WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 10 |

«ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ...»

-- [ Страница 4 ] --

• пеноуглерод марки ТУМаН (предоставлен Российским Федеральным Ядерным Центром ВНИИЭФ, Саров, Россия) ТУМаН – конструкционный стеклоуглеродный открытопористый материал, образованный слабо связанными между собой сферическими пористыми углеродными частицами от 1 до 8 мкм, изготавливается заливкой жидкой композиции в форму с последующим отверждением и карбонизацией.

волокнистые углеродные материалы (пр-ва РУП «Светлогорское «Химволокно»,

Беларусь) (Таблица 6):

• карбонизированные углеродные вискозные волокна Карбопон;

• карбонизированная углеродная вискозная ткань Урал ТМ-4;

• активированные вискозные углеродные волокна Карбопон--актив;

композиционные углеродные материалы (Институт катализа им. Г.К. Борескова

СО РАН, Новосибирск, Россия) (Таблица 8):

• керамзит с синтезированным на поверхности слоем каталитического волокнистого углерода (КВУ);

• керамзит с синтезированным на поверхности слоем графитоподобного углерода;

• массивный КВУ углеродные нанотрубки (Институт термохимии, Пермь, Россия) (Таблица 9).

Многослойные углеродные нанотрубки (МУНТ) синтезировали осаждением из газовой фазы природного газа (содержание метана ~ 97 об.%). Осаждение МУНТ проводили на катализаторе, содержащем оксид магния, оксид никеля, оксид кобальта и частицы металлического сплава никеля и кобальта.

Неочищенные МУНТ содержат: С ~ 83,0 вес.%, MgO ~ 16,6 вес.%, Со ~ 0,3 вес.%, Ni ~ 0,1 вес.%.

Образцы МУНТ очищали посредством травления в растворе азотной кислоты (20 вес.%) при кипячении в течение 2 часов. После выдержки раствор промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод (pH 6,5–7) и сушили при 180С в течение 4 часов. Очищенные МУНТ содержат: С ~ 99,3 вес.%, остальное – химически связанный кислород и остаточные примеси Co и Ni (менее 0,1 вес.%).

Для адсорбционной иммобилизации ферментов использовали немодифицированные коммерческие оксиды алюминия (производства ОАО «Катализатор», Новосибирск) (Таблица 10). Для получения углеродсодержащих адсорбентов (С/Al2O3) в Институте катализа им. Г.К. Борескова СО РАН проводили синтез углеродного слоя, в том числе слоя каталитического волокнистого углерода (КВУ-слоя), путем пиролиза водород-пропан-бутана на немодифицированных оксидах алюминия при 600оС в реакторе с неподвижным слоем катализатора в условиях, описанных в работах [57, 58].

Таблица 6 – Характеристика углеродных материалов

–  –  –

Примечание: V – суммарный объем пор, Vми – объем микропор, Vме – объем мезопор, Vма – объем макропор, dма – диаметр макропор, * - межволоконное пространство Таблица 7 – Характеристика карбонизированных носителей

–  –  –

Гидрофобность поверхности носителей определяли по адсорбции нафталина из 0,1 мМ водного раствора. Концентрацию нафталина в водном растворе после 30 мин контакта с углеродсодержащими адсорбентами определяли методом ВЭЖХ на хроматографе LC-10 (“Shimadzu”, Япония) с колонкой Luna 5u C 18(2) 100A (250 4,6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 10 мМ KH2PO4 и 25% ацетонитрила, скорость потока составляла 0,5 мл/мин при температуре 25°C, детекцию проводили при длине волны 200 нм. Гидрофобность поверхности носителей выражали в % адсорбции нафталина.

Гидрофобность поверхности бактериальных клеток оценивали модифицированным BACH-тестом [358] по относительному распределению между водной фазой и фазой гексадекана. К 3 мл суспензии клеток добавляли 0,1, 0,2, 0,5 и 1 мл гексадекана, интенсивно встряхивали в течение 2 мин, оставляли на 30 мин при температуре 30С и определяли ОП540 водной суспензии клеток.

Гидрофобность поверхности клеток определяли как % адсорбции клеток в фазу гексадекана (среднее значение относительного изменения ОП540 клеточной суспензии в водной фазе) [29].

2.6. Реактивы Акриламид, акриловая кислота, нитрил акриловой кислоты, никотинамид, изоникотинамид, пиколинамид, никотиновая кислота, изоникотиновая кислота, пиколиновая кислота, 2-, 3-, 4-цианопиридин, лактамид, D-, L-молочная кислота, фенилглицинонитрил гидрохлорид, D-, L-фенилглицин использовали в качестве субстратов и контролей для ВЭЖХ.

Хитозан (“Sigma”, Япония), бензохинон (“Fluka”, Швейцария), глутаровый альдегид использовали для иммобилизации ферментов.

Каолин (“Merck”) использовали для адсорбционной иммобилизации клеток бактерий.

Набор реактивов ATP Bioluminescent Assay Kit, (“Sigma”, США) использовали для биолюминесцентного анализа АТФ.

Набор реактивов LIVE/DEAD® (Syto 9/пропидиум иодид) BacLightTM Bacterial Viability Kits (“Invitrogen”, США) использовали для определения жизнеспособных и мертвых клеток с помощью флюоресцентной световой микроскопии.

2.7. Определение нитрилгидратазной, нитрилазной и амидазной активностей и эффективности функционирования иммобилизованной системы Удельные нитрил- и амид-трансформирующие активности (ЕД) определяли по концентрации продуктов реакции в мкмоль (ммоль), образуемых 1 мг (1 г) клеток/фермента за 1 мин (1 ч).

Нитрилгидратазную активность клеток оценивали спектрофотометрически экспресс-методом по изменению концентрации акриламида в реакционной среде за 1 мин трансформации акрилонитрила. Ранее было установлено [33], что в интервале длин волн от 230 до 260 нм акриламид и другие алифатические амиды обладают высоким коэффициентом светопоглощения, а светопоглощение алифатических нитрилов незначительно.

Концентрации алифатических амидов определяли по разности оптической плотности реакционной среды при =240 или 260 нм в начале и в конце реакции.

Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro (England).

Нитрилгидратазную, нитрилазную и амидазную активности свободных или иммобилизованных клеток (фермента) определяли по концентрации продукта (соответствующих амидов или карбоновой кислоты) реакции трансформации нитрилов и амидов. Время реакции выбирали экспериментально в зависимости от концентрации биокатализатора и типа ферментативной реакции, реакцию трансформации алифатических нитрилов и амидов останавливали концентрированной HCl до конечной концентрации 5%, ароматических нитрилов и амидов – быстрым замораживанием образца. Если не указано иное, трансформацию алифатических нитрилов проводили при 22–25С, алифатических амидов и ароматических нитрилов и амидов – при 30С. Реакцию проводили в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) с постоянным перемешиванием при 100 об/мин. Концентрацию продуктов реакции определяли методом ВЭЖХ.

Эффективность функционирования иммобилизованной системы () определяли как отношение ферментативной активности иммобилизованных клеток к активности свободных клеток [119].

2.8. Определение массы адгезированных бактериальных клеток

Выращенную до стационарной фазы бактериальную суспензию центрифугировали 20 мин при 10500 g, отмывали однократно 0,01 М калийфосфатным буфером (рН 7,2±0,2), центрифугировали повторно и ресуспендировали в 0,01 М калий-фосфатном буфере. Адгезию бактериальных клеток проводили в течение 0,5–2 ч при 22С из 10 мл бактериальной суспензии, содержащей 1 мг сухих клеток/мл (в ряде опытов – от 0,1 до 4 мг/мл), на 0,2–1 г углеродсодержащих носителей или каолина при постоянном перемешивании на шейкере со скоростью вращения 100 об/мин. Массу клеток в мл суспензии определяли взвешиванием на аналитических весах предварительно высушенной до постоянного веса биомассы в известном объеме суспензии. Массу адгезированных клеток определяли по формуле:

А = m V (ОДисх – ОДфильтр) / ОДисх, где: А – масса адгезированных клеток, мг; m – концентрация клеток в суспензии до адгезии, мг/мл; V – объем суспензии, из которого адгезировали клетки, мл;

ОДисх – оптическая плотность суспензии клеток до адгезии, измеренная при длине волны 540 нм; ОДфильтр – оптическая плотность суспензии клеток после адгезии.

Носитель с адгезированными клетками отмывали 0,01 М калий-фосфатным буфером (рН 7,2±0,2) и хранили в течение 1–3 суток при температуре 4–10С.

2.9. Определение операционной стабильности иммобилизованных биокатализаторов Операционную стабильность биокатализаторов на основе адгезированных клеток нитрилгидролизующих бактерий оценивали по сохранению нитрилгидратазной, нитрилазной и амидазной активностей при последовательном проведении реакции трансформации акрилонитрила или акриламида, вносимого в каждом цикле до концентрации 1,3 и 0,1 М соответственно.

Для иммобилизованного ферментного препарата концентрация субстратов составила 0,58 и 0,05 М соответственно. Продолжительность нитрилгидратазной реакции – 10–20 минут, нитрилазной и амидазной – 24 ч. После проведения реакционного цикла биокатализаторы однократно отмывали 0,01 М калий-фосфатным буфером и использовали в следующем цикле. В качестве контроля определяли операционную стабильность суспендированных клеток. Свободные клетки отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 10000 g, ресуспендировали в 0,01 М калий-фосфатном буфере, рН 7,2±0,2, повторно центрифугировали и использовали в следующем цикле.

2.10. Получение белкового препарата, содержащего ферменты метаболизма нитрилов Получение ферментного препарата, содержащего нтрилгидратазу.

Нитрилгидратазу выделяли из клеток штамма R. ruber gt1, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью. Бактериальную культуру выращивали в колбах объемом 1 л на качалке со скоростью вращения 100 об/мин при 30°С до стационарной фазы роста на минимальной солевой среде N c 0,1% глюкозы и с добавлением хлористого аммония до конечной концентрации 10 мМ. Биомассу центрифугировали 20 мин при 10500 g, отмывали клетки от среды и ресуспендировали в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,2±0,2, содержащем 44 мМ бутират натрия. Клетки разрушали десятикратной обработкой ультразвуком (УЗГ8-0,4/22, ВНИИ ТВЧ г. Санкт-Петербург, Россия) по 15 с при частоте 22 кГц с охлаждением до 0–4°С. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 10500 g и температуре 4°С, затем проводили фракционирование белка сульфатом аммония, последовательно доводя концентрацию до 35 и 60% от насыщающей. В препарате, полученном при 60%-ном насыщении сульфата аммония, содержание фермента составило 72% от общего количества белка.

Количество белка в пробе определяли по методу Бредфорд с красителем Кумасси бриллиантовым синим G-250 [56, 140]. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Нитрилгидратазную активность в пробе определяли спектрофотометрически, как описано выше.

Получение ферментного препарата, содержащего нитрилазу. Клетки штамма P. fluorescens C2, обладающего нитрилазной активностью, выращивали на минеральной солевой среде N в конических колбах объемом 1 л при температуре 30°C и постоянном перемешивании со скоростью вращения 100 об/мин. В качестве источника углерода использовали глюкозу (0,1%), источника азота – ацетонитрил (0,5%). Клеточную суспензию центрифугировали 20 мин при 10500 g, клеточный осадок отмывали фосфатным буфером, содержащим 44 мМ бутират натрия. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,2±0,2, содержащего бутират натрия в указанной концентрации. Разрушение клеток проводили на ультразвуковом дезинтеграторе при 22 кГц 7 раз по 20 сек с охлаждением осадка. Суспензию, содержащую разрушенные клетки, центрифугировали 20 мин при 10500 g с охлаждением (4°С). Высаливание фермента проводили сульфатом аммония до 35% от насыщающей концентрации и центрифугировали 20 мин при 10500 g с охлаждением. Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с бутиратом натрия, концентрацию белка определяли по методике Бредфорд. Нитрилазную активность в образце оценивали спектрофотометрически при 230 нм по возрастанию оптической плотности раствора в течение 1 мин после добавления субстрата акрилонитрила. Ферментный препарат хранили при температуре –18С.

Получение ферментного препарата, содержащего амидазу. R. rhodochrous 4–1, обладающий амидазной активностью, выращивали в колбах объемом 1 л на шейкере со скоростью вращения 150 об/мин при 30°С до стационарной фазы роста на минимальной солевой среде N. В качестве источника углерода использовали глюкозу в концентрации 0,1%, источника азота – ацетонитрил в концентрации 10 мМ. Биомассу центрифугировали 20 мин при 10500 g, отмывали клетки от среды и ресуспендировали в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2±0,2, содержащем 44 мМ бутират натрия.

Клетки разрушали десятикратной обработкой ультразвуком по 15 с при частоте 22 кГц с охлаждением до 0–4°С. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 10500 g и температуре 4°С, затем фракционировали белок сульфатом аммония, последовательно доводя концентрацию до 35 и 60% от насыщающей. Количество белка в пробе определяли по методу Бредфорд. Амидазную активность оценивали спектрофотометрически при 230 нм по возрастанию оптической плотности раствора в течение 1 мин после добавления субстрата акриламида. Ферментный препарат хранили при температуре –18С.

2.11. Иммобилизация ферментов

Адсорбционная иммобилизация ферментов. Адсорбцию нитрилгидратазы и нитрилазы проводили при контакте раствора белка с носителем (немодифицированные оксиды алюминия и углеродсодержащие адсорбенты на их основе; карбонизированные материалы) в течение 24–168 ч в статических условиях при температуре 4–10С. Адсорбцию амидазы на углеродсодержащих носителях Сибуните и СУМС проводили при 22–25°С в течение 2 ч на шейкере со скоростью вращения 100 об/мин. Носитель с адсорбированным ферментным препаратом отмывали 0,01М фосфатным буфером (pH 7,2±0,2) до исчезновения белка в промывных водах. Количество адсорбированного белка определяли по разности концентрации белка в суспензии до и после сорбции.

Ковалентная иммобилизация ферментов на активированном хитозане.

Нитрилгидратазу и нитрилазу иммобилизовали методом ковалентной сшивки с активированным хитозаном. Готовили 2%-ный (вес/об.) раствор хитозана средней вязкости (“Sigma”, Япония) в 2%-ной (об./об.) уксусной кислоте и накапывали с помощью шприца для инъекций объемом 5 мл в 1 М раствор KOH. После затвердевания в течение 1 ч гранулы отмывали однократно 0,01 М калийфосфатным буфером, рН 7,2±0,2. Полученные гранулы активировали 0,1%-ным раствором бензохинона (“Fluka”, Швейцария) в течение 15 мин в объемном соотношении гранул и активатора 1 : 1. Отмывали 3 раза фосфатным буфером, двукратно превышающим объем раствора бензохинона. Активированные гранулы смешивали с ферментным препаратом в соотношении 2,5 : 1, после 40 мин инкубации при 22–25°С отмывали 3 раза фосфатным буфером, пятикратно превышающим объем раствора белка. Количество белка, связанного с активированным хитозаном, определяли по разности концентрации белка в растворе до и после контакта с носителем. Полученный иммобилизованный препарат хранили при температуре от 0 до +10°C.

Получение поперечно-сшитых агрегатов ферментов (ПСАФ). Поперечносшитые агрегаты амидазы готовили фракционированием белка, выделенного при разрушении клеток R. rhodochrous 4–1, сульфатом аммония как описано выше, с одновременной обработкой 0,1% раствором глутарового альдегида либо 0,1% раствором бензохинона при температуре 22–25°С.

2.12. Определение кинетических параметров ферментативных реакций, катализируемых свободными и иммобилизованными ферментами Константу Михаэлиса-Ментен (КМ) и максимальную скорость ферментативной реакции (Vмакс.) вычисляли по графику зависимости активности от концентрации субстрата, построенному в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка (Рисунок 3). Для определения кинетических параметров реакции, катализируемой нитрилгидратазой, проводили реакции трансформации растворов НАК в диапазоне концентраций от 0,015 до 1,36 М в 1–5 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера (рН 7,2±0,2) при 25°С в течение 10 мин, реакцию останавливали добавлением концентрированной HCl до конечной концентрации 5%, концентрацию образующегося акриламида определяли методом ВЭЖХ. Для определения кинетических параметров реакции, катализируемой нитрилазой, проводили реакции трансформации растворов НАК в диапазоне концентраций от 0,06 до 1,3 М в 1–5 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера (рН 7,2±0,2) при 25°С в течение 40 мин, реакцию останавливали, как описано выше. Для определения кинетических параметров реакции, катализируемой амидазой, проводили трансформацию раствора акриламида в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,8 М в 1–5 мл калий-фосфатного буфера (рН 7,2 ± 0,2) при 25°С в течение 60 мин, реакцию останавливали, как описано выше.

1/V 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

–  –  –

Термостабильность фермента определяли следующим образом:

иммобилизованную и нативную нитрилгидратазу в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) прогревали при 40, 50 и 60°С в течение 15, 30, 45 и 60 мин, резко охлаждали на ледяной бане и проводили реакцию трансформации 0,58 М раствора акрилонитрила при 22°С. Иммобилизованную и нативную амидазу в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) прогревали при 50, 60 и 70°С в течение 15, 30, 45 и 60 мин, резко охлаждали на ледяной бане и проводили реакцию трансформации 0,05 М раствора акриламида при 25°С. Определяли нитрилгидратазную и амидазную активность, как описано выше. Константы термоинактивации фермента (Кин) вычисляли по графику зависимости натурального логарифма активности от времени экспозиции при данной температуре и выражали в обратных минутах (мин-1): Кин = tg, где – угол наклона прямой к оси X.

2.14. Определение рН- и температурного оптимумов активности свободных и иммобилизованных ферментов Зависимость активности иммобилизованной нитрилгидратазы и фермента в растворе от температуры определяли при проведении десятиминутной трансформации 0,58 М раствора акрилонитрила при температуре от 10 до 70°С в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) с предварительным нагревом реакционной смеси до внесения субстрата в течение 10 мин. Зависимость активности иммобилизованной и нативной нитрилазы от температуры определяли при проведении трансформации 0,58 М раствора акрилонитрила при температуре от 10 до 80°С в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) в течение 20 мин с предварительным нагревом реакционной смеси до внесения субстрата в течение 10 мин. Зависимость активности иммобилизованной амидазы и фермента в растворе от температуры определяли при проведении часовой трансформации 0,05 М раствора акриламида при температуре от 10 до 80°С в 0,01 М калийфосфатном буфере (рН 7,2±0,2) с предварительной экспозицией реакционной смеси при заданной температуре до внесения субстрата в течение 10 мин. Нагрев и трансформацию субстрата осуществляли в термостате ТС–1/80 СПУ (“Лабтех”, Россия). Реакцию останавливали, как описано выше. Концентрацию акриламида определяли методом ВЭЖХ.

Зависимость активности иммобилизованной и нативной нитрилгидратазы (нитрилазы) от рН реакционной среды изучали при проведении десятиминутной (40-минутной) трансформации 0,58 М раствора акрилонитрила при 22°С в универсальном буфере Теорелла–Стенхагена [7] при рН от 2 до 10,5.

2.15. Определение концентрации АТФ в бактериальных клетках биолюминесцентным методом Определение концентрации АТФ в клетках бактерий, адгезированных на углеродсодержащих адсорбентах. Экстракцию АТФ из суспендированных и иммобилизованных бактериальных клеток грамположительных и грамотрицательных бактерий проводили диметилсульфоксидом (ДМСО) [16]. Для определения концентрации АТФ в адгезированных клетках к 200 мг углеродсодержащих носителей с клетками добавляли 2 мл ДМСО и через 15 мин экспозиции на льду жидкую фазу центрифугировали 2 мин при 15400 g и замораживали надосадочную жидкость. В качестве контроля концентрацию АТФ определяли в клетках суспензии. Для определения концентрации АТФ в клетках, находящихся в суспензии, 1 мл образца центрифугировали 5 мин при 15400 g, удаляли надосадочную жидкость и разрушали клетки 1 мл 90%-ного ДМСО в течение 15 мин на льду. Образцы замораживали и хранили при –18°С.

Использовали стандартный набор реактивов ATP Bioluminescent Assay Kit (“Sigma”, США), образцы разводили в 10 раз, смешивали с люциферинлюциферазным реагентом в соотношении 1 : 1 и измеряли интенсивность свечения на планшетном ридере Infinite M200 pro (“Tecan”, Швейцария).

Определение концентрации АТФ в клетках бактерий, адгезированных на полистероле.

В лунки 96-луночного полистеролового планшета вносили по 100 мкл суспензии R. ruber gt1 (8,0 108 КОЕ/мл) и P. fluorescens C2 (8,2 1011 КОЕ/мл) и через 2 ч инкубации в статических условиях при температуре 22°С определяли КОЕ/мл суспензии. Суспензию удаляли, адгезированные клетки промывали однократно калий-фосфатным буфером, вносили 100 мкл ДМСО и экстрагировали АТФ в течение 15 мин на льду. Исходную суспензию R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 (1 мл) центрифугировали 10 мин при 15400 g, удаляли надосадочную жидкость, вносили 1 мл 90% ДМСО и экстрагировали АТФ 15 мин на льду.

Определение концентрации АТФ в клетках биопленок. Чтобы оценить динамику роста биопленок, в лунки полистерольного 96-луночного планшета вносили среду N (150 мкл) и инокулировали суспензией нитрилутилизирующих бактерий (10 мкл, 2,0±0,2 x 108 КОЕ/мл). Каждые сутки планктонные клетки удаляли из лунок декантацией, отмывали биопленку 200 мкл фосфатного буфера дважды и вносили 100 мкл ДМСО для экстракции АТФ из лунки. После 15 мин экспозиции на льду пробы отбирали, замораживали и хранили при –18С.

Чтобы оценить влияние токсичных субстратов и продуктов ферментативной реакции на биопленки нитрилгидролизующих бактерий, супернатант отделяли от четырехсуточных биопленок и переносили в пустые лунки. Биопленки промывали 150 мкл фосфатного буфера дважды, вносили 150 мкл буфера, в который добавляли акрилонитрил до конечной концентрации 1,3 М, акриламид до концентрации 1,7 М, акриловую кислоту до концентрации 1,3 М. Те же концентрации органических веществ вносили в суспензию планктонных клеток.

После 20 мин экспозиции раствор с биопленок удаляли декантацией, а суспензию центрифугировали в планшетах 20 мин при 2464 g. Супернатант удаляли, к биопленкам и осадку клеток добавляли 100 мкл ДМСО. Через 15 мин пробы отбирали, замораживали и хранили при –18°С.

Чтобы определить концентрацию АТФ по уровню свечения образца, строили калибровочный график, используя данные свечения образцов с известной концентрацией АТФ (Рисунок 4). Концентрацию АТФ в образце определяли, умножая условные единицы свечения образца на коэффициент, полученный из калибровочного графика: k = ctg, где – угол наклона прямой к оси X.

–  –  –

В лунки полистерольного плоскодонного 96-луночного планшета вносили среду N (150 мкл) и инокулировали суспензией нитрилутилизирующих бактерий (10 мкл, 2,0±0,2 x 108 КОЕ/мл). После 1–7 суток инкубации в термостате при 30°С планктонные клетки удаляли из лунок декантацией, отмывали биопленку 200 мкл калий-фосфатного буфера дважды и определяли биопленкообразование по методу окраски с кристаллическим фиолетовым с модификацией [233, 312, 323].

Биопленку окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 40 мин в темноте, удаляли краситель, отмывали окрашенную биопленку 1 раз калийфосфатным буфером и экстрагировали краситель 96% спиртом (200 мкл).

Биопленкообразование оценивали по оптической плотности раствора красителя при 540 нм на планшетном ридере Infinite M200 pro (“Tecan”, Швейцария).

2.17. Высокоэффективная жидкостная и газовая хроматография Концентрацию алифатических нитрилов и амидов (нитрила акриловой кислоты, акриламида, акрилонитрила) определяли методом ВЭЖХ на хроматографе LC-10 (“Shimadzu”, Япония) с колонкой Synergi 4u Hydro–RP 80A (250 4,6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 25 мМ NaH2PO4, скорость потока составляла 0,75 мл/мин при 25°C, детекцию проводили при длине волны 200 нм (Рисунок 5). Также концентрацию алифатических нитрилов и амидов определяли методом ГХ на хроматографе GC-2014 (“Shimadzu”, Япония), оснащенном пламенно-ионизационным детектором. Хроматографическая колонка длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм была заполнена твердым носителем полисорб-1, фракция 0,25–0,5 мм (“Реахим”, Россия). Газ-носитель азот подавался с объемным расходом 35 см3/мин. Температура термостата составляла 190±3°С, температура испарителя 220±10°С.

Концентрацию ароматических нитрилов и амидов (никотиновой кислоты, никотинамида, 3-цианопиридина; изоникотиновой кислоты, изоникотинамида, 4цианопиридина; пиколиновой кислоты, пиколинамида, 2-цианопиридина) определяли методом ВЭЖХ на колонке Luna 5u C 18(2) 100A (250 4,6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 10 мМ KH2PO4 и 25% ацетонитрила, скорость потока составляла 0,5 мл/мин при температуре 25°C, детекцию проводили при длине волны 200 нм (Рисунок 6, 7, 8).

Рисунок 5 – Разделение акриловой кислоты (1), акриламида (2), нитрила акриловой кислоты (3) на колонке Synergi 4u Hydro–RP 80A Рисунок 6 – Разделение никотиновой кислоты (1), никотинамида (2), 3цианопиридина (3) на колонке Luna 5u C 18(2) 100A Рисунок 7 – Разделение изоникотиновой кислоты (1), изоникотинамида (2) и 4цианопиридина (3) на колонке Luna 5u C 18(2) 100A Рисунок 8 – Разделение пиколиновой кислоты (1), пиколинамида (2) и 2цианопиридина (3) на колонке Luna 5u C 18(2) 100A Концентрацию фенилгилицинонитрила и D-, L-фенилглицина определяли на колонке CROWNPAK® CR(-). В качестве элюента использовали раствор HClO4 (pH 2,0) и 10% метанола, скорость потока составляла 0,300 мл/мин при 30°C, детекцию проводили при длине волны 210 нм (Рисунок 9).

Рисунок 9 – Разделение L-фенилглицина (1), D-фенилглицина (2) и фенилглицинонитрила (3) на колонке CROWNPAK® CR(-)

–  –  –

Сканирующая электронная микроскопия. Визуализацию адгезированных на углеродсодержащих носителях бактериальных клеток проводили в сканирующем электронном микроскопе марок JSM 6460 LV (“Jeol”, Япония) и LEO 1430 (“LEO”, Германия) в Институте катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, Новосибирск; MIRA 3 (“TESCAN”, Чехия) в демонстрационно-методическом центре TESCAN, Санкт-Петербург; JSM 7500F (“Jeol”, Япония) на кафедре минералогии и петрографии геологического факультета ГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» при ускоряющем напряжении 10–30 кВ. Образцы носителей с адгезированными клетками высушивали на воздухе и просматривали в сканирующем электронном микроскопе без каких-либо дополнительных модификаций.

Элементно-структурный анализ носителей выполнен с помощью системы рентгеновского энергодисперсионного микроанализа Oxford Instruments Advanced AztecEnergy с безазотным детектором X-max 20 Standard в сканирующем электронном микроскопе MIRA 3 (“TESCAN”, Чехия).

Световая фазовоконтрастная микроскопия. Неокрашенные биопленки бактерий на полиэтилене изучали в световом микроскопе Leica DM LS (Германия) с фазовым контрастом при увеличении 1000 раз.

Флюоресцентная микроскопия. Биопленки выращивали в чашках Петри на предметных стеклах (2575 мм), погруженных в синтетическую минеральную среду N, инокулированную клетками соответствующего штамма. Биопленки бактерий и суспендированные клетки окрашивали красителем LIVE/DEAD® (Syto 9/пропидиум иодид) BacLightTM Bacterial Viability Kits (“Invitrogen”, США) из расчета 3 мкл смеси красителя на 1 мл физиологического раствора (0,85% NaCl), инкубировали в темноте в течение 20 мин и просматривали в световом микроскопе Leica DM LS с флюоресценцией.

Образцы носителей Световая просвечивающая микроскопия.

просматривали в световом микроскопе Биомед-6 (Россия) при увеличении 40 раз, микрофотографии обрабатывали в программе Thixomet Lite и определяли размер и площадь поверхности частиц. В случае если размер частиц превышал 1,5 мм, дисперсность оценивали с использованием стереомикроскопа SKT-3BT (Meiji techno, Япония) при увеличении 20 раз.

Профилометрия. Шероховатость поверхности носителей определяли с помощью интерференционного микроскопа NewView 5000 (Германия) – бесконтактного оптического трехмерного профилометра высокой точности, измерения проводили на базе лаборатории физических основ прочности Института механики сплошных сред УрО РАН (г. Пермь). Изображения поверхности получали при увеличении 1300 и 2000 раз. Определяли показатель Ra шероховатость, как среднее арифметическое абсолютных значений высоты, отсчитываемых от центральной линии, и rms среднее квадратичное отклонение от центральной линии.

2.19. Статистическая обработка

Все опыты повторяли не менее трех раз. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение, доверительные интервалы, достоверность различий определяли с использованием критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости p0.05.

Анализ результатов проводили с помощью стандартных пакетов лицензионных программ MS Excel 2003 и Statistica.

Вид распределения исследуемых признаков определяли с использованием критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Для исследования связи двух признаков в случае нормального распределения вычисляли коэффициент корреляции Пирсона (r), при этом статистическая достоверность рассчитывалась при уровне значимости p=0,05. При распределении признаков, отличном от нормального, вычисляли непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена (R), при этом достоверными считали связи при p0,05. Степень корреляции оценивали в зависимости от значения коэффициента |R|0,3 – слабая корреляция, 0,3 |R|0,70 – умеренная корреляция, |R|0,70 – сильная корреляция.

ГЛАВА 3. БИОКАТАЛИЗ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

АДГЕЗИРОВАННЫМИ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

Гетерогенные биокатализаторы трансформации алифатических и ароматических нитрилов были разработаны на основе выращенных до стационарной фазы роста клеток нитрилгидролизующих актино- и гаммапротеобактерий, адгезированных на неорганических носителях (углеродсодержащих активированных и неактивированных материалах различных технологических форм – дробленых, гранулированных, порошкообразных, волокнистых; минеральных носителях с углеродом, синтезированным на поверхности; многослойных углеродных нанотрубках; на каолине). Необходимым требованием для успешного приготовления иммобилизованных биокатализаторов такого типа была высокая сорбционная емкость носителей по отношению к бактериальным клеткам, отсутствие диффузионных ограничений, минимальная адсорбция субстрата и продукта ферментативной реакции на носителе.

Соблюдение этих требований позволило осуществить эффективную трансформацию нитрилов в соответствующие амиды и карбоновые кислоты с сохранением, а в некоторых случаях с повышением исходной ферментативной активности суспендированных клеток, а также добиться повышения операционной стабильности биокатализатора по сравнению с клетками в суспензии.

3.1. Адгезия бактериальных клеток на носителях

Клетки выращенной до стационарной фазы роста пятисуточной суспензии R. ruber gt1 (=0,0037 ч-1) и R. erythropolis 11–2 (=-0,0009 ч-1) (Рисунок 10), однократно отмытые 0,01 М калий-фосфатным буфером (рН 7,2±0,2) и ресуспендированные в том же буфере до конечной концентрации 1 мг/мл, были адгезированы на неорганических углеродсодержащих носителях (Рисунок 11, 12).

–  –  –

0.8 0.5 0.7 0.6 0.4 =540 =540 0.5 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1

–  –  –

Рисунок 11 – Адгезия клеток R. ruber gt1 на углеродсодержащих носителях: Урал ТМ-4 (а), Сибунит (б), уголь-сырец (в), Карбопон (г), БАУ (д), «Сапропель» (е)

–  –  –

В Рисунок 12 – Адгезия клеток R. erythropolis 11–2 на БАУ (а) и угле-сырце (б) Сравнивали массу клеток R. ruber gt1, адгезированных из суспензии концентрацией 1 мг/мл на углеродных носителях различных технологических форм, различающихся по пористости, дисперсности и гидрофобности поверхности. Как показано в таблице 11, наибольшая масса адгезированных клеток родококков, достигающая 13–15 мг АСБ/г сорбента, наблюдалась на активных дробленых углях БАУ, ФТД, Norit PK 1-3 и угле-сырце. На волокнистых углеродных материалах – Карбопоне, Урал ТМ-4, а также углеродном материале ФАС адгезировалось меньшее количество клеток – 7,5, 9,5 и 8 мг АСБ/г сорбента, соответственно. Максимальное количество клеток адгезировалось на углеродном тканом материале «Урал» лишь через 1 сутки инкубирования, тогда как на других изученных углеродных носителях максимум достигался в течение получаса.

Таблица 11 – Масса адгезированных клеток R. ruber gt1 на углеродных материалах

–  –  –

Известно, что процесс адсорбции клеток предшествует их необратимой адгезии [43] и зависит от площади доступной поверхности, которая слагается в основном из поверхности макропор, превышающих по размерам микробную клетку [13, 24]. Активированный уголь БАУ обладает развитой системой макропор (1,35–1,45 см3/г), что составляет 80–82% от общего объема пор (Таблица 6). Диаметр макропор изученных носителей находится в диапазоне от 2 до 40 мкм, что обеспечивает эффективную адсорбцию клеток, размер которых 1–7 мкм. Показано, что дисперсное состояние углеродных носителей также имеет значение для процесса адсорбции клеток. Так, мелкодисперсность ФТД и порошкообразного угля-сырца обеспечивала связывание клеток родококков, сравнимое с БАУ. Среди изученных сорбентов, нетканый материал Карбопон имеет меньший суммарный объем пор – 0,60–0,68 см3/г, а у ФАС и активной ткани Урал ТМ-4 суммарный объем микро- и мезопор превышает объем макропор, что отражается на процессе адсорбции клеток. В дальнейшем в работе были изучена корреляция массы адгезированных бактериальных клеток и свойств носителей (дисперсности и гидрофобности поверхности).

На основании того, что неспецифическая адсорбция предшествует адгезии бактериальных клеток, зависимость количества адгезированных клеток от их концентрации в суспензии была представлена в виде изотерм адсорбции. В случае взаимодействия клеток штамма R. ruber gt1 с поверхностью носителей было установлено, что на композиционных углерод-минеральных носителях изотермы адсорбции имеют вид изотерм Лэнгмюра, и на кривых наблюдается характерное плато, соответствующее образованию монослойного покрытия из адсорбированных бактериальных клеток – насыщению поверхности носителя клетками (Рисунок 13, а). Исследования показали, что максимальной адсорбционной способностью по отношению к клеткам R. ruber gt1 обладают углеродные носители семейства «Сапропели» и Сибунит (Рисунок 13, б), масса адгезированных клеток на данных носителях достигала 20–25 мг/г. Для «Сапропеля», как показали расчеты, от 50 до 100% поверхности были доступны для адгезии родококков благодаря макропористой структуре данного носителя, в которой преобладали поры размером 2–4 мкм. Для мезопористых носителей Сибунита и КВУ доступная для адгезии родококков поверхность составляла не более 10% от величины S УД БЭТ (Таблица 7, 8). Для всех носителей было найдено, что при начальной концентрации клеток в суспензии 0,2–0,3 мг/мл на поверхности закрепляется до 90% бактерий от их общего числа в суспензии, тогда как при концентрации клеток 2,7 мг/мл – лишь от 20 до 50% клеток в зависимости от носителя.

–  –  –

Рисунок 13 – Зависимость массы клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродминеральных (а) и углеродных носителях (б), от концентрации клеток в суспензии: 1 – керамзит с КВУ-слоем, 2 – керамзит с Г-слоем, 3 – стеклопена с КВУ-слоем, 4 – «Сапропель», 5 – Сибунит, 6 – массивный КВУ Было обнаружено, что на всех изученных носителях при увеличении времени контакта бактериальной суспензии с адсорбентами количество адгезированных клеток возрастает в 2–3 раза (Таблица 12), что указывает на склонность родоккоков к агрегации, подтвержденной также электронномикроскопическим исследованием (Рисунок 11). Таким образом, адсорбционную способность изученных носителей по отношению к клеткам родококков можно повысить как путем увеличения продолжительности контакта клеток с носителем, так и увеличением концентрации клеточной суспензии.

Таблица 12 – Адсорбционные свойства углеродсодержащих носителей по отношению к клеткам R. ruber gt1 и акриламиду

–  –  –

Изучена адгезия клеток R. erythropolis 11-2 на активном угле БАУ. По типу изотермы можно заключить, что процесс взаимодействия описывается теорией полимолекулярной адсорбции Брунауэра, Эммета, Теллера (БЭТ) и предполагает формирование полислоя клеток на поверхности с высоким адсорбционным потенциалом [26].

Масса адгезированных

–  –  –

Рисунок 14 – Зависимость массы адгезированных на БАУ клеток R. erythropolis 11-2 от концентрации клеток в суспензии По-видимому, в том случае, когда концентрация клеток в суспензии не превышает 0,75 мг/мл, имеет место монослойная адсорбция, т.к. в диапазоне концентрации от 0,09 до 0,75 мг/мл количество адсорбированных клеток не возрастает и составляет 7,3–7,5 мг клеток на 1 г сорбента (Рисунок 14). Но при дальнейшем увеличении концентрации клеток в суспензии величина адсорбции начинает линейно возрастать, достигая 63 мг/г при плотности суспензии 3,9 мг/мл. В этом диапазоне концентрации клеток в суспензии происходит полислойная адсорбция, что может в дальнейшем приводить к затруднениям массообмена при трансформации органических веществ.

Адгезия клеток штаммов P. fluorescens С2 и R. ruber gt1 на волокнистых углеродных адсорбентах была изучена в сравнительном аспекте. Псевдомонады и родококки неслучайно были выбраны в качестве модельных организмов для изучения процесса адгезии на нерастворимых неорганических материалах – главным образом, это связано с тем, что нитрилутилизирующие представители этих родов относятся к различным группам: гамма-протеобактерии Pseudomonas sp. – грамотрицательны, актинобактерии Rhodococcus sp. – грамположительны.

Кроме того, по BACH-тесту оценивалась гидрофобность поверхности клеток исследуемых штаммов [29, 358]. Определено, что относительная гидрофобность клеток R. ruber gt1 и R. erythropolis 11-2, оцененная по сродству к гексадекану, составляет в среднем 41–52%, т.е. около половины клеток суспензии при смешивании с гексадеканом переходит в гидрофобную фазу. Поверхность P. fluorescens С2, наоборот, гидрофильна, т.к. в среднем не более 6% клеток этого штамма переходят в фазу гексадекана. Известно, что адгезивная активность микроорганизмов определяется свойствами клеточной поверхности, прежде всего ее гидрофобностью, и в свою очередь, степень гидрофобности микробных клеток зависит от содержания липидов в клеточной стенке [64]. Нами было показано, что клетки родококков, имеющие гидрофобную поверхность, лучше адгезируются на гидрофобной поверхности углеродных носителей, чем клетки псевдомонад (Рисунок 15). По характеру графиков зависимости массы адгезированных клеток от их начальной концентрации в суспензии можно сделать вывод о насыщении адсорбента клетками, которое наступает при достижении концентрации суспензии P. fluorescens С2 0,15 мг АСБ/мл и R. ruber gt1 – 1–1,5 мг АСБ/мл.

Масса адгезированных клеток на активированном Карбопоне была выше, чем на неактивированном, из чего можно заключить, что активация носителя позволяет увеличить его способность связывать клетки бактерий.

–  –  –

Рисунок 15 – Зависимость массы клеток R. ruber gt1 (а) и P. fluorescens С2 (б), адгезированных на углеродных волокнистых материалах, от концентрации клеток в суспензии: 1 – Карбопон–B–актив, 2 – Карбопон, 3 – Урал ТМ–4 Т.к. по данным BACH-теста клетки P. fluorescens С2 имеют гидрофильную поверхность, можно предположить лучшее сродство клеток к гидрофильному, а не гидрофобному носителю. В качестве такого носителя был выбран каолин – высокодисперсная пластичная порода, состоящая в основном из минерала каолинита (гидросиликата алюминия), которая представляет собой мелкие гидрофильные частицы пластинчатого строения с толщиной пластинок 0,1–3,0 мкм [35].

Показано, что зависимость массы адгезированных клеток P. fluorescens С2 от их начальной концентрации в суспензии близка к линейной. При концентрации клеток в суспензии 3 мг/мл (по сухой биомассе) масса адгезированных клеток достигает 47 мг АСБ на 1 г носителя (Рисунок 16).

Ярко выраженная способность клеток бактерий данного штамма к адгезии на каолине, возможно, связана с высокой дисперсностью материала и сродством гидрофильных поверхностей клеток и носителя. Таким образом, приведенные выше примеры подтверждают, что одним из факторов успешной адгезии бактериальных клеток на нерастворимом носителе является совпадение степени гидрофобности поверхности клетки и носителя. Действительно, движущей силой адсорбционного процесса на низкоэнергетических незаряженных поверхностях являются гидрофобные взаимодействия [60]. Однако формирование полислоя клеток родококков было обнаружено только на активированном адсорбенте БАУ.

3.1.1. Взаимодействие бактериальных клеток с многослойными углеродными нанотрубками Изучено взаимодействие бактериальных клеток с нанообъектами – многослойными углеродными нанотрубками (МУНТ). Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что в присутствии МУНТ бактериальные клетки образуют агрегаты, а углеродные нанотрубки адсорбируются на поверхности отдельных клеток и их агрегатов (Рисунок 17). Характер взаимодействия не зависит от типа клеточной стенки и одинаков как для грамположительных (R. gt1, 11–2), так и для ruber R. erythropolis грамотрицательных (A. faecalis 2) бактерий. Экспериментально подтверждено, что агрегаты клеток бактерий с нанотрубками представляют собой гетерогенный биокатализатор и легко отделяются от реакционной среды фильтрованием через бумажный фильтр «красная лента».

Определено количество бактериальных клеток, которые связываются неочищенными и очищенными нанотрубками (Рисунок 18). Показано, что как грамположительные (R. ruber gt1, R. erythropolis 11–2), так и грамотрицательные (P. fluorescens C2, A. faecalis 2) бактерии лучше связываются неочищенными нанотрубками, причем процент связывания наиболее высок для клеток R.

erythropolis 11–2 – 94 и 88% соответственно, и ниже для P. fluorescens C2 – 58 и 37% соответственно.

а 2 б

–  –  –

Б Рисунок 17 – Агрегация клеток R. erythropolis 11–2 (а, б) и A. faecalis 2 (в, г) в присутствии углеродных нанотрубок: 1 – МУНТ, 2 – клеточные агрегаты, 3 – отдельные клетки, покрытые нанотрубками А Концентрация клеток, мг/г

–  –  –

Адгезия бактериальных клеток на нерастворимых носителях является результатом взаимодействия двух факторов – свойств клеточной поверхности и характеристик самого материала, на котором закрепляются клетки.

Следовательно, для изучения этого процесса необходимо определение основных свойств носителей, таких как гидрофобность, дисперсность, шероховатость и элементный состав.

Гидрофобность углеродсодержащих носителей оценивали по адсорбции нафталина из 0,1 мМ водного раствора (Таблица 13).

Исходя из данных адсорбции гидрофобного нафталина на изученных носителях, наиболее гидрофобным является активированная углеродная ткань Карбопон-В-актив и активный уголь Norit PK 1-3, не адсорбирует нафталин массивный КВУ, а минимальная адсорбция этого вещества наблюдается на пеностекле со слоем каталитического волокнистого углерода. Корреляционный анализ (n=14) выявил статистически значимую положительную связь между гидрофобностью адсорбента и массой адгезированных клеток родококков, имеющих гидрофобную клеточную стенку (r=0,679; p=0,05). Корреляция в данном случае может быть оценена как умеренная.

Также определяли массу адгезированных клеток штаммов бактерий, различающихся гидрофобностью клеточной стенки, на носителях с различной гидрофобностью поверхности (Таблица 14). Оценивали корреляцию массы адгезированных клеток Pseudomonas fluorescens C2 (гидрофобность поверхности 5,9%), Acinetobacter guillouiae 11h (4,8%), Alcaligenes faecalis 2 (18,5%), Rhodococcus erythropolis 11-2 (41,1%) с гидрофобностью носителей. Так, для штамма Pseudomonas fluorescens C2, поверхность клеток которого была оценена как гидрофильная, отмечали умеренную отрицательную связь между массой адгезированных клеток и гидрофобностью носителей (r= –0,664; p=0,05), что может быть объяснено тем, что все носители в той или иной мере были гидрофобны (от 20 до 92%). В то же время, для других штаммов распределение признаков было отличным от нормального, а корреляция была недостоверной.

Это может быть связано с тем, что на адгезию влияют и другие свойства носителей, а именно дисперсность, удельная поверхность и размер макропор.

Однако, при оценке зависимости массы адгезированных клеток изученных штаммов, отличающихся гидрофобностью поверхности, на каждом из изученных углеродсодержащих носителей, была выявлена сильная положительная связь от r=0,884 до r=0,950 (p=0,05). Это может свидетельствовать о том, что при адгезии на гидрофобном носителе масса прикрепившихся клеток тем выше, чем больше гидрофобность их поверхности.

Таблица 13 – Корреляция массы адгезированных клеток R. ruber gt1 с гидрофобностью носителей, выраженной в % адсорбции нафталина (M±m)

–  –  –

Шероховатость поверхности носителей (Таблица 16) оценивали на бесконтактном оптическом трехмерном профилометре высокой точности – интерференционном микроскопе NewView 5000 (Германия). Определяли шероховатость (Ra) и среднее квадратичное отклонение (rms). Оценивали корреляцию массы адгезированных клеток R. ruber gt1 и шероховатости поверхности углеродсодержащих носителей. Был рассчитан непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена: R= –0,276, но при этом p=0,47, что говорит о недостоверности этой связи. Следовательно, нельзя делать заключение о взаимосвязи этих двух параметров. Вероятно, отсутствие достоверной связи этих параметров является следствием влияния множества факторов на адгезию бактериальных клеток на нерастворимом носителе, из которых изменение шероховатости поверхности адсорбента в изученных пределах не является определяющим.

Таблица 16 – Шероховатость носителей

–  –  –

ФАС 145 110 Элементный состав двух отличающихся по происхождению носителей – карбонизированной ткани Урал ТМ-4 (исходное сырье – вискозное волокно) и «Сапропеля» активированного (исходное сырье – ил пресных озер Омской области) был изучен в сканирующем электронном микроскопе MIRA 3 (“TESCAN”, Чехия) с помощью системы рентгеновского энергодисперсионного микроанализа. Показано, что основным элементом карбонизированной ткани Урал ТМ-4 является углерод (Рисунок 19), тогда как «Сапропель» более сложен по элементному составу, и содержит Si, O, K, Na, Mg, Al, Ca, S, Fe и другие элементы, что может быть объяснено органической природой этого носителя (Рисунок 20). Можно выдвинуть предположение, что элементный состав носителя оказывает определенное воздействие на физиологическое состояние адгезированных клеток, следовательно, тоже должен быть учтен при выборе оптимального носителя клеток в гетерогенном биокатализе.

Рисунок 19 – Элементный состав карбонизированной ткани Урал ТМ-4 Рисунок 20 – Элементный состав носителя «Сапропель»

–  –  –

В процессе биокаталитического синтеза важным этапом является отделение конечного продукта ферментативной реакции от биокатализатора. В случае использования иммобилизованных каталитически активных клеток необходимо учитывать связывание полученного продукта с сорбентом. Сорбционная емкость углеродных носителей по отношению к акриламиду представлена в таблице 17.

Показано, что носители с иммобилизованными клетками адсорбировали меньше акриламида, чем свободные от клеток. Разность между адсорбцией продукта реакции свободными носителями и носителями, содержащими клетки, была достаточно велика для дробленого активного угля БАУ (22 и 7 мг/г сорбента соответственно). Сорбция акриламида на угле-сырце практически отсутствовала.

Уменьшение адсорбции акриламида на носителе при иммобилизации клеток, вероятно, объясняется тем, что иммобилизованные клетки блокируют доступ к части микропор, в которых, главным образом, адсорбируются низкомолекулярные органические соединения. Суммарный объем пор угля-сырца в основном представлен макропорами, что объясняет малые величины адсорбции молекул акриламида и полное отсутствие его адсорбции после предварительной иммобилизации клеток.

Было показано, что акриламид не адсорбируется на КВУ и графитоподобном углероде, но в небольшом количестве адсорбируется на Сибуните и «Сапропеле» – 5,31 и 3,92 мг/г носителя соответственно (Таблица 12).

Таблица 17 – Адсорбция акриламида на углеродных носителях, мг/г (M±m)

–  –  –

Изучена адсорбция ароматических нитрилов (цианопиридинов) и соответствующих амидов и карбоновых кислот, образующихся при ферментативном гидролизе этих нитрилов. В отличие от алифатических органических веществ, ароматические соединения адсорбировались на активированных носителях (БАУ, Карбопон-В-актив) в большей степени. Так, на БАУ адсорбировалось до 90 мг/г 3-цианопиридина и до 78 мг/г никотинамида (Таблица 18). Определено, что на 0,5 г БАУ за 40 мин адсорбируется 74% 100 мМ раствора никотинамида и 86% 100 мМ раствора 3-цианопиридина. На 0,2 г Карбопон-В-актив за то же время адсорбировалось 11 и 32%; на 0,2 г «Сапропеля» – 6 и 10% соответственно.

Таблица 18 – Адсорбция ароматических нитрилов, амидов и карбоновых кислот на неорганических носителях, мг/г (M±m)

–  –  –



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 10 |

Похожие работы:

«Берко Татьяна Владимировна ПРОДУКТИВНОСТЬ И ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЕ КАЧЕСТВА ПТИЦЫ РОДИТЕЛЬСКОГО СТАДА КРОССА «ХАЙСЕКС КОРИЧНЕВЫЙ» ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В КОРМЛЕНИИ ТЫКВЕННОГО ЖМЫХА, ОБОГАЩЕННОГО БИОДОСТУПНОЙ ФОРМОЙ ЙОДА 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Лямина Наталья Викторовна УДК 591.148:574.52(262.5) ДИНАМИКА ПАРАМЕТРОВ ПОЛЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В ЧЁРНОМ МОРЕ И ИХ СОПРЯЖЁННОСТЬ С ФАКТОРАМИ СРЕДЫ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор Ю. Н. Токарев Севастополь 2014 г. СОДЕРЖАНИЕ Стр. ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ. ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ ИСТОРИЯ...»

«УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических...»

«БИТ-САВА Елена Михайловна МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЛЕЧЕНИЯ BRCA1/СНЕК2/BLM-АССОЦИИРОВАННОГО И СПОРАДИЧЕСКОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Специальности: 14.01.12 – онкология 03.01.04 – биохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор, член-корр. РАН В.Ф. Семиглазов Научный консультант:...»

«Минаева Наталья Викторовна Отдаленные последствия высокодозной химиотерапии и аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами 14.01.21 – гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель...»

«Кузнецов Василий Андреевич ПОЧВЫ И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПАРКОВО-РЕКРЕАЦИОННЫХ ЛАНДШАФТОВ МОСКВЫ Специальность 03.02.13-почвоведение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, И.М. Рыжова Москва-2015 Содержание Введение Глава 1. Влияние рекреации на лесные экосистемы (Литературный обзор) 1.1.Состояние проблемы 1.2....»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» НА ПРАВАХ РУКОПИСИ НИКУЛИНА НЕЛЯ ШАМИЛЕВНА ПРОДУКТИВНЫЕ КАЧЕСТВА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КОРОВ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОДЫ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ ДОБАВКИ «БИОГУМИТЕЛЬ-Г» 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«БАБЕШКО Кирилл Владимирович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОЧТЕНИЯ СФАГНОБИОНТНЫХ РАКОВИННЫХ АМЕБ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ГИДРОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА БОЛОТ В ГОЛОЦЕНЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Цыганов...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ И ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск...»

«Кузнецова Татьяна Сергеевна ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РЕФРАКЦИОННОГО РЕГРЕССА ПОСЛЕ ЭКСИМЕР-ЛАЗЕРНОЙ КОРРЕКЦИИ БЛИЗОРУКОСТИ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ПРИ МЕХАНИЧЕСКОЙ И ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ ТЕХНОЛОГИЯХ ФОРМИРОВАНИЯ ЛОСКУТА РОГОВИЦЫ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«БОЛГОВА Светлана Борисовна РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Антипова...»

«БУЛГАКОВА МАРИНА ДМИТРИЕВНА КАТАЛЕПТОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ГАЛОПЕРИДОЛА У КРЫС И ЕЕ ИЗМЕНЕНИЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЯИЧНИКОВ И НАДПОЧЕЧНИКОВ 14.03.06 Фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.