WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 10 |

«ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ...»

-- [ Страница 6 ] --

Показано, что при адгезии на различных фракциях угля-сырца клеток P.

fluorescens C2, обладающих нитрилазой, и R. erythropolis 11-2 с амидазной активностью, существует обратная зависимость между массой адгезированных клеток и удельной активностью внутриклеточного фермента. Так, отмечена сильная отрицательная связь между этими показателями (R = –0,886; p = 0,02).

Подобной зависимости не наблюдается при адгезии клеток R. ruber gt1, нитрилгидратаза которых обладает активностью, на порядок и более превышающей нитрилазную и амидазную ферментативную активность.

При проведении стереоселективной трансформации амидов и нитрилов – гидролизе рацемического лактамида и фенилглицинонитрила, было показано, что присутствие носителя в реакционной среде может оказывать влияние на стереоизомерию продуктов, приводя либо к рацемизации смеси, либо к избытку одного из изомеров, которое меняется в зависимости от природы носителя и времени контакта гетерогенного биокатализатора с реакционной смесью. В этом случае экспериментальным путем может быть подобран носитель для иммобилизации клеток, который смещает энантиомерный избыток продукта в сторону желаемого изомера.

Таким образом, впервые, на примере R. ruber gt1, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью, была показана возможность увеличения удельной нитрилгидратазной активности бактериальных клеток при адгезии на углеродных материалах; концентрационная зависимость удельной нитрилазной и амидазной активностей и возможность их увеличения в разбавленных суспензиях и при невысоких концентрациях адгезированных клеток (на примере нитрилазосодержащего штамма P. fluorescens C2 и штамма R. erythropolis 11-2 с выраженной амидазной активностью); возрастание активности в первых циклах многократной конверсии субстрата адгезированными клетками; зависимость стереоселективности трансформации фенилглицинонитрила от носителя, используемого для адгезии клеток, и времени протекания ферментативной реакции.

ГЛАВА 4. БИОКАТАЛИЗ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ

КИСЛОТ БИОПЛЕНКАМИ НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Гетерогенный биокатализатор для осуществления процесса гидролиза нитрилов и амидов может быть получен в процессе культивирования клеток нитрилгидролизующих бактерий в присутствии нерастворимых материалов. В этом случае при культивировании можно получить два типа биокатализатора одновременно: суспендированный и гетерогенный, представляющий собой биопленку, выращенную на носителе. Известно, что клетки в биопленке защищены от вредных воздействий окружающей среды [23, 38, 43, 209], поэтому возникает предположение, что таким способом можно получить биокатализатор для долговременного использования, устойчивый к высоким концентрациям токсичных субстратов и продуктов ферментативной реакции.

В качестве носителей для образования биопленок нитрилгидролизующих бактерий были выбраны углеродные волокнистые материалы, такие как карбонизированная ткань Урал ТМ-4, нетканый волокнистый материал Карбопон, активированный нетканый материал Карбопон-В-актив и полиэтиленовая пленка.

4.1. Визуализация биопленок нитрилгидролизующих бактерий

Биопленки нитрилгидролизующих бактерий визуализировали с помощью световой фазово-контрастной и электронной сканирующей микроскопии. В световом фазово-контрастном микроскопе без дополнительной окраски были получены микрофотографии биопленок на полиэтиленовой пленке высокой плотности (Рисунок 46). Биопленки псевдомонад на полиэтилене представляют собой однородный слой клеток, равномерно покрывающий поверхность полимера, тогда как родококки образуют скопления, состоящие из удлиненных гифообразных клеток размером 7–10 мкм и клеток, поделившихся на мелкие короткие палочки, некоторые из которых близки по форме к коккам и имеют размер не более 1 мкм.

–  –  –

Рисунок 46 – Фазово-контрастное изображение неокрашенных биопленок R. ruber gt1 (а) и P. fluorescens C2 (б) на полиэтиленовой пленке. Увеличение

1000. Масштабная линейка соответствует 10 мкм.

Биопленки R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 на углеродных волокнистых носителях были изучены в электронном сканирующем микроскопе. Было показано, что биопленки псевдомонад имеют более выраженный полимерный матрикс, который в ряде случаев не позволяет визуализировать отдельные клетки (Рисунок 47). Биопленки как псевдомонад, так и родококков формируются на волокнах носителей, частично заполняя межволоконное пространство.

Отмечено, что на углеродных волокнах, особенно на активированном материале КарбопонВ-актив, P. fluorescens C2 образует наиболее мощную биопленку, а на ткани Урал ТМ-4 нарастает слой уплощенных клеток. R. ruber gt1 на волокнах последнего носителя, наоборот, представлен единичными клетками, в основном удлиненными, а на активированном Карбопоне наблюдаются неравномерно выросшие микроколонии. Наболее выраженно биопленка R. ruber gt1 формируется на неактивированном Карбопоне, на котором отмечено присутствие не только колоний клеток на отдельных волокнах, но и массивной биопленки в межволоконном пространстве, покрытой полимерным матриксом.

Рисунок 47 – Биопленки нитрилгидролизующих бактерий на углеродных волокнистых адсорбентах: а, б, в - P. fluorescens C2, г, д, е - R. ruber gt1; а, г – Карбопон, б, д – Урал ТМ–4, в, е – Карбопон–B–актив. 1 – клетки; 2 – волокна носителя

4.2. Динамика роста биопленок нитрилгидролизующих бактерий Количественное определение биопленкообразования вызывает определенные затруднения и необходимость поиска косвенных методов, т.к.

прямой высев клеток биопленки и определение количества колониеобразующих единиц затруднены из-за сложности механического отделения клеток от носителя и разрушения агрегатов клеток без нарушения их жизнеспособности. В некоторых случаях для этих целей используют ультразвук, что также требует подбора параметров озвучивания, при которых не нарушается целостность клеток, но в то же время, обеспечивается полная десорбция клеток с поверхности носителя.

Для оценки биопленкообразования часто используют метод окраски кристаллическим фиолетовым с последующей экстракцией красителя спиртом или уксусной кислотой [323]. Кристаллический фиолетовый – это основной краситель, который связывается с отрицательно заряженными молекулами поверхности клетки и полисахаридами внеклеточного полимерного матрикса. Т.к.

этот краситель окрашивает как живые, так и мертвые клетки, и внеклеточный матрикс, этот метод не позволяет оценить количество жизнеспособных клеток, а дает представление лишь о массивности биопленки в целом [323].

Для оценки динамики роста нитрилгидролизующих бактерий было использовано два метода: определение общей биомассы биопленки при окрашивании кристаллическим фиолетовым и определение общего количества АТФ биопленки. Второй способ позволяет оценить метаболическую активность и жизнеспособность клеток, а сравнение этих методов может показать корреляцию показателей, отражающих биомассу и жизнеспособность.

Определение концентрации АТФ биолюминесцентным методом основано на реакции окисления D-люциферина люциферазой светляков, которое происходит в присутствии АТФ и сопровождается пропорциональным по интенсивности выделением света [51, 63]. Определение внутриклеточного пула АТФ таким способом нацелено, главным образом, на подсчет количества жизнеспособных клеток и основывается на том факте, что средняя величина удельной концентрации АТФ в расчете на одну клетку определенного типа постоянна [110, 134]. Определение численности клеток биолюминесцентным методом особенно актуально, если клетки находятся в прикрепленном состоянии или растут в виде биопленки [85, 102]. Методика определения содержания АТФ в иммобилизованных клетках была разработана Е.Н. Ефременко [16], адаптирована нами к определению энергетического статуса адгезированных клеток и клеток биопленок.

экстрагированного красителя, Оптическая плотность

–  –  –

1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2

–  –  –

Рисунок 48 – Динамика роста биопленок R. ruber gt1 (1) и P. fluorescens C2 (2), оцененная по изменению оптической плотности экстрагированного красителя кристаллического фиолетового При посуточной окраске биопленок R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 и измерении оптической плотности экстрагированного красителя было показано, что максимальная биомасса биопленки P. fluorescens C2 достигается уже через сутки роста, тогда как R. ruber gt1 – на четвертые сутки (Рисунок 48). Через сутки роста количество биомассы биопленки P. fluorescens C2 постепенно снижается, но полного разрушения биопленки к 7-м суткам роста не наблюдается.

Динамика роста биопленок нитрилутилизирующих бактерий оценивалась также по изменению общего количества АТФ, экстрагированного из биопленок (Рисунок 49). При использовании этого метода наблюдалось сходство кривой роста с таковой, полученной предыдущим методом. Так, максимальное количество АТФ экстрагировалось из суточных биопленок P. fluorescens C2 и трехсуточных биопленок R. ruber gt1. К 7-м суткам количество АТФ в биопленках C2 снижалось более значимо, чем оптическая плотность P. fluorescens экстрагированного раствора красителя. Следовательно, к 7-м суткам количество жизнеспособных клеток P. fluorescens C2 снижается, тогда как общая биомасса биопленки, слагаемая из живых, неживых клеток и полимерного матрикса, остается почти неизменной. В этом случае оценка динамики роста биопленок по определению общего количества АТФ более адекватно отражает количество жизнеспособных клеток.

Концентрация АТФ, пикоМ/лунку

–  –  –

Рисунок 49 – Динамика роста биопленок R. ruber gt1 (1) и P. fluorescens C2 (2), оцененная по изменению содержания общего АТФ биопленки Отмечена положительная корреляционная зависимость при сравнении массивности биопленки в целом и жизнеспособности клеток биопленки, лежащих в основе двух методов оценки динамики роста биопленок. Так, при посуточном определении оптической плотности экстрагированного красителя кристаллического фиолетового и концентрации внутриклеточного АТФ у R. ruber gt1 отмечается умеренная корреляция при сравнении этих параметров (r=0,513; p=0,05). У P. fluorescens C2 при распределении величин, отличном от нормального, отмечается достоверно высокая корреляция между этими значениями (R=0,821; p=0,02). Следовательно, несмотря на то, что значения, полученные методом окраски кристаллическим фиолетовым, отражают массивность биопленки в целом, без учета жизнеспособных клеток и полимерного матрикса, завышающего показания, между величинами, определяющими биопленкообразование, и содержанием внутриклеточной АТФ наблюдается корреляция от умеренной до высокой, что дает возможность остановиться на одном из вышеперечисленных способов учета динамики роста биопленки в зависимости от поставленных задач.

4.3. Влияние адгезии нитрилгидролизующих бактерий на содержание внутриклеточного АТФ Адгезия микробных клеток к абиотической или биотической поверхностям инициирует образование биопленки. Важным моментом в формировании биопленок являются изменения в метаболизме бактерий в процессе их перехода от планктонного образа жизни к прикрепленному [23]. Понимание этого вопроса связано с углубленным изучением физиологии мутантов бактерий, у которых нарушен процесс инициации и развития биопленок, микроскопическим наблюдением, анализом мРНК и протеомным анализом [209, 239]. Известно, что индикатором энергетического статуса клеток является их аденилатный пул.

Однако работы, посвященные определению содержания АТФ в клетках биопленок, немногочисленны. В работе S.L. Kinniment и J.W.T. Wimpenny определено содержание АТФ, АДФ и АМФ в срезах биопленки Pseudomonas aeruginosa в двух временных точках – 55 и 105 ч роста, соответствующих «квазистационарной» фазе [244]. Вместе с тем, в научной литературе не было обнаружено сведений об исследовании влияния стадии инициации развития биопленки – необратимой адгезии клеток – на содержание внутриклеточной АТФ.

Методика определения количества клеток микроорганизмов по концентрации АТФ не является абсолютно точной, т.к. количество АТФ в жизнеспособной клетке варьирует в зависимости от физиологического состояния и фазы роста. Изменение концентрации АТФ в клетке, как возрастание в результате разобщения энергетического и конструктивного обмена, так и падение, свидетельствует о стрессовом состоянии микробной клетки [62, 72]. Поэтому данная методика может быть также применима к обратной задаче, а именно к определению энергетического состояния прикрепленной клетки при известном количестве клеток в образце.

Чтобы оценить влияние адгезии клеток на содержание в них АТФ, клетки R.

ruber gt1 и P. fluorescens C2 были выращены в суспензии до стационарной фазы и инкубированы с углеродсодержащими носителями. Показано, что концентрация АТФ в клетках после адгезии в подавляющем большинстве случаев снижается на порядок и более (Таблица 24).

Чтобы определить, отражает ли подобное снижение физиологическое состояние клеток изученных штаммов бактерий, или является результатом присутствия адсорбентов в образце, был проведен эксперимент по адсорбции АТФ на тех же углеродных материалах. Действительно, на носителях, взятых в том же количестве, как и в опытных образцах, из 1,95 нМ раствора АТФ на Урал ТМ-4 адсорбировалось 5,5, на БАУ – 58,3, Сибуните – 20,5, «Сапропеле» – 32,0%.

Данные, представленные в таблице, содержат поправку на адсорбцию АТФ.

Известно, что в адгезии клеток бактерий большую роль играют гидрофобные взаимодействия. Углеродсодержащие носители, использованные для адгезии, гидрофобны, и на них эффективнее адсорбируются клетки, клеточная стенка которых также обладает гидрофобностью. При старении клеток бактерий происходят значительные изменения физиолого-биохимического статуса, проявляющиеся в изменении свойств клеточной поверхности, в частности, ее гидрофильно-гидрофобных характеристик, причем мертвые и гипометаболические клетки имеют очень высокие показатели сорбции на гидрофобизированных носителях [68]. Можно предположить, что заметное снижение количества АТФ в расчете на клетку связано с тем, что сорбируются в первую очередь мертвые клетки за счет повышенной гидрофобности их клеточной стенки. Для того чтобы определить, жизнеспособны ли адгезированные клетки, образцы носителей с клетками переносили в свежую питательную среду и извлекали через 2, 24 и 48 ч. Показано, что содержание АТФ на клетку через 2 ч снижалось даже по сравнению с концентрацией АТФ в клетках сразу после адгезии (Рисунок 50). Но к 24 и 48 ч роста в свежей питательной среде этот показатель начинал возрастать, что говорит о возможном нарастании биомассы на носителях, подтверждающем жизнеспособность адгезированных клеток.

Определено, что клетки R. ruber gt1, находящиеся в логарифмической фазе роста, содержали 2,300±0,077, а P. fluorescens C2 – 3,950±0,452 нМ/мг АТФ. При адгезии клеток, находящихся в логарифмической фазе роста, также наблюдается падение концентрации внутриклеточного АТФ. Так, при адгезии клеток P. fluorescens C2 на Сибуните, содержание АТФ снижалось до 0,025±0,002 нМ/мг.

В фазе активного роста гипометаболические и мертвые клетки практически не содержатся, что также подтверждает предположение, что снижение концентрации АТФ не связано с адсорбцией нежизнеспособных клеток.

Таблица 24 – Влияние адгезии на углеродсодержащих носителях на концентрацию АТФ в клетках R. ruber gt1 и P.

fluorescens C2

–  –  –

«Сапропель» 2–3 4–5 1,071 ± 0,484 0,002 ± 0,001 0,144 ± 0,018 0,006 ± 0,004 Примечание: *Носитель марки Урал ТМ-4 является тканым материалом, состоящим из волокон, вместо диаметра макропор представлено межволоконное пространство (мкм). **У носителя марки Сибунит макропоры отсутствуют, в таблице представлен диаметр мезопор.

–  –  –

Концентрация АТФ в

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1

–  –  –

Рисунок 50 – Изменение концентрации АТФ в клетках R. ruber gt1 (а) и P. fluorescens C2 (б) в результате адгезии на БАУ и после переноса адгезированных клеток в свежую питательную среду: 1 – суспендированные клетки, 2 – клетки сразу после адгезии Основываясь на полученных нами данных, можно заключить, что при адгезии клеток на изученных сорбентах уровни уменьшения концентрации внутриклеточного АТФ различны. Так, более значительное снижение пула АТФ в клетке отмечено при адгезии на носителе «Сапропель» – на порядок для клеток P. fluorescens C2 и на два порядка для клеток R. ruber gt1. В то же время при адгезии клеток P. fluorescens C2 на волокнистом углеродном материале Урал ТМсодержание АТФ в клетке снижается незначительно, а при адгезии клеток R.

ruber gt1 – на порядок. Показано, что на уровень снижения содержания АТФ в клетке при адгезии влияют и природа субстрата, и вид микроорганизма. Носитель «Сапропель» гораздо более сложен по элементному составу, так как по своей природе является карбонизированным илистым отложением. В его составе обнаружены Si, O, Mg, Al, Ca, S, Fe (Рисунок 20). Тканый материал Урал ТМ-4 – карбонизированное вискозное волокно, не содержащее побочных примесей, основным химическим элементом которого является углерод (Рисунок 19).

Выделение в среду различных ионов носителем «Сапропель», вероятно, влияет на адгезированные клетки и их физиологическое состояние, а размер частиц и диаметр макропор носителей влияют скорее на величину адсорбции, а не на энергетическое состояние адгезированных клеток, так как четкой зависимости содержания внутриклеточного АТФ от этих параметров выявлено не было (Таблица 24).

4.4. Трансформация алифатических нитрилов биопленками нитрилгидролизующих бактерий Изучена трансформация акрилонитрила биопленками нитрилгидролизующих бактерий, выращенными на углеродсодержащих материалах и полиэтилене.

При конверсии алифатического субстрата – акрилонитрила только суммарная продукция акриламида планктоном и биопленкой R. ruber gt1, выращенной на полиэтилене, достигала суммарной продуктивности контрольной суспензии. При этом вклад биопленки в суммарную продуктивность был наибольшим при использовании в качестве носителя полиэтилена и наименьшим при использовании Карбопон-В-актив (Рисунок 51).

–  –  –

Рисунок 51 – Образование акриламида и акриловой кислоты планктонными клетками и биопленками R. ruber gt1 (а) и P. fluorescens C2 (б) при конверсии 1,3 М раствора акрилонитрила

–  –  –

Рисунок 52 – Образование никотинамида и никотиновой кислоты планктонными клетками и биопленками R. ruber gt1 (а) и P. fluorescens C2 (б) при конверсии 200 мМ раствора 3-цианопиридина Показано, что выращенные в процессе культивирования с носителем Урал ТМ-4 биопленка и планктон R. ruber gt1 суммарно продуцируют больше никотинамида при конверсии 200 мМ раствора 3-цианопиридина, чем контрольная суспензия, выращенная без носителей (Рисунок 52, а). При трансформации 3-цианопиридина биопленкой, выращенной на активированном носителе Карбопон-В-актив, образуется меньше никотинамида, что сказывается на суммарной конверсии субстрата. Возможным объяснением этого может быть природа самого носителя – на активированном материале сорбируется и субстрат, и продукт ферментативной реакции, что приводит к снижению концентрации продукта в реакционной среде.

При трансформации 3-цианопиридина планктоном и биопленкой P.

fluorescens С2 наибольший выход никотиновой кислоты наблюдается при использовании в качестве носителя полиэтилена, наименьший – при выращивании клеток на носителе Карбопон-В-актив (Рисунок 52, б).

Показано, что акрилонитрил гидролизуется биопленкой менее эффективно, чем ароматический нитрил. При конверсии акрилонитрила биопленкой и планктоном суммарный выход акриловой кислоты не достигает такового, полученного при конверсии контрольной суспензией. Возможно, к такому явлению приводит сочетание природы субстрата и особенностей биопленкообразования этого вида бактерий. Так, P. fluorescens С2 при росте в виде биопленки образует большое количество внеклеточного полимерного матрикса, который затрудняет проникновение субстрата к клеткам. Можно предположить, что более гидрофобный ароматический субстрат в этом случае может лучше проникать через полимерный матрикс, чем алифатический.

Сравнивали продуктивность биопленок, выращенных на различных носителях, при трансформации НАК и 3-цианопиридина. Показано, что наибольшее количество продукта (АК, НК, АА, НА) синтезируют биопленки P.

fluorescens C2 и R. ruber gt1, выращенные на полиэтилене (Таблица 25). Также от этих значений достоверно не отличается продуктивность выращенных на носителе Урал ТМ-4 биопленок P. fluorescens C2 при синтезе АК и биопленок R.

ruber gt1 при синтезе НА. Минимальные количества продукта получены при использовании в качестве биокатализатора биопленок нитрилгидролизующих бактерий, выращенных на носителе Карбопон-В-актив, что, возможно, связано с его адсорбцией на этом активированном носителе.

Таблица 25 – Образование продуктов трансформации акрилонитрила и 3цианопиридина биопленками нитрилгидролизующих бактерий, выращенными на носителях P. fluorescens C2 R. ruber gt1

–  –  –

Изучено влияние акрилонитрила (НАК), акриламида (АА) и акриловой кислоты (АК) на клетки четырехсуточной культуры R. ruber gt1 и P. fluorescens C2, находящиеся в суспензии и в биопленке. Показано, что при 20-минутном воздействии 1,7 М раствора АА на планктонные клетки R. ruber gt1 происходит падение содержания АТФ в клетках более чем в половину от контроля, тогда как концентрация АТФ в клетках биопленки достоверно возрастает (Рисунок 53).

Раствор НАК в концентрации 1,3 М не приводит к достоверному снижению содержания АТФ в клетках планктона, тогда как в клетках биопленки оно значительно (более чем в 2 раза) возрастает. Падение содержания АТФ в планктонных клетках при воздействии высоких концентраций АА может быть связано со снижением их жизнеспособности, тогда как возрастание в клетках биопленки может свидетельствовать о большей адаптивной способности, которая проявляется в стрессовом состоянии. При воздействии НАК на клетки следует учитывать, что одновременно начинается его гидролиз, сопровождающийся накоплением АА, таким образом, воздействие становится многофакторным, включающим влияние токсичного субстрата и продукта.

–  –  –

Рисунок 53 – Влияние 20-минутного воздействия 1,7 М раствора акриламида (АА) и 1,3 М раствора акрилонитрила (НАК) на содержание АТФ в клетках планктона и биопленки R. ruber gt1 При воздействии 1,3 М раствора АК происходит резкое падение концентрации АТФ как в клетках планктона, так и в клетках биопленки P. fluorescens C2, вероятно, связанное с закислением среды, которое приводит к гибели клеток (Рисунок 54). НАК в концентрации 1,3 М приводит к 50%-му снижению содержания АТФ в планктонных клетках, тогда как в клетках биопленки оно не изменяется по сравнению с контролем. Следовательно, физиологическое состояние клеток биопленок нитрилгидролизующих бактерий существенно отличается от планктонного состояния. Биопленки как R. ruber gt1, так и P. fluorescens C2 более устойчивы к воздействию высоких концентраций токсичных субстратов и продуктов и обладают большими адаптивными способностями, чем планктонные клетки.

–  –  –

НАК 1,3 М АК 1,3 М

–  –  –

Рисунок 54 – Влияние 20-минутного воздействия 1,3 М раствора акриловой кислоты (АК) и 1,3 М раствора акрилонитрила (НАК) на содержание АТФ в клетках планктона и биопленки P. fluorescens C2 Для качественной оценки жизнеспособности клеток биопленки и суспендированных клеток нитрилгидролизующих бактерий после воздействия токсичных субстратов и продуктов трансформации нитрилов, выращенные на предметном стекле биопленки и препараты суспензии окрашивали красителем LIVE/DEAD® и просматривали в световой микроскоп с флюоресценцией (Рисунок 55, 56). Следует отметить, что четырехсуточная суспензия P. fluorescens C2 уже содержала значительное количество нежизнеспособных клеток, что, скорее всего, связано с особенностями роста этого микроорганизма. Воздействие 1,3 М раствора НАК приводило к потере жизнеспособности и лизису клеток суспензии, что следует из наблюдаемой картины при окраске флюоресцентной меткой. В то же время клетки биопленки остаются практически полностью жизнеспособными, что коррелирует с данными АТФ-метрии.

Воздействие АК, связанное не только с высокой токсичностью этого соединения, но и с закислением среды до низких значений рН, приводит к лизису большей части клеток суспензии, а отдельные клетки, сохранившие четкие очертания, судя по окраске, имеют нарушенную мембрану. Клетки биопленки, наоборот, большей частью сохраняются, но имеют промежуточную окраску, что не дает возможности делать однозначные выводы об их потенциальной жизнеспособности. Данные АТФ-метрии говорят о потере жизнеспособности не только суспендированных клеток, но и клеток биопленки, либо о стрессовом состоянии последних, сопровождающимся резким снижением внутриклеточного пула АТФ.

Воздействие Воздействие Воздействие Контроль 1,3 М АК 1,7 М АА 1,3 М НАК Суспензия P. fluorescens C2

Биопленка P. fluorescens C2

Рисунок 55 – Влияние 20-минутного воздействия 1,3 М растворов НАК и АК и 1,7 М раствора АА на жизнеспособность клеток P. fluorescens C2 в суспензии и биопленке, оцененное с помощью флюоресцирующей метки LIVE/DEAD®:

зеленое окрашивание – жизнеспособные клетки с неповрежденной мембраной, красное окрашивание – нежизнеспособные клетки с поврежденной мембраной Суспензия R. ruber gt1 Биопленка R. ruber gt1 Контроль Воздействие 1,3 М НАК Воздействие 1,7 М АА Рисунок 56 – Влияние 20-минутного воздействия 1,3 М раствора НАК и 1,7 М раствора АА на жизнеспособность клеток R. ruber gt1 в суспензии и биопленке, оцененное с помощью флюоресцирующей метки LIVE/DEAD®: зеленое окрашивание – жизнеспособные клетки с неповрежденной мембраной, красное окрашивание – нежизнеспособные клетки с поврежденной мембраной

4.7. Смешанные биопленки нитрилгидролизующих бактерий Трансформация нитрилов до соответствующих кислот может протекать как по одноэтапному нитрилазному пути, так и в две стадии, включающие гидратацию до амидов нитрилгидратазой с последующим гидролизом амидазой до карбоновой кислоты [14]. Не всегда штаммы содержат одинаково активные и нитрилгидратазу, и амидазу, т.к. нитрилгидролизующие бактерии биотехнологического значения нередко бывают селекционированы либо в направлении увеличения нитрилгидратазной, либо амидазной активности. В связи с этим возможно создание гетерогенного биокатализатора трансформации нитрилов в соответствующие карбоновые кислоты на основе нескольких штаммов, один из которых обладает высокой нитрилгидратазной, а другой – выраженной амидазной активностью. Наиболее экономичным в данном случае представляется их совместное культивирование в присутствии носителя, с целью получения смешанной биопленки этих штаммов. Эта возможность была изучена при совместном культивировании двух штаммов родококков, один из которых обладал высокой нитрилгидратазной активностью без проявления амидазной активности (R. ruber gt1), другой – выраженной амидазной активностью (R.

erythropolis 11-2). Во втором варианте штамм, проявляющий амидазную активность, был грамотрицательным (A. faecalis 2).

Смешанные биопленки R. ruber gt1 и R. erythropolis 11-2. В среду N (100 мл) с 0,1% глюкозой в качестве источника углерода и 0,05% ацетонитрилом в качестве источника азота вносили по 5 мл (2,0±0,2) x 108 КОЕ/мл суспензии родококков обоих штаммов и культивировали в присутствии носителей Карбопона и полиэтиленовой пленки высокой плотности при 30С с перемешиванием на шейкере (130 об/мин). После 7 суток культивирования определяли КОЕ/мл планктона (колонии R. ruber gt1 имели оранжевую, R.

erythropolis 11-2 – кремовую окраску). При подсчете КОЕ был вывлен факт частичного подавления роста R. erythropolis 11-2, который образовал в 5 раз меньше колоний, чем R. ruber gt1 (1,7 x 108 против 9,1 x 108 КОЕ/мл). Для определения биокаталитической способности биопленок была проведена 48часовая трансформация 1,3 М раствора акрилонитрила (Рисунок 57).

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что биопленки были образованы в основном R. ruber gt1, который осуществляет трансформацию НАК до акриламида, причем суммарный вклад биопленочных и планктонных клеток в эту трансформацию достоверно больше, чем контрольной суспензии, выращенной без носителя. Вклад 11-2 в биотрансформацию при R. erythropolis культивировании в присутствии носителя значительно ниже, чем при культивировании в суспензии без носителей, о чем можно судить по образованию акриловой кислоты из акриламида. Таким образом, формирование биопленок смешанными культурами одного рода бактерий в данном случае происходит с преобладанием одного вида над другим, в данном случае – R. ruber gt1 над R.

erythropolis 11-2.

–  –  –

Рисунок 57 – Образование акриламида (а) и акриловой кислоты (б) при трансформации НАК смешанными культурами R. ruber gt1 и R. erythropolis 11-2 Смешанные биопленки R. ruber gt1 и A. faecalis 2. В среду N (100 мл) с 0,1% глюкозой в качестве источника углерода для штамма R. ruber gt1 и 0,1 М ацетамидом в качестве источника углерода для штамма A. faecalis 2, а также с 0,1 М хлоридом аммония в качестве источника азота, вносили 1 мл инокулята R. ruber gt1 (1,3 х 109 КОЕ/мл) и 0,5 мл A. faecalis 2 (1,0 х 1010 КОЕ/мл) и культивировали в присутствии носителей Карбопона и полиэтилена высокой плотности при 30С с перемешиванием на шейкере (130 об/мин). На 7-е сутки культивирования подсчитывали количество жизнеспособных клеток путем высева на агаризованную среду Луриа-Бертани, колонии различали по окраске.

Смешанная суспензия содержала 1,1 х 1011 КОЕ/мл R. ruber gt1 и 8,6 х 1011 КОЕ/мл A. faecalis 2. Более интенсивный рост R. ruber gt1, отличающийся на два порядка от такового в присутствии R. erythropolis 11-2, вероятно, связан с использованием разных источников углерода при росте в присутствии A. faecalis 2, не потребляющего глюкозу в качестве источника питания.

Отсутствие конкуренции за источники питания приводит к интенсивному росту и второго штамма – A. faecalis 2. Смешанные биопленки, образованные R. ruber gt1 и A. faecalis 2 на Карбопоне, были визуализированы в электронном микроскопе (Рисунок 58). Биопленки, образованные на волокнах, разрастаются в межволоконное пространство. На крупном плане отмечено, что как между клетками, так и между клетками и волокнами образуются тяжи полимерного вещества.

–  –  –

Рисунок 58 – Общий вид (а) и отдельные клетки (б) смешанной биопленки R.

ruber gt1 и A. faecalis 2: 1 – клетки, 2 – тяжи полимерного вещества Проведена 48-часовая трансформация 200 мМ раствора 3-цианопиридина клетками планктона и биопленки. Показано, что за 48 ч трансформации 3цианопиридина контрольной суспензией весь образовавшийся никотинамид трансформируется в никотиновую кислоту амидазой A. faecalis 2, тогда как биопленки в основном образуют никотинамид, и лишь малое его количество трансформируется в никотиновую кислоту (Рисунок 59). Следовательно, несмотря на то, что при совместном культивировании R. ruber gt1 и A. faecalis 2 в суспензии эти микроорганизмы нарастают одинаково интенсивно, в биопленке преобладают клетки R. ruber gt1, о чем можно судить по эффективной трансформации цианопиридина до никотинамида. Возможно, это связано с лучшей адгезией клеток родококков, имеющих гидрофобную клеточную стенку, на гидрофобных носителях.

–  –  –

Рисунок 59 – Образование никотинамида (а) и никотиновой кислоты (б) при трансформации 3-цианопиридина смешанными культурами R. ruber gt1 и A.

faecalis 2 Из результатов, описанных в данной главе, следует, что биопленки нитрилгидролизующих бактерий могут являться компонентом гетерогенного биокатализатора, осуществляющим трансформацию нитрилов и амидов карбоновых кислот. Культивирование в присутствии носителя позволяет объединить два этапа создания гетерогенного биокатализатора (выращивание биомассы и ее иммобилизация на носителе) в один, когда иммобилизация происходит естественным путем наращивания биопленки.

При анализе научной литературы обнаружено, что биопленки микроорганизмов были изучены в процессах ферментации (получение спиртов, органических кислот), биоэнергетике и очистке сточных вод [115, 212, 236, 281, 373], тогда как сведения о «биопленке-биокатализаторе» для процессов трансформации органических веществ единичны. Биопленки нитрилгидролизующих бактерий оказались более устойчивы к действию токсичных нитрилов и амидов карбоновых кислот, чем суспендированные клетки, что подтверждалось АТФ-метрией и оценкой жизнеспособности клеток с помощью флюоресцирующей метки LIVE/DEAD®. В то же время, особенности роста бактериальных культур в виде биопленки, а именно массивность образуемого внеклеточного полимерного вещества, накладывают отпечаток на функционирование этого типа биокатализатора в процессе трансформации органических веществ. Так, псевдомонады, характеризующиеся избыточной продукцией полимерных веществ при образовании биопленки, менее эффективно трансформируют субстрат из-за диффузионных затруднений, создаваемых внеклеточным матриксом.

Выращивание смешанной биопленки, состоящей из штамма бактерий с высокой нитрилгидратазной и штамма с выраженной амидазной активностью, и применение ее для гидролиза нитрилов в соответствующие карбоновые кислоты оказалось неэффективным как в случае представителей одного рода, так и разных родов, отличающихся предпочтениями по питательному субстрату и по типу клеточной стенки. В первом случае, возможно, причиной этой неэффективности являлась конкуренция за субстрат, во втором – худшая адгезивная способность одного из штаммов.

Выявленная физиологическая особенность адгезированного состояния бактериальных клеток (этапа инициации образования биопленки) – снижение внутриклеточного пула АТФ – может повлиять на активность энергозависимых ферментов, в то время как ферменты, на функционирование которых не требуются затраты энергии, трансформируют субстрат столь же эффективно, как и в планктонных клетках.

Рост биопленки может быть оценен посуточно по содержанию в ней АТФ, что дает более точные сведения о жизнеспособности клеток, тогда как метод оценки биомассы биопленки по экстрагированному красителю кристаллическому фиолетовому дает возможность оценить массивность биопленки в целом. В то же время, между данными, полученными этими методами, наблюдается корреляция от умеренной до высокой, что дает возможность определять динамику роста биопленки одним из перечисленных способов. Оценка динамики роста биопленок важна для выбора оптимального срока культивирования в присутствии носителей, что может быть применено и для других промышленно значимых микроорганизмов.

Таким образом, впервые показано, что биопленки нитрилгидролизующих бактерий могут являться гетерогенным биокатализатором трансформации амидов и нитрилов карбоновых кислот, обладающим повышенной устойчивостью к токсичным субстратам и продуктам ферментативной реакции (акрилонитрилу и акриламиду), этап инициации образования которых (стадия необратимой адгезии) характеризуется пониженным содержанием АТФ по сравнению с суспендированными клетками.

ГЛАВА 5. ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ

ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ

ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА НИТРИЛОВ

Гетерогенные биокатализаторы трансформации нитрильных соединений также могут быть приготовлены путем иммобилизации изолированных ферментов метаболизма нитрилов. В данной главе исследованы два способа иммобилизации – адсорбция на нерастворимом носителе и ковалентная сшивка с носителем, изучены каталитические свойства полученных иммобилизованных ферментных препаратов и влияние иммобилизации на кинетические параметры реакции гидратации/гидролиза нитрилов. Кроме того, получены поперечносшитые агрегаты амидазы и изучена их стереоселективность в реакции гидролиза рацемического субстрата, а также влияние способа иммобилизации амидазы на стереоселективность биотрансформации.

–  –  –

5.1.1. Гидратация акрилонитрила адсорбированными ферментными препаратами, содержащими нитрилгидратазу Нитрилгидратаза, выделенная из штамма gt1, Rhodococcus ruber обладающего высокой нитрилгидратазной активностью, была иммобилизована на немодифицированных оксидах алюминия и углеродсодержащих адсорбентах, в том числе на углеродном носителе Сибуните. Изучена активность и операционная стабильность адсорбированной нитрилгидратазы в реакции трансформации акрилонитрила в акриламид.

Установлено, что величина адсорбции белка на углеродсодержащих носителях выше, чем на немодифицированных оксидах алюминия (Таблица 26).

Очевидно, что присутствие углерода в составе адсорбента увеличивает его способность связывать фермент. Максимальная величина адсорбции составляет 8–9 мг/г.

–  –  –

При иммобилизации нитрилгидратазы на немодифицированных оксидах алюминия (без углерода) стационарное состояние в системе «раствор/адсорбент»

устанавливается через 10 сут. При адсорбции фермента на углеродсодержащих носителях количество адсорбированного белка постепенно возрастает (Таблица

27) при увеличении продолжительности адсорбции. Это может быть обусловлено медленной диффузией фермента внутрь гранул носителя и/или полислойной адсорбцией молекул белка за счет межмолекулярных взаимодействий.

Таблица 27 – Кинетика адсорбции нитрилгидратазы на углеродсодержащих носителях и оксидах алюминия

–  –  –

углеродсодержащих адсорбентах С/Al2O3-I, II, III нитрилгидратаза сохраняла не более 2% от первоначальной активности фермента в растворе, равной 300 мкмоль/мг/мин, тогда как на носителях без углерода фермент сохранял 6–10% исходной активности. Это может быть объяснено либо менее плотным строением адсорбционного слоя на исходных оксидах алюминия по сравнению с углеродсодержащими носителями, либо меньшей деформацией молекулы фермента при взаимодействии с полярной гидрофильной поверхностью Al2O3.

Результаты изучения кинетики гидратации акрилонитрила с участием гетерогенных биокатализаторов, приготовленных путем адсорбционной иммобилизации фермента, представлены на рисунках 60–63.

0.6 0.6 Концентрация НАК,моль/л

–  –  –

0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1

–  –  –

Рисунок 60 – Динамика трансформации акрилонитрила (НАК) в акриламид (АА) нитрилгидратазой, иммобилизованной на носителях Al2O3 I (1, 3) и С/Al2O3I (2, 4):

1, 2 – образование АА, 3, 4 – убыль НАК Реакция гидратации акрилонитрила в акриламид с участием биокатализаторов «нитрилгидратаза на Al2O3-I» протекает с одинаковой скоростью независимо от присутствия углеродного слоя на поверхности, и полная конверсия субстрата достигается через 1 ч (Рисунок 60). При этом следует отметить, что количество адсорбированного фермента на углеродсодержащем носителе в 2 раза больше (Таблица 26), чем на немодифицированном оксиде алюминия.

Кинетика реакции гидратации акрилонитрила с участием биокатализаторов «нитрилгидратаза на Al2O3-II» и одинаковым количеством адсорбированного фермента, указывает на такую же закономерность: нитрилгидратаза на немодифицированном оксиде алюминия трансформирует нитрил в 3 раза быстрее (Рисунок 61).

–  –  –

0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1

–  –  –

Рисунок 61 – Динамика трансформации акрилонитрила (НАК) в акриламид (АА) нитрилгидратазой, иммобилизованной на носителях Al2O3 II (1, 3) и С/Al2O3II (2, 4): 1, 2 – образование АА, 3, 4 – убыль НАК

–  –  –

активности фермента. Возможно, в данном случае, снижение активности нитрилгидратазы связано с ее полислойной адсорбцией и/или неправильной ориентацией молекулы фермента на поверхности, которые затрудняют перенос субстрата из раствора к активному центру фермента.

–  –  –

0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1

–  –  –

Рисунок 62 – Динамика трансформации акрилонитрила (НАК) в акриламид (АА) нитрилгидратазой, иммобилизованной на носителях Al2O3 III (1, 3) и С/Al2O3III (2, 4): 1, 2 – образование АА, 3, 4 – убыль НАК Для сравнения нитрилгидратаза была адсорбирована на коммерческих мезопористых носителях марок СУМС (С/-Al2O3) и Сибунит (полностью углеродный носитель). Носитель марки Сибунит ранее был изучен для иммобилизации фермента глюкоамилазы [27]. При сравнении биокатализаторов, приготовленных на основе СУМС и Сибунит, было обнаружено, что трансформация акрилонитрила ферментом, адсорбированным на носителе СУМС, за 24 ч происходит более полно (Рисунок 63), при этом в реакцию вступает в 2 раза меньшее его количество (Таблица 26). Сравнительные исследования биокатализаторов, приготовленных на носителях марок СУМС и Сибунит, подтвердили, что удельная активность иммобилизованной нитрилгидратазы уменьшается при адсорбции на более гидрофобной поверхности Сибунита.

0.6 0.5 Концентрация НАК, моль/л

–  –  –

0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1

–  –  –

Рисунок 63 – Динамика трансформации акрилонитрила (НАК) в акриламид (АА) нитрилгидратазой, иммобилизованной на носителях СУМС (1, 3) и Сибунит (2, 4):

1, 2 – образование АА, 3, 4 – убыль НАК

–  –  –

свежеприготовленного биокатализатора. Нитрилгидратаза, иммобилизованная на носителях I и III, уже к третьему циклу теряла более 50% активности (Рисунок 64, а, в).

Рисунок 64 – Операционная стабильность биокатализаторов, приготовленных адсорбцией нитрилгидратазы на носителях I (а), II (б), III (в): 1 – оксид алюминия, 2 – слой КВУ на оксиде алюминия; и на углеродсодержащих носителях (г): 3 – СУМС, 4 – Сибунит. По оси ординат – сохранение нитрилгидратазной активности в повторяющихся циклах использования биокатализаторов в периодических условиях: концентрация НАК – 0,58 моль/л, 25С, рН 7,2±0,2 (100% – активность в 1-м цикле реакции) Было установлено, что потеря активности происходила, главным образом, не в результате десорбции белка (наличие белка в промыве контролировали по методу Бредфорд), а вследствие ингибирования нитрилгидратазы высокими концентрациями токсичного субстрата. Известно, что акрилонитрил дезактивирует ферменты путем алкилирования сульфгидрильных групп [220].

При сравнении операционной стабильности нитрилгидратазы, иммобилизованной на носителях марок СУМС и Сибунит было показано, что на Сибуните фермент более стабилен и сохраняет 50% активности на протяжении 4-х циклов реакции (Рисунок 64, г). Закономерности между наличием синтезированного слоя углерода на поверхности оксидов алюминия и операционной стабильностью иммобилизованной нитрилгидратазы выявлено не было.

Также была изучена термостабильность иммобилизованной нитрилгидратазы. Иммобилизованная нитрилгидратаза проявляла максимальную активность при 30–40°С. При 70°С нитрилгидратаза в растворе и в иммобилизованном состоянии на немодифицированных и углеродсодержащих оксидах алюминия сохраняла соответственно 2,7, 30 и 17,5% максимальной активности. Следовательно, адсорбция на неорганических носителях повышает термостабильность нитрилгидратазы на порядок.

Таким образом, хотя адсорбция фермента на немодифицированных оксидах алюминия и углеродсодержащих адсорбентах приводит к кажущемуся снижению его активности, иммобилизация дает возможность многократного использования катализатора и повышает его термостабильность.

5.1.2. Гидратация акрилонитрила нитрилгидратазой, ковалентно связанной с активированным хитозаном Иммобилизованный биокатализатор на основе ферментного препарата, содержащего нитрилгидратазу, был получен путем ковалентной сшивки белка с хитозановыми гранулами, предварительно активированными бифункциональными реагентами. В качестве активаторов использовали 0,5; 1; 1,5;

2% раствор глутарового альдегида и 0,1% раствор бензохинона. Глутаровый альдегид в качестве бифункционального реагента часто используется для ковалентного присоединения ферментов к носителю [183]. Для выбора предпочтительного активатора определяли активность иммобилизованного ферментного препарата нитрилгидратазы.

Определено, что при использовании 0,5–2% растворов глутарового альдегида для активации хитозановых гранул у иммобилизованной нитрилгидратазы сохраняется не более 6% первоначальной активности интактного фермента. Полученные результаты согласуются с литературными данными об ингибировании активности нитрилгидратазы глутаровым альдегидом [137]. Основываясь на полученных данных, в дальнейших экспериментах для активирования хитозана использовали 0,1% раствор бензохинона. В некоторых случаях при использовании такой схемы активации носителя добивались полного сохранения активности нативного фермента.

Исследованы каталитические свойства нитрилгидратазы, изолированной из штамма R. ruber gt1 и иммобилизованной методом ковалентной сшивки с хитозаном, активированным 0,1%-ным раствором бензохинона. Определено, что с активированным хитозаном за 20 мин контакта связывается до 70% нативного белка. Определены кинетические параметры реакции гидратации акрилонитрила, катализируемой иммобилизованной нитрилгидратазой и ферментом в растворе.

Каталитические параметры реакции гидратации акрилонитрила в акриламид Изучено влияние концентрации акрилонитрила на активность нитрилгидратазы, связанной с активированным хитозаном (Рисунок 65), определены константа Михаэлиса (КМ) и максимальная скорость нитрилгидратазной реакции (Vмакс.) (Таблица 28). Определено, что максимальная скорость нитрилгидратазной реакции (Vмакс.), катализируемой ковалентно иммобилизованным ферментом, может достигать Vмакс. реакции с участием фермента в растворе – 50 мкмоль/мг/мин. Сохранение ферментативной активности при иммобилизации указывает на то, что бензохинон в качестве бифункционального реагента эффективно связывает молекулу фермента с хитозаном, не затрагивая ее активный центр. Константа Михаэлиса (КМ) нитрилгидратазы, ковалентно присоединенной к хитозану, не изменяется (Таблица 28). Т.к. по определению Vмакс. и КМ – константы уравнения скорости реакции, выведенного для определения ферментативной активности в разбавленном растворе, в случае иммобилизованных ферментов следует говорить о «кажущейся» константе Михаэлиса [73].

–  –  –

Рисунок 65 – Зависимость удельной активности нитрилгидратазы в растворе (а) и иммобилизованной на активированном хитозане (б) от концентрации субстрата Зависимость нитрилгидратазной активности от температуры и термоинактивация свободной и иммобилизованной нитрилгидратазы Известно, что в отличие от оптимума рН не существует температурного оптимума активности ферментов, т.к. зависимость активности от температуры является результатом наложения двух различных процессов: ускорения движения молекул при повышении температуры и денатурации белка, зависящей от температуры и времени ее воздействия [7]. По нашим данным, температурный оптимум активности сдвигался в сторону более высоких значений температуры при увеличении концентрации фермента в растворе. Так, при количестве белка в растворе 0,45–0,5 мг/мл максимальная активность наблюдалась при 30–40°С, а при увеличении количества белка в растворе до 1,1 мг/мл – при 50°С. Интересно, что подобная зависимость активности от температуры прослеживалась и у иммобилизованного фермента: при иммобилизации на хитозане от 0,8 до 2 мг белка максимальная активность наблюдалась при 45°С, от 3,8 до 4 мг – при 55°С.

Пример зависимости нитрилгидратазной активности свободного и иммобилизованного фермента от температуры показан на Рисунке 66. Известно, что зависимость кинетики инактивации от концентрации фермента является критерием диссоциативной инактивации [9]. Таким образом, концентрационная зависимость термоинактивации согласуется с данными об олигомерной структуре нитрилгидратазы [246].

Следуя литературным данным, можно заключить, что нитрилгидратаза не является термостабильным ферментом. Так, только у бацилл температурный оптимум активности нитрилгидратазы достигает 50С, тогда как в среднем эта величина не превышает 30–40С (Таблица 1). Максимум активности выделенной из Brevibacterium A4 и адсорбированной на DEAE-целлюлозе нитрилгидратазы достигался при 40С, что на 5С превышало таковой для фермента в растворе [222]; максимум активности как свободной, так и иммобилизованной на Eupergit®C нитрилгидратазы из термостабильного штамма Geobacillus pallidus RAPc8 был равен 60С [158]. Наибольшая конверсия рацемического нитрила миндальной кислоты нитрилгидратазой из R. rhodochrous ATCC BAA-870, иммобилизованной в ПВС/хитозане, сшитом глутаровым альдегидом, наблюдалась при 40С [322].



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 10 |

Похожие работы:

«Трубилин Александр Владимирович СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАПСУЛОРЕКСИСА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФАКОЭМУЛЬСИФИКАЦИИ КАТАРАКТЫ НА ОСНОВЕ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ И МЕХАНИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«БОЛГОВА Светлана Борисовна РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Антипова...»

«Кошелева Оксана Владимировна НАЕЗДНИКИ СЕМЕЙСТВА EULOPHIDAE (HYMENOPTERA, CHALCIDOIDEA) СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ СО СПЕЦИАЛЬНЫМ ОБСУЖДЕНИЕМ ПОДСЕМЕЙСТВА TETRASTICHINAE 03.02.05 – энтомология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, С. А. Белокобыльский Санкт-Петербург...»

«Храмцов Павел Викторович ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«Максимова Ольга Владимировна «Оценка микробиоты кишечника у детей с аллергическими заболеваниями в зависимости от массы тела» 03.02.03. – Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Зверев Виталий Васильевич академик РАН, д.б.н., профессор Научный консультант: Гервазиева Валентина Борисовна д.м.н, профессор, заслуженный деятель науки РФ МОСКВА – 2015 Оглавление Список сокращений Введение Глава 1 Обзор литературы 1.1...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«НГУЕН ВУ ХОАНГ ФЫОНГ ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ КРУПНЫХ ГОРОДОВ В СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ ВЬЕТНАМ Специальность: 03.02.08экология (биология) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Чернышов В.И. Москва ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«ОВСЯННИКОВ Алексей Юрьевич СЕЗОННАЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ХВОИ PICEA PUNGENS ENGL. И P. OBOVATA LEDEB. НА ТЕРРИТОРИИ БОТАНИЧЕСКОГО САДА УРО РАН (Г. ЕКАТЕРИНБУРГ) 03.02.08 «Экология (в биологии)» диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«ХУДЯКОВ Александр Александрович ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT В РАЗВИТИИ АРИТМОГЕННОЙ КАРДИОМИОПАТИИ НА МОДЕЛИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор...»

«Миранцев Георгий Валерьевич МОРСКИЕ ЛИЛИИ НЕВЕРОВСКОЙ СВИТЫ ВЕРХНЕГО КАРБОНА МОСКОВСКОЙ СИНЕКЛИЗЫ: CИСТЕМАТИКА, МОРФОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ 25.00.02 Палеонтология и стратиграфия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, чл.-корр. РАН Рожнов Сергей Владимирович Москва – 2015 Оглавление ВВЕДЕНИЕ... стр. 4 Глава 1. История изучения...»

«Сигнаевский Воладимир Дмитриевич МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОДУКТИВНОСТИ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТОВ САРАТОВСКОЙ СЕЛЕКЦИИ Специальность 03.02.01 — ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н.,...»

«ВУДС ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА Фармакогенетические аспекты антиангиогенной терапии экссудативной формы возрастной макулярной дегенерации» 14.01.07 – Глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Будзинская Мария Викторовна кандидат биологических наук Погода Татьяна Викторовна Москва – 2015...»

«Толмачева Алла Викторовна УДК 633.34:551.АГРОКЛИМАТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА УСЛОВИЙ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ СОИ В УКРАИНЕ 11.00.09 – метеорология, климатология, агрометеорология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: Полевой Анатолий Николаевич, доктор географических наук, профессор Одесса – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ РАЗДЕЛ І. БИОЛОГИЧЕСКИЕ...»

«Гуськов Валентин Юрьевич МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БУРОГО МЕДВЕДЯ URSUS ARCTOS LINNAEUS, 1758 ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, с.н.с. А.П. Крюков Владивосток – 2015 Оглавление Введение Глава 1. Обзор...»

«УДК: 576.315:591.465.12 КИСЕЛЁВ Артм Михайлович Состав ядерных доменов и динамика слитого белка Y14-Myc в ооцитах жука Tribolium castaneum 03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор...»

«Долгова Анна Сергеевна ЗАЩИТА ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ПОСРЕДСТВОМ ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ТЕРМИНИРУЮЩИХ ТРАНСКРИПЦИЮ. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук (Специальность 03.01.07 – молекулярная генетика) Научный руководитель: академик, д.б.н., профессор П.Г. Георгиев Москва 2015 Оглавление Оглавление 1....»

«Проскурякова Лариса Александровна НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ СОХРАНЕНИЯ ЗДОРОВЬЯ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.