorescens C2 в нейтральном, слабощелочном и кислом растворе проявляет лишь половину от максимальной активности, наблюдаемой при рН 10, тогда как активность иммобилизованного на «Сапропеле» фермента в диапазоне рН от 5 до 10 составляет не менее 60% от максимальных значений.

Операционная стабильность адсорбированной нитрилазы Проведены последовательные 24 часовые циклы конверсии 0,59 М раствора акрилонитрила нитрилазой, адсорбированной на «Сапропеле». К 4-му циклу сохранялось около 50% от первоначальной нитрилазной активности, в дальнейшем снижение активности происходило постепенно и к 16-му циклу сохранялось около 9% активности (Рисунок 75).

Таким образом, за 384 ч 2 мг адсорбированного фермента образует 307 мг акриловой кислоты. В научной литературе имеются сведения о возможности многократного использования поперечно-сшитых агрегатов нитрилазы.

Так, для CLEAs нитрилазы из Alcaligenes faecalis DSMZ 30030 продемонстрировано сохранение почти 90% активности после 5 циклов реакции [242]. Активность CLEAs нитрилазы из рекомбинантной Pseudomonas putida увеличивлась после первых циклов использования, достигая максимума к 5-му циклу, после чего начинала снижаться [175]. Сравнивая результаты с известными данными, можно заключить, что ковалентная сшивка, которая имеет место при образовании CLEAs, значительно стабилизирует фермент по сравнению с адсорбцией на нерастворимых носителях. Однако сохранение 20% первоначальной активности на протяжении 13 циклов 24-х часовой конверсии НАК нитрилазой, иммобилизованной на «Сапропеле», позволяет сделать вывод, что адсорбированный фермент также может долговременно функционировать.

Определено количество белка, связанного немодифицированным хитозаном и хитозаном, активированным 0,1% раствором бензохинона. Показано, что при возрастании концентрации белка в пробе до 18,5 мг/мл связывание белка достигает 55–60% от исходного количества. Установлено, что активация хитозана не приводила к возрастанию количества связанного белка (Рисунок 76). Повидимому, при связывании белка с неактивированным хитозаном имеет место адсорбция, столь же эффективная, как и ковалентная сшивка с активирующим веществом, когда многочисленные аминогруппы хитозана образуют водородные связи с карбоксильными группами белков.

Адсорбция, % 50 20 10 0

–  –  –

Рисунок 76 – Связывание ферментного препарата, содержащего нитрилазу, на неактивированном (1) и активированном (2) хитозане, 100% – концентрация белка в пробе Трансформация акрилонитрила нитрилазой, иммобилизованной на активированном и неактивированном хитозане Изучена активность иммобилизованного и неиммобилизованного препарата нитрилазы в реакции трансформации акрилонитрила. Показано, что при иммобилизации на хитозановых гранулах, как активированных, так и немодифицированных, наблюдается снижение нитрилазной активности (Таблица 29). Возможно, это связано с деформациями активного центра, происходящими при иммобилизации фермента. Кроме того, хитозановые гранулы адсорбируют продукт реакции – акриловую кислоту. В среднем, активированные гранулы адсорбируют 50–70, неактивированные – 40–65% акриловой кислоты. В результате того, что активность фермента оценивается по конечному продукту, истинная активность будет выше измеренной.

Таблица 29 – Нитрилазная активность иммобилизованных ферментных препаратов и фермента в растворе

–  –  –

0,07 21,0 5,6 13,0 0,15 13,7 6,8 22,0 0,29 24,0 9,4 42,5 Влияние температуры на активность нитрилазы, иммобилизованной на активированном и неактивированном хитозане Изучено влияние температуры на активность нитрилазы, связанной с хитозаном, и фермента в растворе. Показано, что как иммобилизованная нитрилаза, так и фермент в растворе имеет максимум активности при 60С (Рисунок 77). При температуре 70С наблюдается снижение активности, у неиммобилизованного фермента на 73%, у связанного с активированным и неактивированным хитозаном – на 36 и 60% соответственно. Ковалентная сшивка с активированным хитозаном обеспечивает бльшую стабильность фермента при воздействии высоких температур, предотвращая диссоциацию на субъединицы, тогда как адсорбция на неактивированном хитозане обеспечивает меньшую термостабильность фермента, чем ковалентная сшивка, но бльшую, чем в растворе.

Удельная активность, ммоль/г/ч

–  –  –

Рисунок 77 – Влияние температуры на активность нитрилазы в растворе (1) и фермента, иммобилизованного на активированном (2) и неактивированном (3) хитозане; 100% – максимальная активность для каждого биокатализатора

–  –  –

Оценивали операционную стабильность биокатализатора на основе иммобилизованной нитрилазы. Показано, что нитрилаза, ковалентно связанная с активированным хитозаном, более стабильна, чем адсорбированная на немодифицированном носителе (Рисунок 78).

В целом, за 312 ч работы биокатализатора, 2 мг ферментного препарата, иммобилизованного на активированном и неактивированном хитозане, при многоцикловой конверсии НАК образуют 136,5 и 37,5 мг акриловой кислоты соответственно. К 11-му циклу реакции активность иммобилизованной нитрилазы падает.

Сохранение активности, % 50

–  –  –

Рисунок 78 – Операционная стабильность нитрилазы, иммобилизованной на активированном (1) и неактивированном (2) хитозане Увеличение активности после первого цикла реакции было показано и для поперечно-сшитых агрегатов нитрилазы. Так, при повторном использовании CLEAs нитрилазы их активность в первых циклах реакции увеличивалась, достигая максимума к 5-му циклу, после чего начинала снижаться [175].

5.2. Гидролиз акриламида иммобилизованными ферментными препаратами, содержащими амидазу2 Получены препараты амидазы 4–1, Rhodococcus rhodochrous иммобилизованной методом ковалентной сшивки с хитозаном, физической адсорбции на углеродсодержащих носителях и методом поперечно-сшитых агрегатов фермента (ПСАФ) в отсутствии носителя. Проведен сравнительный анализ некоторых каталитических свойств свободной и иммобилизованной на активированном хитозане амидазы. Исследовано влияние методов иммобилизации на стереоселективные свойства амидазы в модельной реакции трансформации рацемического лактамида до D- и L-молочной кислоты.

Каталитические параметры реакции трансформации акриламида амидазой, ковалентно связанной с активированным хитозаном Показано, что при иммобилизации амидазы на активированном хитозане ее активность снижалась в 2 раза (Рисунок 79). При увеличении концентрации субстрата акриламида до 0,05 М наблюдалось линейное возрастание активности как иммобилизованного, так и свободного фермента, тогда как дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводило к линейному увеличению активности. Следовательно, данная концентрация субстрата для амидазы являлась насыщающей вне зависимости от связанного или свободного состояния фермента.

При сопоставлении полученных нами результатов с литературными данными можно сделать вывод о более высокой активности амидазы, ковалентно присоединенной к активированному бензохиноном хитозану, по сравнению с поперечно-сшитыми агрегатами амидазы, полученными высаливанием сульфатом 2

1. Экспериментальные работы, касающиеся иммобилизации амидазы и изучения ее каталитических и стереоселективных свойств, выполнены совместно с аспирантом ИЭГМ УрО РАН А.Н. Горбуновой и опубликованы в статье: Горбунова А.Н., Максимова Ю.Г., Овечкина Г.В., Максимов А.Ю. Каталитические и стереоселективные свойства иммобилизованной амидазы Rhodococcus rhodochrous 4–1 // Прикладная биохимия и микробиология. - 2015. – Т. 51, № 5. – С. 482–489.

аммония и поперечной сшивкой глутаровым альдегидом [321]. Так, в работе H.J.

Park с соавт., образованные таким способом агрегаты проявили активность по акриламиду, равную 0,73 ЕД/мл (при активности растворенной амидазы 2,75 ЕД/мл). Единица активности соответствовала количеству фермента, необходимому для образования 1 мкмоль NH3 в минуту, в 1 мл содержалось 10 мг амидазы. Следовательно, активность таких агрегатов составляла 0,073 мкмоль/мг/мин (сохранение 26,5% активности), тогда как в нашем случае максимальная активность составляла 1,29 мкмоль/мг/мин (сохранение 42% исходной активности).

Удельная активность, мкмоль/мг/мин 2 1

–  –  –

Рисунок 79 – Зависимость удельной активности амидазы в растворе (1) и иммобилизованной на активированном хитозане (2) от концентрации субстрата акриламида

–  –  –

трансформации акриламида находился в пределах 40–50С, для иммобилизованного – 45–55С (Рисунок 80). Показано, что при воздействии повышенной температуры иммобилизованный фермент более стабилен, чем находящийся в растворе (Таблица 30). Так, активность иммобилизованной амидазы при воздействии температуры 50°С в течение 30 мин повышалась по сравнению с измеренной при 25°С, а при экспозиции в течение часа при 60°С сохранялось около 90%, тогда как у фермента в растворе – всего 30% активности (Рисунок 81, а, б). Прогрев как свободного, так и иммобилизованного фермента при 70°С в течение 45 мин приводил к полной инактивации (Рисунок 81, в).

Следовательно, ковалентная сшивка амидазы с носителем приводит к стабилизации ее структуры, предотвращая диссоциацию на субъединицы при повышении температуры, что приводит к повышению термостабильности иммобилизованного фермента.

Таблица 30 – Термоинактивация свободной и иммобилизованной амидазы

–  –  –

Рисунок 81 – Термоинактивация (%) амидазы при 50 (а), 60 (б) и 70С (в): 1 – иммобилизованной на активированном хитозане; 2 – в растворе. 100% – активность амидазы при 25С Операционная стабильность амидазы, иммобилизованной на хитозане Изучена операционная стабильность амидазы, ковалентно присоединенной к активированному хитозану. При проведении последовательных циклов конверсии акриламида установлено, что иммобилизованный ферментный препарат сохраняет около 20% активности, измеренной в первом цикле, при 5кратной трансформации (Рисунок 82). За 144 ч при последовательной конверсии 0,05 М раствора акриламида 0,84 мг фермента катализировали синтез 32 мг акриловой кислоты.

Из работы H.J. Park с соавторами известно, что поперечно-сшитые агрегаты амидазы R. erythropolis сохраняют 96% активности после 3-х циклов конверсии изобутирамида [321]. Авторы ограничились тремя реакционными циклами, что может быть связано со сложностью многократного использования CLEAs.

Очевидно, что для многоцикловой конверсии предпочтительнее использовать фермент, иммобилизованный на нерастворимом носителе.

–  –  –

Стереоселективные свойства свободной и иммобилизованной амидазы R. rhodochrous 4-1 изучали в модельной реакции гидролиза рацемического лактамида до D- и L-изомеров молочной кислоты. Отмечено, что при ковалентной сшивке фермента с активированным хитозаном стереоселективность реакции снижается (Таблица 31). Так, соотношение D- и L- энантиомеров молочной кислоты в реакции, катализируемой ферментом в растворе, составило 89 и 11%, тогда как в реакции, катализируемой ковалентно присоединенной к хитозану амидазой – 59 и 41%.

Было изучено влияние адсорбционной иммобилизации на углеродсодержащих носителях на активность и стереоселективность амидазы.

Установлено, что при адсорбции амидаза сохраняет лишь 18% активности нативного фермента. Показано, что фермент, иммобилизованный на СУМС, гидролизовал лактамид до D- и L-молочной кислоты с соотношением энантиомеров 60 к 40%, тогда как фермент, адсорбированный на Сибуните, гидролизовал лактамид без стереоселективности (Таблица 31). С другой стороны, адсорбция амидазы на «Сапропеле» приводила к сдвигу соотношения стереоизомеров в сторону D-лактата. Можно предположить, что стереоселективность реакции снижается как за счет изменения скорости образования энантиомеров, так и в результате влияния гетерогенной среды, в частности, свойств носителей, на рацемизацию полученных продуктов реакции гидролиза лактамида. При контакте смеси D- и L-изомеров молочной кислоты в соотношении 4 : 1 с СУМС в течение 1 ч при 22С происходило превращение смеси в L-изомер, с Сибунитом – в D-изомер. Так как эти данные не согласуются с результатами трансформации рацемического лактамида амидазой, адсорбированной на этих носителях, можно заключить, что на процесс снижения энантиоселективности реакции влияет не только микроокружение фермента, создаваемое углеродным носителем, но и особенности образования ферментсубстратного комплекса у адсорбированной амидазы.

Были получены поперечно-сшитые агрегаты фермента (ПСАФ) при высаливании сульфатом аммония с одновременной сшивкой бифункциональными реагентами – глутаровым альдегидом и бензохиноном. Установлено, что при сшивании молекул амидазы бензохиноном сохраняется около 9% исходной активности фермента, глутаровым альдегидом – около 30% активности. Было показано, что иммобилизованная амидаза, полученная данным методом, проявляет более высокую D-стереоселективность, чем фермент в растворе. Так, биокатализатор, полученный сшивкой глутаровым альдегидом, катализировал гидролиз D,L-лактамида с энантиомерным избытком D-изомера до 94%.

Таблица 31 – Каталитические и стереоселективные свойства амидазы, иммобилизованной различными методами

–  –  –

Изучено влияние температуры на стереоселективные свойства ковалентно иммобилизованной и свободной амидазы. Было показано, что образование изомеров молочной кислоты происходит в диапазоне температур от 25 до 60°С, при этом максимальный энантиомерный избыток (ее), равный 29%, наблюдался у ковалентно присоединенной к хитозану амидазы при 60°С (Рисунок 83).

–  –  –

0.8 30 0.6 0.4 0.2

–  –  –

Рисунок 83 – Зависимость скорости реакции гидролиза рацемического лактамида и стереоселективности амидазы в растворе (а), иммобилизованной на активированном хитозане (б), ПСАФ амидазы, полученных сшивкой глутаровым альдегидом (в), от температуры: 1 – энантиомерный избыток (ee), %; 2 – активность, мкмоль/мг/мин Максимальный ее у ПСАФ амидазы, полученных сшивкой глутаровым альдегидом, достигал 77–78% при 40–60°С. У свободного фермента максимальный энантиомерный избыток наблюдался при 40°С. Сдвиг максимума энантиоселективности ковалентно сшитого фермента в сторону более высоких температур может объясняться стабилизацией определенной конформации амидазы, более предпочтительной для образования фермент-субстратного комплекса с D-изомером лактамида. Температура ниже 20°С и выше 60°С приводила к снижению энантиоселективности. Известно, что энантиоселективность является результатом разницы между свободной энергией активации энантиомеров, которая имеет энтальпический и энтропический компонент. В данном случае образование комплекса D-изомера с активным центром амидазы энтальпически выгодно, но энтропически не выгодно. Другим значимым параметром является температура рацемизации [242]. В данном случае нагрев реакционной смеси до 70°С приводил к резкому снижению энантиоселективности даже в случае ферментов, стабилизированных за счет ковалентной сшивки. По литературным данным, для ПСАФ нитрилазы, гидролизующих рацемический нитрил миндальной кислоты до (R)-миндальной кислоты, увеличение энантиоселективности наблюдалось при снижении температуры, что, тем не менее, сопровождалось нежелательным падением скорости реакции [242]. В данном случае, предпочтительность ковалентносшитой амидазы для стереоселективного гидролиза заключается в совпадении максимумов активности и энантиоселективности.

Таким образом, для проявления стереоселективности амидазы в гетерогенном катализе определяющим является присутствие носителя, который может привести к сдвигу в соотношении образующихся энантиомеров. В этом случае перспективным представляется метод иммобилизации без носителя, а именно образование ПСАФ, приводящий к стабилизации фермента за счет образующихся поперечных сшивок бифункциональными реагентами. Другим возможным решением может быть тщательный подбор носителя, который обеспечит увеличение энантиомерной чистоты образующегося продукта.

Анализируя результаты, касающиеся гетерогенного биокатализа нитрилов и амидов, осуществляемого иммобилизованными ферментами метаболизма нитрилов, следует отметить основные особенности, присущие биокатализаторам, иммобилизованным различными методами. Так, в подавляющем большинстве случаев, иммобилизация ферментов приводила к снижению активности, причем для различных методов и носителей степень этого снижения была различной.

Наибольшее снижение активности было отмечено при адсорбционной иммобилизации нитрилгидратазы на углеродсодержащих носителях, когда сохранение нитрилгидратазной активности не превышало 2% от исходной.

На оксидах алюминия без углерода сохранение активности было чуть большим – до 10%. Активность нитрилазы, адсорбированной на «Сапропеле», снижалась в 2 раза, а амидазы, иммобилизованной на углеродсодержащих носителях, – на 70– 80%. Потери активности ковалентно присоединенных к активированному хитозану ферментов были меньшими – до 40% у амидазы, до 50% у нитрилазы, в некоторых случаях у нитрилгидратазы отмечали сохранение активности (при учете связывания образующегося акриламида хитозаном). В этом случае можно заключить, что адсорбция, особенно на углеродсодержащих носителях, в большинстве изученных случаев менее благоприятна для сохранения активности, чем ковалентная сшивка с активированным хитозаном. Возможно, это связано с гидрофобностью углеродных носителей, которые частично разрушают гидратную оболочку ферментов, необходимую для работы активного центра [277, 377].

Другой немаловажной характеристикой иммобилизованных ферментов является их способность к многоцикловому функционированию, о чем свидетельствует операционная стабильность, оцененная по сохранению активности при периодической конверсии субстрата. У всех иммобилизованных препаратов ферментов гидролиза нитрилов отмечена возможность многократного использования. Операционная стабильность проявлялась в разной степени – адсорбированная на немодифицированных и углеродсодержащих оксидах алюминия нитрилгидратаза проявляла активность при работе в течение 5–6 циклов, нитрилаза на «Сапропеле» – до 16 циклов. Наибольшую операционную стабильность проявила нитрилгидратаза, ковалентно сшитая с активированным хитозаном – активность не ниже таковой, измеренной в первом цикле реакции, сохранялась на протяжении 50-ти последовательных циклов. У ковалентно сшитой амидазы и нитрилазы активность была отмечена на протяжении 6 и 10 циклов соответственно.

Общей чертой изученных иммобилизованных ферментов метаболизма нитрилов явилось увеличение их термостабильности и температурного оптимума активности. Возможность работы фермента при высоких температурах в большей степени обеспечивалась адсорбционной иммобилизацией, так, нитрилгидратаза на неорганических носителях была активна даже при 70С, тогда как у фермента, ковалентно присоединенного к активированному хитозану, при этой температуре активности не наблюдалось. Нитрилаза, адсорбированная на «Сапропеле», при 80С сохраняла 20% от максимальной активности. Термостабильность ковалентно сшитой амидазы и нитрилазы возрастала незначительно. Эффект возрастания устойчивости фермента к действию повышенных температур, по всей вероятности, связан с двумя факторами – стабилизацией субъединичной структуры ферментов как при адсорбции, так и при ковалентной сшивке, обеспечивающей уменьшение подвижности молекул, и защитным действием неорганических адсорбентов. За счет меньшей теплопроводности носителей по сравнению с водой, адсорбированный фермент находится в более выгодных условиях, чем находящийся в растворе или присоединенный к активированному органическому носителю, такому, как хитозан.

Изменение рН-профиля активности нитрилгидролизующих ферментов при их иммобилизации во многом зависит от природы носителя. Так, сдвиг максимума активности в кислую сторону и отсутствие ингибирования активности при кислых значениях рН, проявляющееся при иммобилизации на хитозане и «Сапропеле», по всей вероятности, связано с защелачивающим действием этих носителей. Так, в микроокружении фермента создается более щелочная среда, позволяющая ферменту функционировать даже при сильном закислении макроокружения.

Наибольшая стереоселективнось амидазы отмечена при ее иммобилизации методом ПСАФ (в отсутствии носителя), снижение энантиомерной чистоты получаемого продукта наблюдалось при низких (менее 40С) и высоких (более 60С) температурах, причем максимум стереоселективности совпадал с пиком активности.

Таким образом, впервые была показана перспективность иммобилизации нитрилгидратазы методом ковалентной сшивки с хитозаном, активированным 0,1% бензохиноном, заключающаяся, главным образом, в высокой операционной стабильности (не менее 50 циклов без снижения активности, измеренной в первом цикле) и устойчивости к низким рН, а также перспективность создания поперечно-сшитых агрегатов амидазы для повышения оптической чистоты продукта стереоселективного гидролиза рацемических амидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе сравнительного анализа трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот иммобилизованными биокатализаторами выявлены закономерности гетерогенного процесса, катализируемого адгезированными бактериальными клетками, обладающими высокой нитрилгидратазной, нитрилазной и выраженной амидазной активностью; биопленками нитрилгидролизующих бактерий, полученными в процессе культивирования с носителем, и иммобилизованным ферментным препаратом нитрилгидратазы, нитрилазы и амидазы.

Преимущества гетерогенного биокаталитического процесса над гомогенным отмечены достаточно давно: это стабилизация ферментативной активности, легкость отделения биокатализатора от среды, возможность создания непрерывных технологий. Но на настоящий момент остаются невыясненными ряд положений, а именно, в чем заключаются и с чем связаны физиологические изменения, протекающие в бактериальных клетках при их адгезии на твердом нерастворимом носителе; возможно ли управлять биотехнологическим процессом с помощью подбора носителя для иммобилизации клеток; как перейти от эмпирического трудозатратного подбора методов иммобилизации биокатализаторов и используемых носителей к научным основам создания гетерогенных биокатализаторов.

Основываясь на полученных в диссертационной работе результатах, составлена схема взаимодействия компонентов гетерогенного биокаталитического процесса (Рисунок 84): для адгезии бактериальных клеток предпочтительны макропористые носители с шероховатой поверхностью, совпадающие по степени гидрофобности с поверхностью клетки, для адсорбции ферментов метаболизма нитрилов – мезопористые материалы преимущественно с гидрофильной поверхностью; для конверсии алифатических субстратов – активированные адсорбенты, ароматических – неактивированные.

–  –  –

Рисунок 84 – Схема взаимодействия компонентов гетерогенного биокаталитического процесса, основанного на адгезированных бактериальных клетках и адсорбированных ферментах На основании результатов диссертационной работы был предложен алгоритм изучения свойств гетерогенного биокатализатора (Рисунок 85):

–  –  –

Алгоритм заключается в последовательном изучении ряда характеристик иммобилизованной биологической составляющей гетерогенного процесса. На первом этапе определяют, есть ли связывание фермента или адгезия клеток на нерастворимом носителе. Если количество связанного фермента (адгезированных клеток) достаточно – например, в процессе, рассмотренном нами, принимался минимум 1 мг АСБ адгезированных клеток на 1 г носителя для дальнейшего изучения, – следующим этапом являлось проведение ферментативной реакции с целью определения сохранения каталитической активности иммобилизованного биокатализатора. В процессе проведения ферментативной реакции проводили отбор проб через разные промежутки времени для изучения динамики трансформации. Так, при трансформации ароматических субстратов бактериальными клетками, адгезированными на активированных углеродных адсорбентах, наблюдали неэквимолярную конверсию вещества – при полном расходовании субстрата в реакционной среде продукт не был образован в равном количестве. В этом случае целесообразно определение адсорбции субстратов и продуктов реакции на носителе. На конечном этапе изучения следует определить операционную стабильность иммобилизованного биокатализатора – при возможности его многоциклового использования подтверждается эффективность полученного гетерогенного биокатализатора.

В диссертационной работе рассмотрено три типа гетерогенного биокатализатора: 1) бактериальные клетки, адгезированные на твердом нерастворимом носителе, в основном углеродном или углеродсодержащем (активные угли, углеродные волокна, композиционные материалы с синтезированным слоем углерода, углеродные нанотрубки и т.

д.); 2) бактериальные биопленки, выращенные на нерастворимом носителе; 3) изолированные ферменты, иммобилизованные методом адсорбции на неорганических носителях или ковалентной сшивкой с активированным органическим носителем.

Подавляющее большинство исследований, касающихся создания гетерогенного биокатализатора на основе клеток микроорганизмов, посвящено методу включения клеток в структуру гелей. Это справедливо и для изучения иммобилизованных клеток нитрилгидролизующих бактерий [83, 166, 181, 182, 229, 303, 328, 391]. Действительно, этот метод интересен эффективным «захватом» клеток матрицей геля, предотвращающим их вымывание в реакционную среду, а также возможностью создания различных технологически удобных форм биокатализатора. Однако, как подтверждают многочисленные исследования, основной проблемой такого биокатализатора становится затруднение массопереноса субстратов и продуктов в гранулах геля, что приводит к снижению активности иммобилизованных клеток и продуктивности биотехнологического процесса. Кроме того, снижение ферментативной активности может происходить в результате различных физико-химических воздействий при фазовых переходах золь/гель: так, жидкое состояние термотропных гелей, к которым относятся, например, агар, агароза и каррагинаны, достигается при повышенных температурах, что отрицательно сказывается на ферментативной активности; отвердение ионотропных гелей требует присутствия определенных ионов (кальция, бария, стронция) [406];

полимеризация ковалентносшитых гелей (ПАА) происходит в присутствии высоко реакционноспособных веществ и является экзотермической. В свою очередь, адгезия бактериальных клеток возвращает микроорганизм в естественное «прикрепленное» состояние и предполагает создание защитного микроокружения.

Ряд авторов подтверждает, что сорбционный метод иммобилизации микроорганизмов на различных носителях позволяет значительно повысить эффективность биокатализа и биодеградации, кроме того, он прост в реализации и не оказывает стрессовых воздействий на клетки [4]. Углеродные или углеродсодержащие адсорбенты были выбраны в качестве носителей неслучайно:

углерод может считаться одним из наиболее «биосовместимых» химических элементов, является основой органических веществ, химически инертен в нормальных условиях. Возможность применения углеродных адсорбентов для иммобилизации микробных клеток была описана в работах, связанных с биодеградацией загрязняющих веществ [40, 98, 127, 400]. Синтезу композиционных материалов с поверхностным слоем углерода и изучению их как носителей для иммобилизации клеток микроорганизмов посвящены работы Г.А.

Коваленко с соавторами [29, 57, 58, 151]. Для создания гетерогенного биокатализатора гидролиза нитрилов и амидов на основе нерастущих бактериальных клеток углеродные адсорбенты были применены впервые. Было проведено сравнение широкого ряда углеродных носителей для иммобилизации клеток: активные угли (БАУ, Norit PK 1-3, ФТД), уголь-сырец (порошкообразный, дробленый), волокнистые углеродные материалы (Карбопон, Карбопон-В-актив, Урал ТМ-4), углеродные материалы (на основе фуриловой смолы – ФАС, на основе карбонизированных илистых отложений пресных озер – «Сапропель», на основе графитизированной сажи – Сибунит), композиционные материалы (керамзит со слоем синтезированного слоя КВУ и графитоподобного углерода, стеклопена со слоем КВУ), массивный КВУ, пеноуглерод марки ТУМаН, многослойные углеродные нанотрубки. Как отражено в алгоритме исследования эффективности гетерогенного биокатализатора, на первом этапе оценивали адгезию бактериальных клеток на носителях и изучали зависимость массы адгезированных клеток от их концентрации в суспензии, используя полученные данные для построения изотерм адсорбции.

Объектами изучения являлись бактериальные штаммы, различающиеся строением и гидрофобногидрофильными характеристиками клеточной стенки: грамположительные Rhodococcus ruber gt1 и R. erythropolis 11-2 (поверхность которых, следуя BACHтесту, оценивалась как гидрофобная – 41–52% клеток переходило в фазу гексадекана), грамотрицательные Pseudomonas fluorescens C2 и Acinetobacter guillouiae 11h с гидрофильной поверхностью клетки (соответственно 6 и 5% клеток при распределении между фазами гексадекан/вода переходило в фазу гексадекана), Alcaligenes faecalis 2, поверхность клеток которых может быть оценена как слабо гидрофобная (18,5%). Следует отметить, что родококки адгезировались на всех изученных углеродных носителях, вне зависимости от степени их гидрофобности, оцененной по адсорбции нафталина. Так, на массивном КВУ, степень гидрофобности которого была равна 0, из бактериальной суспензии концентрацией 1 мг/мл адгезировалось 7 мг сухих клеток/г носителя, тогда как 8 мг клеток адгезировалось на носителе марки ФАС, гидрофобность которого составляла 55%. В то же время, корреляционный анализ показал умеренную положительную связь между гидрофобностью носителя и массой адгезированных клеток R. ruber gt1 (r=0,679; p=0,05). Была выявлена сильная положительная связь между гидрофобностью поверхности клеток различных штаммов родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus и их адгезией на гидрофобных углеродных материалах (БАУ, Norit PK 1-3, ФТД, ФАС): от r=0,884 до r=0,950 (p=0,05). Адгезия клеток P. fluorescens C2, поверхность которых оценивалась как гидрофильная, на неактивированных углеродных носителях была мала (менее 1 мг сухих клеток на г носителя), что затрудняло построение изотерм адсорбции. Лишь на активированных носителях (Карбопон-В-актив, БАУ) масса адгезированных клеток псевдомонад достигала 6 мг/г.

Адгезия микроорганизмов является комплексным процессом, в который вовлечены взаимодействия на уровне поверхности клетки. Первоначально адгезия бактерий к абиотическим поверхностям опосредована неспецифическими взаимодействиями. Адгезия зависит от таких факторов, как ионная сила и состав среды, рН, температура, время контакта и концентрация клеток, заряд поверхности, гидрофильность/гидрофобность, пористость, шероховатость и микротопография поверхности [118, 217, 297]. Сопоставляя собственные результаты по иммобилизации клеток R. ruber gt1 на различных углеродных материалах с накопленными сведениями о бактериальной адгезии, можно заключить, что на адгезию влияет не только гидрофобность носителя, а целый комплекс характеристик: дисперсность и наличие макропор, от которых зависит площадь удельной поверхности материала, тип поверхности носителя (шероховатая/гладкая), обеспечивающий оптимальный контакт с поверхностью бактерии, активация углеродного адсорбента. Однако корреляция между массой адгезированных клеток и дисперсностью материала была определена как слабая (r=0,220; p=0,05), а корреляционная связь между массой адгезированных клеток и шероховатостью поверхности носителя была недостоверной, что подтверждает превалирование гидрофобных взаимодействий при адгезии клеток на поверхности носителя. Известно, что наружная поверхность клеточной стенки родококков шероховатая, неровная, со множественными выступами и шишковидными выростами, содержащими адгезины, которые характеризуются повышенной степенью гидрофобности, что позволяет бактериальным клеткам легко преодолевать электростатическое отталкивание при сближении с носителем [10].

Интересно, что при адгезии родококков на активированном носителе БАУ изотермы адсорбции имеют вид изотерм БЭТ, что свидетельствует о переходе монослойной адсорбции в полислойную при достижении определенной концентрации клеток в суспензии, тогда как изотермы адсорбции бактериальных клеток на волокнистых углеродных и композиционных материалах с синтезированным углеродным слоем на поверхности, а также на носителях Сибунит и «Сапропель» имеют вид изотерм Лэнгмюра, что подтверждает формирование монослоя клеток на поверхности носителя.

Если взаимодействие бактериальной клетки, имеющей микрометровые размеры, с нерастворимым носителем происходит по принципу адгезии клетки на его поверхности, то, как и следовало ожидать, взаимодействие клетки с нанообъектами происходит по иному принципу. Сканирующая электронная микроскопия выявила агрегацию бактериальных клеток в присутствии нанотрубок. Показано, что агрегация позволяет беспрепятственно отделять биокатализатор от реакционной среды при использовании бумажных фильтров, через поры которых профильтровываются единичные клетки, находящиеся в суспензии. Впервые обоснована возможность создания гетерогенного биокатализатора на основе агрегатов бактериальных клеток с очищенными многослойными углеродными нанотрубками.

Изучение влияния углеродных нанотрубок на жизнеспособность бактерий, проведенное разными исследователями, дало противоречивые результаты. Так, некоторые авторы утверждают наличие у нанотрубок сильной антимикробной активности, выявленной как при воздействии на споры, так и на вегетативные клетки, которое заключается в локализованном нарушении клеточной стенки углеродными нанотрубками, действующими как «шприцы». Более того, ведется речь о новой технологии (CNT – carbon nanotube technology), обеспечивающей обеззараживание воды путем концентрирования патогенов и нарушения их жизнеспособности [103, 374]. S. Kang с соавторами одними из первых привлекли внимание к цитотоксическому действию одностенных нанотрубок в отношении бактериальных клеток [111, 374], в то же время в ряде работ подчеркивается антибактериальная активность многостенных углеродных нанотрубок [395, 418].

Следует отметить, что еще в пионерских исследованиях, посвященных биопленкам морских микроорганизмов, высказывались идеи об отрицательном влиянии на бактериальную клетку объектов, имеющих меньшие размеры [420]. С другой стороны, Д.Г. Дерябин с соавт. методом атомно-силовой микроскопии показали, что контакт многостенных и ряда одностенных углеродных нанотрубок с поверхностью E. coli не сопровождается изменением морфологии и жизнеспособности модельного организма [25]. Также интересен эффект воздействия нанотрубок на бактериальную популяцию в целом.

Экспериментальное внесение нанотрубок в почву в концентрации 1000 мг/кг привело к снижению количества представителей родов Derxia, Holophaga, Opitutus и Waddlia, тогда как количество бактерий, относящихся к родам Rhodococcus, Cellulomonas, Nocardioides и Pseudomonas, которые известны своей способностью деградировать трудноразлагаемые соединения, увеличилось [97].

Углеродные нанотрубки могут быть полезны для биоремедиации, при удалении поллютантов, особенно органики, которая не может быть легко сконцентрирована при использовании другого микропористого адсорбента. Эффективность удаления токсина цианобактерий посредством Ralstonia solanacearum, формирующей биопленки на нанотрубках, была на 20% выше, чем его удаление отдельно нанотрубками путем адсорбции или неиммобилизованными бактериями [189]. Биодеградация трихлорэтилена в грунтовых водах осуществлялась бактериями, иммобилизованными на нанотрубках, при этом поллютант вначале адсорбировался нанотрубками, а затем удалялся иммобилизованными бактериями [399]. Таким образом, углеродные нанотрубки рассматриваются как мультифункциональный адсорбент, хотя вопрос, касающийся их токсичности и биосовместимости, остается спорным [383].

Нами, в свою очередь, было подтверждено сохранение ферментативной активности агрегатов как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий при их взаимодействии с очищенными нанотрубками, тогда как агрегация клеток с неочищенными МУНТ приводила к значительному снижению активности, вероятно, вследствие отрицательного воздействия технологических примесей на физиологическое состояние клетки.

Определена эффективность функционирования иммобилизованной системы (), выраженная как отношение ферментативной активности адгезированных клеток к активности клеток в суспензии.

Показано, что в подавляющем большинстве случаев при конверсии алифатического субстрата адгезированными клетками R. ruber gt1, обладающими нитрилгидратазной активностью, была больше 1. Это означает, что активность иммобилизованных клеток не только сохранялась, но и увеличивалась по сравнению с интактными. По убыванию ряд носителей распределился следующим образом: «Сапропель» Сибунит Керамзит/КВУ (6.47% С) Керамзит/КВУ (3.63% С) уголь-сырец ФТД ФАС БАУ Norit PK 1-3 Карбопон КВУ массивный Урал ТМ-4 Карбопон-Вактив Керамзит/графитоподобный слой. Отмечено, что только для носителей Карбопон-В-актив, Керамзит/графитоподобный слой и шунгит была меньше 1.

В то же время, по операционной стабильности иммобилизованных биокатализаторов, определенной как количество последовательных циклов конверсии субстрата (n), в которых сохраняется не менее 50% активности, измеренной в первом цикле, ряд носителей распределился следующим образом:

Керамзит/КВУ (6,47% С) БАУ = Norit PK 1-3 = уголь-сырец ФТД = Урал ТМКарбопон = ФАС = КВУ массивный Керамзит/КВУ (3,63% С) КарбопонВ-актив «Сапропель» Сибунит = Керамзит/графитоподобный слой. Сравнивая эти два ряда, по сочетанию и n можно составить интегративный ряд от наиболее к наименее предпочтительному адсорбенту в данном процессе: Керамзит/КВУ (6,47% С) уголь-сырец БАУ ФТД Norit PK 1-3 «Сапропель»



Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 10 |

Похожие работы:

«МУХА (DIPTERA MUSCIDAE) КАК ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКА ДЛЯ ПТИЦ НА ВОСТОКЕ КАЗАХСТАНА 16.02.02 – кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук КОЖЕБАЕВ БОЛАТПЕК ЖАНАХМЕТОВИЧ Научный руководитель – доктор биологических наук профессор Ж.М. Исимбеков...»

«Злепкин Дмитрий Александрович Теоретическое и практическое обоснование повышения продуктивности свиней и птицы за счет улучшения биологической полноценности кормления 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный...»

«ЗАУЗОЛКОВА Наталья Андреевна АГАРИКОИДНЫЕ И ГАСТЕРОИДНЫЕ БАЗИДИОМИЦЕТЫ ЛЕСОСТЕПНЫХ СООБЩЕСТВ МИНУСИНСКИХ КОТЛОВИН 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – кандидат биологических наук, И. А. Горбунова Абакан – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ... ГЛАВА 1....»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Горовой Александр Иванович БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ И ШИШЕК PINUS KORAIENSIS (ПОЛУЧЕНИЕ, СОСТАВ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тагильцев Ю. Г. Хабаровск – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр Введение.. 4 Глава 1 Обзор...»

«ПОДОЛЬНИКОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО СТАТУСА МОЛОКА КОРОВ УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ (НА ПРИМЕРЕ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность: 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ доктор...»

«Кузнецова Татьяна Сергеевна ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РЕФРАКЦИОННОГО РЕГРЕССА ПОСЛЕ ЭКСИМЕР-ЛАЗЕРНОЙ КОРРЕКЦИИ БЛИЗОРУКОСТИ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ПРИ МЕХАНИЧЕСКОЙ И ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ ТЕХНОЛОГИЯХ ФОРМИРОВАНИЯ ЛОСКУТА РОГОВИЦЫ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1.Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1 Экологическая...»

«Борисов Станислав Юрьевич Морфологические изменения во внутренних органах крыс при воздействии нано-, микрои мезоразмерных частиц цеолитовых туфов 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«» Кравченко Виктор Михайлович Дирофиляриоз плотоядных в северо-западном регионе Кавказа (эпизоотическая ситуация, патогенез, патоморфологическая характеристика) 03.02.11 – паразитология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: Карташев Владимир Васильевич доктор медицинских наук,...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«ДЯТЛОВА ВАРВАРА ИВАНОВНА ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Специальность: 03.02.03 – микробиология. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Улановская Ирина Владимировна БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HEMEROCALLIS HYBRIDA HORT. КОЛЛЕКЦИИ НИКИТСКОГО БОТАНИЧЕСКОГО САДА 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор З.К. Клименко Ялта – 2015 СОДЕРЖАНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ 1. ИСТОРИЯ...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«ШАРАВИН Дмитрий Юрьевич IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А.И. Саралов Пермь – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СТР. ВВЕДЕНИЕ.. 4...»

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тугуз А.Р. Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений.. 3 Введение.. 5 Глава I....»

«УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических...»

«Дандал Али Шебли ПАТОГЕНИТЕЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.