WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 10 |

«ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ...»

-- [ Страница 5 ] --

3.3. Трансформация алифатических нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий Одним из основных качеств гетерогенного биокатализатора, по которому можно судить о его эффективности, является сохранение исходной ферментативной активности клеток как сразу после адгезии, так и при многократном использовании биокатализатора. Сохранение активности при проведении последовательных циклов трансформации субстрата было обозначено термином «операционная стабильность биокатализатора». Эту характеристику определяли как для иммобилизованных, так и для свободных клеток нитрилгидролизующих бактерий.

–  –  –

Удельная нитрилгидратазная активность суспендированных клеток линейно возрастает при увеличении концентрации НАК до 0,05 М (Рисунок 21). При дальнейшем повышении концентрации субстрата значительного возрастания активности не наблюдается, т.к. происходит насыщение активного центра фермента субстратом. В данном случае график зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата представляет собой часть равнобочной гиперболы, как и в большинстве случаев, касающихся кинетики реакций, катализируемых изолированными ферментами [15].

Рисунок 21 – Зависимость удельной нитрилгидратазной активности клеток R. ruber gt1 от концентрации НАК Нитрилгидратазная активность, равная максимальной активности интактных клеток, у родококков, иммобилизованных на всех изученных углеродных сорбентах, за исключением «Сапропеля», достигается при возрастании концентрации субстрата до 0,8–1,3 М (Таблица 19).

Таблица 19 – Эффективность функционирования иммобилизованной системы () и стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродсодержащих носителях

–  –  –

циклов, в которых сохраняется 50% активности гетерогенного биокатализатора;

суспензии клеток принято за 1.

При этом адгезированные клетки проявляют при трансформации высоких концентраций субстрата ферментативную активность, превышающую на 20–40% ее максимальное значение у суспендированных клеток. Исключение составляют гетерогенные биокатализаторы, приготовленные путем адгезии клеток родококков на материалах Карбопон-В-актив (активность не превышает 81% исходной), керамзите с графитоподобным слоем углерода на поверхности (57% исходной) и шунгите (11%). Возможно, такое снижение активности связано со свойствами носителей. Активированное нетканное полотно "Карбопон-В-актив" представляет собой углеродный волокнистый сорбент, нетканная основа которого импрегнирована мелкодисперсным активированным углеродом [2]. В результате такой модификации материал Карбопон-В-актив обладает сильно гидрофобной поверхностью и высокой сорбционной емкостью, что приводит к частичной адсорбции продукта реакции. Также снижение активности может быть связано с возникновением диффузионных затруднений при полислойной адсорбции клеток, о которой можно судить по характеру кривых адсорбции (Рисунок 15). Падение нитрилгидратазной активности родококков при адгезии на шунгите может быть объяснено бактерицидной природой этого адсорбента [22], что также свидетельствует в пользу утверждения, что для проявления данной ферментативной активности необходимо поддержание жизнеспособности клетки.

Относительно гладкий графитоподобный слой углерода, синтезированный на поверхности керамзита, по-видимому, оказывает неблагоприятное воздействие на активность адгезированных на нем клеток, возможно, связанное с увеличением сайтов адгезии при взаимодействии с гладкой поверхностью, что может неблагоприятно сказаться на массообмене. Так, при сравнении микрофотографий, полученных в сканирующем электронном микроскопе, можно заметить отличие между характером адгезии клеток на гладком (керамзите с поверхностным слоем графитоподобного углерода) и шероховатом (керамзите со слоем КВУ) носителе (Рисунок 22). Можно предположить, что гладкая поверхность носителя менее благоприятна для проявления ферментативной активности иммобилизованного биокатализатора.

Пределом растворимости НАК является концентрация 1,1 М (7,35% при температуре 20С) [1]. Возможность использования более высоких концентраций для биотрансформации связана с тем, что клетки постепенно поглощают субстрат и трансформируют его в продукт (акриламид), удаляя НАК из реакционной среды, в результате чего происходит постепенное его растворение и конверсия.

Повышение концентрации НАК в среде ограничено, по-видимому, его токсичностью для клеток и ферментативных систем.

–  –  –

Рисунок 22 – Клетки R. ruber gt1, адгезированные на керамзите с поверхностным слоем КВУ (а) и на керамзите с поверхностным слоем графитоподобного углерода (б) [36].

Нитрилазная активность адгезированных клеток P. fluorescens С2 Было отмечено, что нитрилазная активность штамма P. fluorescens С2, как и нитрилгидратазная R. ruber gt 1, возрастала у адгезированных клеток по сравнению с суспендированными. В зависимости от носителя активность возрастала: при адгезии клеток на углеродной ткани Урал ТМ-4 – в 7,4 раза (до 2,6 мкмоль/мг/мин), на Карбопон-В-актив – в 2 раза (до 0,7 мкмоль/мг/мин) при исходной активности суспендированных клеток 0,35 мкмоль/мг/мин. Такое увеличение ферментативной активности наблюдалось лишь при высоких концентрациях вносимого субстрата (9–10 об.%), значительно превышающих технологические концентрации (2%), разработанные для проведения синтеза карбоновых кислот и амидов суспендированной биомассой [3].

В то же время, активность адгезированных клеток P. fluorescens С2 зависела от концентрации клеток в реакционной среде. Так, на угле-сырце различной дисперсности (порошкообразном, дробленом с размером фракций 1–6 и 3–10 мм) масса адгезированных клеток возрастала с увеличением дисперсности, но при этом снижалась удельная нитрилазная активность по отношению к НАК (Рисунок 23).

Нитрилазная активность суспензии P. fluorescens С2 также находится в обратной зависимости от концентрации клеток при избытке субстрата в среде (конверсия 1,3 М раствора НАК). Обнаружена сильная отрицательная корреляционная связь между этими показателями (r= –0,871; p=0,05).

–  –  –

Рисунок 23 – Зависимость удельной нитрилазной активности при конверсии НАК от концентрации клеток P. fluorescens С2, адгезированных на различных фракциях угля-сырца (ПС – порошкообразный, ФрС1 – фракция с размером частиц 1–6 мм, ФрС2 – фракция с размером частиц 3–10 мм) Таким образом, на удельную нитрилазную активность клеток влияет их концентрация в реакционной среде, а в гетерогенном биокатализе ферментативная активность зависит от количества адгезированных клеток при прочих равных условиях и избытке субстрата.

Адгезия клеток P. fluorescens С2 на каолине приводила к достоверному увеличению нитрилазной активности иммобилизованных клеток при концентрации НАК от 0,59 до 1,3 М (p0,05), причем средняя величина активности адгезированных клеток при концентрации субстрата 1,3 М превышала таковую свободных клеток в 2 раза (Рисунок 24). Всплеск активности при данной концентрации субстрата может быть связан с тем, что эта концентрация НАК является оптимальной для иммобилизованных клеток – несмотря на то, что она находится за пределами растворимости (1,1 М при 20С), присутствие адсорбента влияет на равномерное потребление субстрата с постепенным его растворением.

Удельная нитрилазная активность, 3.5

–  –  –

Рисунок 24 – Влияние концентрации субстрата на удельную нитрилазную активность адгезированных на каолине (1) и свободных (2) клеток штамма P. fluorescens С2, взятых в концентрации 0,4 мг/мл Удельная нитрилазная активность клеток P. fluorescens С2, адгезированных на каолине, при гидролизе 1,3 М раствора НАК была сопоставима с активностью высокопродуктивных продуцентов нитрилазы Alcaligenes denitrificans C-32 и A.

denitrificans ВКПМ В-9582 (2,4 и 3,6 мкмоль/мг/мин при выращивании на мясопептонном агаре и 2,8 и 4,0 мкмоль/мг/мин при выращивании на минеральной среде с ацетатом аммония и кукурузным экстрактом в колбах) [69]. В то же время, при малой концентрации адгезированных клеток активность P. fluorescens С2 достигала 12 мкмоль/мг/мин, что говорит о перспективности использования малых количеств адгезированных клеток или сильно разбавленных суспензий микроорганизмов для увеличения нитрилазной активности.

Амидазная активность адгезированных клеток R. erythropolis 11-2

Чтобы оценить влияние адгезии клеток R. erythropolis 11-2 на амидазную активность, проводили трансформацию различных концентраций акриламида свободными и иммобилизованными на БАУ клетками. Определено, что удельная амидазная активность находилась в обратной зависимости от концентрации клеток при конверсии амидов как интактными клетками, так и адгезированными на носителе (Рисунок 25). Показана сильная обратная связь между концентрацией клеток в суспензии и их активностью (R = –0,821; p = 0,02). Подобная зависимость была обнаружена для амидазной и нитрилазной активности, что, вероятно, связано с невысокой скоростью конверсии субстрата. В этом случае удельная активность составляла единицы мкмоль продукта, образуемого в минуту 1 мг сухих клеток, тогда как в случае нитрилгидратазной активности – сотни мкмоль. В связи с этим может быть выдвинута гипотеза, по которой при изначальной относительно низкой скорости ферментативной реакции определяющую роль играет диффузия субстрата, когда затруднения массообмена возникают как при высокой концентрации клеток в суспензии, так и при избыточной (полислойной) адсорбции клеток на носителе.

–  –  –

Рисунок 25 – Зависимость удельной амидазной активности адгезированных на БАУ (а) и суспендированных (б) клеток R. erythropolis 11-2 от их концентрации в реакционной среде.

При одинаковом количестве адгезированных и суспендированных клеток (4–4,5 мг) в реакционной среде иммобилизованные клетки трансформировали 50– 500 мМ раствор акриламида с меньшей скоростью, чем свободные (Рисунок 26).

По-видимому, в данном случае плотность клеток имела определяющее значение для проявления активности, хотя за время, в течение которого определяли накопление продукта, субстрат реакции полностью не использовался. Плотность адгезированных клеток была в данном случае значительно выше, чем в суспензии, что, возможно, оказывало неблагоприятное воздействие на проявление активности в связи с диффузионными затруднениями и конкуренцией за субстрат.

Удельная амидазная активность,

–  –  –

Рисунок 26 – Влияние концентрации акриламида на удельную амидазную активность клеток R. erythropolis 11–2 в суспензии (1) и адгезированных на БАУ (2) Клетки R. erythropolis 11-2 были адгезированы на различных фракциях углясырца: порошкообразном и дробленом с размером частиц 1–6 и 3–10 мм. Было показано, что на порошкообразном носителе адгезируется в 10 раз больше биомассы, чем на дробленых фракциях, но величина удельной амидазной активности при этом находится в обратной зависимости от количества клеток (Рисунок 27).

–  –  –

Рисунок 27 – Зависимость удельной амидазной активности при конверсии акриламида от концентрации клеток R. erythropolis 11-2, адгезированных на различных фракциях угля-сырца (ПС – порошкообразный, ФрС1 – фракция с размером частиц 1–6 мм, ФрС2 – фракция с размером частиц 3–10 мм) При сравнении полученных данных с данными других исследователей можно утверждать, что удельная амидазная активность клеток R. erythropolis 11-2, достигающая 300 ммоль/г/ч при концентрации адгезированных клеток на дробленом угле-сырце 2,5 мг АСБ/г, превышает амидазную активность, которую проявляет Rhodococcus erythropolis MTCC 1526 на оптимизированной среде культивирования [198]. Так, внесение в качестве индуктора ацетамида позволило авторам исследования достичь активности, равной 464,23 ЕД/г (ЕД активности была принята как количество фермента, конвертирующего 1 мкмоль ацетамида и гидроксиламина до ацетгидроксамата и аммония в мин при 37С), что соответствовало 28 ммоль/г/ч. Максимум амидазной активности в этом исследовании был достигнут при выращивании родококков на оптимизированной среде с определенным соотношением сорбитола, дрожжевого экстракта, мясного пептона и ацетамида, и был равен 1162,09 ЕД/г, что соответствовало 70 ммоль/г/ч [198].

3.3.2. Операционная стабильность биокатализаторов на основе адгезированных клеток нитрилгидролизующих бактерий Для того чтобы оценить операционную стабильность биокатализатора, проводили последовательные циклы конверсии субстрата, после каждого цикла гетерогенный биокатализатор отделяли от реакционной среды, промывали 0,01 М калий-фосфатным буфером (рН 7,2±0,2) и использовали в дальнейших трансформациях. Снижение ферментативной активности при многократной конверсии субстрата может происходить либо в результате ингибирования фермента, либо из-за десорбции клеток и вымывания их из реакционной среды.

Преимущество имел биокатализатор, способный длительно и многократно конвертировать субстрат без потери ферментативной активности.

Операционная стабильность биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt 1, адгезированных на углеродсодержащих носителях Операционную стабильность биокатализаторов на основе адгезированных клеток R. ruber gt 1 оценивали при проведении последовательных 20-минутных циклов трансформаций НАК. После 1-го цикла реакции у клеток, иммобилизованных на большинстве изученных носителей, наблюдали повышение активности фермента в последующих циклах (Рисунок 28, 29). Подобное повышение активности может быть обусловлено защитным действием носителей и/или адаптацией внутриклеточного фермента к дозированному поступлению субстрата. Это явление также может быть связано с тем, что активность вычисляется по образованию продукта, который в первом цикле частично адсорбируется на носителях (адсорбция акриламида показана в таблице 17). В последующих циклах величина адсорбции продукта снижается, т.к. уменьшается доступная для адсорбции поверхность носителя, что приводит к повышению концентрации акриламида в реакционной среде. В этом случае происходит кажущееся повышение активности фермента, обусловленное лишь снижением адсорбции продукта по мере уменьшения доступной поверхности носителя. Тем не менее, 3–4 кратное повышение активности в последующих циклах не может быть объяснено лишь адсорбционными процессами, особенно в случае таких носителей, как порошкообразный уголь-сырец, который не адсорбирует акриламид. D. Chand с соавторами (2004 г) наблюдали подобное явление повышения ферментативной активности в последующих циклах по сравнению с первым циклом конверсии при многоцикловом гидролизе ацетамида, акриламида и пропионамида клетками R. rhodochrous NHB–2, иммобилизованными методом включения в структуру гелей агара и акриламида. Авторы предполагали, что это связано с поддержанием в системе иммобилизованных клеток определенного уровня субстрата и продукта, благоприятствующего протеканию реакции [396].

Показано, что нитрилгидратазная активность клеток R. ruber gt 1, адгезированных на БАУ и порошкообразном угле-сырце, не ниже активности фермента в первом цикле на протяжении 8 циклов реакции, на Карбопоне, Norit PK 1-3, ФАС – 7 циклов, на ФТД и дробленом угле-сырце – 6 циклов.

При сравнении операционной стабильности гетерогенных биокатализаторов, носителями которых являются волокнистые активированные и неактивированные углеродные материалы, показано, что нитрилгидратазная активность клеток на активированных углеродных волокнах (Карбопон-В-актив) сохраняется в большей степени и большее количество циклов, чем на неактивированных (Урал ТМ-4) (Рисунок 29).

Оценивали продуктивность иммобилизованных родококков при многократной биотрансформации НАК (Таблица 20). Наибольшая продуктивность при трансформации 1,3 М раствора НАК наблюдалась у клеток, адгезированных на Карбопоне, наименьшая – на дробленом угле-сырце.

Рисунок 28 – Операционная стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродных носителях: 1 – БАУ, 2

– ФТД, 3 – Norit PK 1-3, 4 – порошкообразный уголь-сырец, 5 – ФАС, 6 – Карбопон, 7 – Урал, 8 – дробленый уголь-сырец.

Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин

–  –  –

Изучена операционная стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродсодержащих носителях марок Сибунит, «Сапропель», керамзитах с графитоподобным слоем углерода и слоем КВУ на поверхности.

Рисунок 30 – Операционная стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродных носителях: 1 – массивном КВУ, 2 – «Сапропеле», 3 – Сибуните Рисунок 32 – Операционная стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на композиционных углеродминеральных носителях: 1 – керамзит со слоем КВУ, 2 – керамзит со слоем графитоподобного углерода При сравнении операционной стабильности гетерогенных биокатализаторов, полученных адгезией клеток R. ruber gt1 на углеродных («Сапропеле», Сибуните, массивном КВУ, носителях семейства ТУМаН) и углерод-минеральных носителях алюмосиликатной природы (керамзит, стеклопена) с синтезированными на их поверхности слоями различной морфологии, было показано, что только КВУ-слой дает преимущества при многократной конверсии НАК (Рисунок 30, 32). Снижение нитрилгидратазной активности клеток, иммобилизованных на этих носителях, наблюдается только к 7-му реакционному циклу, тогда как во всех остальных случаях падение активности начинается со второго цикла. Наиболее показательным является сравнение операционной стабильности гетерогенных биокатализаторов, носителями которых является керамзит с синтезированным на поверхности графитоподобным углеродом (гладкий слой) и КВУ (шероховатый слой) (Рисунок 32). При адгезии клеток на гладком графитоподобном слое углерода существенно снижается и нитрилгидратазная активность, и операционная стабильность.

Сохранение нитрилгидратазной

–  –  –

Рисунок 33 – Операционная стабильность суспендированных клеток R. ruber gt1 Операционную стабильность гетерогенных биокатализаторов сравнивали с таковой биокатализатора в виде суспензии клеток R. ruber gt1 стационарной фазы роста. Показано, что 50% первоначальной активности терялось уже во 2 цикле трансформации 1,3 М раствора НАК, а к 7 циклу оставалась не более 3% нитрилгидратазной активности (Рисунок 33). Следовательно, гетерогенный процесс значительно стабилизирует ферментативную активность и дает возможность многократного использования биокатализатора.

Также было показано, что снижение активности гетерогенных биокатализаторов при многоцикловом использовании обусловлено дезактивацией фермента, а не десорбцией клеток, т.к. в десорбирующем буферном растворе нитрилгидратазную активность не обнаруживали. В препаратах промывных вод, исследованных в световом фазово-контрастном микроскопе, бактериальные клетки не обнаруживались, хотя реакция на присутствие белка с реактивом Бредфорд была слабой положительной, что может свидетельствовать о присутствии единичных клеток, либо содержимого лизированных клеток в промыве.

Сравнивая операционную стабильность адгезированных клеток родококков, обладающих нитрилгидратазной активностью, с данными научной литературы, следует отметить, что клетки, иммобилизованные в геле альгината кальция, могут конвертировать некоторые субстраты более продолжительное время и в течение большего количества последовательных циклов реакций. Так, биокатализатор на основе клеток P. chlororaphis B23, иммобилизованых в структуре геля альгината кальция, осуществлял гидратацию адипонитрила до 5-циановалерамида на протяжении 58 последовательных реакционных циклов [83]. Клетки CH1, включенные в гель альгината кальция и ПАА, Brevibacterium трансформировали акрилонитрил до акриламида при 7С в течение 7 дней без потери активности [221]. В то же время, при выборе способа иммобилизации и носителя следует учитывать не только операционную стабильность, но и другие характеристики, а именно сохранение активности при иммобилизации, нагрузку клетками, доступность (дешевизну) носителя, стоимость процедуры иммобилизации и др. Кроме того, как отмечает D. Kub с соавторами, операционная стабильность иммобилизованного биокатализатора сильно зависит от субстрата и /или продукта биотрансформации – так, клетки R. equi A4, иммобилизованные в структуре носителя носителя LentiKats® (сополимер ПВС и полиэтиленгликоля), трансформировали (R,S)-3-гидрокси-2-метиленобутанонитрил в течение 4-х циклов без потери активности, тогда как при трансформации бензонитрила терялось около 20 и 30% первоначальной активности уже во втором и третьем циклах [136].

Операционная стабильность биокатализатора на основе клеток P. fluorescens С2, адгезированных на углеродсодержащих носителях Несмотря на то, что нитрилазная активность значительно ниже нитрилгидратазной, стабильность нитрилазы гораздо выше, что, возможно, связано с ее большей термостабильностью по сравнению с нитрилгидратазой.

Известно, что тепловой выход реакции гидратации НАК составляет +18–19 ккал/моль [3], а разогрев реакционной смеси, находящийся в прямой зависимости от концентрации субстрата, приводит к падению активности фермента. В случае нитрилазной активности операционная стабильность гомогенных биокатализаторов превышала таковую гетерогенных на основе клеток P. fluorescens С2, адгезированных на волокнистых углеродных материалах.

Наибольшую стабильность при многократной конверсии НАК проявил гетерогенный биокатализатор, носителем клеток в котором был Карбопон-Вактив (Рисунок 34).

При проведении последовательных циклов трансформации НАК клетками P. fluorescens С2, адгезированными на носителе Карбопон-В-актив, наблюдали повышение активности во втором цикле по сравнению с гидролизом субстрата сразу после адгезии. Факт повышения активности во втором и нескольких последующих циклах был неоднократно отмечен при многоцикловой конверсии НАК адгезированными клетками R. ruber gt1, в том числе и иммобилизованными на носителе Карбопон-В-актив. Подобное явление было обнаружено в работах [153, 168, 396], хотя исчерпывающего объяснения ему дано не было.

Рисунок 34 – Операционная стабильность биокатализатора на основе клеток P. fluorescens С2, адгезированных на носителях: 1– Карбопон-В-актив, 2 – Урал ТМ-4, 3 – Карбопон, 4 – суспензия

–  –  –

Рисунок 35 – Операционная стабильность биокатализатора на основе клеток P. fluorescens С2, адгезированных на каолине Данные, касающиеся операционной стабильности адгезированных клеток P. fluorescens С2, полученные нами, сопоставимы с литературными данными по операционной стабильности иммобилизованных нитрилазосодержащих бактерий в реакциях трансформации нитрилов. Так, при изучении различных способов иммобилизации клеток Bacillus sp. UG-5B было показано, что наименьшей стабильностью при конверсии бензонитрила обладают адсорбированные клетки и включенные в гибридные матриксы – остаточная активность после 5 циклов составляет 20 и 40% соответственно, а наибольшей – связанные с полисульфоновыми мембранами, сохраняющие 100% активности после 8 циклов и 50% после 10 циклов реакции [227].

Операционная стабильность биокатализатора на основе клеток R. erythropolis 11-2, адгезированных на углеродсодержащих носителях Изучена операционная стабильность биокатализатора на основе клеток R.

erythropolis 11-2, адгезированных на БАУ. Показано, что иммобилизованные клетки на протяжении 7 циклов последовательных 24-х часовых реакций трансформации акриламида до акриловой кислоты сохраняют более 80% своей активности, причем до 6-го цикла активность даже превышает первоначальную, измеренную после адгезии клеток (Рисунок 36). В то же время, активность суспендированных клеток снижается уже во втором цикле, составляя менее 40% первоначальной, а к 7-му циклу не превышает 3% первоначальной активности.

Таким образом, за 168 ч биокатализатор на основе адгезированных на БАУ клеток R. erythropolis 11-2 в количестве 3 мг (по сухой биомассе клеток) образует 37,4±2,6 мг акриловой кислоты.

Сохранение амидазной активности, %

–  –  –

Рисунок 36 – Операционная стабильность биокатализатора на основе клеток R.

erythropolis 11-2, адгезированных на БАУ (1), и в свободносуспендированном состоянии (2) В работах других исследователей было показано сохранение амидазной активности при иммобилизации клеток в структуре гелей. Клетки Bacillus sp., включенные в агар и ПАА, конвертировали ацетамид до ацетогидроксамовой кислоты в течение 10 циклов без потери активности [135]. Также 10 циклов не снижалась ацилтрансферазная активность амидазы клеток B. megaterium, иммобилизованных в структуре геля альгината кальция [168]. Клетки Delftia CCTCC M 205114, содержащие амидазу, осуществляли tsuruhatensis энантиоселективный гидролиз (R)-2, 2-диметилциклопропанокарбоксамида при включении в гель альгината кальция в течение 8 последовательных циклов реакций, причем эффективность конверсии к 8-му циклу составляла 83,1% [193].

Литературные данные позволяют заключить, что клетки, включенные в гели, обладают достаточной операционной стабильностью, что объясняется особенностями этого метода иммобилизации клеток – клетки «захвачены»

структурой геля, их вымывание сведено к минимуму. Однако, при адгезии между клеткой и ностелем также создаются более прочные связи по сравнению с начальной обратимой адсорбцией. Поэтому данные, полученные при определении операционной стабильности адгезированных клеток, сравнимы с данными, полученными при включении клеток в структуру гелей.

3.4. Трансформация ароматических нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий1 Выявление закономерностей гетерогенного биокатализа нитрилов связано также с решением вопроса, влияет ли химическая природа субстрата на Экспериментальные работы, касающиеся трансформации ароматических нитрилов, выполнены совместно с аспирантом ГБОУ ВПО ПГНИУ Д.М. Васильевым и результаты опубликованы в статьях: Максимова Ю.Г., Васильев Д.М., Овечкина Г.В., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Трансформация 2- и 4-цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилгидролизующих бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. – 2013. – Т. 49, № 4. – с. 358–363; Максимова Ю.Г., Васильев Д.М., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Биокаталитическая трансформация 3-цианопиридина иммобилизованными и суспендированными клетками нитрилутилизирующих бактерий // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. – 2012. – Т. 8., № 2. – С. 54-58.

особенности протекания ферментативной реакции в гетерогенной среде. С этой целью была изучена трансформация ароматических нитрилов и амидов адгезированными клетками и проведено сравнение с гетерогенной конверсией алифатических субстратов теми же биокатализаторами.

Трансформация цианопиридинов адгезированными клетками R. ruber gt1

Адгезию клеток R. ruber gt1 проводили на активированных и неактивированных углеродных адсорбентах. Изучали динамику трансформации 2, 3, 4-цианопиридинов этими гетерогенными биокатализаторами.

Изучена динамика трансформации 3-цианопиридина клетками R. ruber gt1, адгезированными на носителях БАУ, Карбопон-В-актив и «Сапропель»

активированный (Рисунок 37).

Несмотря на то, что к 120 мин реакции, катализируемой иммобилизованными клетками, 3-цианопиридин практически полностью трансформируется (а, б), не происходит эквимолярной конверсии субстрата в продукт, вероятно, за счет адсорбции большей части продукта на активированных носителях (Таблица 18).

В данном биокаталитическом процессе для иммобилизации клеток родококков наиболее предпочтительными оказываются неактивированные углеродные адсорбенты, как, например, карбонизированные углеродные волокна Урал ТМ-4 и уголь-сырец. Изучена зависимость удельной нитрилгидратазной активности свободных и иммобилизованных клеток R. ruber gt1 от концентрации субстрата 3-цианопиридина. Показано, что активность клеток, иммобилизованных на карбонизированных волокнах Урал ТМ-4, при конверсии субстрата, концентрация которого не превышает 200 мМ, близка к активности свободносуспендированных клеток. При дальнейшем повышении концентрации субстрата до 800 мМ у неиммобилизованных клеток наблюдается линейная зависимость активности от концентрации 3-цианопиридина, а у адгезированных происходит лишь незначительное повышение активности (Рисунок 38).

–  –  –

В отличие от конверсии алифатических нитрилов адгезированными клетками, при трансформации ароматических нитрилов не наблюдалось повышение активности клеток при их иммобилизации.

Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин

–  –  –

Рисунок 38 – Влияние нитрилгидратазной активности клеток R. ruber gt1, суспендированных (1) и адгезированных на носителе Урал ТМ-4 (2), от концентрации 3-цианопиридина Суспендированные и иммобилизованные на углеродных волокнах Урал ТМклетки gt1 служили биокатализаторами для получения R. ruber концентрированного раствора никотинамида. Определено, что при внесении в среду 3-цианопиридина до конечной концентрации 200 мМ каждый час в течение 6-ти часов свободносуспендированный биокатализатор в количестве 0,6 г/л синтезирует раствор никотинамида концентрацией 26 г/л, а иммобилизованный в количестве 500 г/л (по общей массе носителя) – 10 г/л (Рисунок 39). Интересно, что по истечении каждого часа конверсии свободными клетками субстрат в среде не обнаруживался, но и концентрация продукта эквимолярно не возрастала.

Вероятно, это связано с накоплением продукта в клетках, что объясняется прекращением пассивного транспорта никотинамида из клеток в реакционную среду при возрастании его концентрации вне клеток. Действительно, при разрушении клеток ультразвуком в цитоплазме обнаруживали никотинамид и 3цианопиридин. При конверсии иммобилизованными клетками после 6 ч конверсии в реакционной среде оставался 3-цианопиридин в концентрации 27 г/л.

Концентрация никотинамида, г/л

–  –  –

Рисунок 40 – Динамика трансформации 2-цианопиридина (а, б) и 4-цианопиридина (в, г) суспензией клеток R. ruber gt1 (а, в) и клетками, адгезированными на угле-сырце (б, г): 1 – пиколинамид, 2 – 2-цианопиридин, 3- изоникотинамид, 4 – 4-цианопиридин Суспензия клеток R. ruber gt1 и адгезированные на угле-сырце клетки трансформировали 2- и 4-цианопиридин до пиколинамида и изоникотинамида соответственно (Рисунок 40). Нитрилгидратазная активность суспендированных клеток по этим субстратам достоверно не различалась, а при иммобилизации наблюдалось незначительное снижение активности по 4-цианопиридину (Таблица 21). В то же время активность по 2-цианопиридину у иммобилизованных клеток была ниже, чем у свободных в 1,4–2,6 раза и в 1,2–2 раза ниже, чем по 4цианопиридину у иммобилизованных клеток.

Таблица 21 – Активность свободносуспендированных и адгезированных на углесырце клеток R. ruber gt1 по отношению к 2- и 4-цианопиридину, ммоль/г/ч

–  –  –

Таким образом, снижение активности нитрилгидратазы иммобилизованных клеток по 2-цианопиридину было значительнее, чем по 4-цианопиридину.

Вероятно, это связано с природой субстрата – 2-цианопиридина, который не смешивается с водой, образуя в ней эмульсию. Возможно, для трансформации этого субстрата необходима его адсорбция на клеточной стенке бактерий, а уже затем проникновение в клетку. При смешивании бактериальной суспензии с эмульсией 2-цианопиридина в воде дисперсная фаза не визуализировалась, что можно объяснить переходом этого вещества в адсорбированное состояние.

Адгезия бактериальных клеток на нерастворимом носителе в определенной мере снижает площадь доступной поверхности клетки и затрудняет процессы диффузии, что в свою очередь может сказываться на активности внутриклеточного фермента.

Трансформация цианопиридинов адгезированными клетками P. fluorescens С2 Клетки грамотрицательных псевдомонад были адгезированы на гидрофильном каолине для проведения гетерогенной трансформации 2- и 4цианопиридина. Суспензия клеток P. fluorescens С2 и клетки, иммобилизованные на каолине, осуществляли одностадийную конверсию нитрилазой 2цианопиридина в пиколиновую кислоту и 4-цианопиридина в изоникотиновую кислоту (Рисунок 41).

Время полной конверсии 200 мМ раствора 2-цианопиридина как свободными, так и иммобилизованными клетками, было в 10 раз больше, чем 4цианопиридина, при использовании одинаковой массы биокатализатора. При этом активность адгезированных клеток по 4-цианопиридину достоверно не отличалась от активности свободных клеток (Таблица 22). При использовании псевдомонад в качестве биокатализатора для гидролиза цианопиридинов в соответствующие пиридинзамещенные карбоновые кислоты наблюдается такая же тенденция при трансформации 2-цианопиридина, как и в случае родококков.

Таблица 22 – Активность свободносуспендированных и адгезированных на каолине клеток P. fluorescens С2 по отношению к 2- и 4-цианопиридину, ммоль/г/ч

–  –  –

Рисунок 41 – Динамика трансформации 2-цианопиридина (а, б) и 4-цианопиридина (в, г) суспензией клеток P. fluorescens С2 (а, в) и клетками, адгезированными на каолине (б, г): 1 – пиколиновая кислота, 2 – 2-цианопиридин, 3 – изоникотиновая кислота, 4 – 4-цианопиридин Трансформация амидов пиридинкарбоновых кислот адгезированными клетками R. erythropolis 11-2 Проведена трансформация никотинамида клетками R. erythropolis 11-2, адгезированными на различных фракциях угля-сырца. При конверсии ароматического субстрата наблюдается такая же зависимость, как и в случае алифатических амидов – с уменьшением биомассы иммобилизованных клеток возрастает их удельная амидазная активность. Масса адгезированных клеток родококков на порошкообразном угле-сырце в 3,5 раза превышает таковую на фракциях дробленого угля-сырца, тогда как удельная амидазная активность клеток, адгезированных на дробленом угле с размером частиц 3–10 мм, превышает активность клеток на порошкообразном угле в 1,3 раза (Рисунок 42).

–  –  –

В данном случае, вероятно, как и вслучае конверсии алифатического субстрата, на активность могут влиять два фактора – конкуренция за субстрат при увеличении концентрации клеток и затруднения массообмена, наблюдающиеся при полислойной адсорбции клеток на порошкообразном угле-сырце. Удельная амидазная активность адгезированных клеток по никотинамиду, полученная нами (0,207–0,288 мкмоль/мг/мин при 30С), сопоставима данными, полученными M.

Cantarella с соавт. (2008 г) – 0,243 мкмоль/мг/мин при конверсии 100 мМ раствора субстрата суспендированными клетками Microbacterium imperiale CBS 498-74 при температуре 50С [109].

3.5. Гетерогенный биокатализатор трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот на основе бактериальных клеток, агрегированных с нанотрубками Методом сканирующей электронной микроскопии было показано, что при взаимодействии с нанотрубками в жидкой среде бактериальные клетки формируют агрегаты (Рисунок 17). Формирование агрегатов предположительно обусловлено взаимным влиянием положительно заряженных нанотрубок и отрицательно заряженной поверхности клеток. Изучено влияние гетерогенной среды на нитрил- и амидгидролизующую активность R. ruber gt1, R. erythropolis 11-2 и A. faecalis 2. Показано, что при трансформации акрилонитрила до акриламида у клеток R. ruber gt1, агрегированных с очищенными МУНТ, нитрилгидратазная активность незначительно снижается по сравнению с активностью суспензии, тогда как у клеток, агрегированных с неочищенными МУНТ, падает и составляет не более 2% от исходной активности (Рисунок 43).

При конверсии 3-цианопиридина до никотинамида агрегаты клеток с очищенными МУНТ проявляют активность, равную активности суспензии, а при связывании с неочищенными МУНТ сохраняется 33% первоначальной активности интактных клеток.

При трансформации 0,1 М раствора акриламида до акриловой кислоты клетками R. erythropolis 11-2, агрегированными с очищенными и неочищенными МУНТ, удельная амидазная активность составляет 55 и 14% исходной активности интактных клеток соответственно. У A. faecalis 2 активность агрегатов клеток с очищенными МУНТ достигает активности интактных клеток, а с неочищенными нанотрубками снижается в 10 раз (Рисунок 44).

Удельная нитрилгидратазная активность,

–  –  –

Рисунок 43 – Удельная нитрилгидратазная активность клеток R. ruber gt1 в суспензии (1), агрегированных с очищенными (2) и неочищенными МУНТ (3) Удельная амидазная активность, ммоль/г/ч

–  –  –

Рисунок 44 – Удельная амидазная активность клеток R. erythropolis 11-2 и A.

faecalis 2 в суспензии (1), агрегированных с очищенными (2) и неочищенными МУНТ (3) Несмотря на то, что с неочищенными МУНТ связывается больше клеток, чем с очищенными, для создания гетерогенного биокатализатора требуется очистка нанотрубок от примесей. Необходимость очистки обусловливается значительным снижением ферментативной активности клеточных агрегатов, которая обнаружена и при функционировании различных ферментов (нитрилгидратаза R. ruber gt1 и амидаза R. erythropolis 11-2 и A. faecalis 2), и при трансформации различных субстратов (алифатический акрилонитрил и ароматический 3-цианопиридин). Снижение ферментативной активности может являться следствием нарушения либо жизнеспособности клетки в целом, либо транспортной системы, ассоциированной с клеточными мембранами, а также происходить в результате затруднения массообмена клетки с окружающей средой, создаваемого адгезированными к клеточной поверхности нанотрубками.

Установленный факт отрицательного влияния технологических примесей в составе наноматериалов согласуется с литературными данными [25]. В то же время, нами установлена способность бактериальных клеток расти в присутствии как очищенных, так и неочищенных нанотрубок в концентрации 2 мг/мл. Этот факт может указывать на то, что МУНТ не обладают прямым бактерицидным действием, а снижение ферментативной активности скорее связано с затруднением транспорта субстратов и продуктов через клеточную мембрану при формировании агрегатов клетка–МУНТ.

Таким образом, для получения гетерогенного биокатализатора на основе нерастущих бактериальных клеток носителями могут служить не только адсорбенты, дисперсность которых превышает размеры бактерий, но и наноматериалы. В этом случае характер взаимодействия клетка–носитель качественно иной – клетки не адгезируются к поверхности носителя, а формируют агрегаты, покрытые наноразмерными объектами. Для сохранения ферментативной активности биокатализатора важна очистка МУНТ от примесей, кроме того, представляется перспективной функционализация нанотрубок с целью снижения повреждающего действия на клетку с одновременным сохранением высокого сродства этих материалов к клеточной поверхности.

3.6. Стереоселективная трансформация нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий Известно, что нитрилаза и амидаза часто проявляют стереоселективность в реакциях гидролиза нитрилов и амидов, что является важным свойством, нашедшем применение в биокаталитическом синтезе ряда интермедиатов фармацевтических препаратов [107, 108, 119, 122, 214]. В то же время, данные, позволяющие анализировать влияние гетерогенной среды на стереоселективность этих ферментов, немногочисленны. Эти работы касаются либо включения клеток или ферментов в структуру гелей [107, 322], либо приготовления поперечносшитых агрегатов ферментов без носителя [242, 390]. С целью изучения влияния адгезии клеток и присутствия носителя в среде на стереоселективность реакции была проведена трансформация рацемического фенилглицинонитрила гетерогенным биокатализатором на основе клеток P. fluorescens С2, содержащих нитрилазу, и рацемического лактамида иммобилизованными клетками амидазосодержащих родококков.

Трансформация фенилглицинонитрила адгезированными клетками P. fluorescens С2 Клетки P. fluorescens С2, адгезированные на углеродсодержащих носителях Сибунит и «Сапропель», конвертировали 10 мМ раствор фенилглицинонитрила в D- и L-фенилглицин (Рисунок 45). Активность нитрилазы суспендированных и адгезированных на Сибуните и «Сапропеле» клеток при конверсии этого субстрата составила 1,57±0,42, 0,86±0,55 и 3,14±1,82 ммоль/г/ч соответственно.

Показано, что при часовой конверсии фенилглицинонитрила клетками, иммобилизованными на Сибуните, энантиомерный избыток (ee) L-изомера составляет 54%, тогда как при продолжительности реакции 20 ч увеличивается до 96%. В случае клеток псевдомонад, адгезированных на «Сапропеле», при часовой конверсии ee L-изомера составляет 30%, но при увеличении времени протекания реакции до 20 ч смещается в сторону выхода D-изомера, ee которого к этому времени достигает 78%. В качестве контроля реакцию проводили суспендированными клетками, и в этом случае стереоселективность реакции мало изменялась во времени, а ee L-фенилглицина составлял 50–68%.

–  –  –

Рисунок 45 – Соотношение изомеров D- и L-фенилглицина при гидролизе фенилглицинонитрила суспендированными и адгезированными на Сибуните и «Сапропеле» клетками P. fluorescens С2 Такое изменение энантиомерного избытка одного из образующихся изомеров может быть связано с природой носителя, используемого для адгезии клеток. Выдвинута гипотеза, по которой изменение рН в микроокружении адсорбента может влиять на взаимопревращения уже образовавшихся изомеров.

Этим может объясняться влияние длительности реакции (длительности контакта реакционной среды с носителем) на энантиомерный избыток одного из стереоизомеров фенилглицина.

Трансформация рацемического лактамида адгезированными клетками родококков, содержащими амидазу Для того чтобы оценить влияние адгезии клеток родококков на стереоселективность амидазы, проводили реакцию трансформации рацемического лактамида до L- и D-молочной кислоты. Суспендированные клетки R. erythropolis 6–2 и R. rhodochrous 4-1 гидролизовали лактамид до D- и L-молочной кислоты с соотношением энантиомеров 76 к 24% и 62 к 38% соответственно, а штамм R.

erythropolis 11-2 образовывал рацемическую смесь изомеров. При иммобилизации клеток R. erythropolis 6-2 на БАУ мольная доля D-изомера составляла 70%, тогда как адгезированные клетки R. rhodochrous 4-1 гидролизовали лактамид без стереоселективности (Таблица 23).

Известно, что многие оптически активные вещества обладают лишь ограниченной устойчивостью. В случае снижения доли одного из оптических изомеров при трансформации иммобилизованными на углеродном носителе клетками, возможно, происходит рацемизация молочной кислоты. Рацемизация чаще происходит не самопроизвольно, а вызывается различными физикохимическими воздействиями, причем катализаторами рацемизации могут выступать щелочные агенты [55]. В данном случае, причина снижения оптической чистоты образующейся молочной кислоты при гидролизе адгезированными клетками, по-видимому, была связана не с изменением скорости образования изомеров, а с присутствием носителя, приводящем к рацемизации.

Действительно, контакт с БАУ D- и L-изомеров молочной кислоты в соотношении 4:1 в течение 1 ч при 22С приводил к смещению этого соотношения в сторону преобладания L-изомера.

Таблица 23 – Стереоселективная трансформация рацемического лактамида до Dи L-молочной кислоты суспендированными и адгезированными на БАУ клетками родококков, обладающими амидазной активностью

–  –  –

Таким образом, стереоселективность амидазы в модельной реакции гидролиза рацемического лактамида при адгезии клеток снижалась, что обусловливало необходимость поиска других способов получения гетерогенного биокатализатора для стереоселективной трансформации, в частности, разработку способов выделения и иммобилизации фермента.

следует выделить особенности Обобщая вышеизложенное, биокаталитической трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, протекающей в гетерогенной среде с участием адгезированных бактериальных клеток.

Так, в процессе гидролиза алифатических нитрилов R. ruber gt1 наиболее предпочтительными для адгезии клеток среди изученных углеродных материалов являлись макропористые активированные носители БАУ и Norit PK 1-3, мелкодисперсные ФТД и порошкообразный уголь-сырец, волокнистые материалы Урал ТМ-4 и Карбопон, а также носители со слоем КВУ на поверхности. Эти носители обеспечивали сохранение и даже повышение ферментативной активности после адгезии, а также высокую операционную стабильность, выражающуюся в сохранении не менее 50% первоначальной активности на протяжении 7–8 последовательных циклов конверсии акрилонитрила. Носители, наиболее приемлемые для адгезии клеток родококков, либо обладали макропорами, превышающими по размеру бактериальную клетку, либо были высокодисперсными, что обеспечивало увеличение площади поверхности, доступной для клеток. Межволоконное пространство тканных и войлочных материалов, либо шероховатая поверхность носителя, с которой клетка взаимодействовала по отдельным сайтам адгезии, а не всей своей поверхностью, обеспечивали незатрудненную диффузию субстрата и продукта. В этих случаях выполнялись следующие требования к созданию гетерогенного биокатализатора:

количество адгезированных клеток было достаточным в сочетании с малой адсорбцией продукта ферментативной реакции, диффузионные затруднения отсутствовали либо были малы, что не сказывалось на ферментативной активности клеток. Кроме того, в ряде случаев у адгезированных клеток наблюдали повышение нитрилгидратазной и нитрилазной активности.

Увеличение активности могло быть связано с защитным действием адсорбента при конверсии высоких концентраций токсичного субстрата, и/или изменением проницаемости клеточной мембраны, происходящем при адгезии клеток. Кроме того, снижение ферментативной активности клеток при адгезии на природном углеродсодержащем минерале шунгите и при взаимодействии с неочищенными нанотрубками позволяет выдвинуть предположение, что для проявления нитрили амидгидролизующей активности необходимо поддержание жизнеспособности бактериальной клетки. Известно, что и неочищенные нанотрубки [25], и минерал шунгит [22] обладают бактерицидным действием.

При адгезии клеток псевдомонад, имеющих гидрофильную поверхность, предпочтительным являлся гидрофильный высокодисперсный каолин. Отмечена умеренная корреляция между гидрофобностью поверхности носителя и массой адгезированных клеток родококков, также имеющих гидрофобную поверхность (r=0,679; p=0,05), а также сильная положительная связь между гидрофобностью поверхности клеток различных штаммов родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus и массой адгезированных клеток на гидрофобных углеродных материалах (БАУ, Norit PK 1-3, ФТД, ФАС): от r=0,884 до r=0,950 (p=0,05). Корреляция между количеством адгезированных клеток и дисперсностью материала была определена как слабая (r=0,220; p=0,05), а корреляционная связь между шероховатостью поверхности адсорбента и массой адгезированных клеток была недостоверна. Следовательно, гидрофобногидрофильные свойства поверхности адсорбата и адсорбента являются определяющими при адгезии бактериальных клеток на нерастворимом носителе.

Так как процессу адгезии бактериальных клеток предшествует их адсорбция на носителе, зависимость массы адгезированных клеток от их начальной концентрации в суспензии была описана различными типами изотерм адсорбции.

Так, изотермы адсорбции клеток родококков на композиционных углеродминеральных и волокнистых углеродных носителях имели вид изотерм Лэнгмюра, что подтверждало образование монослоя на поверхности носителя; на активированных (БАУ) – вид изотерм Брунауэра, Эммета, Теллера (БЭТ), что предполагало формирование полислоя клеток на поверхности носителя. В свою очередь, зависимость массы адгезированных клеток P. fluorescens С2 на каолине от начальной концентрации клеток в суспензии в диапазоне концентраций до 3 мг сухих клеток/мл близка к линейной, что в данном случае, возможно, говорит не о полислойной адсорбции, а об отсутствии точки насыщения адсорбента в этом диапазоне концентраций клеточной суспензии, что является следствием высокой дисперсности материала.

Операционная стабильность родококков, содержащих нитрилгидратазу, при адгезии на углеродных носителях значительно повышалась по сравнению с суспендированными клетками, тогда как адгезия клеток псевдомонад, имеющих нитрилазную активность, не давала такого преимущества. Этот факт может быть объяснен различиями в каталитических свойствах этих нитрилтрансформирующих ферментов – термостабильность нитрилазы значительно выше, чем нитрилгидратазы [30, 408], и ее активность в меньшей степени ингибируется при экзотермической реакции гидролиза высоких концентраций акрилонитрила.

Ароматические субстраты и продукты реакции (цианопиридины, пиридинкарбоновые кислоты и их амиды) вносят определенные коррективы в алгоритм создания гетерогенного биокатализатора гидролиза нитрилов и амидов.

Так, благодаря своей химической структуре, ароматические соединения в высокой степени адсорбируются на активированных носителях, что в данном случае делает выбор этих материалов для иммобилизации бактериальных клеток необоснованным. Выбор носителя при этом приходится останавливать на неактивированных адсорбентах, несмотря на то, что бактериальные клетки в большей степени адгезируются на поверхности активированных углеродных материалов, чем неактивированных.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 10 |

Похожие работы:

«Дорошенко Васса Борисовна ХОЗЯЙСТВЕННО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И КАЧЕСТВЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ МЯСА БЫЧКОВ КАЗАХСКОЙ БЕЛОГОЛОВОЙ ПОРОДЫ РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ 06.02.10 – частная зоотехния, технология...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Ксыкин Иван Валерьевич ВРЕДОНОСНОСТЬ СОРНЯКОВ И МЕРЫ БОРЬБЫ С НИМИ В ПОСЕВАХ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР НА СВЕТЛО-КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ВОЛГО-ДОНСКОГО МЕЖДУРЕЧЬЯ Специальность: 06.01.01 общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Флоринский Игорь Васильевич Теория и приложения математико-картографического моделирования рельефа Специальность 25.00.33 – картография Диссертация на соискание ученой степени доктора технических наук Пущино – 2010 СОДЕРЖАНИЕ Обозначения и сокращения Введение Глава 1 Основные понятия и методы моделирования рельефа 1.1 Цифровые модели рельефа и морфометрические характеристики 1.1.1 Методы...»

«УДК: 576.315:591.465.12 КИСЕЛЁВ Артм Михайлович Состав ядерных доменов и динамика слитого белка Y14-Myc в ооцитах жука Tribolium castaneum 03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор...»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Минаева Наталья Викторовна Отдаленные последствия высокодозной химиотерапии и аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами 14.01.21 – гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель...»

«Храмов Александр Валерьевич ЮРСКИЕ СЕТЧАТОКРЫЛЫЕ (INSECTA: NEUROPTERA) ЦЕНТРАЛЬНОЙ АЗИИ 25.00.02 Палеонтология и стратиграфия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Пономаренко Александр Георгиевич Москва 2014 Оглавление ВВЕДЕНИЕ Глава 1. История изучения юрских Neuroptera Глава 2. Отряд Neuroptera 2.1. Система и биология...»

«МАХАЧЕВА ХАННА ГАДЖИЕВНА СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ МОДЕРНИЗАЦИИ ОТОРИНОЛАРИНГОЛОГИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ В РЕСПУБЛИКЕ ДАГЕСТАН 14.01.03 – болезни уха, горла и носа 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Н.А. Дайхес доктор медицинских наук, профессор Л.М. Асхабова...»

«МИНАЕВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ ПОВЕДЕНИЕ ЛОСЯ В УСЛОВИЯХ ДОМЕСТИКАЦИИ (биотелеметрическое исследование) Специальность 03.00.08 зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 1992. -2ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. Введение........... 3 Глава 1. Материал и методика....... 7 Глава 2. Система радиоопределения Лось-2 и оптимальные методы работы с...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«Злепкин Дмитрий Александрович Теоретическое и практическое обоснование повышения продуктивности свиней и птицы за счет улучшения биологической полноценности кормления 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Научный...»

«КОНОНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НОВЫХ СОРТОВ СТЕВИИ Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley ПРИ ВВЕДЕНИИ В КУЛЬТУРУ В ЦЕНТРАЛЬНОМ ПРЕДКАВКАЗЬЕ по специальности 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«МИХАЙЛОВ РОМАН АНАТОЛЬЕВИЧ ЭКОЛОГО-ФАУНИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ СРЕДНЕЙ И НИЖНЕЙ ВОЛГИ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор И.А. Евланов Тольятти – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.