WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 10 |

«ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Нитрилгидратазы Fe-типа предпочтительно гидратируют алифатические нитрилы с небольшой цепью, тогда как Со-NHase проявляют высокую аффинность к ароматическим нитрилам [176].

Известно, что удельная активность нитрилгидратазы намного выше, чем нитрилазы. Это обусловлено различием в реакционных механизмах этих двух ферментов. У нитрилазы в активном центре содержатся остатки цистеина, участвующие в гидролизе нитрилов, тогда как NHase содержит в активном центре металл [249]. Учитывая структуру и функции железосодержащих и кобальтсодержащих NHase, предложены модели протекания ферментативных реакций, которые предполагают три стадии. Во-первых, присоединение нитрила происходит близко к гидроксид-иону или к металлсвязывающей молекуле воды.

Во-вторых, каждая гидроксильная группа или металлсвязывающая молекула воды атакуется нитрильным атомом углерода, в результате образуется имидат [R – C(OH) = NH]. Наконец, имидат таутомеризуется до амида. Следовательно, уникальная структура активного центра нитрилгидратазы катализирует нитрилы с большей эффективностью [277].

Большинство нитрилгидратаз имеет оптимум активности в нейтральной среде и при температуре 30–40С, хотя встречаются и более термостабильные ферменты, главным образом, изолированные из клеток бактерий рода Bacillus (Таблица 1).

Успешное применение этих ферментов в промышленном производстве амидов привело к возрастанию интереса исследователей к их структуре и функциям. В течение последних 10 лет значительное количество работ было направлено на изучение сложных моделей, которые имитируют активный центр нитрилгидратазы. Цель такого поиска – установить роль негемового железа (или некорриноидного кобальта) активного центра нитрилгидратазы в процессе гидратации органических нитрилов [249].

Таблица 1 – Каталитические свойства некоторых нитрилгидратаз

–  –  –

Структура и функции амидазы Амидазы – ферменты, гидролизующие амидную связь между азотом и углеродом в молекулах небелковой природы с образованием кислоты и аммония [46, 365]. Большинство известных в настоящее время амидаз были обнаружены и описаны у бактерий родов Rhodococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Brevibacterium, Nocardia, Streptomyces, Blastobacter, Arthrobacter, Alcaligenes, Helicobacter, Lactobacillus и Methilophilus [208].

По современной классификации, основанной на гомологии аминокислотных последовательностей и наличии консервативных мотивов, амидазы подразделяют на две группы. К первой из них относятся амидазы из семейства CN-гидролаз (или нитрилазного суперсемейства), существующие в растворе в виде гомотетрамерных и гомогексамерных комплексов, и содержащие в каталитическом центре остатки лизина, цистеина и глутаминовой кислоты. К этой группе относятся в основном алифатические амидазы, субстратами которых являются алифатические короткоцепочечные амиды – ацетамид, акриламид, пропионамид. Ко второй группе относятся амидазы семейства “amidase signature”, содержащие в активном центре два остатка серина и один остаток лизина. Эти амидазы формируют гомодимерные и гомооктомерные комплексы.

Особенностью этих амидаз является абсолютно консервативный мотив GGSS, содержащий один из каталитически активных остатков серина. Субстратная специфичность таких амидаз шире, они способны гидролизовать наряду с алифатическими амидами также ароматические и разветвленные амиды – фенилацетамид, 2-фенилпропионамид, амид миндальной кислоты. Часто эти амидазы обладают стереоселективностью [46, 380].

Амидазы, активные по отношению к широкому спектру субстратов, являются растворимыми ферментами. Максимальная активность амидаз наблюдается при нейтральном значении pH. Однако есть амидазы, имеющие оптимум активности в щелочной среде (Таблица 2). Были обнаружены амидазы, имеющие молекулярный вес 180 кДа. Кроме того, обнаружена амидаза из Arthrobacter J-1, молекулярный вес которой был много больше – 320 кДа.

Электрофоретический анализ показал, что амидазы Brevibacterium sp. R312 состоят из одного типа субъединиц. Каждая субъединица имеет молекулярную массу около 44 кДа. Четвертичная структура амидаз Brevibacterium sp. R312 отличается от таковой P. aeruginosa, которая состоит из 6 субъединиц (Мr = 33 кДа) и от амидазы Arthrobacter J-1, которая состоит из 8 субъединиц (Мr = 40 кДа). Ингибированием йодоуксусной кислотой, N-этилмалеимидом и парагидроксимеркурибензоатом было подтверждено, что амидазы содержат по крайней мере одну SH группу в активном центре [388].

По сравнению с нитрилгидратазами, амидазы более термостабильны.

Встречаются амидазы, которые проявляют максимальную активность при температурах, превышающих 50С (Таблица 2).

Таблица 2 – Каталитические свойства некоторых амидаз

–  –  –

Охарактеризована структура амидазы Rhodococcus sp. N-771 (Rh-амидаза).

Rh-амидаза содержит три домена: N-терминальный, малый и большой домен. Nтерминальный домен не был обнаружен у других ферментов амидазного семейства. Этот домен вовлечен в формирование димера и вместе с малым доменом образует узкий субстрат-связывающий тоннель. Большой домен обнаруживает высокое структурное сходство с другими ферментами амидазного семейства. В этом домене локализуются каталитическая триада цис-серин, серин и лизин. Гидрофобные остатки малого домена участвуют в распознавании субстрата и связаны с различиями в субстратной специфичности ферментов амидазного семейства [380].

Структура и функции нитрилазы С момента своего открытия в 1964 г. нитрилазы были обнаружены у многих организмов: бактерий, грибов и растений, а в последние десятилетия их структура и функции активно изучаются, что связано с биотехнологическим интересом, который они представляют. Биокаталитическое значение нитрилаз обусловлено их способностью гидролизовать широкий спектр различных нитрилов [301, 342, 343].

Нитрилазы (/-гидролазы), наряду с цианидгидратазами и цианиддегидратазами, представляют собой одну из ветвей нитрилазного надсемейства, в которое входит 12 семейств, не обладающих пептидазной активностью, и только данная ветвь использует в качестве субстратов нитрилы.

Ферменты этого типа обладают четырехслойной (---) структурой типа сэндвич, и каталитически активной триадой, состоящей из остатков глутаминовой кислоты, лизина и цистеина. При образовании --- структуры, пара -спиралей располагается по бокам, и два слоя, каждый из шести -нитей, образуют середину.

Два таких ----комплекса взаимодействуют друг с другом, образуя тетрамерную структуру. Ассоциация субъединиц нитрилов в гомоолигомерные образования с высоким молекулярным весом, формирующих спиральную структуру и закрученные нити, является типичной структурной особенностью этих ферментов [143, 276].

Существует гипотетическая схема реакции для объяснения образования двух альтернативных продуктов, карбоновой кислоты или амида (побочный продукт) [276] (Рисунок 2).

Считается, что при взаимодействии субстрата с ферментом происходит перенос электронов с сульфгидрильной группы цистеинового остатка на углерод цианогруппы нитрила, что приводит к образованию первичного комплекса, который гидролизуется с образованием интермедиата, обладающего четвертичной структурой. В дальнейшем происходит отщепление аммиака, которое возможно благодаря положительному заряду на атоме азота лизинового остатка, стабилизируемому остатком глутаминовой кислоты, в результате чего конечными продуктами реакции является карбоновая кислота и аммиак. Но при альтернативном пути, ведущем к получению на выходе амида, стабилизации положительного заряда мешает электронный или стерический эффект Rзаместителя. Таким образом, на тип продукта существенно влияет конфигурация R-группы.

Рисунок 2 – Схема образования двух альтернативных продуктов на примере нитрила миндальной кислоты Была предложена следующая оценка роли каталитической триады: остатки цистеина и глутаминовой кислоты берут на себя роль нуклеофила и связующего звена соответственно, в то время как остаток лизина участвует в стабилизации образующегося в ходе реакции интермедиата с четвертичной структурой [276].

Нитрилазы являются мультимерными энзимами, при работе с которыми особенно сложной проблемой является их стабилизация. В случае мономерных ферментов, первым шагом их инактивации будут изменения в их третичной структуре, тогда как при инактивации мультимерных ферментов происходит диссоциация субъединиц фермента или нарушения, связанные с неправильной сборкой субъединиц. По этой причине предотвращение диссоциации фермента – это основная задача, необходимая для их стабилизации. Успешные работы по стабилизации мультимерных энзимов были проведены с помощью различных методов иммобилизации [232, 243].

Нитрилазы – чувствительные к кислороду ферменты, что связано с аутоокислением остатков цистеина, находящихся в активном центре.

Инактивации кислородом можно избежать при проведении реакции в бескислородной среде. Добавление биологически совместимых электролитов с высокой ионной силой может снизить концентрацию кислорода в реакционной смеси и скорость инактивации фермента. Однако такой подход может вызвать трудности при использовании различных гидрофобных субстратов. Другим возможным решением может быть окружение молекулы фермента гидрофильной оболочкой, снижающей концентрацию кислорода в среде фермента. Доказано, что создание гидрофильных оболочек вокруг иммобилизованных ферментов стабилизирует их, уменьшая вредное воздействие органических растворителей.

Предполагают, что этот эффект вызван снижением концентрации органического растворителя вокруг молекулы фермента [377].

Таким образом, стабилизация нитрилаз должна включать в себя два момента: предотвращение диссоциации мультимера на субъединицы и защита активного центра от окисления. Однако, температурный и рН-диапазон работы этих ферментов достаточно широк, хотя у большинства нитрилаз рН-оптимум активности сдвинут в щелочную область (Таблица 3).

Диапазон возможностей применения нитрилаз на сегодняшний день довольно широк, многие из катализируемых нитрилазой биотрансформаций имеют потенциал для технического использования, однако ферменты и/или условия процесса должны быть доработаны, чтобы удовлетворять условиям промышленного процесса. Для достижения этой цели могут быть использованы скрининг ферментов из новых источников, модификация структуры субстрата, подбор параметров среды и реакционного процесса, инженерия ферментов и различные способы иммобилизации, а также возможно совмещение этих подходов. В результате можно добиться улучшения субстратной специфичности, стабильности, активности или энантиоселективности, а также снижение амидной доли в нитрилазном продукте. Перспективным также считается использование нитрилаз в сочетании с другими ферментными или химическими катализаторами, что может привести к более эффективной эксплуатации нитрилаз в биокатализе.

Такие подходы были разработаны, например, для синтеза (S)-миндальной кислоты, (S)–амида миндальной кислоты или гликолевой кислоты [276, 362].

Таблица 3 – Каталитические свойства некоторых нитрилаз

–  –  –

Нитрильные соединения широко распространены в природе, главным образом, присутствуют в растениях в виде цианогликозидов, а также цианолипидов, цианоалкалоидов, рицина, фенилацетонитрила и др. Более 2000 видов растений накапливают цианогликозиды в семенах, корнях и листьях, а также секретируют нитрильные метаболиты в виде основного компонента экссудата ризосферы корней. Вероятно, этот процесс влияет на эволюцию и распространение микроорганизмов, способных к ассимиляции нитрилов [277].

Кроме того, химическая промышленность широко использует различные органические нитрилы для производства ряда полимеров, химических веществ и фармпрепаратов. Эти соединения также используются в качестве растворителей, экстрактантов, пестицидов, в органическом синтезе аминов, амидов, карбоновых кислот, эфиров, альдегидов, кетонов и гетероциклических соединений. Многие нитрилы очень токсичны, обладают мутагенным и канцерогенным действием, инактивируют респираторную систему, связываясь с цитохром С оксидазой.

Биодеградативный потенциал микроорганизмов позволяет использовать их в качестве основного звена в биологической очистке окружающей среды от высокотоксичных нитрилов [121, 268].

Микроорганизмы, обладающие ферментативными системами трансформации нитрильных соединений, могут быть использованы в биотехнологической промышленности для получения соответствующих амидов и карбоновых кислот. Благодаря своим уникальным свойствам (высокой удельной активности и стабильности, хемо-, регио- и энантиоселективности) ферменты метаболизма нитрилов находят широкое применение в органическом синтезе.

Наиболее ярким примером применения нитрилгидролизующих бактерий в производстве является промышленное получение акриламида из акрилонитрила, начатое в середине 80-х гг прошлого века японской компанией Nitto Chemical Ltd.

С тех пор биотехнологический способ производства акриламида был усовершенствован, получены новые штаммы, осуществляющие гидратацию акрилонитрила с большой степенью эффективности. В России промышленная технология получения биоакриламида разработана в ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов совместно с его Саратовским филиалом (в настоящее время ЗАО «Биоамид») и Саратовским филиалом НИИ полимеров на основе высокопродуктивного штамма Rhodococcus rhodochrous M33. В настоящее время в мире свыше 25% акриламида производится с помощью биокатализа (в Китае – свыше 40%), этот биотехнологический способ получил свое развитие в Японии, России, Китае и Южной Корее [14].

Акриловая кислота является сырьем для получения полимеров и сополимеров различного назначения, широко применяемых во всех сферах народного хозяйства. Акриловые полимеры применяются в производстве суперабсорбирующих материалов, флокулянтов, диспергирующих и загущающих агентов, лакокрасочных материалов, моющих средств, клеев, шпатлевок, текстиля. Объемы производства акрилатов неуклонно возрастают на протяжении двух последних десятилетий, что обусловлено ростом потребности в акриловой кислоте в среднем на 4–5% ежегодно [3]. Получение акрилатов из акрилонитрила может быть осуществлено с помощью ферментативных систем микроорганизмов либо двустадийно – нитрилгидратазой до амида и амидазой до соответствующей карбоновой кислоты, либо одностадийно нитрилазой. Большинство описанных микроорганизмов обладает низкой активностью нитрилазы, что делает их промышленное использование нерентабельным и обусловливает необходимость дальнейшего поиска и селекции новых штаммов и совершенствование технологии биосинтеза акрилатов. Сотрудниками ЗАО «Биоамид» (Саратов) совместно с ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва) путем направленной селекции Alcaligenes denitrificans С-32 [59] получен штамм A.

denitrificans ВКПМ В-9582, обладающий нитрилазной активностью, достаточной для промышленного получения акрилата аммония [69]. Предприятие «Ашленд МСП» (Пермь) для собственных нужд (производства флокулянтов) производит биокаталитическим путем сотни тонн акрилата аммония, используя в качестве катализатора штамм A. denitrificans С-32 и его мутант [14].

Пиридинкарбоновые кислоты и их амиды – предшественники ряда фармацевтических препаратов и различных востребованных в народном хозяйстве химических соединений. Витамины группы PP (никотинамид и никотиновая кислота) являются необходимым элементом питания и признанным официальной медициной лекарственным средством [112]. Изоникотиновая кислота является промежуточным продуктом в синтезе ряда противотуберкулезных препаратов группы гидразида изоникотиновой кислоты, антидепрессантов – ингибиторов моноаминооксидазы, хинуклидиновых лекарственных средств. Некоторые производные пиколиновой кислоты, в частности, 6-метилпиколиновая кислота – промежуточные продукты в синтезе фармацевтических препаратов, например, димеколина [82]. Впервые возможность получения ароматических карбоновых кислот из соответстующих нитрилов биокаталитическим способом была показана японскими исследователями в 1988 году. Ферментативная конверсия 3-цианопиридина в никотиновую кислоту и никотинамид была осуществлена при использовании в качестве биокатализатора клеток R. rhodochrous Jl, содержащих нитрилгидратазу и нитрилазу [300, 305].

Компании Nitto, BASF и Lonza разработали промышленный процесс биотрансформации 3-цианопиридина в никотинамид на основе клеток R.

rhodochrous Jl [112]. Общий годовой объем производства никотинамида биотехнологическим путем превышает 3000 тонн [14].

Способность к трансформации ароматических нитрилов до соответствующих амидов и карбоновых кислот встречается у представителей различных родов бактерий: Rhodococcus, Nocardia, Agrobacterium, Microbacterium, Arthrobacter, Alcaligenes, Comamonas, Klebsiella, Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter [18] и грибов Fusarium, Aspergillus, Giberella, Pinicillum [224]. Кроме биокатализатора R. rhodochrous Jl, для синтеза пиридинкарбоновых кислот и их амидов в лабораторных условиях были использованы нитрилаза Aspergillus niger К10 [342], клетки Microbacterium imperiale CBS 498-74 [112, 295, 296], R.

rhodochrous PA-34 [330], N. globerula NHB-2 [308, 366, 367], R. erythropolis MTCC 1526 [240], B. pallidus Dac521 [106]. Группой исследователей под руководством L.

Martnkov был разработан процесс синтеза никотиновой кислоты в мембранном реакторе [112, 295, 296].

Нитрилгидролизующие ферменты способны осуществлять региоселективные трансформации, т.е. предпочтительное протекание реакции по одному из нескольких возможных реакционных центров молекулы. Так, нитрилаза Acidovorax facilis 72W и нитрилгидратазно-амидазная ферментативная система нескольких штаммов Comamonas testosteroni гидролизует (E,Z)-2-метилбутанонитрил до (E)-2-метил-2-бутановой кислоты (тиглиновой кислоты), интермедиата синтеза ряда фармпрепаратов и ароматизаторов [354]. С помощью нитрилазы из R. rhodochrous J1 был осуществлен региоселективный синтез 3- и 4цианобензойных кислот из изофталонитрила и терофталонитрила соответственно, со степенью конверсии более чем 99% [251].

Некоторые амидазы [160, 193, 199, 208, 215, 254, 263, 293, 345] и нитрилазы [116, 119, 120, 161, 171, 190, 191, 195, 355, 362, 411], редко – нитрилгидратазы [322, 346], обладают стереоселективностью, т.е. способностью гидролизовать преимущественно один изомер из рацемической смеси. Это свойство определяет интерес к этим ферментам как катализаторам синтеза энантиомерно чистых предшественников фармпрепаратов. Например, стереоселективная нитрилаза может гидролизовать 3-гидроксиглутаронитрил до (R)-4-циано-3гидроксибутирата, являющегося промежуточным соединением при синтезе препарата Аторвастатина (Lipitor), снижающего уровень холестерина в крови и являющегося на настоящий момент одним из наиболее продаваемых лекарственных препаратов в мире [299]. Эта трансформация может также катализироваться нитрилгидратазно-амидазной системой, в которой стереоселективностью обладает амидаза, как в случае конверсии 3гидроксиглутаронитрила штаммом R. erythropolis N'4 [159].

Оптически активные 2-арилпропионовые кислоты являются активными субстанциями для синтеза нестероидных противовоспалительных средств – профенов. Известно, что активность профенов заключается в S-энантиомере. Тем не менее, многие профены используются как рацемические соединения, из-за сложности их получения в виде оптически чистых растворов. Поэтому ферментативный энантиоселективный синтез представляет для фармацевтической промышленности особый интерес. Так, в результате скрининга был выделен штамм sp. AK226, конвертирующий рацемический 2-(4'Acinetobacter изобутилфенил)пропионитрил в S-(+)-2-(4'-изобутилфенил)пропионовую кислоту

– S-(+)-ибупрофен [340].

Амид D-фенилглицина и D-фенилглицин являются ключевым интермедиатом в синтезе полусинтетических антибиотиков [107, 108, 144, 223].

Путем скрининга были получены штаммы рода Rhodococcus, использующие различные нитрилы в качестве единственного источника углерода и азота и обладающие неселективной нитрилгидратазой и экстремально селективной Lамидазой. Эти культуры гидролизовали D,L-фенилглицинонитрил до амида Dфенилглицина с выходом 48% и более чем 99% энантиомерным избытком и Lфенилглицина с выходом 52% и ee 97% [223]. Проведена трансформация рацемического фенилглицинонитрила в D-фенилглицин с энантиомерным избытком 95–98% клетками Pseudomonas aeruginosa 10145 [107, 108]. Выделено и исследовано несколько бактериальных изолятов, содержащих стереоселективную нитрилгидратазу. Различными штаммами Pantoea sp. и Nocardioides sp.

осуществлен гидролиз (RS)-фенилглицинонитрила до (S)-фенилглицина (99% ee), (R)-фенилглицина (99% ee), и амида (S)-фенилглицина (52% ee) [214].

Одно из направлений исследований нитрилгидролизующих бактерий и их ферментов связано с синтезом энантиомеров миндальной кислоты. (R)-(-)миндальная кислота является ключевым интермедиатом для получения полусинтетических цефалоспоринов и пенициллинов [362]. (R)-(-)-миндальная кислота была получена из рацемического нитрила миндальной кислоты в процессе биокатализа клетками Alcaligenes faecalis ATCC 8750 c энантиомерным избытком 100% [339], Pseudomonas putida MTCC 5110 с ee 98,8% [119, 195], ферментным препаратом грубой очистки, содержащим нитрилазу из A. faecalis МТСС 126 с ee 98,89% [355], изолятами P. putida, Microbacterium paraoxydans, M.

liquefaciens с ee 93% [362].

1.3. Иммобилизация клеток нитрилгидролизующих бактерий для целей биокатализа и биодеградации Данные, касающиеся иммобилизации клеток нитрилгидролизующих бактерий, обобщены в таблице 4. Анализ литературных данных показал, что подавляющее большинство исследований, касающихся иммобилизации нитрилутилизирующих микроорганизмов, связано с изучением биокаталитических свойств клеток, включенных в структуру гелей. Наиболее распространенным носителем, применяемым в этом методе иммобилизации клеток, является альгинат кальция. Так, клетки P. putida MTCC 5110, обладающие нитрилазной активностью, были включены в структуру альгината кальция и использованы для энантиоселективного гидролиза нитрила миндальной кислоты.

Удельная активность иммобилизованных клеток была в 1,56–1,77 раза ниже, чем таковая свободных клеток при соответствующих рН, что, по предположению авторов, было обусловлено ограничением массопереноса в гелевом матриксе [119]. Известно, что одной из основных проблем иммобилизации биокатализатора являются ограничения массопереноса, возникающие из-за некаталитического матрикса, который составляет наибольшую часть иммобилизованного препарата.

Нерастворимость многих нитрильных субстратов в водной среде приводит к эскалации диффузионных проблем, что, в свою очередь, приводит к падению скоростей реакций и снижению выхода продукта [243].

Таблица 4 – Иммобилизация клеток нитрилгидролизующих бактерий

–  –  –

Тем не менее, иммобилизация в альгинате кальция обеспечивала клеткам P.

putida MTCC 5110 дополнительную степень термостабильности, проявляющуюся в более высокой активности при температурах выше 45С. Также иммобилизация позволяла многократно использовать биокатализатор с 88%-ной эффективностью конверсии нитрила миндальной кислоты на протяжении 20 последовательных реакционных циклов. При дозированном введении субстрата в реактор продуктивность на единицу объема составляла 0,49 г миндальной кислоты/л/ч, а каталитическая продуктивность – 0,39 г кислоты на 1 г клеток, причем энантиомерная чистота продукта составляла 98,8% [119].

Для трансформации нитрила миндальной кислоты до (R)-(–)-миндальной кислоты в структуре геля альгината кальция были иммобилизованы клетки рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21 (DE3), содержащие ген нитрилазы из P. putida MTCC 5110. В ряде экспериментов гранулы альгината кальция были обработаны глутаровым альдегидом для стабилизации. При повторном использовании в последовательных циклах конверсии субстрата наиболее стабильными были клетки, иммобилизованные в альгинате кальция с обработкой сшивающим агентом, наименее стабильными – суспендированные клетки.

Нитрилазная активность клеток в альгинате кальция без дополнительной стабилизации была достаточно высокой на протяжении 8 последовательных циклов конверсии субстрата. Во всех случаях энантиомерная чистота продукта была близка к 100% [379].

Клетки Pseudomonas aeruginosa 10145, иммобилизованные в структуре альгината кальция, катализировали гидролиз 2-фенил-2-аминоацетонитрила в энантиомерночистый D-фенилглицин. Максимальная конверсия субстрата, составляющая 20%, была достигнута за 3 ч реакции при использовании в качестве носителя гранул, пористость которых достигалась за счет более разбавленного раствора альгината натрия (1,5% вес/об.). При этом энантиомерный избыток Dфенилглицина составлял 98% [107].

Включенные в структуру геля альгината бария клетки Candida guilliermondii CCT 7207 были способны к деградации разнообразных нитрильных соединений, тогда как дрожжи в свободном состоянии не метаболизировали бензонитрил, циклопентанокарбонитрил и бензамид [181]. Инкапсулированные в альгинате кальция и бария клетки Rhodococcus sp. AJ270, содержащие нитрилгидратазноамидазную ферментативную систему, эффективно катализировали биотрансформацию рацемического транс-2-метил-3-фенил-оксиранкарбонитрила до энантиомерночистого в 2R,3S-(–)-2-метил-3-фенил-оксиранкарбоксамида присутствии органических растворителей метанола и ацетона [229].

Скрининг различных носителей, среди которых были альгинат кальция, агар, полиакриламид, ПВС, для иммобилизации клеток Bacillus subtilis ZJB-063, содержащих нитрилазу, показал, что наибольшей активностью в реакции биосинтеза p-метоксифенилуксусной кислоты из p-метоксифенилацетонитрила обладал препарат, в котором матриксом являлся альгинат кальция. За ним следовал агар, а иммобилизованный биокатализатор на основе ПАА и ПВС проявил наименьшую активность. Клетки, включенные в структуру геля альгината кальция, могли быть повторно использованы на протяжении 9 последовательных реакционных циклов с сохранением не менее 50% активности, а дополнительная обработка гранул полиэтиленимином и глутаровым альдегидом приводила к увеличению операционной стабильности до 18 циклов [156].

Некоторые авторы, наоборот, отмечают преимущества использования в качестве гелевого матрикса ПВС по сравнению с альгинатами. Так, гранулы геля ПВС, содержащие клетки, механически более устойчивы, и что более важно, не теряют своей структуры при использовании широкого ряда буферов различных значений рН, тогда как гель альгината кальция растворяется в кислых растворах.

Высушенные гранулы геля ПВС с иммобилизованными в их структуре клетками Rhodococcus sp. ATCC 39484 не теряли своей нитрилгидратазной активности при регидратации [328]. Среди четырех изученных носителей – ацетата целлюлозы, альгинатов кальция и бария и полиакриламида показано преимущество последнего для иммобилизации клеток Brevibacterium CH1, обладающих высокой активностью нитрилгидратазы по отношению к акрилонитрилу в сочетании с низкой активностью амидазы. Т.к. фермент быстро деактивировался при достижении концентрации акрилонитрила 10,1%, в реакторе поддерживали концентрацию субстрата ниже 3% и температуру 4С [221].

Гели триацетата целлюлозы и альгината кальция были использованы для иммобилизации клеток Klebsiella oxytoca, осуществляющих биодеградацию пропионитрила. Иммобилизованные системы были более эффективны, чем свободные клетки, для удаления пропионитрила в широких диапазонах температур (20–40С) и рН (6–8) и осуществляли деградацию субстрата до 99% в пяти последовательных циклах [128].

Возвращаясь к сравнению альгинатных гелей с другими носителями, нужно подчеркнуть, что примеры преимущества этих матриксов для иммобилизации клеток нитрилгидролизующих микроорганизмов встречаются чаще. Так, клетки UFMG-Y65, иммобилизованные в Са-альгинате, Candida guilliermondii деградируют ацетонитрил более эффективно, чем включенные в структуру геля каррагинана или цитрусового пектина [182]. Иммобилизация клеток Pseudomonas chlororaphis B23, содержащих нитрилгидратазу, гидратирующую адипонитрил до 5-циановалерамида с высокой региоселективностью, в гели агарозы и каррагинана оказалась невозможна, т.к. клетки быстро деактивировались при температурах, необходимых для иммобилизации в этих матрицах (35–50С).

Адсорбция на поверхности пористых неорганических носителей (таких как цеолит и пористое стекло) также не была предпочтительной из-за очень низкой удельной активности биокатализатора и механического истирания частиц в реакторе с перемешиванием. Высокая удельная активность биокатализатора была достигнута при включении клеток в структуру ПААГ и альгината кальция, но в идентичных условиях последний был более предпочтителен из-за его стабильности и большего выхода продукта на единицу веса катализатора [83].

Показано преимущество геля альгината кальция перед непрочными гранулами геля ПВС для иммобилизации клеток штаммов псевдомонад, деградирующих нитрил янтарной кислоты [397].

Иммобилизация клеток B. pallidus Dac521, продуцирующих нитрилазу, в структуре альгината кальция не воздействовала на удельную активность фермента, которая в реакции трансформации 3-цианопиридина до никотиновой кислоты сохранялась на уровне 98% от активности нативных клеток. При этом клетки были более устойчивы к инактивации при 60С, чем неиммобилизованные.

Колоночный биореактор, заполненный иммобилизованным биокатализатором, функционировал при 50 и 60С с сохранением 100% нитрилазной активности в течение 100 и 10 ч соответственно [106]. Одним из способов преодоления ограничений массопереноса, возникающих при иммобилизации клеток в структуре гелей, является повышение температуры реакции. Но в этом случае активность ферментов будет снижаться в результате тепловой денатурации. Так, хотя иммобилизованные методом включения в структуру геля альгината кальция клетки B. pallidus Dac521 сохраняли 98% своей первоначальной активности при трансформации 3-цианопиридина, нитрилазная активность при 50°С составляла лишь 37 нмоль/мг/мин [106]. В сравнении со штаммом B. pallidus Dac521, содержащим термофильную нитрилазу, клетки Nocardia rhodochrous (R. rhodochrous) LL100-21, нитрилаза которых мезофильна, сохраняли только 38% активности при иммобилизации в структуре геля альгината кальция, хотя при этом активность составляла 61 нмоль/мг/мин при 30°С [401].

Показано, что иммобилизация клеток термофильных Bacillus spp. в геле альгината кальция обеспечивала небольшую дополнительную термо- и химическую стабильность к высоким концентрациям субстрата, но скорость утилизации субстрата была лимитирована диффузионными затруднениями [303].

Также клетки R. rhodochrous, инкапсулированные в гранулы альгината, осуществляли биотрансформацию бензонитрила до бензойной кислоты нитрилазой со снижением скорости реакции на 26% по сравнению со свободными клетками [391]. В свою очередь, деградация акриламида амидазосодержащими клетками Pseudomonas aeruginosa, включенными в структуру геля альгината кальция, начиналась раньше, чем свободными, однако к третьим суткам деградация неиммобилизованными клетками была интенсивнее [329].

Клетки Rhodococcus AJ270, проявляющие амидазную активность, были иммобилизованы включением в гель агара и агарозы с целью дальнейшего использования для получения акриловой кислоты, и в качестве сравнения адсорбированы на анионной ионообменной смоле Dowex 1. По сравнению с бактериями, адсорбированными на Dowex 1, клетки, включенные в структуру агара, проявляли восьмикратно более высокую активность в расчете на см3 матрикса. Адсорбция и включение в структуру геля приводили к увеличению термостабильности амидазы в 3–4 раза, кроме того, включение в агар приводило к сдвигу рН оптимума с 8 до 7 и увеличению Km [166].

Клетки B. megaterium F-8, содержащие амидазу, были иммобилизованы в структуру гелей альгината кальция, агара, ПАА, и ПВС-альгинат кальция [135, 168]. При включении клеток в структуру гелей агара, ПАА и ПВС-альгинат кальция сохранялось 75, 65 и 80% ацилтрансферазной активности амидазы в реакции трансформации ацетамида в ацетогидроксамовую кислоту, тогда как при иммобилизации клеток в структуре геля альгината кальция потери ферментативной активности не наблюдалось. Иммобилизованные клетки проявили устойчивость по отношению к высоким концентрациям ацетамида (более 600–700 мМ), в то время как рост свободных клеток при этих концентрациях субстрата полностью ингибировался. При проведении повторных циклов трансформации ферментативная активность иммобилизованных клеток постепенно повышалась к 5-му циклу, после чего активность оставалась постоянной до 10-го цикла [135].

Подобная зависимость при многоцикловом использовании была обнаружена для клеток R. rhodochrous NHB-2, иммобилизованных в агаре и ПААГ: после 5-го цикла амидазная активность, рассчитанная в % от исходной активности неиммобилизованных клеток, повышалась соответственно с 75 и 65% до 98 и 92%. Клетки, иммобилизованные в структуре геля альгината кальция, проявили более высокую термостабильность, чем свободные [396].

T.C. Bhalla с соавторами сообщили об эффективной конверсии 4цианопиридина клетками Nocardia globerula NHB-2, иммобилизованными в 1%ном агаре. При этом концентрация субстрата в среде, равная 100мМ, была оптимальна для конверсии иммобилизованными клетками [337].

Клетки R. equi A4, проявляющие нитрилгидратазную и амидазную активность, были иммобилизованы в гранулах гидрогеля LentiKats® линзообразной формы, которые представляют собой сополимер ПВС и полиэтиленгликоля. Полученный иммобилизованный биокатализатор был использован для биотрансформации бензонитрила, 3-цианопиридина, (R,S)-3гидрокси-2-метиленбутанонитрила и (R,S)-гидрокси-2-метилен-3фенилпропанонитрила. Иммобилизованные клетки полностью сохраняли нитрилгидратазную активность после иммобилизации, но стабильность фермента при повторных циклах трансформации была невелика. Наоборот, амидаза полностью сохраняла свою активность при повторном использовании биокатализатора. Исключительная стабильность биокатализатора при конверсии 3-гидрокси-2-метиленбутанонитрила позволила авторам предположить, что маленькие молекулы алифатических нитрилов являются наиболее подходящими субстратами [136].

Клетки умеренно термофильного штамма Bacillus sp. UG-5B, обладающего нитрилазной активностью, были иммобилизованы различными способами – на поверхности (либо в структуре) разных носителей. Для включения клеток были использованы гибридные соль-гель матриксы, в которых предшественник оксид кремния был заменен 5–20% органического компонента – полиэтиленгликоля и/или ПВС. Клетки были включены в структуру вышеперечисленных матриксов, либо адсорбированы на них. Кроме того, для ковалентного связывания клеток были использованы те же носители и полисульфоновые мембраны, предварительно активированные формальдегидом. Активация носителей приводила к возрастанию ферментативной активности связанных клеток в 3 раза и была наибольшей для клеток на активированных мембранах (0,53 ЕД/мг клеток, где 1 ЕД соответствует количеству фермента, продуцирующему 1 мкм аммония в мин при конверсии бензонитрила). При повторных циклах конверсии наименьшей стабильностью обладали адсорбированные клетки [227].

S. Chacko с соавторами изучали продукцию амидазы иммобилизованными в альгинат кальция клетками P. putida MTCC 6809 и влияние дегидратации гранул на продукцию этого фермента. Иммобилизованный биокатализатор асептически переносили в свежую питательную среду, выращивали в течение 48 ч и определяли его амидазную активность. Авторы отмечают, что амидазная активность увеличивалась после 1 цикла, достигая максимума ко 2, 3 и 4-му циклам, после чего снижалась с сохранением 70% активности к 5 и 6-му циклу.

Включение клеток в гранулы альгината обеспечивало небольшое повышение активности при 35 и 45°С на 20 и 10% соответственно. Дегидратация гранул приводила к снижению активности, которая составляла лишь 27% по сравнению с гидратированными гранулами, хотя и давала ряд преимуществ, таких как снижение риска бактериальной контаминации и легкость в транспортировке [153].

Был проведен асимметрический гидролиз (R)-2, 2-диметилциклопропана карбоксамида из рацемического (R, S)-2, 2-диметилциклопропана карбоксамида клетками Delftia tsuruhatensis CCTCC M 205114, иммобилизованными в геле альгината кальция, с целью накопления в среде S-изомера – ключевого интермедиата циластатина.

Иммобилизованные клетки проявили более высокую операционную стабильность по сравнению со свободными клетками – при включении клеток в стуктуру альгината кальция к 8-му циклу конверсия составляла 83,1%, тогда как у свободных клеток этот показатель был менее 50% после 3-х последовательных циклов реакции [193].

Также для получения гетерогенного биокатализатора был разработан метод образования обращенных мицелл катионного сурфактанта тетрадецилтриметилбромида аммония в гептане/октаноле (80/20%) с включенными в них клетками Pseudomonas aeruginosa, содержащими амидазу.

Такие мицеллярные системы были использованы для синтеза гидроксамовых кислот. Иммобилизованный биокатализатор обладал большей стабильностью и проявлял более высокую активность при более низких концентрациях субстрата по сравнению со свободными клетками [338].

Иммобилизация нитрилгидролизующих бактерий была выполнена и для других целей – так, клетки R. ruber NCIMB 40757 в матриксе пористых колец из диметилсиликона ImmobaSilTM осуществляли детоксикацию паров акрилонитрила [124] и были использованы в составе кондуктометрического биосенсора для определения акрилонитрила в растворе [180].

По современным представлениям, микроорганизмы в природе существуют в виде структурированных сообществ – биопленок, формирующихся на поверхности раздела фаз [43]. При сравнении планктонных и прикрепленных популяций, одной из наиболее явных отличительных черт биопленок является внеклеточный полимерный матрикс, в который заключены клетки [209]. Сложная архитектура биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток внутри хорошо организованных систем [23].

Помимо общеизвестной отрицательной роли микробных биопленок, которая заключается в биокоррозии трубопроводов и систем коммуникации, в развитии инфекционного процесса, усугубляющегося повышенной устойчивостью биопленкообразующих микроорганизмов к антибиотикам и бактерицидным агентам, колонизацией медицинского оборудования, имплантантов и катетеров, есть и другая, положительная сторона процесса пленкообразования. То, что является серьезной медицинской проблемой, становится неоспоримым преимуществом при биологической очистке сточных вод и загрязненных почв. Устойчивость к биоцидам, токсичным веществам, растворителям, высоким концентрациям тяжелых металлов позволяет рассматривать микробные биопленки как основное звено процесса биодеградации поллютантов. Кроме того, биопленки промышленно значимых штаммов микроорганизмов могут рассматриваться как самоиммобилизующиеся и саморегенерируемые биокатализаторы, что особенно актуально в тех случаях, когда субстраты и/или продукты биокатализа отрицательно воздействуют на жизнеспособность клетки [281].

Если использование биопленок в биологической очистке сточных вод имеет длительную историю, то целесообразность применения самоиммобилизованных в процессе роста микроорганизмов для целей биокатализа до сих пор остается спорным вопросом. В зависимости от природы катализатора, реакции, используемых субстратов и образующихся продуктов разработаны различные подходы к использованию в этих процессах целых клеток микроорганизмов.

Целые клетки главным образом применяются в реакциях, основанных на катализе нестабильными, мультикомпонентными или мембран-связанными ферментами, или в сложных многостадийных реакциях и/или требующих присутствия кофакторов. Кроме того, целые клетки предпочтительнее изолированных ферментов из-за возрастания стоимости процесса, требующего стадии их выделения и очистки. Можно отметить несколько различных стратегий, касающихся цельноклеточного катализа, которые могут быть дифференцированы в зависимости от типа реакции (ферментация или биотрансформация) и типа используемых клеток (свободные или иммобилизованные, растущие или покоящиеся). Особый тип биокатализатора представляют биопленки, которые состоят из смеси растущих и покоящихся клеток и применимы как для ферментации, так и для биотрансформации [281].

Многие микроорганизмы способны формировать биопленки, представляющие собой монокультуру, и являться биокатализаторами различных процессов трансформаций органических веществ. Монопленки микроорганизмов предпочтительны для процессов получения органических веществ, т.к. при этом возможен контроль и максимальный выход желаемых продуктов [130, 131]. В то же время, конструирование многовидовых бактериальных сообществ может оказаться полезным для выполнения каскадных или многошаговых реакций в синтезе предшественников фармпрепаратов или в биоэнергетике [212].

Возможность осуществления процессов с использованием биопленок зависит от биологических свойств микроорганизмов. Известно, что рост биопленки – это многостадийный процесс, включающий начальный этап прикрепления клетки к твердой поверхности, за которым следует необратимая адгезия, обусловленная внеклеточными полимерными веществами, продуцируемыми клеткой, пролиферация клеток и созревание биопленки, и, наконец, отрыв клеток от биопленки [209]. Внеклеточный полимерный матрикс, в составе которого могут быть углеводы, протеины, ДНК и липиды, сильно варьирует у различных микроорганизмов в зависимости от условий окружающей среды и, в свою очередь, оказывает влияние на морфологию и физиологию биопленки. При использовании биопленок в промышленности образование внеклеточного полимерного матрикса должно строго контролироваться, т.к. его избыток ограничивает массоперенос и загрязняет среду, снижая продуктивность катализа. Влияние образования внеклеточного полимерного матрикса на продуктивность, по-видимому, обусловлено свойствами самого организма, составом среды и типом процесса. Требования к микроорганизму, биопленка которого используется для биотрансформаций, заключаются в следующем: 1) непатогенность; 2) генетическая стабильность; 3) возможность быстрого образования прочно прикрепленной биопленки; 4) отсутствие избыточного образования внеклеточных полимерных веществ [281].

Многослойные зрелые биопленки состоят из клеток в различном физиологическом состоянии, причем на этой стадии развития биопленок обычно наблюдается ограничение диффузии субстратов и продуктов. Различия в физиологическом состоянии и метаболической активности клеток, наряду с ограничением диффузии, создают градиенты субстратов и продуктов в биопленках. Хорошо известно, что биопленки обладают повышенной по сравнению с суспендированными клетками толерантностью к антимикробным агентам, токсичным веществам и другим вредным факторам. Ряд механизмов резистентности связан с такими моментами, как ограничение диффузионных процессов, лимитирование роста клеток, образование особых клеток в переживающем состоянии – «персистеров» и активное удаление токсинов.

Некоторые из этих механизмов устойчивости могут быть неблагоприятны для продуктивного катализа. Например, устойчивость, обусловленная ограничением роста или состоянием метаболического покоя, может затруднять продукцию метаболитов, связанных с ростом, тогда как ограничение массопереноса и активное удаление токсичных субстратов посредством эффлюкса или деградации может негативно воздействовать на продуктивность [281].

Несмотря на то, что биопленки микроорганизмов традиционно используются для очистки сточных вод [47, 115, 213, 236, 275, 286, 324, 351, 373] и деградации поллютантов [139, 356], имеются примеры эффективного использования биокатализаторов в виде биопленок микроорганизмов в процессах ферментации и трансформации органических веществ. В реакторах, основанных на жизнедеятельности микробных биопленок, могут быть получены этанол [167, 169, 178, 259, 262, 398], бутанол [170, 207, 350, 405], 2,3-бутандиол [274], уксусная [131], молочная [89, 179, 216, 387], янтарная [202], фумаровая кислоты [336, 372].

В лабораторных условиях были проведены трансформации стирола в энантиомерно чистый (S)-оксид стирола биопленками штамма Pseudomonas sp.

VLB120C [282], конверсия D-аланина в пировиноградную кислоту биопленками Acetobacter xylinum, самоиммобилизованными в целлюлозных нановолокнах, которые штамм образовывал в процессе роста [364], трансформация бензальдегида в бензиловый спирт биопленками Zymomonas mobilis [197]. Кроме того, известны примеры использования биопленок микроорганизмов в биоэнергетике, в частности, для получения биогаза [114, 132, 270, 417].

Однако, что касается нитрилгидролизующих бактерий, в научной литературе имеются сведения только о деградации нитрилов биопленками для целей биологической очистки, а не для целей биокатализа. Так, был разработан процесс культивирования микроорганизмов, использующих ацетонитрил как единственный источник углерода и азота, в виде биопленки на пластиковых носителях. Для этого был использован реактор с перемешиванием и постоянной подачей ацетонитрила. Эффективность процесса деградации ацетонитрила составляла от 53 до 100% в зависимости от нагрузки органическим веществом.

Чтобы улучшить биодеградационные возможности процесса, был разработан двухшаговый процесс, основанный на применении двух реакторов, работающих совместно. В этом случае была достигнута эффективность 92–100% с нагрузкой 2 г ацетонитрила/л/сутки в первом реакторе [211].

Обобщая данные научной литературы, касающиеся иммобилизации нитрилгидролизующих бактерий, следует подчеркнуть, что данные по применению адгезированных клеток для биокатализа нитрилов единичны и не подтверждают успешность этого метода. В то же время известно, что метод включения клеток в структуру гелей разработан скорее на лабораторном уровне, т.к. является более дорогим и трудозатратным, а также в большинстве случаев приводит к снижению выхода продукта из-за затруднений массообмена в матриксе гелей. Поэтому метод иммобилизации путем адгезии клеток на носителе требует детальной разработки, сопровождающейся правильным подбором носителей и условий, для дальнейшего внедрения в биокаталитическое производство.

1.4. Иммобилизованные ферменты метаболизма нитрилов В некоторых производствах гораздо выгоднее вместо целых клеток использовать изолированные ферменты или неочищенные клеточные экстракты.

В этом случае ферментативная реакция имеет следующие преимущества [6]:

– высокоспецифична по отношению к субстрату и продукту (тогда как клетка может обладать альтернативными метаболическими путями, в ходе которых образуются нежелательные побочные продукты);

– легче вести борьбу с микробным загрязнением продукта;

– не требуется специальной питательной среды для выращивания клеток;

– отсутствуют клеточные мембраны, препятствующие взаимодействию фермента и субстрата.

Хотя большинство ферментов, имеющих промышленное значение, содержится внутри микробных клеток, некоторые из них, особенно обладающие протеазным действием, относятся к внеклеточным ферментам. Очевидно, что для использования таких ферментов нет смысла осуществлять иммобилизацию микробных клеток. Иммобилизация клеток бесполезна во всех случаях, когда субстрат представляет собой полимер или нерастворимое вещество, так как она приводит к еще большему ограничению контакта между катализатором и субстратом. Кроме того, если в клетках содержится фермент, оказывающий неблагоприятное влияние на субстрат или на продукт основной реакции, можно избавиться от этой нежелательной ферментативной активности, например, путем ее ингибирования или избирательной тепловой денатурации. Если же от нее не удается избавиться, то имеет смысл использовать очищенный фермент вместо целых клеток.

В то же время при использовании ферментов в качестве промышленных катализаторов также возникает целый ряд проблем, связанных с тем, что фермент часто оказывается нестабильным; растворимый фермент практически не поддается регенерации, процесс, основанный на работе растворимых ферментов, обычно носит периодический характер, и поэтому его трудно автоматизировать [73].

Среди различных способов стабилизации ферментов можно выделить следующие:

– увеличение жесткости белковой глобулы, которое препятствует ее денатурационному разворачиванию и тем самым инактивации. Этот подход может достигаться образованием химических связей между молекулами с образованием водорастворимого препарата; либо многоточечного взаимодействия белка (как ковалентного, так и физического) с поверхностью носителя для получения нерастворимого, гетерогенного биокатализатора.

– пространственное разделение фермента и тех факторов среды, которые не благоприятствуют сохранению каталитической активности и специфичности [37].



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 10 |

Похожие работы:

«Минаева Наталья Викторовна Отдаленные последствия высокодозной химиотерапии и аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами 14.01.21 – гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Храмов Александр Валерьевич ЮРСКИЕ СЕТЧАТОКРЫЛЫЕ (INSECTA: NEUROPTERA) ЦЕНТРАЛЬНОЙ АЗИИ 25.00.02 Палеонтология и стратиграфия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Пономаренко Александр Георгиевич Москва 2014 Оглавление ВВЕДЕНИЕ Глава 1. История изучения юрских Neuroptera Глава 2. Отряд Neuroptera 2.1. Система и биология...»

«ШАЯХМЕТОВ МАРАТ РАХИМБЕРДЫЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ПОЧВЕННОГО ПОКРОВА ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ НА ОСНОВЕ ДИСТАНЦИОННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ ЗЕМЛИ 03.02.13 – почвоведение Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Л.В. Березин Уфа...»

«КОНОНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НОВЫХ СОРТОВ СТЕВИИ Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley ПРИ ВВЕДЕНИИ В КУЛЬТУРУ В ЦЕНТРАЛЬНОМ ПРЕДКАВКАЗЬЕ по специальности 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«УДК 5 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 «антропология» по биологическим наукам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор исторических наук, чл.-корр. РАН А.П. БУЖИЛОВА...»

«УДК 591.15:575.17-576.3 БЛЕХМАН Алла Вениаминовна ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННАЯ И ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ШИРОКОАРЕАЛЬНОГО ВИДА HARMONIA AXYRIDIS PALL. ПО КОМПЛЕКСУ ПОЛИМОРФНЫХ ПРИЗНАКОВ 03.00.15 генетика Диссертация на соискание ученой степени V кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук,...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Галкин Алексей Петрович ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Специальность 03.02.07 – генетика диссертация на соискание учной степени доктора биологических наук Научный консультант: Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....»

«КОЛОТВИН АНДРЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ Прогностическая значимость генетического полиморфизма патогена и хозяина для оценки эффективности терапии и развития фиброза печени при хроническом гепатите С Молекулярная биология –...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«КУЖУГЕТ ЕЛЕНА КРАССОВНА «Хозяйственно-биологические особенности крупного рогатого скота, разводимого в разных природно-климатических зонах Республики Тыва» 06.02.10. Частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«МИХАЙЛОВ РОМАН АНАТОЛЬЕВИЧ ЭКОЛОГО-ФАУНИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ СРЕДНЕЙ И НИЖНЕЙ ВОЛГИ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор И.А. Евланов Тольятти – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ...»

«СИНЕЛЬЩИКОВА Александра Юрьевна Ночная миграция дроздов рода Turdus в юго-восточной Прибалтике Специальность 03.02.04 – Зоология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник К.В. Большаков Санкт-Петербург Оглавление Введение... 3 Глава 1. Особенности миграции...»

«ШАРАВИН Дмитрий Юрьевич IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А.И. Саралов Пермь – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СТР. ВВЕДЕНИЕ.. 4...»

«ЯКОВЛЕВ Роман Викторович Древоточцы (Ьер1^р1ега, Cossidae) Старого Света Том 1 (Приложения в 2-х томах) 03.02.05 энтомология диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук научный консультант Дубатолов Владимир Викторович, доктор биологических наук Барнаул 2014 Оглавление Оглавление Введение Глава 1. История изучения древоточцев (Lepidoptera, Cossidae) Старого Света 1.1. Периоды изучения древоточцев Старого Света...»

«ЕРМОЛАЕВ Антон Игоревич ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ МЕЛКИХ СОКОЛОВ В ДОЛИНЕ МАНЫЧА 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.