WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 10 |

«ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ...»

-- [ Страница 3 ] --

Иммобилизация является наиболее часто используемой стратегией, позволяющей увеличить операционную стабильность биокатализатора, улучшить операционный контроль, более легко отделять продукт от реакционной среды и избежать его загрязнения биокатализатором, а также разрабатывать различные модификации реакторов [238, 353]. В результате связывания фермента на носителе были созданы гетерогенные катализаторы, для которых в 1971 г. был введен термин “иммобилизованные ферменты” [6]. Первое применение иммобилизованных ферментов в промышленности было описано в 1967 г. Chibata с соавторами, которые получили иммобилизованную аминоацилазу Aspergillus oryzae для разделения синтетической рацемической смеси D,L-аминокислот [142].

С появлением иммобилизованных ферментов открылись принципиально новые перспективы перед прикладной энзимологией. Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных положительных характеристик при использовании их в прикладных целях, по сравнению с нативными предшественниками [6, 150]:

1. Гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в нужный момент, использовать катализатор повторно, получать продукт, не загрязненный ферментом, что особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств.

2. Использование гетерогенных катализаторов позволяет проводить ферментативный процесс непрерывно, например, в проточных колоннах, и регулировать скорость катализируемой реакции, а также выход продукта путем изменения скорости потока, и в целом облегчить конструкцию реактора.

3. Иммобилизация или модификация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности, зависимости каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды и, что очень важно, его стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям.

4. Иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя.

Разнообразие процессов (как отражение разнообразия субстратов, типа реакций, конфигураций реактора и проточных процессов) обязательно требует разработки специфичных иммобилизованных ферментов, которые могут соответствовать требованиям данного процесса. Основными задачами

при разработке иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов являются выбор подходящего носителя (определяемый как некаталитическая часть иммобилизованного фермента), условий (рН, температуры и характера среды) и самого фермента [150].

При работе с мультимерными энзимами проблема стабилизации становится главной. Одной из самых интересных и важных задач является предотвращение диссоциации субъединиц [205, 232].

Природа препарата иммобилизованного фермента, очевидно, зависит от характера содержащего фермент носителя. Включение фермента осуществляют различными способами: фермент может быть ковалентно связан с носителем, адсорбирован на нем или физически включен в нее [73, 100, 232].

В начале 60-х гг XX века исследования в области твердофазной химии протеинов позволили заключить, что поперечная сшивка поверхностных аминогрупп растворенных ферментов с бифункциональным реагентом, таким как глутаровый альдегид, приводит к образованию поперечно-сшитых нерастворимых ферментов (CLEs), сохраняющих свою каталитическую активность. Тем не менее, этот метод имел множество недостатков, среди которых низкая активность, низкая механическая стабильность, трудности в использовании. В 1964 г. Quiocho и Richards показали, что поперечно-сшитые кристаллизованные ферменты (CLECs) сохраняли свою активность. Использование CLECs в качестве промышленных биокатализаторов было начато в 1990-х гг компанией Vertex Pharmaceuticals и в дальнейшем коммерциализировано Altus Biologics. Первые исследования были выполнены на CLECs термолизина (КФ 3.4.24.4), представляющего интерес в производстве аспартама, а затем методика была применена к широкому ряду ферментов [369]. CLECs были устойчивы к денатурации и нагреванию, органическим растворителям и протеолизу, высокоактивны и удобны в использовании. Главным их недостатком была необходимость кристаллизовать фермент, что требовало его высокой чистоты. С другой стороны, было хорошо известно, что добавление солей, органических растворителей или неионных полимеров к водным растворам белков приводит к осаждению их агрегатов без нарушения структуры и денатурации.

Последующая поперечная сшивка полученных агрегатов делает их нерастворимыми, обеспечивает поддержание их суперструктуры, и, следовательно, каталитической активности. Разработка этого подхода дала начало новому семейству иммобилизованных ферментов, которое получило название «поперечно-сшитые агрегаты ферментов» (CLEA®) [88, 368]. Т.к. осаждение ферментов из водных растворов при добавлении сульфата аммония или полиэтиленгликоля часто использовалось как один из этапов их очистки, методология CLEA объединила очистку и иммобилизацию в один этап. К настоящему времени созданы препараты CLEA различных ферментов: липаз, пенициллин G амидазы, нитрилаз, эстераз, протеаз, аминоацилаз, гликозидаз, оксидоредуктаз [368, 369].

Разработана новая технология получения структурированных самоиммобилизованных ферментов – сферозимов [284, 285, 375]. Этот метод заключается в формировании сферических каталитически активных макрочастиц, названных авторами «сферозимы», который происходит в водно-масляной эмульсии. Этот метод первоначально был разработан для липаз, обладающих гидрофобной поверхностью, активный центр которой также окружен гидрофобным кольцом, создаваемым определенными аминокислотами. В эмульсии эти белки имеют тенденцию локализоваться и ориентироваться на сферической поверхности эмульсионной капли. Последующая поперечная сшивка белка приводит к формированию самоиммобилизованной частицы [375].

Иммобилизация часто приводит к резким изменениям измеряемых параметров ферментативной реакции. Это относится, например, к максимальной скорости реакции, константе Михаэлиса, оптимумам температуры и рН, влиянию ингибиторов. Степень и природа этих изменений зависят не только от использованного метода иммобилизации, но и от типа ферментативной реакции [73].

Хотя иммобилизация ферментов развивалась в соответствии с требованиями производств, следует отметить, что преимущества прикрепления ферментов к поверхности используются живой клеткой. Прикрепление ферментов к подходящей поверхности обеспечивает их локализацию в определенном месте, где требуется их активность. Иммобилизация увеличивает концентрацию фермента и может защитить его от разрушения [142].

Различные методы иммобилизации и стабилизации были применены для нитрилаз, нитрилгидратаз и амидаз. Данные, касающиеся иммобилизации ферментов метаболизма нитрилов, обобщены в таблице 5.

Таблица 5 – Иммобилизация ферментов метаболизма нитрилов

–  –  –

В исследовательских работах по иммобилизации гидролаз, описанных в научной литературе последних десятилетий, первенство по количеству ссылок принадлежит методу поперечно-сшитых агрегатов ферментов (cross-linked enzyme aggregates, CLEAs). Методика получения CLEAs ферментов, основы которой были разработаны и описаны R.A. Sheldon, в ряде работ была применена для иммобилизации нитрилазы [175, 242, 377]. Известно, что нитрилазы являются довольно чувствительными фермантами из-за присутствия остатков цистеина в каталитическом центре. Поэтому создание активного и стабильного биокатализатора на основе этих ферментов остается актуальной задачей, одним из решений которой является их иммобилизация [242]. Большинство нитрилаз довольно неустойчивы в растворе, и жесткие условия реакции во время иммобилизации могут нанести ущерб их активности. Тем не менее, некоторые мягкие методы пригодны для этой цели, в первую очередь это касается получения CLEAs [283].

C. Mateo и R.A. Sheldon с сотрудниками исследовали влияние кислорода на три различные нитрилазы. В течение 40 ч происходила 50–100% потеря активности ферментов, в то время как в присутствии аргона активность нитрилаз была полностью сохранена. Такое влияние кислородного фактора обычно связывают с аутоокислением каталитического центра этих ферментов.

Инактивации нитрилаз кислородом можно избежать с помощью бескислородной среды, но такая среда является серьезным ограничением для работы реактора.

Возможным решением является окружение молекул фермента гидрофильной оболочкой для снижения концентрации кислорода только в микроокружении фермента.

Для достижения такого эффекта была проведена адсорбция ферментов на носителях, активированных полиэтиленимином, в результате чего за счет высаливающего эффекта этих катионных полимеров были достигнуты хорошие результаты по стабилизации фермента в отношении вредного воздействия органических растворителей. Предполагается, что этот эффект был обусловлен снижением концентрации органического растворителя вокруг молекул фермента.

Несмотря на высокую эффективность такого биокатализатора, его подготовка является многоступенчатой и довольно сложной. В качестве очень простого и эффективного метода было предложено создание агрегатов фермента соосаждением с полимером полиэтиленимином без ковалентной сшивки. Такие агрегаты нитрилаз были гораздо устойчивее к воздействию кислорода, чем растворенные ферменты. Нитрилаза из Pseudomonas fluorescens ЕВС 191, в частности, не теряла активности при воздействии кислорода в течение 48 ч.

Исследователи объясняют этот результат низкой локальной концентрацией кислорода вблизи биокатализатора благодаря высаливающему эффекту этого полимера. При сравнении таких агрегатов нитрилаз из Pseudomonas fluorescens ЕВС 191 с CLEAs, приготовленными поперечной сшивкой декстран полиальдегидом, показано сохранение соответственно 55 и 50% первоначальной активности после иммобилизации [377].

с соавт. продолжили работу по созданию устойчивого, P. Kaul высокоэффективного биокатализатора на основе нитрилазы и провели анализ влияния температуры и органических растворителей на энантиоселективность иммобилизованного фермента. Энантиоселективная нитрилаза из Alcaligenes faecalis DSMZ, экспрессированная в Escherichia coli, была очищена и использована для приготовления CLEAs. Условия для подготовки CLEAs были оптимизированы с помощью различных органических растворителей и сшивающих агентов. Максимум активности фермента сохранялся при осаждении 85% (об.) изопропиловым спиртом и дальнейшем сшивании 30 мМ глутаровым альдегидом. Приготовленные таким образом CLEAs сохраняли около 80% от первоначальной нитрилазной активности. Стабильность фермента в составе поперечно-сшитых агрегатов при 30C и 50C была больше, чем у растворимого препарата. CLEAs повторно использовали в течение 5 раз, при этом сохранялось 90% активности. Потеря энантиоселективности нитрилазы с увеличением температуры (от 10 до 50C) наблюдалась для обоих препаратов, но этот эффект был значительно менее выраженным для CLEAs [242].

(R)-Оксинитрилаза, выделенная из миндаля (Prunus amygdalus), осуществляющая реакцию превращения альдегидов до гидроцианидов, была иммобилизована в виде CLEAs путем осаждения 1,2-диметоксиэтаном и последующей сшивкой глутаральдегидом. Полученный препарат оказался высокоэффективным биокатализатором в средах с низким содержанием воды, в которых подавляются неферментативные побочные реакции. Это повысило чистоту и энантиоселективность конечного продукта. При этом на протяжении 10 последовательных циклов реакций CLEAs оксинитрилазы не теряли активности [174].

S. Kumar с соавторами проводили осаждение агрегатов нитрилазы, ген которой был клонирован из P. putida MTCC 5110 в E. coli BL21 (DE3), сульфатом аммония (35%) и использовали глутаровый альдегид (125 мМ) в качестве сшивающего агента. При этом CLEAs сохраняли 70% активности при конверсии нитрила миндальной кислоты, а их термостабильность в диапазоне температур от 4 до 45С по сравнению с ферментом в растворе увеличивалась во много раз.

Отмечено, что даже при 4С за 75 ч нитрилаза в растворе теряла 90% своей активности, тогда как 140 ч воздействие температуры 45С на CLEAs приводило к потере лишь 50% первоначальной активности. При повторном использовании CLEAs активность в первых циклах реакции увеличивалась, достигая максимума к 5-му циклу, после чего начинала снижаться [175].

Определенные ферменты, которые используются в одном каскаде реакций, могут совместно осаждаться, или фермент и гидрофильные полимеры могут быть совместно иммобилизованы для защиты фермента от взаимодействия с газами или органическими растворителями.

Альтернативой совместной экспрессии оксинитрилазы и нитрилазы является ко-иммобилизация этих ферментов в комбинированных CLEAs. Кроме того, амидазы могут быть использованы в качестве третьего коиммобилизованного фермента, который будет конвертировать побочный амид в карбоновые кислоты [368]. Энантиомерно чистая (S)-миндальная кислота была синтезирована из бензальдегида путем последовательных присоединения молекул воды к цианогруппе и гидролиза в биэнзиматическом каскаде, который осуществлялся комбинированными CLEAs (S)-селективной оксинитрилазы из Manihot esculenta и неселективной нитрилазы из P. fluorescens EBC 191. При включении в CLEAs амидазы из R. erythropolis, конвертирующей побочный продукт амид, получили чистую (S)-миндальную кислоту с выходом 90% и энантиомерной чистотой более 99% [390].

Попытки иммобилизации нитрилазы другими способами, в частности, на полимерном носителе Eupergit®C, оказались неудачными. Так, несмотря на то, что связывание фермента с полимером достигало 98%, он полностью инактивировался, а насыщение нитрилазы субстратом перед иммобилизацией с целью защиты активного центра от взаимодействия с носителем приводило к сохранению лишь 3,5% первоначальной активности нативного энзима. Авторы предполагают, что причиной инактивации явилось либо связывание цистеиновых групп активного центра с оксирановыми группами носителя, либо потеря мультимерной активной структуры ферментного комплекса в процессе связывания [363].

Была показана возможность использования нитрилазы, иммобилизованной на алюминии, в синтезе из нитрилов ряда -гидрокси и -гидроксизамещенных карбоновых кислот, в частности, 2-гидрокси-4-метилтиобутановой кислоты, однако авторы не проводили сравнения активности и каталитических свойств иммобилизованной нитрилазы и свободного фермента [225].

Хотя бактериальные клетки, содержащие нитрилгидратазу, широко используются для получения амидов из нитрилов, в целых клетках амиды обычно подвергаются дальнейшей трансформации до карбоновых кислот и аммония амидазами, которые экспрессируются в одном опероне с нитрилгидратазами. В этом случае может добавляться селективный ингибитор амидазы, либо активность ферментов может контролироваться условиями реакции. В качестве альтернативного решения этой проблемы предлагается использование очищенных или частично очищенных нитрилгидратаз. Но использование изолированных нитрилгидратаз сдерживает их нестабильность, в частности, невысокая термостабильность, что может быть преодолено при использовании адекватного метода иммобилизации [137].

Попытки получить иммобилизованный препарат нитрилгидратазы были сделаны еще в 80-х гг. прошлого века. H. Fradet с соавторами иммобилизовали частично очищенную нитрилгидратазу из Brevibacterium A4 на ионобменной смоле DEAE-целлюлозе. Полученный препарат в среднем терял 38% первоначальной активности при трансформации пропионитрила до пропионамида, а иммобилизация не приводила к существенному возрастанию термостабильности – после десятиминутной экспозиции при 45С активность снижалась на 80%. Иммобилизация на DEAE-целлюлозе приводила к небольшому сдвигу рН-оптимума активности в сторону более низких значений и небольшому повышению температурного оптимума, но концентрация продукта, полученная за единицу времени, была относительно низка [222].

Современные работы по иммобилизации нитрилгидратазы более успешны.

Так, CLEAs нитрилгидратазы, полученные осаждением сульфатом аммония и поперечной сшивкой декстранполиальдегидом, сохраняли 88% первоначальной активности. Использование других веществ для осаждения белка приводило к полной деактивации фермента. Глутаровый альдегид в качестве сшивающего агента ингибировал активность нитрилгидратазы [137], подобный эффект был описан и для нитрилаз [88]. Авторы связывают этот эффект с тем, что макромолекулярный кросс-линкер слишком велик, чтобы проникать в активный центр фермента и реагировать с аминокислотными остатками, существенными для проявления каталитической активности, тогда как молекулы глутарового альдегида, возможно, взаимодействуют с ними.

Нитрилгидратаза из термофильного штамма Geobacillus pallidus RAPc8 была иммобилизована на ряде нерастворимых носителей при использовании различных поперечно-сшивающих агентов. Препараты на основе Eupergit®C, активированного 1-этил-3-(диметиламино-пропил)карбодиимидом, проявили самую высокую эффективность иммобилизации (93%), расcчитанную как отношение активности иммобилизованного фермента к активности свободного.

Оптимум рН и температуры для проявления активности остался неизменным, но термостабильность иммобилизованного препарата увеличилась по сравнению с ферментом в растворе – время полужизни иммобилизованной нитрилгидратазы при 60С составило 330 мин по сравнению с 54,5 мин у фермента в растворе.

Операционная стабильность при иммобилизации значительно увеличилась, иммобилизованный биокатализатор сохранял 85,7% первоначальной активности после 8 последовательных циклов реакции. Иммобилизованный препарат на основе Eupergit®C значительно в меньшей степени ингибировался субстратом (Ki =194,7 мМ), чем фермент в растворе (Ki=101,0 мМ) [158].

Энантиоселективный гидролиз рацемицеского нитрила миндальной кислоты до миндальной кислоты катализировали нитрилгидратазой из R-амида Rhodococcus rhodochrous ATCC BAA-870, иммобилизованной на носителе ПВС/хитозан – глутаральдегид. Иммобилизованный биокатализатор готовили путем смешивания нитрилгидратазы с хитозаном, последующей сшивкой глутаровым альдегидом, после чего добавляли ПВС и полученный гель высушивали при замораживании. Иммобилизованная нитрилгидратаза конвертировала нитрил миндальной кислоты до R-амида миндальной кислоты с энантиомерным избытком 81%, а оптимальными условиями для стереоселективного гидролиза являлись рН 8 и температура 40С. Константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции составляла 17,07±1,04 мM и 10,74±0,72 мМ/мин для иммобилизованной нитрилгидратазы и 13,6±0,91, 11,02±1,41 для свободного фермента соответственно. Иммобилизованный фермент выдерживал 9 последовательных циклов реакции, причем к 9-му циклу конверсия составляла 10% [322].

Описана совместная иммобилизация нитрилгидролизующих ферментов для различных целей – биокатализа и поверхностной модификации синтетических полимеров. Поверхностная модификация полиакрилонитрила заключалась в адсорбции на нем нитрилгидратазы и амидазы, которая приводила к гидролизу цианогрупп до карбоновых кислот [117]. Пример биокаталитического применения совместно иммобилизованных ферментов заключался в том, что нитрилаза из Aspergillus niger или Fusarium solani и амидаза из R. erythropolis, совместно иммобилизованные на колонке с бутил-сефарозой, гидролизовали 4цианопиридин в изоникотиновую кислоту. Нитрилаза A. niger конвертировала субстрат в смесь кислоты и амида в молярном соотношении 3:1, тогда как амидаза гидролизовала амид, образующийся в качестве побочного продукта. При иммобилизации нитрилазы из F. solani молярное соотношение кислоты к амиду составляло 98:2, полная конверсия 40 мМ раствора 4-цианопиридина достигалась за счет увеличения количества иммобилизованной нитрилазы (5,5 ЕД), а общий выход продукта увеличивался до 88 мг/мл/ч. Снижение количества амида как побочного продукта также было достигнуто при использовании двух отдельных колонок (одна – с иммобилизованной нитрилазой, другая – с амидазой), работающих в тандеме. Этот подход позволяет предотвратить конкуренцию нитрилгидратазы, присутствующей в препарате амидазы, и нитрилазы за субстрат 4-цианопиридин. В этом случае достигали 99,8% чистоты раствора изоникотинамида без присутствия субстрата в элюенте [228].

Сведения об иммобилизации изолированных амидаз немногочисленны.

Иммобилизацию этих ферментов осуществляли путем включения в гели полимеров синтетического и природного происхождения и адсорбции на активированном Амберлите-XAD57 [90], ковалентного присоединения к носителю [84, 147] и образования поперечно-сшитых агрегатов фермента [321].

Так, термостабильная амидаза Geobacillus pallidus RAPc8, иммобилизованная в гранулы полиакрилатного полимера Eupergit®С, катализировала D-селективный гидролиз лактамида. При этом наблюдалась высокая степень связывания фермента с гранулами Eupergit®С и практически сохранялась амидазная активность (до 80%) [90]. Пенициллин амидаза, ковалентно иммобилизованная в Eupergit®С, активированном эпоксидными группами, была использована в промышленном масштабе [84]. Нативная и конъюгированная с декстраном пенициллин амидаза была ковалентно присоединена к диоксиду кремния с активированными амино-группами, что приводило к увеличению ее термостабильности [147]. Поперечно-сшитые ко-агрегаты амидазы Rhodococcus и БСА, образованные поперечным сшиванием глутаровым erythropolis альдегидом, после осаждения сульфатом аммония оставались стабильными как при повышении температуры до 50°С, так и в диапазоне рН от 5 до 12 [321].

Таким образом, на основании анализа научной литературы можно заключить, что наиболее успешным подходом к созданию иммобилизованного катализатора на основе ферментов нитрильного метаболизма явилось создание CLEAs. Но, несмотря на преимущества, заключающиеся в стабилизации и сохранении активности поперечно-сшитых агрегатов ферментов, в данном случае не происходит иммобилизации в классическом смысле этого слова, или, как иначе называют эти методики, происходит «иммобилизация без носителя». Отсутствие некаталитических масс в реакторе, с одной стороны, приводит к повышению продуктивности, рассчитанной на объем реактора, но, с другой стороны, лишает биокатализатор тех преимуществ, которые дает присутствие носителя.

Затрудняется отделение продукта от реакционной среды, проведение непрерывного процесса биокатализа, невозможно конструирование различных типов реакторов. Поэтому поиск подходящих носителей и разработка методик иммобилизации этих ферментов остаются актуальными, а решением вышеперечисленных проблем, возможно, является объединение преимуществ CLEAs и носителей для создания стабильного и активного гетерогенного биокатализатора.

1.5. Физиология иммобилизованных микроорганизмов

Существуют три принципиально различные причины, по которым прикрепление к твердым поверхностям может изменить физиологию микроорганизмов [271]:

1. посредством влияния концентрации и/или доступности питательных веществ;

2. посредством модификации процессов, ассоциированных с клеточной мембраной (например, транспорт субстрата или генерация энергии);

3. посредством развития биопленки, наличия полимерного матрикса, защищающего клетки от воздействий окружающей среды, возникновения в ней новых клеточных взаимодействий.

Изучая бактериальные популяции образцов морской воды, C.E. ZoBell еще в 1943 г. сделал вывод, что среди бактерий морских вод в природной среде преобладают сессильные (прикрепленные к твердой поверхности) формы. В средах, где источники питательных веществ находятся в сильно разбавленном состоянии, таких как морская вода, органические вещества концентрируются путем адсорбции на твердых поверхностях, повышая активность прикрепленных бактерий [420].

При рассмотрении физиологических изменений клеток при их иммобилизации следует провести границу между самоиммобилизованными в процессе роста бактериями (биопленками) и искусственно иммобилизованными предварительно выращенными культурами. Одной из трудностей в осмыслении этого вопроса является отсутствие в работах исследователей четкого разделения понятий «биопленка», т.е. самоиммобилизованные на нерастворимом носителе в процессе роста клетки микроорганизмов, и «иммобилизованные клетки», под которым чаще всего понимают прикрепленные к поверхности или связанные в массе носителя нерастущие клетки.

На настоящий момент не остается сомнений по поводу того, что рост в прикрепленном состоянии приводит к значительным изменениям в экспрессии генов по сравнению с планктонным способом существования [43, 209, 231, 239]. Кроме того, наблюдаются различия в физиологии клеток самой биопленки, связанные с доступом субстратов роста и кислорода, местоположением клеток (на поверхности биопленки, в глубине, вблизи носителя), стадией созревания биопленки. Многочисленные работы по колониальной организации микроорганизмов свидетельствуют о морфологической и физиологической гетерогенности входящих в ее состав клеток. Отмечено, что помимо вертикальной слоистости колониям микроорганизмов на плотных средах свойственны также секторные и концентрические зоны. Сектора соответствуют генетически различающимся клонам, что находит отражение в их различной окраске, консистенции, форме, скорости роста, активности ферментов. В качестве примера такой гетерогенности можно привести фазовую диссоциацию бактерий на R-, S- и M-формы [49].

Интересно, что клетки одного вида проявляют большие различия в таких факторах, как повышение содержания рибосом и скорость деления, даже когда клетки распространяются по поверхности тонким монослоем при отсутствии явных отличий в окружающей их среде [407].

Известно, что биопленка на нерастворимом субстрате претерпевает ряд изменений в процессе своего развития, которое условно можно поделить на несколько этапов. Первым этапом является обратимая адсорбция клеток на носителе. На этом этапе действуют неспецифические физико-химические силы между молекулами и структурами на поверхностях микроорганизма и твердого субстрата (Ван-дер-Ваальсовы, гидрофобные, электростатические и др.). Затем следует необратимая адгезия или стадия инициации развития биопленки: клетки теряют подвижность, слипаются, начинают выделять внеклеточные полимеры (полисахариды, липополисахариды, гликопротеины), формируя внеклеточный полимерный матрикс [43]. Этот этап, по-видимому, является ключевым в ее образовании [148] и связан со значительными метаболическими и структурными перестройками, изменениями белкового профиля клетки. Инициация образования биопленки происходит через множественный, конвергентный сигнальный путь, который регулируется различными сигналами окружающей среды [311].

Очевидно, что для адгезии живых организмов характерны специфичность, биологическая целесообразность, вовлечение органелл типа жгутиков и фимбрий и метаболический контроль [52]. Затраты метаболического потенциала на процесс адгезии и инициацию образования биопленки велики: это синтез адгезинов, представляющих собой белки типа лектинов с «липкими» концами, которые обратимо и регулируемо связывают клетки с поверхностями; синтез антиадгезинов, нейтрализующих действие адгезинов, а также элементов системы передачи сигнала, позволяющей клеткам взаимодействовать друг с другом [44, 52]. Следовательно, прикрепление к поверхностям инициирует каскад физиологических изменений в клетках, которые приводят, в частности, к сверхпродукции экзополимеров, не только иммобилизующих клетки на колонизируемой поверхности, но также способствующих пространственному разделению различных видов в биопленке [204]. Внеклеточные полимерные вещества микроорганизмов представляют собой различные органические соединения, такие как полисахариды и протеины, составляющие до 90% общей массы, а также в меньшем количестве нуклеиновые кислоты и липиды. Они существенно влияют на бактериальную адгезию на твердых субстратах, обеспечивая инициацию формирования биопленки, т.к. поверхность клетки в этом случае изменяет свои физико-химические характеристики, такие как заряд, гидрофобность и полимерные свойства [203]. Затем следует этап образования микроколоний, обусловленный делением прикрепленной клетки, который еще называют стадией незрелой биопленки. К клеткам, локализованным на поверхности, прикрепляются вторичные колонизаторы. Одновременно с увеличением толщины биопленки формируются ее специфические структуры – полости, каналы, выросты, поры. Эта стадия зрелой биопленки в благоприятных условиях продолжается достаточно долго, а в неблагоприятных вступает в последнюю фазу – разрушения, сопровождающуюся гибелью части клеток и высвобождением остальной части клеток, переходом их в планктонное состояние и миграцией в новые места обитания [43].

Популяции микроорганизмов способны оценивать собственную плотность по концентрации вырабатываемых всеми клетками популяции сигнальных веществ – аутоиндукторов. Кворум-зависимые (quorum-sensing) системы ставят под контроль плотности микробной популяции (кворума) многие процессы, в том числе люминесценцию, синтез экзоферментов, факторов вирулентности, антибиотиков, межклеточный перенос генетической информации (трансформацию, конъюгацию), споруляцию, агрегацию с образованием плодовых тел, формирование биопленок и др. [38, 48, 49]. Грамположительные бактерии главным образом используют в качестве сигнальных молекул системы кворум-сенсинга посттрансляционно-модифицированные олигопептиды. Эти автоиндуцирующиеся полипептиды состоят из 5–17 аминокислот с боковыми цепями, модифицированными изопрениловыми группами или кольцами тиолактона. Они синтезируются в цитоплазме в виде пептидовпредшественников, затем расщепляются, модифицируются и транспортируются во внеклеточную среду, где могут быть определены мембран-связанными двухкомпонентными системами детекции. Их детекция приводит к фосфорилированию и активации регуляторного протеина, который взаимодействует с промотором ДНК и включает экспрессию регуляторных генов кворум-сенсинга. В грамотрицательных бактериях сигнальными молекулями являются N-ацилгомосеринлактоны, которые также называют аутоиндуктор 1.

Они содержат консервативное кольцо гомосеринлактона, которое соединено с ацильной цепью различной длины (4–18 атома углерода) и различной модификации. Комплекс ацилированных гомосеринлактонов и белков активирует транскрипцию генов, отвечающих за кворумзависимые процессы. Аутоиндуктор 2, представляющий собой фуранозилборатный эфир, обнаружен более чем у 50 различных видов бактерий, как грамотрицательных, так и грамположительных, и может служить «универсальным сигналом» для межвидовой коммуникации [349].

Скорость роста бактерий разных видов может возрастать, снижаться, либо не изменяться после иммобилизации, в зависимости от природы субстрата и возможности его сорбции на носителе. Так, скорость роста Klebsiella oxytoca, адсорбированного на частицах гранулярного активного угля, возрастает более чем в 10 раз при росте на глутамате, который адсорбируется на поверхности углей, и не изменяется при росте на глюкозе, не адсорбирующейся на носителе [177]. С другой стороны, исследования И.К. Курдиш и З.Т. Бега показали, что глинистые минералы в концентрации 0,2–1,0% существенно стимулируют рост фосфатмобилизующих бактерий Bacillus subtilis при их культивировании в среде, содержащей труднорастворимый фосфат кальция. Авторы предполагают, что одним из механизмов повышения интенсивности роста бацилл в этом случае является увеличение массопереноса кислорода, которое снижается при повышении концентрации глинистых материалов до 2%, приводя к ингибированию их роста. При этом способность глюкозы и ионов фосфата сорбироваться на монтмориллоните авторы рассматривают как отрицательный момент [34]. В более ранних работах И.К. Курдиш и Л.В. Титовой также было показано, что высокодисперсные материалы оказывали стимулирующий эффект на рост бактерий. В частности, высокодисперсный диоксид кремния и его модифицированные формы, а также глинистые природные материалы палыгорскит, монтмориллонит и каолин в концентрации 10 г/л повышали выживаемость и интенсивность роста азотфиксирующих бактерий Agrobacterium radiobacter в процессе гетерофазного культивирования. В данной работе авторы сделали заключение, что изменения физиологической активности микроорганизмов при их взаимодействии с высокодисперсными материалами невозможно объяснить одними только ионообменными процессами между питательной средой и твердыми материалами, т.

к. компонентный состав питательных сред при взаимодействии с этими материалами практически не изменялся [35]. При изучении стимулирующего влияния диоксида титана на рост азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий Azobacter vinelandii и B. subtilis авторы установили, что этот эффект не является следствием сорбции сахарозы на поверхности твердых частиц, и выдвинули предположение, что контактное взаимодействие клеток бактерий с диоксидом титана обуславливает увеличение проницаемости клеточной стенки, что приводит к более полному потреблению субстрата [81]. Таким образом, в научной литературе не было выработано единого мнения о механизмах влияния высокодисперсных твердых материалов на физиологию растущих в их присутствии микроорганизмов.

Также была продемонстрирована возможность глубинного гетерогенного культивирования молочнокислых бактерий, и показано, что присутствие в среде твердой фазы в виде измельченного (0,5–1 мм) жома топинамбура способствует повышению стрессоустойчивости этих бактерий и увеличивает количество клеток, остающихся жизнеспособными после длительного хранения. Авторы предполагают, что основной причиной этого эффекта является адгезия клеток на твердых частицах жома, что увеличивает их устойчивость к стрессовым факторам [11].

Сведения об удельной скорости продукции или выходе различных вторичных метаболитов, таких как ферменты и антибиотики, при иммобилизации клеток также противоречивы. Ряд работ подтверждает возрастание выхода вторичных метаболитов у иммобилизованных клеток. Например, уровень изопропилтиогалактозид-индуцированной -галактозидазы был выше у иммобилизованных клеток E. coli, чем у суспендированных [92]. Иммобилизация в альгинате кальция стимулировала биосинтез супероксиддисмутазы клеток Aspergillus niger. Также иммобилизация изменяла спектр пектинолитических ферментов, экскретируемых A. niger: у иммобилизованных клеток наблюдалась сверхпродукция полиметилгалактуроназы и полигалактуроназы и снижение продукции пектинэстеразы и пектинлиазы [231]. В работе Т.М. Григорьевой с соавторами было отмечено, что, культивирование B. subtilis в виде биопленки дает увеличение продукции амилазы в 1,5–2,4 раза и глюканазы в 3 раза [12]. В то же время есть немало примеров снижения удельной продуктивности по отношению к свободным клеткам, что объясняется ограничениями массопереноса в системе иммобилизованных клеток [231].

Повышенная устойчивость биопленок микроорганизмов к ингибиторам, биоцидам и антибиотикам также общеизвестна, но нет единого мнения о механизмах этой устойчивости. Одним из наиболее распространенных объяснений является затруднение проникновения веществ-ингибиторов в структуру биопленки из-за диффузионных ограничений, обусловленных полимерным матриксом. Другая гипотеза связана с существованием «биопленочного фенотипа», т.е. различной экспрессией генов в планктонных и прикрепленных клетках [43, 209, 231]. Сравнение профилей экспрессии генов в клетках одних и тех же бактерий, существующих в составе биопленки и в планктонном состоянии, показало, что около 45 генов экспрессируются различно.

Более того, обнаружено, что дифференцированная экспрессия генов наблюдается в разных местах биопленки, что может свидетельствовать о способности индивидуальных членов бактериального сообщества выполнять разные функции, повышая выживаемость всего сообщества [38].

Наибольшее распространение получило представление о существовании в биопленках особых «персистирующих» клеток, находящихся в покоящемся состоянии и поэтому более устойчивых к действию неблагоприятных факторов [43, 209].

Прикрепление клеток E. coli к абиотической поверхности вызывает важные изменения в составе внешних мембранных белков, из которых 17 показали возросшие уровни синтеза, а 15 – уменьшенные [23]. Изменения проницаемости мембраны клеток в ответ на иммобилизацию также могут объяснить возрастание устойчивости грамотрицательных биопленкообразующих бактерий к антимикробным агентам. SDS-PAGE анализ протеинов внешней мембраны свободных и включенных в структуру геля клеток E. coli, устойчивых к лактамным антибиотикам, показал дефицит уровня неспецифического поринового белка OmpF, которому принадлежит основная роль в проникновении антибиотиков в клетку, у иммобилизованных клеток по сравнению со свободными [231].

Сигналы, приводящие к активации стресс-зависимых реакций, часто приводят к образованию биопленки, которая, в свою очередь, индуцирует механизмы стрессорных ответов. Регуляторные механизмы этих процессов включают двухкомпонентные регуляторные системы, в которых главные регуляторы, такие как ген rpoS и сигнальные молекулы, такие как циклический диГМФ, находятся в сложном взаимодействии [265]. Альтернативная S cубъединица РНК полимеразы, кодируемая геном rpoS, и поэтому также называемая белком RpoS, рассматривается как основной регулятор общего стрессорного ответа у E. coli [265, 71]. Когда бактерии растут в периодической культуре на полноценной среде, внутриклеточная концентрация белка RpoS резко повышается в стационарной фазе роста и S-ассоциированная форма РНКполимеразы становится основной формой РНК-полимеразы, активной на этой стадии роста. Важность rpoS в регуляции факторов адгезии и адаптации к существованию в виде биопленки продемонстрирована тем, что 46% rpoSзависимых генов различно экспрессируется в прикрепленных клетках, и что делеция rpoS отрицательно воздействует на способность E. coli формировать биопленки. Индукция регулона rpoS может быть согласована с аккумуляцией S фактора в клетках биопленки, в результате их более медленного роста в сравнении с планктонными клетками [265].

Однако на сегодняшний момент остается открытым вопрос, какие физиологические изменения происходят в клетках искусственно иммобилизованных бактерий, предварительно выращенных в суспензии. Ранее исследователи придерживались мнения, что изменения, связанные с ферментативной активностью и стабильностью иммобилизованных клеток, могут быть обусловлены не внутренними перестройками клетки, а изменением окружающей среды [24]. Но, в то же время, в ряде работ появлялись гипотезы о физиологических перестройках, происходящих в иммобилизованных клетках, в том числе в клетках, включенных в структуру гелей [231, 385]. На сегодняшний момент изучение этих изменений может быть связано с развитием протеомного анализа, который, возможно, способен дать ответ об изменении экспрессии генов у микроорганизмов в ответ на иммобилизацию. Протеины, количество которых в клетке значительно варьирует при образовании биопленки или в искусственно иммобилизованных системах, могут быть разделены на три основных класса – белки, связанные с метаболическими процессами; вовлеченные в процессы адаптации и защиты; мембранные протеины [94, 239]. Результаты протеомного анализа подтверждают, что при культивировании бактерий в виде суспензии существуют значительные физиологические различия клеток в экспоненциальной и стационарной фазах роста, но при этом искусственно иммобилизованные клетки не могут быть приравнены к суспендированным клеткам в стационарной фазе роста [239].

Большой интерес представляют сведения, касающиеся повышения ферментативной активности иммобилизованных клеток. Как было показано Г.А.

Коваленко с соавт., у адсорбированных на углеродсодержащих носителях дрожжевых клеток наблюдалась активация внутриклеточной инвертазы в 1,5–1,8 раза и возрастание оксигеназной активности у адсорбированных родококков в 3,7 раза по сравнению с суспендированными клетками [76].

В связи с промышленной важностью культур дрожжевых клеток большое количество научных работ было сфокусировано на изучении их метаболического ответа на иммобилизацию. Показана активация энергетического метаболизма дрожжей при иммобилизации, увеличение удельных скоростей поглощения субстрата (особенно глюкозы) и экскреции продукта (этанола). Такая активация метаболизма дрожжей наблюдалась у различных типов иммобилизованных систем – включения в гель, адсорбции и колонизации пористого носителя [230, 231].

Также у иммобилизованных дрожжей было выявлено возрастание количества как запасных питательных веществ (гликогена и трегалозы), так и структурных полисахаридов (глюкана и маннана), что может быть связано с взаимодействием между поглощением глюкозы и активностью фосфофруктокиназы. Отмечено увеличение толерантности к этанолу и сдвиг в сторону повышения содержания насыщенных жирных кислот. В свою очередь, результаты изучения экспрессии стресс-зависимых генов HSP12 и SSA3 подтвердили, что иммобилизованные клетки в основном находятся в менее стрессовых условиях, чем свободносуспендированные, возможно, из-за защитных свойств микроокружения. В любом случае, иммобилизация оказывает большое влияние на свойства плазматической мембраны, что может стать причиной изменений в ряде транспортных систем [230].

В ответ на стресс, лимитирование по источникам питания, изменение рН или уровня этанола, или при воздействии малых молекул, продуцируемых макроорганизмом-хозяином (ауксин растений, НАД млекопитающих), у дрожжей инициируются метаболические пути, приводящие к синтезу различных адгезинов

– протеинов клеточной стенки. Это переключение от не-адгезивности к адгезивности, возможно, позволяет дрожжам адаптироваться к стрессу. Так, в конце ферментационного процесса, когда все доступные сахара ферментированы в этанол и диоксид углерода, дрожжевые клетки начинают адгезироваться друг к другу, формируя макроскопические флоки [402].

Также было установлено, что такой показатель, как активность воды, является одним из основных факторов, воздействующих на клетки, иммобилизованные в структуре гелей [113, 279, 360]. Макромолекулы полимера способны структурировать молекулы воды и поэтому снижать количество воды, доступной для клеток [279]. Так, клетки Klebsiella aerogenes компенсировали низкую активность воды в микроокружении повышенным синтезом осмотически активных соединений. В результате иммобилизованные клетки продуцировали большее количество многоатомных спиртов, в том числе глицерина и маннита [113]. В целом, снижение активности воды и доступа кислорода приводит к тому, что иммобилизованные клетки компенсируют это стрессовое воздействие окружающей среды изменениями в концентрации промежуточных метаболитов, за которым следует сдвиг в сторону альтернативных метаболических путей.

Низкая активность воды увеличивает пул полиолов в клетке и способствует формированию этанола и молочной кислоты. Низкая концентрация кислорода увеличивает анаэробную ферментацию и снижает активность цикла трикарбоновых кислот и дыхательной цепи. Так, изменение окислительновосстановительного потенциала воздействует на баланс NADH/NADPH и благоприятствует формированию жирных кислот, каротинов и вторичных метаболитов из ацетил коэнзима А [360]. Например, иммобилизованные дрожжевые клетки ферментируют глюкозу до этанола более эффективно [279].

Также низкая активность воды приводит к более высокой концентрации NADPH в клетке, что стимулирует анаболические реакции [113].

Таким образом, объяснение физиологических изменений, происходящих в клетке при иммобилизации, во многом противоречиво и, в основном, находится на стадии гипотез. Так, остается открытым вопрос, находится ли иммобилизованная клетка в состоянии стресса или, наоборот, в менее стрессовых условиях; является ли определяющим защитное действие микроокружения или на клетки воздействует увеличение их плотности. Кроме того, основное внимание при изучении биопленок уделяется патогенным и условнопатогенным микроорганизмам, борьба с антибиотикоустойчивостью которых является первоочередной медицинской задачей. Среди промышленно значимых микроорганизмов более изученными остаются дрожжи, тогда как бактериальным культурам уделяется существенно меньше внимания. При изучении физиологии искусственно иммобилизованных клеток микроорганизмов основной изучаемой иммобилизационной системой, главным образом, являются клетки, включенные в структуру гелей. Почти не уделяется внимание адгезированным клеткам, тогда как это состояние является естественным и понимание физиологических изменений, протекающих в клетке, может объяснить процессы, происходящие в природной среде.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

–  –  –

Объектами исследования являлись штаммы, изолированные из антропогенно загрязненных почв и селекционированные в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии (прежнее название – лаборатория химического мутагенеза) Института экологии и генетики микроорганизмов УрО

РАН:

Rhodococcus ruber gt1 (ИЭГМ 612, Региональная профилированная коллекция алканотрофных микроорганизмов, акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/iegmcol/index.html), обладающий высокой нитрилгидратазной активностью и практически неопределяющейся амидазной активностью;

Pseudomonas fluorescens C2 (ВКМ В-2597Д), обладающий нитрилазной активностью;

R. erythropolis 11-2, R. erythropolis 6-2, R. rhodochrous 4-1, Alcaligenes faecalis 2, Acinetobacter guillouiae 11h, обладающие амидазной активностью в сочетании с низкой нитрилгидратазной активностью.

Штаммы культивировали на синтетической минеральной среде N следующего состава (г/л): минеральная основа – KH2PO4 – 1,0; K2HPO43H2O – 1,6; NaCl – 0,5; MgSO47H2O – 0,5, микроэлементы CaCl2 – 0,005; FeSO47H2O – 0,01; CoCl26H2O – 0,01, рН 7,2±0,2. Источниками углерода являлась глюкоза – 1,0, источниками азота NH4Cl – 0,3 (для R. ruber gt1); ацетонитрил – 3,9 (для P.

fluorescens C2), 0,39 (для R. erythropolis 11-2, R. erythropolis 6-2, R. rhodochrous 4Для штамма Alcaligenes faecalis 2 и Acinetobacter guillouiae 11h источником и углерода, и азота являлся 0,1 М ацетамид.

Штаммы поддерживали на агаризованной среде Луриа-Бертани (LB), содержащей (г/л): триптон – 10,0; дрожжевой экстракт – 5,0; NaCl – 10,0; агар (Sigma) – 15,0.

2.2. Условия культивирования бактерий в жидких питательных средах и определение ростовых характеристик В автоклавированную при 121°С среду N асептически добавляли источники углерода и азота и микроэлементы. Клетки бактерий выращивали в 40 мл среды N в конических колбах объемом 100 мл; в 100 мл среды N в конических колбах объемом 250 мл; в 400 мл среды N в конических колбах объемом 1000 мл на роторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью вращения 90–120 об/мин и температуре 28–30°С.

Плотность культуры бактерий измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-3 с использованием 0,5 см кюветы. Бактериальный рост оценивали по оптической плотности клеточной суспензии при =540 нм с учетом разведения. Абсолютно сухую биомассу определяли путем взвешивания на аналитических весах предварительно отцентрифугированных в течение 10 мин при 12000 g и высушенных до постоянной массы клеток из известного объема суспензии.

Удельную скорость роста () определяли по формуле:

= dx/dt 1/x, где – прирост биомассы в единицу времени на единицу биомассы, x – начальная биомасса, мг/мл; t – время, ч

2.3. Культивирование бактерий в присутствии носителей

Культивирование осуществляли в 100 мл среды N в конических колбах объемом 250 мл. Среду N предварительно автоклавировали с 1 г углеродсодержащего носителя или с пленкой полиэтилена высокой плотности площадью 1 дм2. В среду асептически добавляли источники углерода и азота, микроэлементы и инокулировали 4 мл бактериальной культуры (ОП540=0,5).

Культивирование осуществляли на роторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью вращения 90–120 об/мин и температуре 28–30°С в течение 7 суток.

2.4. Носители для иммобилизации бактериальных клеток и ферментов

В качестве носителей для иммобилизации бактериальных клеток использовали дробленые, гранулированные и порошкообразные углеродные материалы (Таблица 6, 7):

• уголь активный березовый дробленый БАУ (пр-во Россия),

• уголь активный гранулированный ФТД (пр-во Россия),

• углеродный материал ФАС на основе фуриловой смолы (пр-во Россия),

• уголь активный дробленый Norit PK 1-3 (пр-во Голландия),

• уголь-сырец, измельченный до порошкообразного состояния с размером частиц 50–300 мкм,

• дробленый уголь-сырец с размером частиц 1–6 мм и 3–10 мм;

• Сибунит (Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, Новосибирск, Россия) • «Сапропель» (Институт переработки углеводородов СО РАН, Омск, Россия) Носители семейства «Сапропелей» были получены карбонизацией илистых отложений пресных озер Омской области.

• Шунгит (углеродсодержащий природный минерал) Шунгит (название дано по поселку Шуньга, Карелия, РФ) – минерал, промежуточный продукт между аморфным углеродом и кристаллическим графитом, содержащий углерод (30 масс. %), кварц (45 масс. %) и силикатные слюды (около 20 масс. %). Шунгитовый углерод представляет собой окаменевшее вещество органических донных отложений высокого уровня карбонизации [22].



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 10 |

Похожие работы:

«Серёгин Сергей Викторович Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук Бажан Сергей Иванович...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«Зубенко Александр Александрович СИНТЕЗ И ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНЫХ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ В РЯДУ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук г. Новочеркасск – 2015 Содержание ВВЕДЕНИЕ.. 6 1.Обзор литературы..19 1.1. Проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов и пути её преодоления..19 1.2. Проблема...»

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бакиев А.Г. Тольятти – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. К...»

«ТУРТУЕВА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ 14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор НИКОЛАЕВА ГАЛИНА ГРИГОРЬЕВНА Улан-Удэ – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Очиров Джангар Сергеевич НАРУШЕНИЯ МИКРОНУТРИЕНТНОГО СТАТУСА ОВЕЦ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор ветеринарных...»

«Храмцов Павел Викторович ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович...»

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент И.В. КИСЕЛЕВА Санкт-Петербург – ОГЛАВЛЕНИЕ Раздел 1....»

«Галкин Алексей Петрович ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Специальность 03.02.07 – генетика диссертация на соискание учной степени доктора биологических наук Научный консультант: Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Горовой Александр Иванович БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ И ШИШЕК PINUS KORAIENSIS (ПОЛУЧЕНИЕ, СОСТАВ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тагильцев Ю. Г. Хабаровск – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр Введение.. 4 Глава 1 Обзор...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«КАРПЕНКО Анна Юрьевна Изменение трансинтестинальной проницаемости и показателей врожденного иммунитета у онкологических больных в периоперационном периоде 14.03.09 – клиническая иммунология и аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук...»

«Петро ва Ю лия Геннад ь евна «ШКОЛА УХОДА ЗА ПАЦИЕНТАМИ» ПР И ПР ОВЕДЕНИИ МЕДИЦИНСКОЙ Р ЕАБИЛИТАЦИИ ПОСЛЕ ЦЕР ЕБР АЛЬНОГО ИНСУЛЬ ТА 14.01.11 – нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Пряников И.В. профессор Москва – 2015 стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА И ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ...»

«МУСТАФАЕВ РОВШАН ДЖАЛАЛ ОГЛЫ «СОВРЕМЕННЫЕ ЛАЗЕРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ЛЕЧЕНИИ ПЕРИТОНИТА» (Экспериментально-клиническое исследование) Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности–14.01.17 хирургия Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Гейниц А.В. Москва 2014 СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ...»

«Рагимов Александр Олегович ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПОЧВ В ФОРМИРОВАНИИ УРОВНЯ БЛАГОПОЛУЧИЯ НАСЕЛЕНИЯ ВЛАДИМИРСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Жукова Дарья Григорьевна ДИАГНОСТИКА И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РЕАКЦИЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЛЕКАРСТВЕННЫМ ПРЕПАРАТАМ У БОЛЬНЫХ В ПЕРИОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ В УСЛОВИЯХ МНОГОПРОФИЛЬНОГО СТАЦИОНАРА 14.03.09 клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор...»

«ТОМОШЕВИЧ Мария Анатольевна ФОРМИРОВАНИЕ ПАТОКОМПЛЕКСОВ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» 03.02.08 – «Экология» Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: д.б.н., академик РАН Коропачинский И.Ю. Новосибирск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ: ВВЕДЕНИЕ.. 4 ГЛАВА 1. АНАЛИЗ...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.