WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«ГИДРОЛИЗ РАЦЕМИЧЕСКИХ АМИДОВ ФЕРМЕНТАМИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Химический способ получения D-фенилглицина начинается с синтеза рацемического фенилглицина в реакции Штрекера из бензальдегида, циановодорода и аммония. Далее получают диастереомерную соль рацемата и разделяют ее методом кристаллизации. В качестве разделяющего агента используется камфорсульфоновая кислота (рисунок 6, А) (Sheldon, 1993).

Однако, получение энантиомерно чистого D- или L-фенилглицина методом разделения рацематов – экономически невыгодный, трудоемкий и длительный процесс. Успех химического разделения зависит от вида и количества применяемого растворителя, температуры кристаллизации и легкости отщепления вспомогательного вещества от диастереомерной соли.

Только в исключительных случаях выделение оптически чистого энантиомера удается без последующей перекристаллизации. Кроме того, данный метод требует применения камфорсульфоновой кислоты дорогостоящего агента расщепления (May et al., 2002).

D-фенилглицин может быть также получен в результате ферментативного разделения рацемической смеси. D-специфическая гидантоиназа катализирует гидролиз рацемического фенилгидантоина до DN-карбамоилфенилглицина. Последний в присутствии азотистой кислоты превращается в D-фенилглицин (рисунок 6, Б) (Gokhale et al., 1996).

Рисунок 6 – Способы получения D-фенилглицина: А – метод химического синтеза, Б – ферментативное разделение с использованием D-специфической гидантоиназы (Sheldon, 1993).

Хемо-энзиматический синтез D-фенилглицина с использованием гидантоиназы не нашел большого распространения по ряду причин: выход процесса составляет всего 50%, образующийся D-N-карбамоилфенилглицин необходимо трансформировать в D-фенилглицин, что требует наличия сильнокислой среды.

Разработан еще один способ получения энантиомеров фенилглицина.

Энзиматический гидролиз D,L-фенилглицинонитрила, катализируемый нитрилгидратазно-амидазной системой, ведет к получению как D-, так и Lизомера фенилглицина в зависимости от стереоспецифичности используемой амидазы:

Рисунок 7 – Гидролиз D,L-фенилглицинонитрила (D,L-ФГН) через D,Lфенилглицинамид (D,L-ФГА) нитрилгидратазой и амидазой (Wegman et al., 2001; Wang et al., 2001).

Такой гидролиз способны осуществлять виды Rhodococcus, которые обладают неселективной нитрилгидратазой и L- или D-специфичной амидазой. Штаммы MAWA, MAWB, MAWE, MAWC и MAWD синтезировали нитрилгидратазу, которая конвертировала нитрил до амида, и L-специфичную амидазу, которая гидролизовала накапливающийся амид до L-кислоты (Wegman et al., 2001). В результате оптимизации условий роста полученных культур, был отобран штамм R. globerulus MAWA, который в течение 5 минут катализировал гидролиз D,L-фенилглицинонитрила с образованием 48% D-фенилглицинамида (ее – 99%) и последующий 4часовой гидролиз амида с образованием 52% L-фенилглицина (ее – 97%) (Wegman et al., 2001).

Штамм Rhodococcus sp. AJ270, обладающий нитрилгидратазной и амидазной активностью, способен гидролизовать широкий ряд рацемических

-замещенных фенилацетонитрилов и 2-арилциклопропанкарбонитрилов с высокой энантиоселективностью (Meth-Cohn et al., 1997; Wang et al., 2000).

Данный штамм был использован для энантиоселективной биотрансформации D,L-фенилглицинонитрила. После реакции в течение 2,5 часов был получен D-фенилглицинамид (ее=74%) и L-фенилглицин (ее=93%) (Wang et al., 2001).

Выделен и идентифицирован штамм Pantoea endophytica, который синтезировал S-фенилглицин (ее99%) в результате гидролиза Sфенилглицинамида. Синтез R-фенилглицина (ее99%) был достигнут при использовании другого штамма Pantoea sp., обладающим R-селективной амидазой. Nocardioides sp. гидролизовал рацемический фенилглицинонитрил до S-фенилглицинамида (ее=52%) без последующего гидролиза в кислоту изза отсутствия амидазной активности (Hensel et al., 2002). Aspergillus fumigatus с помощью нитрилазы катализирует гидролиз D,L-фенилглицинонитрила до L-фенилглицина с энантиомерным избытком 80% (Choi et al., 1986; Lee et al., 1988).

Клетки Pseudomonas aeruginosa 10145 использовали в качестве биокатализатора в трансформации 2-фенил-2-аминоацетонитрила до Dфенилглицина. После реакции в течение 1 часа было получено 18% Dфенилглицина с энантиомерным избытком 95% (Alonso et al., 2008). Чтобы повысить биокаталитический потенциал, клетки Ps. aeruginosa 10145 были включены в 1,5%-ный альгинат кальция. 20%-ная конверсия 2-фенил-2аминоацетонитрила до D-фенилглицина была достигнута в результате 3часовой реакции (ее98%). Иммобилизованный фермент использовали в 4-х циклах, в ходе которых сохранялась биокаталитическая активность (Alonso et al., 2007).

Таким образом, энантиоселективная биотрансформация D,Lфенилглицинонитрила с использованием нитрилгидролизующих ферментов является перспективным методом получения изомеров фенилглицина.

1.5. Биотрансформация фенилаланинамида Фенилаланин – ароматическая аминокислота, которая существует в двух оптически изомерных формах L и D. Потребность в этой аминокислоте очень велика. Фенилаланин используется для сбалансирования кормов животных, как компонент спортивного питания. Значительная часть фенилаланина идёт на производство дипептида аспартама — синтетического сахарозаменителя, активно использующегося в пищевой промышленности (Kamphuis et al., 1990).

До недавнего времени единственным методом лечения болезни Паркинсона было хирургическое вмешательство в область головного мозга.

Сейчас найдено эффективное лекарство — 3,4-диоксифенилаланин (ДОФА) и его производные. L-метил-3,4-дигидроксифенилаланин используют в качестве исходного вещества для синтеза Эналаприла – лекарственного препарата против гипертензии. D-фенилаланин является основой противодиабетического лекарственного средства (James, 2003).

Получение фенилаланина возможно методами прямого микробиологического синтеза (Khamduang et al., 2009), либо методами биотрансформации с использованием предшественников, в качестве которых рассматриваются коричная кислота (Yamada et al., 1981), фенилпируват (Miller 1987). Использование для синтеза фенилаланина et al., предшественников считается наиболее перспективным в силу более высоких достигаемых концентраций целевого продукта и большей скорости реакции.

Энантиомеры фенилаланина также получают ферментативным расщеплением рацемических предшественников аминокислоты:

производных гидантоина (Zhou et al., 2011), эфиров и амидов фенилаланина (Komeda et al., 2006; Komeda et al., 2003), ацетилпроизводных (Hermes et al., 1993). С открытием D-стереоспецифических ферментов появилась возможность получения не только L-, но и D-энантиомеров аминокислот, которые ранее получали исключительно химическим синтезом. В связи с этим, энзиматические методы приобрели большую популярность (Leuchtenberger et al., 2005).

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования Объектом исследования явились штаммы, выделенные из образцов антропогенно-загрязненной почвы, а также штаммы лабораторной коллекции, обладающие амидазной активностью. Образцы почвы были отобраны на территории Подольского завода цветных металлов и предоставлены сотрудниками кафедры физиологии растений и микроорганизмов (ПГНИУ, Пермь).

Для дальнейших исследований были отобраны два штамма Arthrobacter sp. 6-1 и R. rhodochrous 4-1, обладающие амидазной активностью и стереоселективностью.

2.2. Выделение и идентификация амидгидролизующих бактерий Штаммы выделяли методом прямого высева. Навеску почвы (1,0 г) суспендировали в 100 мл стерильного фосфатного буфера, оставляли при температуре 28°С при постоянном перемешивании со скоростью вращения 120 об/мин на 1 час. Полученный раствор использовали для разведений и последующего параллельного высева на чашки Петри с агаризованной средой N, содержащей селективный субстрат – лактамид в концентрации 10 мМ. На 3-7 сутки роста отбирали среди образовавшихся колоний наиболее крупные, а также морфологически различающиеся переносили на чашки Петри со свежей селективной средой. Чистую культуру пересевали в колбы с жидкой средой аналогичного состава и культивировали в течение 5-7 суток.

Селекцию проводили на минеральной среде N с добавлением лактамида до конечной концентрации 50 мМ в качестве единственного источника углерода и азота.

Предварительную идентификацию штаммов, проявляющих амидазную активность, проводили путем ПЦР-анализа с праймерами к генам 16S рРНК, сконструированными на основе последовательностей, представленных в базе данных GenBank и синтезированными ООО «Евроген», г. Москва (таблица 5).

–  –  –

Идентификацию штамма Arthrobacter sp. 6-1, отобранного для дальнейших исследований, проводили на основании культуральноморфологических и биохимических характеристик согласно определителю бактерий Берджи (Хоулт, 1997).

Морфологию и жизненный цикл изучали у 12-72 часовой культуры, выращенной на агаризованной среде LB с использованием фазовоконтрастной микроскопии.

Для изучения физиолого-биохимических признаков культуру 6-1 выращивали в аэробных условиях на среде LB.

Гидролиз эскулина Культуру выращивали на агаризованной среде LB с добавлением 0,01%-ного эскулина и 0,05%-ного лимоннокислого железа. При гидролизе эскулина среда приобретает черный цвет. Наблюдали отсутствие роста культуры и неизменную окраску среды.

Гидролиз желатины Культуру выращивали на агаризованной среде LB с добавлением 1%ного желатина и индикатора фенолового красного. Наблюдали гидролиз желатины с образованием розовой окраски среды.

Гидролиз крахмала Культуру 6-1 высевали на агаризованную среду с добавлением 0,2%ного растворимого крахмала, после инкубации агар заливали раствором иода.

При положительном тесте вокруг зоны роста появляется бесцветный участок.

Гидролиз крахмала не наблюдали.

Утилизация цитрата Готовили цитратный агар Симмонса, содержащий в качестве единственного источника углерода цитрат натрия и бромтимоловый синий в качестве индикатора. Рост культуры сопровождался появлением голубой окраски среды, означающей утилизацию цитрата.

Ферментация углеводов К минеральной среде Смита, содержащей бромтимоловый синий в качестве индикатора, добавляли 1%-ный сахар (лактозу, глюкозу, сахарозу).

Использования сахаров и подкисления среды не наблюдали.

Уреазный тест Готовили агар Кристенсена с мочевиной и индикатором феноловым красным. На наличие уреазы, которая расщепляет мочевину до аммиака и углекислого газа, указывает окрашивание среды в красно-фиолетовый цвет.

Оксидазный тест В оксидазном тесте использовали бесцветный краситель фенилендиамин дигидрохлорид, используемый как искусственный акцептор электронов, который при участии оксидазы окисляется и образует окрашенное вещество индофенол синий.

Тест на каталазу На исследуемую колонию наносили 1-2 капли 3%-ной перекиси водорода и наблюдали появление пузырьков, что свидетельствует об образовании кислорода и наличии каталазы.

Тест на липазу Готовили агаризованную среду с добавлением 0,01%-ного хлорида кальция и 1%-ного твина 80, засевали штрихом. Наблюдали появление мутного ореола вокруг колоний, означавшего образование кристаллов кальциевого мыла.

2.3. Среды и субстраты для культивирования Бактериальные штаммы культивировали на синтетической среде N следующего состава (г/л): KH2PO4 - 1.0; K2HPO43H2O - 1.6; NaCl - 0.5;

MgSO47H2O - 0.5; CaCl2 - 0.005; CoCl26H2O – 0.01; FeSO47H2O - 0.005;

рН 7.2 ± 0.2 (Максимов и др., 2003). Агаризованную среду получали добавлением бакто-агара (Sigma) до конечной концентрации 1,5 %.

В качестве источника углерода для штамма R. rhodochrous 4-1 использовали глюкозу в конечной концентрации 0,1%. В качестве источника азота – ацетонитрил в концентрации 10 мМ. Источники углерода и азота для штамма Arthrobacter sp. 6-1 варьировали.

Бактериальный рост оценивали по изменению оптической плотности суспензии клеток при =540 нм с учетом разведения на фотоэлектроколориметре КФК-3, либо на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro с использованием с использованием кварцевой кюветы (длина пути 1 см).

Соответствие единицы ОП весу сухих клеток определяли для каждого штамма взвешиванием на аналитических весах предварительно высушенной биомассы из 1 мл суспензии известной ОП.

2.4. Определение амидазной активности и стереоселективности штаммов Удельную активность клеток определяли как количество акриловой кислоты в мкмоль, образуемое за 1 минуту биомассой бактерий, соответствующей 1 мг сухого веса. Удельную активность фермента рассчитывали на 1 мг белка. Единица амидазной активности клеток (1 ЕД) соответствует 1 мкмоль кислоты/мг клеток/мин, в случае амидазной активности ферментного препарата – 1 мкмоль кислоты/мг белка/мин.

Амидазную активность бактериальной суспензии и ферментного препарата предварительно оценивали спектрофотометрически (Ultraspec

3000) по возрастанию оптической плотности реакционной среды при проведении минутной реакции с акриламидом в качестве субстрата при =230 нм (Кузнецова, 2004).

Стереоселективные свойства штаммов определяли путем трансформации D,L-лактамида, D- и L-изомеры молочной кислоты анализировали спектрофотометрически на планшетном ридере Tecan infinite M200 pro (“Tecan”, Швейцария) при использовании набора реактивов для энзиматического определения D- и L-молочной кислоты (“R-Biopharm”, Германия), следуя инструкциям производителя.

Энантиомерный избыток (ее) рассчитывали по формуле, где Х и У – доли энантиомеров. При этом суммарную концентрацию энантиомеров молочной кислоты принимали за 100%.

2.5. Выделение амидазы Клеточную суспензию центрифугировали 10 мин со скоростью вращения 10000 g, клеточный осадок отмывали фосфатным буфером, содержащим 44 мМ бутират натрия. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл фосфатного буфера, содержащего бутират натрия в указанной концентрации.

Озвучивание клеток проводили на ультразвуковом дезинтеграторе при 22 кГц 10 раз по 15 секунд с охлаждением на льду. Суспензию, содержащую разрушенные клетки, центрифугировали 20 мин при скорости вращения 10000 g с охлаждением (4°С).

Высаливание белка осуществляли следующим образом: к 10 мл надосадочной жидкости добавляли 2,08 г сульфата аммония (концентрация сульфата аммония составляет 35% от насыщения) и центрифугировали 20 мин при 10000 g с охлаждением. В результате чего образовался осадок, который растворили в 10 мл фосфатного буфера, содержащего бутират натрия. К 10 мл надосадочной жидкости добавили 1,63 г сульфата аммония (концентрация сульфата аммония составляет 60% от насыщения) и центрифугировали 20 мин при 10000 g с охлаждением. Образовавшийся осадок растворили в 10 мл фосфатного буфера, содержащего бутират натрия.

На каждом этапе после растворения осадка спектрофотометрически измеряли амидазную активность по отношению к акриламиду. По активности определяли, в какой пробе находится амидаза. Высаливание амидазы происходило при добавлении сульфата аммония до 60% от насыщающей концентрации. Ферментный препарат хранили при -18°С.

Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда. Реагент Бредфорда готовили следующим образом: 50 мг Кумасси G-250 растворили в 25 мл 96% этилового спирта, добавили 50 мл ортофосфорной кислоты, довели до 500 мл дистиллированной водой и профильтровали через бумажный фильтр.

0,25 0,2 0,15 ОП 595 0,1 0,05

–  –  –

Рисунок 8 – Калибровочный график для определения концентрации белка в растворе по методу Бредфорда (Bradford, 1976).

Делали калибровку по бычьему сывороточному альбумину (рисунок 8).

К 1 мл пробы добавляли 1 мл реагента Кумасси, выдерживали в течение 5 мин для развития окраски, измеряли оптическую плотность при =595 нм. По калибровочному графику рассчитывали концентрацию белка в пробе.

2.6. Иммобилизация Адсорбцию клеток с амидазной активностью проводили в течение 2 часов при 22С из 10 мл бактериальной суспензии на 500 мг активного угля БАУ (ООО “УралХимСорб”, Россия). Массу клеток в мл суспензии определяли взвешиванием на аналитических весах предварительно высушенной до постоянного веса биомассы в известном объеме суспензии.

Количество адгезированных клеток определяли по формуле:

А = (ОПисх – ОПфильтр) / ОПисх m, где: А – количество адгезированных клеток, мг; ОПисх – оптическая плотность суспензии клеток до адсорбции, измеренная при длине волны 540 нм; ОПфильтр – оптическая плотность суспензии клеток после адсорбции; m – концентрация клеток в суспензии до адсорбции, мг/мл. Носитель с адгезированными клетками отмывали калий-фосфатным буфером.

Иммобилизацию ферментного препарата осуществляли следующими методами: методом ковалентной сшивки с хитозаном, методом адсорбции и методом поперечно-сшитых агрегатов (ПСФА).

Для иммобилизации амидазы методом ковалентной сшивки с хитозаном готовили 2%-ный (вес/об.) раствор хитозана в 2%-ной (об./об.) уксусной кислоте. Гранулы готовили следующим образом: 2 мл 2%-ного хитозана накапывали через иглу шприца в 1М раствор KOH объемом 5 мл. В этом растворе гранулы затвердевали в течение 40 мин, далее их промывали фосфатным буфером 3 раза по 10 мл до нейтральной реакции промывных вод. Активацию гранул проводили 0,1%-ным бензохиноном в течение 15 минут. Затем гранулы промывали фосфатным буфером 3 раза по 10 мл. К хитозановым гранулам добавляли 2 мл ферментного препарата, выдерживали 40 мин при температуре 22-24°С, промывали фосфатным буфером до исчезновения белка в промывных водах. Концентрацию связанного белка определяли по разности концентрации белка в растворе до и после контакта с гранулами:

Асорб = (Аисх – Афильтр)х M Асорб – связанный белок, мг Аисх – концентрация белка в растворе до адсорбции, мг/мл Афильтр – концентрация белка в растворе после адсорбции, мг/мл М – количество раствора, мл.

Процент сорбции вычисляли по следующей формуле:

Ссорб = (Асорб / Сисх) х 100% Ссорб – адсорбция, % Асорб – связанный белок, мг Сисх – количество белка в растворе до адсорбции, мг.

Для иммобилизации амидазы методом адсорбции использовали углеродсодержащие носители: мезопористый Сибунит, Sуд = 441 м2/г (Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, г. Новосибирск, Россия) и Сферический углерод-минеральный сорбент (СУМС), Sуд = 220 м2/г (Россия) (Коваленко и др., 2007). Раствор белка (2 мл) инкубировали с 200 мг носителя при 22–25°С в течение 2 часов на шейкере со скоростью вращения 100 об/мин, носитель отмывали 0,01 М калий-фосфатным буфером, рН 7,2 ± 0,2 до исчезновения белка в промывных водах. Количество адсорбированного белка определяли по разности концентрации белка в растворе до и после контакта с носителем.

Поперечно-сшитые ферментные агрегаты получали фракционированием белка сульфатом аммония как описано выше с одновременной обработкой 0,1%-ным раствором глутарового альдегида, либо 0,1%-ным раствором бензохинона.

2.7. Определение продуктов реакции трансформации нитрилов и амидов Трансформацию нитрилов и амидов изолированной амидазой проводили в 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, рН 7,2, при начальной концентрации субстрата 10-50 мМ. Реакцию проводили в течение 60 мин и останавливали добавлением концентрированной HCl до конечной концентрации в растворе 5%. Пробы центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Продукты реакции анализировали методами ТСХ и ВЭЖХ.

Восходящую тонкослойную хроматографию продуктов трансформации фенилаланинамида проводили на пластинках Сорбфил (АО «Сорбполимер», г. Краснодар). Из четырех апробированных вариантов составов подвижных фаз (ацетон-вода-уксусная кислота-муравьиная кислота, бутанол-водауксусная кислота, вода-пропанол-аммиак, бутанол-ледяная уксусная кислотавода) эффективное разделение исследуемых веществ наблюдалось в системе:

вода-пропанол-аммиак (1:8:1). Исследуемые вещества на хроматограмме обнаруживали путем опрыскивания пластинок 0,1%-ным раствором нингидрина в этиловом спирте и последующем нагревании при 110°С в течение 10 мин.

Количественный анализ субстратов и продуктов реакции трансформации нитрилов и амидов аминокислот проводили методом ВЭЖХ при использовании жидкостного хроматографа “Shimadzu LC-10A” (Япония), оснащенного диодной матрицей. Концентрацию акриламида и акриловой кислоты определяли на колонке Synergi 4u Hydro–RP 80A (250 4.

6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 25 мМ NaH2PO4, скорость потока составляла 0,75 мл/мин при 25°C, детекцию проводили при длине волны 200 нм. Концентрацию фенилглицинонитрила, L-фенилглицина, фенилаланинамида и фенилаланина определяли на колонке CROWNPAK® CR(-). В качестве элюента использовали раствор HClO4 (pH 2,0) и 10%-ного метанола, скорость потока составляла 0,3 мл/мин при 30°C, детекцию проводили при длине волны 210 нм. Количественные данные были получены при сравнении со стандартной кривой известных концентраций исследуемых соединений.

2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция Препараты хромосомной ДНК получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из актиномицетов. Для этого колонии бактерий переносили в пробирки для микроцентрифугирования типа эппендорф, ресуспендировали в 0,5 мл раствора SSC (NaCl 0,15 М, цитрат натрия 0,015 М, лизоцим 5 мг), выдерживали при 37С в течение 30 мин.

Добавляли 50 мкл 20%-ного раствора SDS, перемешивали и выдерживали в течение 10 мин при 65С в твердотельном термостате Термит (Россия).

Добавляли 0,5 мл фенола и центрифугировали при 10000 g в теченние 10 мин. Супернатант (водную фазу) переносили в чистую микропробирку, добавляли равный объем (0,5 мл) хлороформа, перемешивали и центрифугировали при 10000 g 3 мин. Водную фазу переносили в чистую микропробирку и добавляли равный объем изопропанола (0,5 мл), центрифугировали при 10000 g 3 мин. Полученную смесь выдерживали при

-18С в течение 1 ч и центрифугировали в течение 5 мин при 10000 g.

Полученный осадок высушивали и растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0).

Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Taqполимеразы производства ООО «СибЭнзим» (Новосибирск) на термоциклере Т3 (Biometra, Германия). Олигонуклеотидные праймеры, специфичные к генам известных D-аминокислотных амидаз, были разработаны с использованием баз данных GenBank по заданным последовательностям и синтезированы в Мировой лаборатории «Микробных и клеточных биотехнологий», Пермь (таблица 6).

Режим амплификации для праймеров, специфичных к генам Dаминокислотных амидаз включал: денатурацию – 60 сек при 94С, отжиг – 60 сек при 56С для праймеров BrIDAA, при 57С – для праймеров BrDAA и при 50С для праймеров OchDAA; элонгацию – 80 сек при 72С (35 циклов);

в завершающем цикле – дополнительно 60 сек при 72С.

–  –  –

Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР-реакции проводили в 1,2-1,5%-ном агарозном геле в трис-боратном буфере при напряженности поля 5 В/см. Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК использовали молекулярные маркеры 1 kb и 100 b (ООО «СибЭнзим» и Axigen®).

Визуализацию полос и документирование данных осуществляли после окрашивания геля бромистым этидием с использованием системы гель-документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия).

2.9. Секвенирование ДНК Очистку ПЦР-продукта перед секвенированием осуществляли двумя способами:

1) с использованием смеси ферментов ExoSAPMix (Fermentas Life Sciences): Exonuclease I(Exo I) - 1мкл, Shrimp Alkaline Phosphatase - 10 мкл, деионизованная вода - 89 мкл. Обработка ПЦР-продуктов: 2 мкл ExoSAPMix на 25 мкл ПЦР-продукта. Инкубация при 37°С 40 мин, 85°С - 15 мин;

2) путем гель-электрофореза с помощью аппарата E-Gel (Invitrogen) согласно инструкции фирмы-производителя.

Секвенирующую реакцию проводили в следующей реакционной среде:

Big Dye Terminator (Applied Biosystems, США) - 8 мкл, очищенный ПЦР продукт - 1мкл, праймер-1мкл, деионизованная вода-10 мкл. Температурный режим секвенирующей ракции: 95°С – 1 мин, 95°С - 10 сек, 50°С - 5 сек, 60°С

- 4 мин, 25 циклов.

После секвенирующей реакции проводили чистку и переосаждение образцов двумя методами:

1) с использованием Big Dye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, США): 90 мкл SAM Solution+20 мкл Terminator на 20 мкл продукта. Полученную смесь встряхивали на вортексе при 10000 g в течение 30 мин., после чего осаждали центрифугированием;

2) к образцу (20 мкл) добавляли 2 мкл 7,5М ацетата аммония и 60 мкл 96%-ного этанола. Выдерживали смесь в течение 20 мин при -18°С и центрифугировали 15 мин при 10000 g. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 100 мкл 70%-ного этанола, выдерживали в течение 2 минут при комнатной температуре и центрифугировали 15 мин при 10000 g.

После переосаждения сливали надосадочную жидкость, осадок высушивали при 50°С, растворяли в 10 мкл смеси MegaBACE Loading Solution (70% формамид, 1% ЭДТА, 29% H2О) и анализировали нуклеотидную последовательность с помощью системы секвенирования ДНК MegaBACE1000 (APBiotech).

Полученные нуклеотидные последовательности обрабатывали с помощью пакета программ MegaBACE1000 и программы Chromas lite 2.1.

Сравнение нуклеотидных последовательностей проводили с применением программ ClustalW 2.0.9 и YACWGUI 1.2. Для построения графического изображения филогенетического древа использовали программу YACWGUI 1.2.

2. 10. Статистическая обработка Все эксперименты проводились не менее чем в трехкратной повторности. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение и доверительные интервалы.

Достоверность различий определяли с использованием t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990). Различия считались значимыми при р0,05.

Анализ результатов проводили с помощью прикладных программ MS Office XP Excel и Statistica 5.0.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И

СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1

3.1. Выделение и селекция штаммов, способных к стереоселективной трансформации D,L-лактамида1 С целью выделения амидгидролизующих бактерий были взяты почвенные образцы, отобранные на территории Подольского завода цветных металлов.

Для первичного отбора микроорганизмов использовали минеральную среду N, содержащую в качестве селективного субстрата 50 мМ лактамид.

Клоны микроорганизмов, способных к утилизации лактамида, выделяли методами накопительной культуры и прямого высева. Все культуры были протестированы на наличие амидазной активности. В результате предварительного отбора получено 45 клонов, имеющих амидазную активность выше 1,5 ЕД. Культуры, выделенные из образцов почв, а также штаммы лабораторной коллекции были исследованы на способность к стереоселектвиному гидролизу D,L-лактамида. В ходе работы было показано, что 45 штаммов гидролизовали лактамид без стереоселективности, 18 гидролизовали D-изомер лактамида и 10 - L-изомер.

В результате селекции были отобраны две культуры 4-1 и 6-1, гидролизующие D,L-лактамид с образованием D-молочной кислоты с максимальным энантиомерным избытком 44 и 43% соответственно (таблица 7).

___________________

1 Результаты получены лично.

–  –  –

3.2. ПЦР-анализ генов D-аминокислотных амидаз С помощью ПЦР анализа проведен скрининг последовательностей, гомологичных генам D-аминокислотных амидаз почвенных изолятов.

Установлено, что у 13 штаммов грамположительных бактерий присутствовали фрагменты ДНК размером около 750 п.н., гомологичные генам D-амидаз, ранее обнаруженных у Brevibacterium iodinum TPU 5850 GenBank, AB233405.1 (рисунок 9, 10). Штаммы принадлежали к роду Rhodococcus и Microbacterium.

–  –  –

Рисунок 10 – ПЦР-продукты, соответствующие гену D-аминокислотной амидазы Brevibacterium iodinum.

У одного штамма из группы грамположительных микроорганизмов амплифицирована последовательность, соответствующая гену D-амидазы аминокислот Brevibacillus borstelensis BCS-1, GenBank AF441121.1.

Ни в одном из образцов геномной ДНК выделенных почвенных изолятов не удалось обнаружить нуклеотидных последовательностей гомологичных гену D-аминокислотной амидазы Ochrobactrum anthropi SV3, GenBank AB026907.1.

Штаммы, у которых обнаружены фрагменты ДНК, соответствующие по размеру гену D-аминокислотной амидазе B. iodinum, использовали в реакции трансформации D,L-лактамида до D- или L-изомеров молочной кислоты. Было установлено, что культуры, обладающие генами D-амидаз, катализируют гидролиз рацемического лактамида с образованием D-изомера с очень низким энантиоселективным избытком или без стереоселективности.

Это свидельствует о том, что амидазы являются индуцибельными ферментами, экспрессия их генов требует определенных условий и зависит от ряда факторов среды.

В ходе селекции штаммов было обнаружено, что наличие амидазной активности не всегда связано с наличием гена фермента. Отсутствие продуктов ПЦР с экспериментальной ДНК-матрицы может объясняться вырожденностью праймеров, наличием амидазы с иной нуклеотидной последовательностью и условиями проведения ПЦР-анализа.

3.3. Идентификация выделенных культур Проведена идентификация бактерий, способных к активному росту на среде с лактамидом. Видовая принадлежность изолятов была определена путем анализа секвенированных фрагментов гена 16S рРНК, полученных при амплификации с праймерами к генам 16S рРНК, сконструированными и синтезированными на основе последовательностей, представленных в базе данных GenBank. Показано, что большую часть бактерий, способных к росту на селективной среде, составляют грамположительные аэробные бактерии родов Microbacterium, Dietzia, Rhodococcus, Arthrobacter, Micrococcus (таблица 8).

–  –  –

Высокоактивная культура 6-1 была отобрана для дальнейших исследований и идентифицирована как Arthrobacter sp. на основании культурально-морфологических и биохимических свойств (таблица 9). Для выявления цикла развития проводили последовательное микроскопическое наблюдение за культурой разного возраста (6-24-48-72 часа, 5-7 суток).

Установлено, что молодая культура, находящаяся в экспоненциальной фазе роста, представлена палочками неправильной формы, с V-образными булавовидными концами. В культуре, соответствующей стационарной фазе роста (72 часа), палочки распадаются на кокки, одиночные или в скоплениях (рисунок 11).

–  –  –

Также путем секвенирования последовательностей генов 16S рРНК было подтверждено, что грамположительный штамм 6-1, отнесенный к виду Arthrobacter sp. на 98% соответствует гену 16S рРНК Arthrobacter sp. FB24 из базы данных GenBank.

3.4. Влияние источника углерода на рост и амидазную активность бактерий Оптимизация условий культивирования позволяет не только увеличить скорость роста и выход биомассы биотехнологически значимого штамма, но и повысить его продуктивность в отношении желаемых субстратов. При этом важную роль играют такие компоненты среды как источник углерода и азота.

Оценивали влияние различных источников углерода (глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза, сорбит, маннит, дульцит, инозит, янтарная, муравьиная, уксусная, лимонная кислоты) на рост и амидазную активность клеток R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1. Исследуемые источники углерода вносили в минеральную среду в концентрации 0,1%, в качестве источника азота использовали 10 мМ ацетонитрил.

–  –  –

Рисунок 12 – Оптическая плотность культуры (ОП540) при культивировании R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 в присутствии различных источников углерода: 1 - глюкоза; 2 - сорбит; 3 - дульцит; 4 - инозит;

5 - маннит; 6 - мальтоза; 7 - лактоза; 8 - сахароза; 9 - уксусная кислота;

10 - лимонная кислота; 11 - муравьиная кислота; 12 - янтарная кислота.

Высокая плотность культуры R. rhodochrous достигалась в результате использования в качестве источника углерода ряда спиртов – сорбита, дульцита и инозита, а также янтарной кислоты. Максимальный рост штамма Arthrobacter sp. 6-1 наблюдался в присутствии сахарозы и ряда кислот – уксусной, лимонной и янтарной (рисунок 12). Указанная плотность соответствует максимальной и наблюдается в конце экспоненциальной фазы роста культур (3-4 сутки).

–  –  –

Рисунок 13 – Удельная активность амидазы R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1, рассчитанная по трансформации акриловой кислоты, при росте на разных источниках углерода (активность при росте на глюкозе принята за 100 %): 1 - глюкоза; 2 - сорбит; 3 - дульцит; 4 - инозит; 5 - маннит; 6 мальтоза; 7 - лактоза; 8 - сахароза; 9 - уксусная кислота; 10 - лимонная кислота; 11 - муравьиная кислота; 12 - янтарная кислота.

Установлено, что штамм R. rhodochrous 4-1 проявляет максимальную амидазную активность при использовании сорбита в качестве источника углерода. Высокую активность амидазы штамма 4-1 также наблюдали при росте клеток на инозите и муравьиной кислоте. Оптимальными субстратами для роста и проявления амидазной активности Arthrobacter sp. 6-1 являются кислоты (лимонная, муравьиная и янтарная). Максимальная активность была зарегистрирована при росте клеток на муравьиной кислоте (рисунок 13).

3.5. Влияние источника азота на рост и амидазную активность бактерий Исследовано влияние ряда альтернативных источников азота на рост и амидазную активность штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1.

–  –  –

Рисунок 14 – Оптическая плотность культуры (ОП540) при культивировании R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 в присутствии различных источников азота: 1 – хлорид аммония; 2 – нитрат натрия;

3 – нитрат калия; 4 – нитрат аммония; 5 – фосфат аммония;

6 – сульфат аммония; 7 - ацетонитрил; 8 – мочевина.

Максимальный рост клеток R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 наблюдался в присутствии ацетонитрила, который обеспечивал достаточно высокий уровень ферментативной активности (рисунок 14). Повышение амидазной активности культуры 4-1 наблюдалось также в присутствии мочевины (рисунок 15).

–  –  –

Рисунок 15 – Удельная активность амидазы штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1, на минеральной среде с различными источниками азота (активность в присутствии хлорида аммония принята за 100 %, источник углерода – 0,1 % глюкоза): 1 – хлорид аммония; 2 – нитрат натрия;

3 – нитрат калия; 4 – нитрат аммония; 5 – фосфат аммония;

6 – сульфат аммония; 7 - ацетонитрил; 8 – мочевина.

По данным литературы известно, что оптимизация условий культивирования позволяет повысить не только активность, но и энантиоселективность фермента (Wu, 2002).

В результате проведенных экспериментов было установлено, что при выращивании штаммов 4-1 и 6-1 с использованием оптимальных источников углерода и азота, наблюдалось незначительное повышение (2-15%) стереоселективных свойств по отношению к D,L-лактамиду (таблица 10).

–  –  –

3.6. Влияние иммобилизации на стереоселективные свойства внутриклеточных амидаз Изучение влияния иммобилизации штаммов 4-1 и 6-1 на стереоселективность внутриклеточных амидаз также проводили путем трансформации рацемического лактамида до D- или L-изомера молочной кислоты. Клетки штаммов иммобилизовали методом адсорбции на активном березовом угле (БАУ). Суспендированные клетки R. rhodochrous 4–1 и Arthrobacter sp. 6-1 гидролизовали лактамид до D- и L-молочной кислоты с соотношением энантиомеров 76 к 24% и 72 к 28% соответственно, тогда как адгезированные не проявляли стереоселективных свойств (таблица 11).

–  –  –

Известно, что многие оптически активные вещества обладают лишь ограниченной устойчивостью. В случае снижения доли одного из оптических изомеров при трансформации иммобилизованными на углеродном носителе клетками, возможно, происходит рацемизация молочной кислоты. Известно, что рацемизация чаще может происходить не самопроизвольно, а вызываться различными физико-химическими воздействиями, причем катализаторами рацемизации могут выступать щелочные агенты (Потапов, 1988). В данном случае, скорее всего, причиной снижения оптической чистоты образующегося раствора молочной кислоты при гидролизе адгезированными клетками является не изменение скорости образования изомеров, а присутствие носителя в образце, приводящее к рацемизации.

Таким образом, установлено, что оптимальными источниками углерода и азота для роста и проявления амидазной активности штамма R. rhodochrous 4-1 являлись дульцит и ацетонитрил, для штамма Arthrobacter sp. 6-1 муравьиная кислота и ацетонитрил. Стереоселективность, проявленная штаммами на этих питательных средах, незначительно отличалась от стереоселективности культур при росте на контрольной среде, а иммобилизация клеток на углеродном адсорбенте БАУ приводила к снижению оптической чистоты образующегося продукта.

ГЛАВА 4. СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТНЫХ

ПРЕПАРАТОВ АМИДАЗ R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1

4.1. Каталитические свойства амидазы, иммобилизованной методом ковалентной сшивки с хитозаном, активированным бензохиноном2 Амидазы штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 были иммобилизованы различными методами – методом ковалентной сшивки с хитозаном, методом адсорбции и методом поперечно сшитых агрегатов.

Установлено, что фермент R. rhodochrous, ковалентно иммобилизованный на хитозане, сохраняет 50-60% исходной активности при гидролизе акриламида и проявляет большую термостабильность по сравнению со свободным.

Иммобилизованный фермент Arthrobacter sp. 6-1 не проявлял высокой активности по отношению к акриламиду.

Показано, что при иммобилизации амидазы на активированном хитозане ее активность снижалась в 2 раза (рисунок 16).

_________________________

2 Экспериментальные работы по иммобилизации штамма R. rhodochrous 4-1 выполнены совместно с с.н.с. ЛММБ ИЭГМ УрО РАН к.б.н. Максимовой Ю.Г.

–  –  –

Рисунок 16 - Зависимость активности свободного (1) и иммобилизованного (2) ферментного препарата R. rhodochrous 4-1 от концентрации субстрата.

При увеличении концентрации субстрата - акриламида до 0,05 М наблюдалось линейное возрастание активности как иммобилизованного, так и свободного фермента, тогда как дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводило к увеличению активности. Следовательно, данная концентрация субстрата для амидазы являлась насыщающей вне зависимости от связанного или свободного состояния фермента.

На графике зависимости скорости реакции, катализируемой иммобилизованной амидазой, от концентрации субстрата в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка наблюдается четко выраженный излом, свидетельствующий о том, что при концентрации субстрата выше 0,02 М (прямая 1) реакция протекает в кинетическом, ниже 0,02 М (прямая 2) – в диффузионном режиме (рисунок 17).

–  –  –

Рисунок 17 – Зависимость скорости реакции, катализируемой иммобилизованной амидазой R. rhodochrous 4-1, от концентрации субстрата.

Полученная зависимость является доказательством того, что диффузия играет в этом процессе важную роль (Березин и др., 1987).

Изучена операционная стабильность амидазы, ковалентно присоединенной к активированному хитозану. При проведении последовательных циклов конверсии акриламида установлено, что иммобилизованный ферментный препарат сохраняет около 20% активности, измеренной в первом цикле, после 5-кратной трансформации (рисунок 18).

2,5

–  –  –

Рисунок 18 – Операционная стабильность иммобилизованной амидазы R. rhodochrous 4-1.

За 144 ч при последовательной конверсии 0,05 М раствора акриламида 0,84 мг фермента катализировали образование 32 мг акриловой кислоты.

Изучена зависимость амидазной активности штамма R. rhodochrous 4-1 от температуры. Определено, что для фермента в растворе температурный оптимум трансформации акриламида находился в пределах 40С, для иммобилизованного – 55С (рисунок 19).

–  –  –

Рисунок 19 – Зависимость каталитической активности свободной (1) и иммобилизованной (2) амидазы R. rhodochrous 4-1 от температуры.

Для исследования термической инактивации свободной и иммобилизованной амидазы проводили определение остаточной активности фермента при температурах 50–70°С (рисунки 20-22).

Активность,%

–  –  –

Рисунок 22 – Термостабильность свободной (1) и иммобилизованной (2) амидазы R. rhodochrous 4-1 – воздействие температуры 70°С.

Обнаружено, что остаточная активность иммобилизованного фермента при 60°С после 60 минут инкубации составила 87% от начальной.

Нагревание фермента при 70°С в течение 30 минут приводило к неполной инактивации иммобилизованного фермента: он сохранял 14% каталитической активности. Было показано, что при воздействии повышенной температуры иммобилизованный фермент более стабилен, чем находящийся в растворе: константы скорости инактивации для иммобилизованного препарата амидазы при любой температуре будут ниже, чем для свободного фермента. Значения констант скорости термической инактивации свободной и ковалентно иммобилизованной амидазы представлены в таблице 12.

–  –  –

Таким образом, ковалентная сшивка амидазы с носителем приводит к стабилизации ее структуры, предотвращая диссоциацию на субъединицы при повышении температуры, что приводит к повышению термостабильности иммобилизованного фермента.

Изучено сохранение активности иммобилизованного биокатализатора на основе амидазы, ковалентно присоединенной к активированному хитозану, в полностью дегидратированном состоянии. Так, при высушивании гранул хитозана иммобилизованный фермент сохранял 60% исходной активности, что подтверждает возможность длительного хранения высушенного иммобилизованного ферментного препарата.

4.2. Стереоселективные свойства амидаз, иммобилизованных различными методами Изучали стереоселективные свойства иммобилизованных амидаз R.

rhodochrous 4–1 и Arthrobacter sp. 6-1 в модельной реакции гидролиза рацемического лактамида до D- и L-изомеров молочной кислоты.

Отмечено, что при ковалентной сшивке ферментов обоих штаммов с активированным хитозаном стереоселективность реакции снижается (таблица 13, 14). Так, соотношение D- и L-энантиомеров молочной кислоты в реакции, катализируемой ферментом 4-1 в растворе, составило 89 и 11%, тогда как в реакции, катализируемой ковалентно присоединенной к хитозану амидазой – 59 и 41%.

Было изучено влияние адсорбционной иммобилизации на углеродсодержащих носителях на активность и стереоселективность амидаз.

Установлено, что при адсорбции амидаза R. rhodochrous сохраняет лишь 15активности нативного фермента, а амидаза Arthrobacter sp. – 36-46%.

Показано, что фермент 4-1, иммобилизованный на СУМС, гидролизовал лактамид до D- и L-молочной кислоты с соотношением энантиомеров 60 к 40%, тогда как фермент, адсорбированный на Сибуните, гидролизовал лактамид без стереоселективности (таблица 13). Иммобилизованный фермент Arthrobacter sp., полученный методом адсорбции, также проявлял низкую стереоселективность (таблица 14). Можно предположить, что в этом случае стереоселективность реакции снижается как за счет изменения скорости образования энантиомеров, так и в результате влияния гетерогенной среды, в частности, свойств носителей, на рацемизацию полученных продуктов реакции гидролиза лактамида. При контакте смеси Dи L-изомеров молочной кислоты в соотношении 4 : 1 с СУМС в течение 1 ч при 22С происходило превращение смеси в L-изомер, с Сибунитом – в Dизомер. Так как эти данные не согласуются с результатами трансформации рацемического лактамида амидазой, адсорбированной на этих носителях, можно заключить, что на процесс снижения энантиоселективности реакции влияет не только микроокружение фермента, создаваемое углеродным носителем, но и особенности образования фермент-субстратного комплекса у адсорбированного фермента.

Были получены поперечно-сшитые ферментные агрегаты при высаливании сульфатом аммония с одновременной сшивкой бифункциональными реагентами – глутаровым альдегидом и бензохиноном.

Установлено, что при сшивании молекул амидазы 4-1 бензохиноном сохраняется около 9% исходной активности фермента, глутаровым альдегидом – около 30% активности. Было показано, что иммобилизованные амидазы штаммов, полученные данным методом, проявляют более высокую D-стереоселективность, чем ферментные препараты в растворе. Так, биокатализатор 4-1, полученный сшивкой глутаровым альдегидом, катализировал гидролиз D,L-лактамида с энантиомерным избытком Dизомера до 92%, а поперечно сшитые агрегаты амидазы Arthrobacter sp. 6-1 при использовании глутаральдегида и бензохинона – 84 и 95% соответственно (таблица 13, 14).

Таблица 13 – Влияние иммобилизации на активность и стереоселективные свойства амидазы R. rhodochrous 4-1

–  –  –

Рисунок 23 – Влияние иммобилизации на стереоселективные свойства амидаз штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1: 1 – амидаза в растворе, 2 – адсорбция на сибуните, 3 – адсорбция на СУМСе, 4 – ковалентная сшивка с хитозаном, 5 – поперечная сшивка 0,1% глутаровым альдегидом, 6 – поперечная сшивка 0,1% бензохиноном.

4.3. Влияние температуры на стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз3 Изучено влияние температуры на стереоселективные свойства поперечно сшитых ферментных препаратов амидаз. Было показано, что образование изомеров молочной кислоты происходит в диапазоне температур от 30 до 60°С, проявление максимальной активности ферментов наблюдали при 60°С.

Максимальный энантиомерный избыток реакции (ее), равный 78%, наблюдался у поперечно сшитых агрегатов амидазы 4-1 при 40-60°С, тогда как у свободного фермента – при 40°С (рисунок 24).

_________________________

3 Результаты получены лично.

–  –  –

Рисунок 24 – Зависимость энантиомерного избытка (1) и активности (2) поперечно сшитых препаратов амидазы R. rhodochrous 4-1 от температуры.

Максимальный энантиомерный избыток у ПСФА амидазы 6-1, полученных сшивкой глутаровым альдегидом, достигал 83% при 60°С. При этом наблюдали совпадение максимума энантиоселективности с максимумом активности фермента (рисунок 25).

–  –  –

Рисунок 25 – Зависимость энантиомерного избытка (1) и активности (2) поперечно сшитых препаратов амидазы Arthrobacter sp. 6-1 от температуры.

Сдвиг максимума энантиоселективности поперечно сшитых агрегатов амидазы в сторону более высоких температур может объясняться стабилизацией определенной конформации амидазы, более предпочтительной для образования фермент-субстратного комплекса с Dизомером лактамида. Температура ниже 20°С и выше 60°С приводила к снижению энантиоселективности. Известно, что энантиоселективность является результатом разницы между свободной энергией активации энантиомеров, которая имеет энтальпический и энтропический компонент. В данном случае образование комплекса D-изомера с активным центром амидазы энтальпически выгодно, но энтропически не выгодно. Другим значимым параметром является температура рацемизации. В данном случае нагрев реакционной смеси до 70°С приводил к резкому снижению энантиоселективности даже в случае ферментов, стабилизированных за счет иммобилизации.

4.4. Влияние рН на стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз Исследовали влияние рН среды на активность и стереоселективность препаратов амидаз. Установлено, что стереоселективность обоих ферментов достигает максимума при рН 6.0 (рисунок 26, 27). Тогда как максимум активности (1,51 ЕД) наблюдается при рН 7.0 - Arthrobacter sp. 6-1 и рН 7.0R. rhodochrous 4-1 (2,01 и 2,32 ЕД соответственно).

–  –  –

1,5 40 1 0,5

–  –  –

1,2 60 0,8 40 0,4 20

–  –  –

Рисунок 27 – Влияние рН среды на энантиомерный избыток (1) и активность амидазы (2) Arthrobacter sp. 6-1.

Влияние рН на активность и стереоселективность ферментов связано с ионизацией функциональных групп аминокислотных остатков белка, обеспечивающих оптимальную конформацию активного центра фермента.

При закислении среды происходит протонирование свободных аминогрупп, что приводит к изменению конформации молекулы фермента и конформации активного центра. В данном случае снижение рН с 7.0 до 6.0, вероятно, вызвало увеличение сродства D-изомера лактамида к активному центру амидазы.

ГЛАВА 5. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИДОВ

АМИНОКИСЛОТ

5.1. Биотрансформация D,L-фенилглицинонитрила4 5.1.1. Скрининг микроорганизмов, способных к гидролизу D,Lфенилглицинонитрила Для получения культур, гидролизующих рацемический фенилглицинонитрил до фенилглицина, исследовали способность бактерий усваивать фенилглицинонитрил как единственный источник азота. Для выделения активных штаммов использовали лабораторную коллекцию из 30 нитрилутилизирующих штаммов и 45 изолятов из образцов почвы промышленных предприятий.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Похожие работы:

«ЛИТВИНЮК ДАРЬЯ АНАТОЛЬЕВНА МОРСКОЙ ЗООПЛАНКТОН И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ЕГО ИЗУЧЕНИЯ Специальность 03.02.10. – Гидробиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Самышев Эрнест Зайнуллинович МОСКВА 2015 СОДЕРЖАНИЕ Стр. ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ РАЗДЕЛ 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. История изучения и методологические аспекты оценки...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Кузнецова Татьяна Сергеевна ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РЕФРАКЦИОННОГО РЕГРЕССА ПОСЛЕ ЭКСИМЕР-ЛАЗЕРНОЙ КОРРЕКЦИИ БЛИЗОРУКОСТИ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ПРИ МЕХАНИЧЕСКОЙ И ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ ТЕХНОЛОГИЯХ ФОРМИРОВАНИЯ ЛОСКУТА РОГОВИЦЫ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«БОЛОТОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И МИГРАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЭКОСИСТЕМАХ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность: 03.02.08. Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«Очиров Джангар Сергеевич НАРУШЕНИЯ МИКРОНУТРИЕНТНОГО СТАТУСА ОВЕЦ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор ветеринарных...»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«ИВАНОВ Сергей Иванович Особенности воспроизводства атлантического лосося (Salmo salar L.) в озерно-речной системе реки Шуя (Республика Карелия) Специальность 03.02.06 – ихтиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени...»

«ВУДС ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА Фармакогенетические аспекты антиангиогенной терапии экссудативной формы возрастной макулярной дегенерации» 14.01.07 – Глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Будзинская Мария Викторовна кандидат биологических наук Погода Татьяна Викторовна Москва – 2015...»

«Лёвкина Ксения Викторовна Влияние сроков, норм высева и удобрений на урожайность и качество зерна озимой твердой пшеницы в подзоне светло-каштановых почв Волгоградской области Специальность: 06.01.01 – общее земледелие, растениеводство Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Миронов Андрей Викторович КОРРЕКЦИЯ АККОМОДАЦИОННЫХ НАРУШЕНИЙ У ПАЦИЕНТОВ ЗРИТЕЛЬНО-НАПРЯЖЕННОГО ТРУДА МЕТОДАМИ ФИЗИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ 14.01.07 – глазные болезни 14.03.11 восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура, курортология и физиотерапия Диссертация на...»

«Регузова Алёна Юрьевна Исследование специфической активности полиэпитопных Т-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«ШАЯХМЕТОВ МАРАТ РАХИМБЕРДЫЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ПОЧВЕННОГО ПОКРОВА ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ НА ОСНОВЕ ДИСТАНЦИОННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ ЗЕМЛИ 03.02.13 – почвоведение Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Л.В. Березин Уфа...»

«Коротких Алина Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВИДОВ И СОРТОВ РОДА NARCISSUS L. В УСЛОВИЯХ ЮГО-ЗАПАДА ЦЧЗ (НА ПРИМЕРЕ БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ) 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой...»

«ТОМОШЕВИЧ Мария Анатольевна ФОРМИРОВАНИЕ ПАТОКОМПЛЕКСОВ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» 03.02.08 – «Экология» Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: д.б.н., академик РАН Коропачинский И.Ю. Новосибирск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ: ВВЕДЕНИЕ.. 4 ГЛАВА 1. АНАЛИЗ...»

«Владимирова Элина Джоновна ИНФОРМАЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ЛЕСНОЙ КУНИЦЫ И НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ХИЩНЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ СО СРЕДОЙ ОБИТАНИЯ (CARNIVORA: CANIDAE ET MUSTELIDAE) Том 1 03.02.08 – экология, 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание...»

«Максимова Ольга Владимировна «Оценка микробиоты кишечника у детей с аллергическими заболеваниями в зависимости от массы тела» 03.02.03. – Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Зверев Виталий Васильевич академик РАН, д.б.н., профессор Научный консультант: Гервазиева Валентина Борисовна д.м.н, профессор, заслуженный деятель науки РФ МОСКВА – 2015 Оглавление Список сокращений Введение Глава 1 Обзор литературы 1.1...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.