WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |

«ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

МАКСИМОВА Юлия Геннадьевна

ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ

НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И

ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ

КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

чл.-корр. РАН, профессор, доктор медицинских наук Демаков Виталий Алексеевич Пермь – 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………………..6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………………….21

ГЛАВА 1. ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ ТРАНСФОРМАЦИИ

НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ……………………………...21

1.1. Метаболизм нитрилов у микроорганизмов……………………………………..27

1.2. Биокаталитическое получение амидов и карбоновых кислот из нитрилов……………………………………………………………………………40

1.3. Иммобилизация клеток нитрилгидролизующих бактерий для целей биокатализа и биодеградации…………………………………………….45

1.4. Иммобилизованные ферменты метаболизма нитрилов………………………..60

1.5. Физиология иммобилизованных микроорганизмов……………………………75

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………...86

2.1. Бактериальные штаммы и среды культивирования……………………………86

2.2. Условия культивирования бактерий в жидких питательных средах и определение ростовых характеристик………………………………………….87

2.3. Культивирование бактерий в присутствии носителей…….…………………..87

2.4. Носители для иммобилизации бактериальных клеток и ферментов……........88

2.5. Определение гидрофобности поверхности носителей и бактериальных клеток…………………………………………………………94

2.6. Реактивы………………………………………………………………………......94

2.7. Определение нитрилгидратазной, нитрилазной и амидазной активностей и эффективности функционирования иммобилизованной системы…………...95

2.8. Определение массы адгезированных бактериальных клеток…………………96

2.9. Определение операционной стабильности иммобилизованных биокатализаторов………………..………………………………………..……...97

2.10. Получение белкового препарата, содержащего ферменты метаболизма нитрилов…………………………………………………...………97

2.11. Иммобилизация ферментов…………………………...………………………..99

2.12. Определение кинетических параметров ферментативных реакций, катализируемых свободными и иммобилизованными ферментами………...100

2.13. Определение констант термоинактивации свободных и иммобилизованных ферментов……………………………….……………….101

2.14. Определение рН- и температурного оптимумов активности свободных и иммобилизованных ферментов…………………..…………..…102

2.15. Определение концентрации АТФ в бактериальных клетках биолюминесцентным методом………………………………………………...103

2.16. Оценка биопленкообразования………………………..……………………...105

2.17. Высокоэффективная жидкостная и газовая хроматография………………..106

2.18. Микроскопия…………………………………………………………………...110

2.19. Статистическая обработка…………………………………………………….112

ГЛАВА 3. БИОКАТАЛИЗ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

АДГЕЗИРОВАННЫМИ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ …………………..113

3.1. Адгезия бактериальных клеток на носителях…………………………………113 3.1.1. Взаимодействие бактериальных клеток с многослойными углеродными нанотрубками……………………………………………….…124

3.2. Свойства углеродсодержащих носителей……………………………………..127 3.2.1. Адсорбция нитрилов, амидов и карбоновых кислот на неорганических носителях……………………………….………………..133

3.3. Трансформация алифатических нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий………...….135 3.3.1. Влияние адгезии клеток нитрилгидролизующих бактерий на их ферментативную активность ………………………………………….136 3.3.2. Операционная стабильность биокатализаторов на основе адгезированных клеток нитрилгидролизующих бактерий…………………146

3.4. Трансформация ароматических нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий….……...…158

3.5. Гетерогенный биокатализатор трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот на основе бактериальных клеток, агрегированных с нанотрубками ………...…………..………………………..168

3.6. Стереоселективная трансформация нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий…..….…….171

ГЛАВА 4. БИОКАТАЛИЗ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

БИОПЛЕНКАМИ НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ………………....179

4.1. Визуализация биопленок нитрилгидролизующих бактерий…………………179

4.2. Динамика роста биопленок нитрилгидролизующих бактерий………………182

4.3. Влияние адгезии нитрилгидролизующих бактерий на содержание внутриклеточного АТФ……………………………………………………...…185

4.4. Трансформация алифатических нитрилов биопленками нитрилгидролизующих бактерий……………………………

4.5. Трансформация ароматических нитрилов биопленками нитрилгидролизующих бактерий………………………………………….…..192

4.6. Влияние токсичных субстратов и продуктов реакции гидролиза нитрилов на концентрацию внутриклеточного АТФ и жизнеспособность клеток биопленок R. ruber gt1 и P. fluorescens С2..….194

4.7. Смешанные биопленки нитрилутилизирующих бактерий…………………..200

ГЛАВА 5. ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ ТРАНСФОРМАЦИИ

НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ НА ОСНОВЕ

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА

НИТРИЛОВ ……………………………………….…………………………………207

5.1. Трансформация акрилонитрила иммобилизованными ферментами гидролиза нитрилов……………………..…………………...…207 5.1.1. Гидратация акрилонитрила адсорбированными ферментными препаратами, содержащими нитрилгидратазу……………….…………….207 5.1.2. Гидратация акрилонитрила нитрилгидратазой, ковалентно связанной с активированным хитозаном…………….……………………...215 5.1.3. Гидролиз акрилонитрила адсорбированными ферментными препаратами, содержащими нитрилазу…………...…………………………226 5.1.4. Гидролиз акрилонитрила ковалентно иммобилизованными ферментными препаратами, содержащими нитрилазу…………...…..…….234

5.2. Гидролиз акриламида иммобилизованными ферментными препаратами, содержащими амидазу……………………………………......238

5.3. Стереоселективный гидролиз рацемического лактамида иммобилизованной амидазой………………………...…………..…………...244 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………...252 ВЫВОДЫ………………………………………………………………………….....274 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ………………………………………......277 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………...…278

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования Биокатализ - высокоэффективный специфичный процесс трансформации органических веществ, который в отличие от химического катализа происходит в «мягких» условиях, при нормальной температуре и давлении. Стадии хемоэнзиматического синтеза органических веществ, широко используемого в химической и фармацевтической промышленности, могут катализироваться микробными клетками, обладающими определенной ферментативной активностью, либо изолированными ферментами. Преимущества применения ферментов как промышленных катализаторов по сравнению с химическим катализом обусловлены экологической безопасностью ферментативных процессов, способностью к осуществлению стерео- и региоселективных трансформаций, возможностью получения органических веществ, не загрязненных продуктами побочных реакций [145, 186, 234, 235, 327, 359, 394, 416].

Получение амидов и карбоновых кислот с помощью микробных ферментов нитрилгидратазно-амидазного и нитрилазного пути метаболизма нитрилов является активно развивающейся биокаталитической технологией [14, 146, 220, 276]. Биотехнологическим способом из соответствующих нитрилов могут быть получены такие продукты, как акриламид [247, 316, 386], акриловая кислота [59, 69, 291, 404], никотинамид, никотиновая, изоникотиновая и пиколиновая кислоты [106, 109, 112, 278, 295, 305], путем стереоселективного гидролиза – энантиомерно чистые органические вещества, используемые в качестве интермедиатов при получении фармпрепаратов и химических веществ различного назначения [107, 119, 122, 362].

Интенсификация биотехнологических процессов может быть достигнута за счет перехода от гомогенного катализа к гетерогенному. Гетерогенный биокатализ – это ферментативный катализ, протекающий на границе раздела фаз.

В качестве катализаторов такого процесса могут выступать иммобилизованные ферменты или целые клетки микроорганизмов. Применение иммобилизованных биокатализаторов имеет ряд несомненных преимуществ, среди которых их стабилизация, возможность внедрения непрерывных технологий, упрощение процедуры выделения и очистки конечных продуктов, снижение количества отходов [24].

Несмотря на очевидные преимущества гетерогенного процесса, разработки иммобилизованных биокатализаторов часто остаются на лабораторном уровне, являются трудозатратными и не могут быть масштабированы и внедрены в производственный процесс. Неэффективность процесса создания гетерогенных биокатализаторов нередко связана с лежащим в его основе эмпирическим методом, иначе говоря, методом «проб и ошибок», отсутствием научно обоснованного подхода к их разработке в соответствии с требованиями биокаталитического процесса.

Подавляющее большинство исследований гетерогенных биокаталитических процессов выполнено на основе клеток микроорганизмов, включенных в структуру гелей [87, 141, 172, 253, 273, 320, 403], тогда как использованию адгезированных клеток в биокатализе уделяется существенно меньше внимания.

Это утверждение справедливо и для работ, касающихся иммобилизации клеток нитрилгидролизующих бактерий: основным методом иммобилизации является включение клеток в структуру гелей альгинатов [181, 229, 303, 391], каррагинанов [182], агара и агарозы [166], ПВС [328], ПАА [83]. Недостаточное внимание, уделяемое адгезированным биокатализаторам, может являться следствием основного недостатка этого метода – не очень высокой прочности взаимодействий, возникающих между клеткой и носителем, что приводит к вымыванию клеток. В то же время, именно иммобилизованные биокатализаторы на основе клеток микроорганизмов, приготовленные методом адгезии, могут быть масштабированы до уровня промышленного производства, т.к. их приготовление требует меньше времени, является несложным и экономически более выгодным.

Основным требованием к функционированию таких биокатализаторов является сохранение ферментативной активности и достижение высокой операционной стабильности, которое происходит, в основном, благодаря правильному подбору носителя. Следовательно, разработка научных основ создания гетерогенных биокатализаторов на основе адгезированных клеток остается особенно актуальной.

Адгезия микроорганизмов в природной среде является естественным процессом, обусловливающим их существование в прикрепленном состоянии и инициирующим процессы образования биопленки. Исследования, касающиеся прикрепленного состояния бактерий, в настоящее время интенсивно развиваются и затрагивают генетические основы биопленкообразования [23], анализ мРНК и протеомный анализ [231, 239], морфологические и физиологические особенности иммобилизованных клеток [230, 265, 360, 402], состав и структуру внеклеточного полимерного матрикса [19, 203, 204]. В то же время, невыясненными остаются особенности энергетического состояния адгезированных клеток, наблюдающиеся на стадии инициации образования биопленки при переходе клетки от планктонного способа существования к прикрепленному.

Известны лабораторные и промышленные разработки, в которых процессы микробной ферментации для получения спиртов, органических кислот, биогаза катализировались биопленками [114, 178, 179, 202, 262, 336, 372, 398]. В то же время, лишь единичные исследования посвящены изучению биопленок как катализаторов процессов трансформаций органических веществ [197, 282, 364], тогда как ряд авторов справедливо отмечает, что биопленка может являться самоиммобилизованным и саморегенерируемым катализатором, имеющим преимущества в тех случаях, когда токсичные субстраты и/или продукты ферментативного катализа оказывают неблагоприятное воздействие на жизнеспособность клетки [212, 281].

Иммобилизация ферментов для получения органических веществ имеет длительную историю [142], ряд работ посвящен трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот иммобилизованными нитрилгидролизующими ферментами [137, 158, 175, 222, 242, 377]. Однако остается не до конца выясненным вопрос целесообразности применения изолированных иммобилизованных ферментов в том случае, когда они являются внутриклеточными, и может быть иммобилизована целая микробная клетка без сложной и дорогостоящей процедуры выделения отдельного фермента.

Необходима систематизация знаний, касающихся каталитических свойств иммобилизованных различными способами ферментов метаболизма нитрилов и кинетических параметров катализируемых ими реакций, с целью выбора наиболее предпочтительных способов иммобилизации в зависимости от поставленных целей и особенностей биокаталитического процесса.

Изложенные проблемы обусловливают актуальность диссертационной работы, посвященной всестороннему анализу процесса гетерогенной трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, основанному на иммобилизованных биокатализаторах трех типов: адгезированных бактериальных клетках, самоиммобилизованных, растущих в виде биопленок бактериях, а также иммобилизованных нитрилгидролизующих ферментах.

Степень разработанности темы исследования Нитрилгидролизующие микроорганизмы в течение нескольких десятилетий остаются объектом повышенного внимания со стороны исследователей, изучающих генетические основы процессов трансформации нитрилов [28, 149, 163, 184, 326, 332, 393], метаболические пути, в которые вовлечены нитрилы и амиды, а также их предшественники и продукты нитрильного метаболизма [123, 185, 219, 245, 280, 292, 307, 325, 361,], биохимические основы процесса трансформации нитрилов и амидов [61, 162, 260], структуру нитрилгидролизующих ферментов [165, 176, 206, 246, 314, 315, 335, 409].

Возрастающий интерес к этой группе микроорганизмов вызван, главным образом, возможностью их применения в биотехнологических процессах для получения ряда промышленно важных химических веществ и фармпрепаратов [59, 69, 220, 287, 289]. Многочисленные работы посвящены гидролизу акрилонитрила в акриламид [221, 316, 352, 386] или акриловую кислоту [59, 69, 291, 404] микроорганизмами, обладающими нитрилгидратазо-амидазной системой [91, 173, 196, 272, 290, 304, 318] либо нитрилазой [18, 155, 248, 252, 298, 302, 310, 319].

Также в связи с перспективностью получения пиридинкарбоновых кислот и их амидов, широко используемых в качестве витаминов, пищевых добавок и предшественников фармпрепаратов, разрабатываются процессы микробного гидролиза цианопиридинов [109, 112, 240, 261, 278, 295, 296, 305, 308, 330, 348, 367]. Способность к стереоселективной трансформации [122, 235], обнаруженная у нитрилаз и амидаз, явилась причиной возросшего интереса к этим ферментам и появления большого количества научных работ, посвященных стереоселективному гидролизу нитрилов и амидов. Так, стереоселективная трансформация нитрила миндальной кислоты до изомера миндальной кислоты осуществляется бактериями родов Pseudomonas, Microbacterium, Alcaligenes, клетки которых содержат нитрилазу [119, 339, 355, 362, 381, 384]. Ряд работ посвящен получению других оптически активных производных нитрилов с помощью нитрилазной или нитрилгидратазно-амидазной ферментативных систем микроорганизмов: (S)-диметилциклопропан карбоновой кислоты – предшественника для синтеза антибиотика циластатина [414], (S)гидроксифеноксибутанамидов как потенциальных интермедиатов для синтеза адренергических блокаторов [191], -аминокислот – структурных компонентов ряда лекарственных препаратов [269, 333, 334, 382], D-фенилглицина – интермедиата для синтеза антибактериальных препаратов [107, 108, 171, 200, 214], этил (R)-4-циано-3-гидроксибутирата – интермедиата синтеза статинов [159, 299], нестероидного противовоспалительного препарата S-(+)-ибупрофена [340] и S-напроксена [192], (S)-3-(тиофен-2-илтио)бутановой кислоты – интермедиата синтеза противоглаукомного препарата [133].

Благодаря своим уникальным свойствам нитрилгидролизующие микроорганизмы и ферменты метаболизма нитрилов нашли промышленное применение. Примером успешного внедрения в производство является получение акриламида из акрилонитрила, осуществляемое биотехнологическим путем в Японии, России, Китае и Южной Корее. Наиболее эффективными биокатализаторами на данный момент являются Rhodococcus rhodochrous J1, разработанный в университете Киото и внедренный компанией Nitto Chemical Ltd.

(Япония), и R. rhodochrous М33, селекционированный в ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва) и внедренный на ряде предприятий России [14]. Производство акриламида только компанией Nitto превышает 20000 тонн/год, синтез никотинамида (Lonza, Китай) – более 3000 тонн/год [234]. Также, по данным 2001 г, компания BASF (Германия) осуществляла гидролиз рацемического нитрила миндальной кислоты до Rминдальной кислоты с помощью фермента нитрилазы, выпуск продукта составлял несколько тонн в год; компания DSM (Дания) осуществляла трансформацию рацемических амидов аминокислот с помощью амидазы до непротеиногенных L-аминокислот, выпуск составлял от нескольких тонн до нескольких десятков тонн в год [234].

Иммобилизация нитрилконвертирующих бактерий и ферментов гидролиза нитрилов находится на стадии лабораторных разработок и представляет собой либо включение клеток в структуру ионотропных, термотропных и ковалентносвязанных гелей [83, 166, 181, 182, 229, 303, 328, 391], либо, в случае использования изолированной нитрилазы, активно разрабатывается метод получения поперечносшитых агрегатов ферментов [175, 242, 377]. Известно, что в процессе промышленного производства акриламида из акрилонитрила биокатализатор вносят в реактор в виде частиц ПАА, содержащих несколько клеток R. rhodochrous М33 (ЗАО «Биоамид», г. Саратов) [14], но, в то же время, синтез концентрированного раствора акриламида представляет собой периодический процесс.

Цель настоящего исследования – выявление закономерностей процессов биокаталитической трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, протекающих в гетерогенной среде с участием адгезированных бактериальных клеток и биопленок нитрилгидролизующих бактерий, а также иммобилизованных ферментов метаболизма нитрилов, для создания эффективного биокатализатора.

Основные задачи исследования:

1. Получение гетерогенного биокатализатора на основе адгезированных клеток нитрилгидролизующих бактерий, изучение процесса адгезии клеток на носителях и взаимодействия с многослойными углеродными нанотрубками, а также гидролиза алифатических и ароматических нитрилов и амидов карбоновых кислот этими биокатализаторами.

2. Трансформация нитрилов и амидов самоиммобилизованными в биопленку нитрилгидролизующими бактериями, выявление особенностей функционирования гетерогенного биокатализатора на основе биопленок, оценка его устойчивости к токсичным субстратам и продуктам ферментативного катализа.

3. Изучение энергетического статуса клеток нитрилгидролизующих бактерий на этапе инициации образования биопленки – стадии необратимой адгезии.

4. Изучение каталитических свойств иммобилизованных ферментных препаратов нитрилгидратазы, нитрилазы и амидазы, определение кинетических параметров трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, катализируемой свободными и иммобилизованными ферментами.

5. Осуществление стереоселективного гидролиза нитрилов и амидов карбоновых кислот гетерогенным биокатализатором на основе адгезированных клеток бактерий и выделенных иммобилизованных ферментов. Изучение зависимости стереоселективности процесса от способа иммобилизации, типа биокатализатора и используемых носителей.

Научная новизна Разработаны научные основы создания гетерогенного биокатализатора трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, позволяющие на основании ряда характеристик, присущих биологической составляющей процесса, носителю и трансформируемым субстратам предсказать его эффективность.

Разработан алгоритм изучения свойств гетерогенного биокатализатора.

Обоснован выбор иммобилизованного биокатализатора (адгезированные клетки или иммобилизованные изолированные ферменты) в зависимости от получения целевых продуктов и особенностей биокаталитического процесса, показано, что выделение и иммобилизация фермента предпочтительны для стереоселективной трансформации субстратов.

Показана первостепенность гидрофобных взаимодействий, предшествующих адгезии клеток на углеродных носителях, выявлена прямая зависимость между гидрофобностью поверхности клеток различных штаммов нитрилгидролизующих бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus и массой адгезированных клеток на гидрофобных углеродных материалах (от r=0,884 до r=0,950, p=0,05). Показана эффективность использования активированных углеродных адсорбентов для получения биокатализатора гидролиза алифатических нитрилов на основе адгезированных бактериальных клеток и, наоборот, предпочтительность использования неактивированных носителей в гетерогенном процессе трансформации ароматических нитрилов. Изучены особенности взаимодействия клеток бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus с многослойными углеродными нанотрубками. Впервые показана возможность создания гетерогенных биокатализаторов на основе агрегированных с многослойными углеродными нанотрубками бактериальных клеток, и обоснованы преимущества таких биокатализаторов, заключающиеся, в частности, в легкости их отделения от реакционной среды и высокой клеточной нагрузке.

Проведено сравнение кинетических параметров реакции трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, катализируемых ферментными препаратами нитрилгидратазы, нитрилазы и амидазы, иммобилизованными различными способами (адсорбцией, ковалентной сшивкой с носителем, образованием поперечно-сшитых ферментных агрегатов), а также каталитических свойств этих гетерогенных биокатализаторов. Изучено влияние способа иммобилизации на стереоселективность реакции гидролиза рацемических нитрилов и амидов, а также воздействие различных видов носителей на выход стереоизомеров в процессе гетерогенного биокатализа. Показана предпочтительность создания гетерогенного биокатализатора для стереоселективной трансформации на основе поперечно-сшитых агрегатов ферментов.

Разработана методика получения иммобилизованных ферментов гидролиза нитрилов путем ковалентной сшивки белков с гранулами хитозана, активированного 0,1% бензохиноном, и образованием поперечно-сшитых агрегатов фермента при высаливании белка из раствора сульфатом аммония с одновременным воздействием 0,1% раствора глутарового альдегида или бензохинона.

Впервые показана возможность создания гетерогенного биокатализатора гидролиза нитрилов на основе биопленок нитрилтрансформирующих бактерий родов полученных в процессе Rhodococcus, Pseudomonas, Alcaligenes, культивирования с носителями, его повышенная устойчивость к токсичным субстратам и продуктам ферментативной реакции по сравнению с суспендированными клетками. Показана эффективность культивирования бактерий в присутствии носителя как способа создания гетерогенного биокатализатора, объединяющего наращивание биомассы микроорганизмов и иммобилизацию в один этап. Определена продуктивность биопленок нитрилгидролизующих бактерий при трансформации алифатических и ароматических нитрилов и амидов.

Впервые изучены особенности энергетического статуса клеток бактерий родов Rhodococcus и Pseudomonas при необратимой адгезии на нерастворимом носителе, выражающиеся в значительном снижении концентрации АТФ в клетке при адгезии и в первые часы после переноса адгезированных клеток в свежую питательную среду. Показано, что степень снижения внутриклеточного пула АТФ зависит от свойств носителя, на котором адгезируются клетки.

Показана обратная концентрационная зависимость активности гетерогенного биокатализатора, которая наблюдается при невысоких скоростях ферментативной реакции (единицы мкмоль продукта, образуемые 1 мг биокатализатора в минуту) даже при избытке субстрата. Определено, что подобная зависимость не наблюдается при высоких скоростях ферментативной реакции (сотни мкмоль продукта, образуемые 1 мг биокатализатора в минуту).

Теоретическая значимость работы Результаты исследований позволили сформулировать концепцию о значимости адгезированной формы существования бактерий для биокаталитических трансформаций. Замена свободносуспендированного состояния бактериальных клеток на адгезированное позволяет получить преимущество в биокаталитическом синтезе амидов и карбоновых кислот из соответствующих нитрилов, выражающееся в повышении ферментативной активности и стабильности в процессе многократных биотрансформаций.

Полученные экспериментальные данные расширяют представления о гетерогенном биокатализе нитрилов и амидов карбоновых кислот, осуществляемом как клетками микроорганизмов, так и выделенными ферментами. Экспериментальная адгезия микроорганизмов на нерастворимом носителе рассматривается как модель инициации образования биопленки в природе, связанной с прикреплением клеток к биотической или абиотической поверхности. Изучение самоиммобилизованных в процессе культивирования с носителями нитрилгидролизующих бактерий позволяет получить новые знания о существовании этих микроорганизмов в естественном, биопленочном состоянии.

Принимая во внимание, что внутриклеточные ферменты функционируют не в разбавленном растворе, а в сложной гетерогенной среде, изучение каталитических свойств иммобилизованных ферментов и кинетических параметров катализируемых ими реакций дает новые знания о влиянии факторов окружающей среды на фермент, находящийся в прикрепленном состоянии.

Полученные результаты, касающиеся энергетического статуса адгезированных бактерий, раскрывают особенности физиологического состояния клеток на этапе инициации образования биопленки – стадии необратимой адгезии, и позволяют провести параллель между этой стадией и лаг-фазой при периодическом культивировании бактерий в жидкой среде.

Полученные новые данные о влиянии гетерогенной среды на стереоселективность трансформаций, катализируемых иммобилизованными клетками и ферментами, расширяют представление о стереохимии ферментативных реакций и показывают возможность управления процессом получения стереоизомеров при варьировании используемого носителя для иммобилизации биокатализаторов.

Разграничение терминов «адгезированные клетки микроорганизмов» и «биопленки микроорганизмов» в рамках более широкого понятия «иммобилизованные клетки» позволяет внести ясность в понимание гетерогенных биокаталитических процессов.

Практическая значимость работы Практическая значимость работы заключается в создании активных и стабильных гетерогенных биокатализаторов процесса трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот для получения химических веществ, значимых в народном хозяйстве, и предшественников фармпрепаратов (акриламид, акриловая кислота, никотинамид, никотиновая, изоникотиновая и пиколиновая кислоты, фенилглицин и др.).

Разработанный алгоритм изучения гетерогенного биокатализатора на примере процесса гетерогенного биокатализа нитрилов и амидов карбоновых кислот позволяет перейти от эмпирического подбора носителей для иммобилизации клеток и ферментов к менее трудозатратному способу оценки эффективности процесса, основанному на прогнозировании свойств гетерогенного биокатализатора по ряду признаков, присущих носителю, биологическому объекту и ферментативной реакции.

Методология и методы исследования Диссертационная работа выполнена с применением классических и современных микробиологических (культивирование бактерий, поддержание бактериальных культур, определение ростовых характеристик, подсчет жизнеспособных клеток), биохимических (ферментативные трансформации органических веществ, получение препаратов ферментов, определение константы Михаэлиса-Ментен, максимальной скорости ферментативной реакции, константы термоинактивации, температурной и рН зависимости активности ферментов, энантиомерного избытка стереоизомеров), аналитических (методы спектрофотометрии, ВЭЖХ и ГХ) и микроскопических (фазово-контрастная и флюоресцентная световая микроскопия, сканирующая электронная микроскопия) методов. Иммобилизация клеток и ферментов выполнена модифицированными методами, известными из научной литературы, а также авторскими запатентованными методами (патент РФ № 2352635; патент РФ № 2500814).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Гидрофобные взаимодействия являются определяющими при адгезии на углеродсодержащих материалах клеток бактерий родов Pseudomonas, с различной степенью Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus гидрофобности поверхности. Выбор носителя для иммобилизации бактериальных клеток обусловлен особенностями биокаталитического процесса и химической природы трансформируемых веществ.

2. Биопленки нитрилгидролизующих бактерий, полученные в процессе культивирования в присутствии носителей, могут служить гетерогенным биокатализатором трансформации алифатических и ароматических нитрилов и амидов карбоновых кислот. Устойчивость клеток биопленки к токсичному действию субстратов и продуктов реакции трансформации нитрилов повышается по сравнению с суспендированным состоянием.

3. Адгезия бактерий приводит к снижению содержания АТФ в клетках, которое продолжается в первые часы после переноса в свежую питательную среду; уровень снижения концентрации внутриклеточного АТФ зависит от свойств носителя, на котором адгезируются клетки. Изменение энергетического статуса клетки не влияет на активность нитрилгидролизующих ферментов.

4. На каталитические свойства иммобилизованного ферментного препарата, содержащего ферменты метаболизма нитрилов, влияют методы иммобилизации (адсорбция или ковалентная сшивка) и свойства носителей.

Адсорбция на неорганических носителях дает преимущества в термостабильности фермента, ковалентная сшивка с органическими носителями – возрастание операционной стабильности и изменения рН профиля активности.

5. На стереоселективность гетерогенного гидролиза рацемических амидов и нитрилов влияет присутствие нерастворимого носителя в реакционной среде; наибольшую стереоселективность проявляют поперечно-сшитые ферментные агрегаты амидазы.

Степень достоверности и апробация результатов Достоверность результатов исследования подтверждается объемом данных, полученных в ходе экспериментальных работ, выполненных с применением современных микробиологических, биохимических и аналитических методов.

Получение гетерогенных биокатализаторов на основе клеток бактерий, адгезированных на носителях или выращенных в виде биопленок, подтверждено методами электронной и световой микроскопии; образующиеся в ходе биохимических трансформаций органические вещества проанализированы методами ВЭЖХ и ГХ. Полученные результаты обработаны с помощью лицензионных программ и методов статистического анализа.

Основные положения диссертационной работы доложены на 7-й и 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2003, 2004; Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов», Москва, 2004; Третьем Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005; 2-й и 3-й Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», Пермь – Казань – Пермь, 2005, Пермь – Нижний Новгород – Пермь, 2008; Международной научной конференции «Микробные биотехнологии», Одесса, 2006; Международной научной конференции молодых ученых “Modern problems of microbiology and biotechnology”, Odesa, 2007; VI и VII Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2008, 2010; 4th and 5th Congress of European Microbiologists (FEMS), Geneva, Switzerland, 2011, Leipzig, Germany, 2013; International Conference “Biofilms 5”, Paris, France, 2012, “Biofilms 6”, Vienna, Austria, 2014.

По теме диссертации опубликовано 86 научных работ, в том числе 2 обзора и 17 экспериментальных статей в журналах, входящих в перечень, рекомендованный ВАК Минобрнауки РФ, 13 из которых входят в международные базы цитирования Web of Science/Scopus; получено 2 патента РФ.

Связь работы с научными программами Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер государственной регистрации 0120.0406511).

Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ № 04-04-97514-р_офи «Фундаментально-прикладные исследования для биотехнологического процесса получения 10–15% гидрогеля полиакриламида высокой чистоты на основе штамма микроорганизмов Rhodococcus ruber», 2004–2006 гг.; программы интеграционных исследований Уральского и Сибирского отделений РАН, 2004– 2006 гг.; Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», 2009–2014 гг; аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы, 2009–2010 гг; молодежного гранта по УрО РАН №35, 2004 г.; гранта РФФИ № 07-04-97617-р_офи «Фундаментальноприкладные исследования для создания безотходного биокаталитического процесса получения акриловых мономеров», 2007–2008 гг; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг., государственный контракт 02.740.11.0078; гранта РФФИ №13-04-96050-р_урал_а «Исследование стереоселективной биотрансформации амидов и сложных эфиров почвенными бактериями с применением энзимологических, метагеномных и геномных методов», 2013–2015 гг.

Личный вклад автора и благодарности Автору принадлежит выбор проблемы, постановка целей и задач проведенных исследований, планирование экспериментов, выполнение 80% экспериментальной работы или непосредственное руководство экспериментами, анализ, обобщение и интерпретация результатов, подготовка научных публикаций и патентов.

Экспериментальные работы по трансформации ароматических нитрилов гетерогенным биокатализатором выполнены совместно с аспирантом ПГНИУ Д.М. Васильевым, по иммобилизации и изучению каталитических и стереоселективных свойств изолированной амидазы – с аспирантом ИЭГМ УрО РАН А.Н. Горбуновой.

Автор выражает благодарность профессору кафедры материалов, технологий и конструирования машин Пермского национального исследовательского политехнического университета, д.т.н. В.Ф. Олонцеву за предоставленные образцы активных углей; ведущему научному сотруднику Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН д.х.н. Г.А. Коваленко за предоставленные образцы углеродсодержащих носителей и помощь в обсуждении ряда полученных результатов; начальнику лаборатории ОАО «Уральского НИИ композиционных материалов» С.М. Никулину за предоставленные образцы многослойных углеродных нанотрубок; д.г.-м.н., заслуженному деятелю науки РФ, профессору кафедры минералогии и петрографии Пермского государственного национального исследовательского университета Б.М. Осовецкому и сотруднику демонстрационно-методического центра TESCAN (г. Санкт-Петербург) к.ф.-м.н. М.В. Лукашовой за помощь в электронномикроскопическом анализе образцов; ведущему инженеру лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН Г.В. Овечкиной за помощь в ВЭЖХ-анализе образцов. Профилометрия адсорбентов была выполнена в лаборатории физики основ прочности в Институте механики сплошных сред УрО РАН (г. Пермь).

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту, чл.-корр. РАН, профессору, д.м.н. В.А. Демакову за многолетнюю помощь и поддержку.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ ТРАНСФОРМАЦИИ

НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

–  –  –

В биотехнологии в середине XX века также возрос интерес к использованию прикрепленных (иммобилизованных) клеток микроорганизмов. В производственном процессе иммобилизация клеток микроорганизмов была впервые применена более 150 лет назад. Однако бурное развитие методов иммобилизации живых клеток началось с 70-х гг ХХ века, что связано с потребностями фундаментальных исследований в области биохимии, молекулярной биологии, физиологии микроорганизмов, а также с разработкой современных биотехнологических производств. В России в начале 70-х годов Г.К. Скрябин и К.А. Кощеенко совместно с другими сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР провели первые эксперименты по иммобилизации интактных клеток микроорганизмов. В 1975 г.

на Советско-американской конференции Г.К. Скрябин обосновал теоретические аспекты иммобилизации живых клеток микроорганизмов и возможности их практического использования, в том числе как биокатализаторов пролонгированного действия в синтезе стероидных гормонов [8]. В начале 70-х годов группа исследователей из Японии под руководством I. Chibata сообщила об успешном проведении биосинтеза L-аспартата иммобилизованными клетками, содержащими аспартазу [157], после чего значительное количество исследовательских групп начали разработку процессов трансформации органических веществ иммобилизованными клетками микроорганизмов.

Различные направления биотехнологии связаны с использованием иммобилизованных и самоиммобилизованных клеток микроорганизмов – это, прежде всего, биологическая очистка сточных вод и загрязненных почв, биодеградация, биосинтез, ферментация и биокатализ. Биокатализ и биотрансформация являются процессами химического превращения одного или более веществ, протекающими под действием биологических катализаторов – ферментов или клеток с определенной ферментативной активностью.

Гетерогенный биокатализ – это специфический, высокоэффективный процесс трансформации органических веществ, протекающий на поверхности раздела фаз.

Катализатором этого процесса является биологическая составляющая (фермент, комплекс ферментов, органеллы, клетки), иммобилизованная на нерастворимом носителе. По определению Я. Халгаша, иммобилизация биокатализаторов – это фиксирование ферментов или клеток в некоторой фазе, чаще всего нерастворимой, отделенной от другой фазы (раствора), в которой находятся молекулы субстрата и (или) продукта, причем возможен межфазный перенос этих молекул [77]. На первой конференции по инженерной энзимологии (Henniker, NH, США, 1971) было определено, что иммобилизованные биокатализаторы – это ферменты или клетки, физически зафиксированные в определенной области, для того чтобы катализировать специфические реакции без потери каталитической активности и с возможностью повторного использования [201].

Известны различные способы иммобилизации биокатализаторов (Рисунок 1), подразделяющиеся на адсорбцию и ковалентное связывание (иммобилизация на поверхности материала носителя); включение в гели и инкапсуляцию (иммобилизация в структуру материала носителя). Отдельно можно выделить мембранные технологии и иммобилизацию без носителя (поперечная сшивка с образованием ковалентных связей) [31].

Рисунок 1 – Методы иммобилизации биокатализаторов

Адсорбция – это увеличение концентрации вещества на поверхности раздела фаз по сравнению с его концентрацией в объеме фазы [26].

Иммобилизация путем адсорбции – наиболее мягкий и предпочтительный способ фиксации биокатализатора по сравнению с включением в органические полимеры [67]. Отмечается, что сорбционный метод иммобилизации микроорганизмов на различных носителях позволяет значительно повысить эффективность биокатализа и биодеградации [4].

Адгезия – (от лат. adhaesio-притяжение, сцепление), явление соединения приведенных в контакт поверхностей конденсированных фаз [78]. Установлено, что приблизившись к поверхности, бактерии взаимодействуют с ней сначала с помощью гидрофобных взаимодействий, которые не могут обеспечить большой специфичности взаимодействия. Затем наступает более прочное прикрепление, которое осуществляется через несколько часов или даже суток после начала адгезии и достигается благодаря синтезу бактериями биополимеров, обычно полисахаридов, но иногда и полипептидов, с помощью которых клетки прочно прикрепляются к поверхности [20]. Y.H. An и R.J. Friedman в книге «Handbook of Bacterial Adhesion: Principles, Methods, and Applications» предлагают терминами «адгезия», «связывание» и «прикрепление» описывать эксперименты, касающиеся ранних стадий биопленкообразования, от обратимого связывания до необратимого прикрепления. Такие эксперименты охватывают временные периоды от минут до 1–2 ч. Когда эксперименты более длительны, 6–24 ч, наблюдения могут касаться как начальной адгезии, так и последующего размножения микроорганизмов на поверхности. В этом случае предпочтительнее использовать термины «колонизация», «образование микроколоний», «образование биопленки» или «формирование микробных матов» [96].

В экспериментальной части диссертационной работы будет рассмотрено приготовление и свойства гетерогенных биокатализаторов на основе адсорбированных и ковалентно присоединенных к носителю ферментов, а также адгезированных бактериальных клеток, взятых из культуры, находящейся в стационарной фазе роста, и биопленок, выращенных на носителях.

Для иммобилизации клеток микроорганизмов могут быть использованы адсорбенты органической (хитин, древесина, целлюлоза и т.д.) либо неорганической (глины, песок, кремнеземы, угли и т.д.) природы, искусственные неорганические носители (углеродные материалы, металлические сплавы, керамика и т.д.) и синтетические полимеры (полиэтилен, нейлон, полиуретаны и т.д.) [24].

Из вышеперечисленных носителей основное внимание в экспериментальной части работы будет уделено углеродсодержащим материалам. Углерод – основа органических веществ, он может быть рассмотрен как элемент, наиболее совместимый с живыми организмами. Поэтому логично ожидать, что носители, приготовленные на его основе, будут обладать свойствами, необходимыми для адгезии и дальнейшего роста микроорганизмов.

Пористые углеродные материалы, в частности активные угли, являются одними из наиболее перспективных носителей [65]. Атомы углерода на поверхности кристаллов находятся в ином электронном и энергетическом состоянии, чем атомы объемной фазы, особенно в местах дефектов кристаллической решетки. Наличие у таких атомов свободных валентностей облегчает их химическое и сорбционное взаимодействие с различными веществами [50]. Угольные материалы обладают высокой химической и биологической стойкостью, механической прочностью, достаточной проницаемостью, большой удельной поверхностью (1000 м2/г и более), возможностью получения удобных в технологическом отношении форм (гранул, тканей, волокон). Иммобилизацию биопрепаратов на угольных материалах проводят либо адсорбцией, либо химическим связыванием с использованием бифункциональных реагентов [13].

Г.А. Коваленко с соавт. были разработаны неорганические углеродсодержащие носители для создания высокостабильных гетерогенных биокатализаторов. Макроструктурированные керамические носители, покрытые слоем каталитического волокнистого углерода и графитоподобным углеродом, успешно применялись для иммобилизации как растущих, так и нерастущих бактериальных и дрожжевых клеток. Авторы отметили, что носители со слоем каталитического волокнистого углерода обеспечивают прочное связывание микробных клеток, а также полное сохранение ферментативной активности микроорганизмов и максимальную стабилизацию полученных биокатализаторов [74, 75, 76, 151].

Преимущества гетерогенного биокатализа заключаются в следующем [24]:

1. Упрощаются операции разделения биокатализатора и сред, содержащих целевые продукты, что позволяет перейти от периодических схем к более производительным непрерывным технологиям;

2. Появляется возможность более длительной эксплуатации клеток в отличие от однократного использования свободных культур;

3. Повышается устойчивость клеток к действию неблагоприятных инактивирующих внешних факторов (температуры, кислотности, концентрации электролитов, токсичных веществ), иногда становится возможной дополнительная защита культуры от загрязнения в случае нарушения стерильности;

4. Появляется возможность повышения продуктивности процессов в результате увеличения концентрации биомассы в единице рабочего объема реактора;

5. В некоторых случаях возможно повышение ферментативной активности биокатализатора;

6. Снижается количество отходов в виде отработанной биомассы.

Таким образом, гетерогенный биокатализ органических соединений не только позволяет улучшить технологическую схему процесса, но и возвращает клетки микроорганизмов в их естественное (прикрепленное) состояние, что также может давать определенные преимущества перед свободными суспендированными клетками.

1.1. Метаболизм нитрилов у микроорганизмов

Ферментативная активность, связанная с метаболизмом нитрилов, известна у нескольких семейств растений, грибов (Fusarium, Aspergillus, Penicillium), а также распространена у бактерий. Бактерии, обладающие ферментами гидролиза нитрилов, встречаются среди родов Acidovorax, Acinetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Comamonas, Gordona, Corynebacterium, Klebsiella, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus и др. [121, 126, 188]. Представители родококков, утилизирующие нитрилы в качестве единственного источника углерода и энергии, обладают наиболее активными ферментами, конвертирующими нитрилсодержащие соединения, и выделяются из почвенной среды чаще других бактерий [146, 155, 404]. Уникальные свойства родококков, а именно сочетание высокого биодеградативного потенциала с непатогенностью подавляющего большинства представителей этого рода, обусловливают повышенный интерес исследователей-микробиологов и биотехнологов к этим бактериям [5, 21, 41, 129].

Известно несколько возможных путей биоконверсии нитрилов. Наиболее перспективным в прикладном отношении является их гидролиз. Согласно литературным данным, существует два пути микробной деструкции нитрилов [125]:

1. Нитрилы метаболизируются непосредственно в соответствующие кислоты и аммиак при помощи фермента нитрилазы (КФ 3.5.5.1):

RCN+2H2O RCOOH +NH3

2. Нитрилы подвергаются двуступенчатой деградации сначала до амида при участии фермента нитрилгидратазы (КФ 4.2.1.1.84);

RCN+H2O RCONH2 затем амид превращается в соответствующую кислоту и аммиак, в этом процессе участвует фермент амидаза (КФ 3.5.1.4):

RCONH2+H2O RCOOH+NH3 Структура и функции нитрилгидратазы Нитрилгидратаза – ключевой фермент в процессе ассимиляции нитрилов микроорганизмами. Основной особенностью этих ферментов является присутствие металла в активном центре, что лежит в основе их подразделения на 2 типа: железо- и кобальтсодержащие нитрилгидратазы [314, 331].

Железосодержащая нитрилгидратаза состоит из и субъединиц, которые формируют тесно связанный гетеродимер [206, 277]. И активный центр, и четвертичная структура стабилизируются молекулами воды внутри и снаружи фермента. 76 молекул воды между и субъедицами нитрилгидратазы способствуют образованию гетеродимера, формируя множественные водородные связи, и снижают поверхностный заряд субъедицы. Двадцать молекул воды формируют водородные связи, стабилизирующие уникальную структуру активного центра.

Кобальтсодержащие нитрилгидратазы принадлежат к группе Со-зависимых ферментов, которые содержат некорриноидный кобальт в своей структуре [277].

Промышленно значимый микроорганизм Rhodococcus rhodochrous J1 содержит высокомолекулярную (H-NHase) и низкомолекулярную (L-NHase) нитрилгидратазу. Эти ферменты состоят из двух субъединиц (, ). Для экспрессии генов, кодирующих эти нитрилгидратазы, требуются ионы кобальта и амиды. Для экспрессии генов, кодирующих H-NHase, требуется мочевина, LNHase – циклогексанокарбоксамид. Когда штамм R. rhodochrous J1 был культивирован в среде, содержащей в качестве индуктора мочевину, наблюдалась сверхпродукция H-NHase. Ее количество в этом случае составляло более 50% от всего растворимого белка [247].

Субъединицы всех известных нитрилгидратаз содержат высоко гомологичные аминокислотные последовательности. Цистеиновый кластер, который координирует железо или кобальт субъединицы и два остатка аргинина субъединицы полностью консервативны. Нитрилгидратазы Fe-типа в отличие от Со-типа проявляют фотореактивность и связывают молекулы NO.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |

Похожие работы:

«КОЛОТВИН АНДРЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ Прогностическая значимость генетического полиморфизма патогена и хозяина для оценки эффективности терапии и развития фиброза печени при хроническом гепатите С Молекулярная биология –...»

«КОВАЛЕВА АННА ВАЛЕРЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ ФИТОСИРОПОВ И ФИТОЭКСТРАКТОВ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ Специальность 05.18.01 – Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор...»

«Дорошенко Васса Борисовна ХОЗЯЙСТВЕННО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И КАЧЕСТВЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ МЯСА БЫЧКОВ КАЗАХСКОЙ БЕЛОГОЛОВОЙ ПОРОДЫ РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ 06.02.10 – частная зоотехния, технология...»

«Гуляева Анна Федоровна ТРАВЯНЫЕ МЕЛКОЛИСТВЕННЫЕ ЛЕСА КУЗНЕЦКОЙ КОТЛОВИНЫ: СИНТАКСОНОМИЯ, ЭКОЛОГИЯ, ГЕОГРАФИЯ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., ст.н.с. Н.Н. Лащинский Новосибирск 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОСТИ...»

«Кузнецов Василий Андреевич ПОЧВЫ И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПАРКОВО-РЕКРЕАЦИОННЫХ ЛАНДШАФТОВ МОСКВЫ Специальность 03.02.13-почвоведение ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, И.М. Рыжова Москва-2015 Содержание Введение Глава 1. Влияние рекреации на лесные экосистемы (Литературный обзор) 1.1.Состояние проблемы 1.2....»

«ОВСЯННИКОВ Алексей Юрьевич СЕЗОННАЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ХВОИ PICEA PUNGENS ENGL. И P. OBOVATA LEDEB. НА ТЕРРИТОРИИ БОТАНИЧЕСКОГО САДА УРО РАН (Г. ЕКАТЕРИНБУРГ) 03.02.08 «Экология (в биологии)» диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Миронов Андрей Викторович КОРРЕКЦИЯ АККОМОДАЦИОННЫХ НАРУШЕНИЙ У ПАЦИЕНТОВ ЗРИТЕЛЬНО-НАПРЯЖЕННОГО ТРУДА МЕТОДАМИ ФИЗИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ 14.01.07 – глазные болезни 14.03.11 восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура, курортология и физиотерапия Диссертация на...»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«ГЕНС ГЕЛЕНА ПЕТРОВНА Роль молекулярно-биологических маркеров и многофункционального белка YB-1 в лечении и прогнозе больных раком молочной железы 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант:...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«ХОАНГ ЗИЕУ ЛИНЬ ЭКОЛОГИЗАЦИЯ ЗАЩИТЫ КАПУСТНЫХ КУЛЬТУР ОТ ОСНОВНЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ ВРЕДИТЕЛЕЙ В УСЛОВИЯХ МОСКОВСКОГО РЕГИОНА Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попова Татьяна Алексеевна, кандидат биологических наук, доцент...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«ШАРАВИН Дмитрий Юрьевич IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А.И. Саралов Пермь – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СТР. ВВЕДЕНИЕ.. 4...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент И.В. КИСЕЛЕВА Санкт-Петербург – ОГЛАВЛЕНИЕ Раздел 1....»

«ТОМОШЕВИЧ Мария Анатольевна ФОРМИРОВАНИЕ ПАТОКОМПЛЕКСОВ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» 03.02.08 – «Экология» Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: д.б.н., академик РАН Коропачинский И.Ю. Новосибирск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ: ВВЕДЕНИЕ.. 4 ГЛАВА 1. АНАЛИЗ...»

«ЕРОШЕНКО Дарья Владимировна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ПЕРВЫЕ ЭТАПЫ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат медицинских наук, доцент Коробов В. П. Пермь – 2015 СТР. СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.