WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«ГИДРОЛИЗ РАЦЕМИЧЕСКИХ АМИДОВ ФЕРМЕНТАМИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ ...»

-- [ Страница 1 ] --

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ГОРБУНОВА Анна Николаевна

ГИДРОЛИЗ РАЦЕМИЧЕСКИХ АМИДОВ

ФЕРМЕНТАМИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ

03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Максимов А. Ю.

Пермь – 201

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Амидазы – нитрилгидролизующие ферменты

1.1.1. Применение L- и D-энантиомеров аминокислот

1.1.2. L-селективные аминокислотные амидазы

1.1.3. D-селективные аминокислотные амидазы

1.2. Биотрансформация субстратов иммобилизованными амидазами......... 29 1.2.1. Иммобилизация клеток с амидазной активностью

1.2.2. Иммобилизация выделенных амидаз

1.3. Факторы, влияющие на стереоселективность ферментов

1.4. Энантиоселективная биотрансформация D,L-фенилглицинонитрила. 36

1.5. Биотрансформация фенилаланинамида

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Выделение и идентификация амидгидролизующих бактерий............... 43

2.3. Среды и субстраты для культивирования

2.4. Определение амидазной активности и стереоселективности штаммов 46

2.5. Выделение амидазы

2.6. Иммобилизация

2.7. Определение продуктов реакции трансформации нитрилов и амидов 50

2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция

2.9. Секвенирование ДНК

2. 10. Статистическая обработка

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И

СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1

3.1. Выделение и селекция штаммов, способных к стереоселективной трансформации D,L-лактамида

3.2. ПЦР-анализ генов D-аминокислотных амидаз

3.3. Идентификация выделенных культур

3.4. Влияние источника углерода на рост и амидазную активность бактерий

3.5. Влияние источника азота на рост и амидазную активность бактерий.. 65

3.6. Влияние иммобилизации на стереоселективные свойства внутриклеточных амидаз

ГЛАВА 4. СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТНЫХ

ПРЕПАРАТОВ АМИДАЗ R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1............... 69

4.1. Каталитические свойства амидазы, иммобилизованной методом ковалентной сшивки с хитозаном, активированным бензохиноном........... 69

4.2. Стереоселективные свойства амидаз, иммобилизованных различными методами

4.3. Влияние температуры на стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз

4.4. Влияние рН на стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз

ГЛАВА 5. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИДОВ

АМИНОКИСЛОТ

5.1. Биотрансформация D,L-фенилглицинонитрила

5.1.1. Скрининг микроорганизмов, способных к гидролизу D,Lфенилглицинонитрила

5.1.2. Индукция нитрилгидролизующей активности штамма Rhodococcus rhodochrous 4-1

5.1.3. Трансформация D,L-фенилглицинонитрила изолированной амидазой R. rhodochrous 4-1

5.1.4. Влияние температуры на активность и стереоселективность амидазы R. rhodochrous 4-1 в реакции гидролиза D,Lфенилглицинонитрила

5.1.5. Влияние иммобилизации нитрилгидратазы и амидазы R. rhodochrous 4-1 на стереоселективность реакции

5.2. Биотрансформация L-фенилаланинамида

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы В последние годы получение оптически чистых аминокислот становится все более и более актуальной задачей современной биотехнологии (Leuchtenberger et al., 2005). Являясь не только структурными элементами белков и других эндогенных соединений, аминокислоты имеют большое функциональное значение.
Их применяют в пищевой промышленности, в животноводстве и ветеринарии для питания и лечения животных (Сафонова, 1974; Bercovici, Fuller, 1995). Некоторые аминокислоты нашли применение в здравоохранении, в изготовлении косметических средств, в качестве питательных сред для производства вакцин (James, 2003). Намечаются пути использования аминокислот в химической промышленности (Schoemaker et al., 1992). Непротеиногенные аминокислоты выступают в качестве предшественников новых инсектицидов, гербицидов и полусинтетических антибиотиков (Breuer et al., 2004; Kamphuis et al., 1990).

В настоящее время основой крупнотоннажного производства аминокислот служит микробиологический синтез - около 60% от производимого объема (Leuchtenberger et al., 2005). В меньшей степени распространен химический синтез, а также получение аминокислот путем гидролиза белков.

Микробиологический способ получения аминокислот основан на способности микроорганизмов синтезировать все L-аминокислоты, а в определенных условиях, — обеспечивать их «сверхсинтез». Однако, живые организмы, с которыми приходится работать, очень чувствительны к малейшему изменению условий, концентрация целевого продукта получается низкой, что требует увеличения размеров реакторов. При микробиологическом синтезе образуются только L-аминокислоты, метод не позволяет получать непротеиногенные аминокислоты и их производные (Якубке, Ешкайт, 1985).

В результате химического синтеза образуется рацемическая смесь аминокислот, требующая разделения, а в большинстве других случаев доля одного из изомеров ненамного превышает содержание второго (Nakamura et al., 1980).

Одним из перспективных путей получения оптически чистых аминокислот является использование отдельных ферментов. В настоящее время интенсивно изучаются процессы ферментативного разделения рацемической смеси амидов аминокислот с помощью стереоселективных амидаз. Эти ферменты обладают широкой субстратной специфичностью, катализируют реакции без образования побочных продуктов, а сам процесс трансформации проводится в водных растворах при температуре 25-35°С.

Кроме того, наличие амидаз, стереоспецифичных как к L-, так и к Dизомерам, позволяет осуществлять выбор схемы процесса разделения рацематов аминокислот в зависимости от того, какой из двух оптических изомеров необходимо получить.

В связи с этим, поиск новых биокатализаторов стереоселективного гидролиза рацемических амидов, а также изучение их каталитических свойств и влияния внешних факторов на стереоизомерию образующихся продуктов является актуальной задачей биотехнологии.

Стереоселективность является определяющим свойством в гидролизе рацемических аминокислотных амидов. Известно, что большинство выделенных и охарактеризованных на данный момент амидаз проявляют Sселективность (Sharma et al., 2009). Однако стереоспецифичность ферментов не является строгой и зависит от ряда различных факторов таких, как рН реакционной среды, температура, метод иммобилизации фермента, структура субстрата. Несмотря на то, что амидазы выступают эффективными биокатализаторами стереоселективного гидролиза, в научной литературе практически не встречаются данные, касающиеся влияния различных факторов на их стереоселективные свойства.

Цель настоящего исследования – поиск новых штаммов бактерий, способных к стереоселективной биотрансформации амидов и изучение катализируемых ими процессов в гомогенных и гетерогенных системах.

Основные задачи исследования:

1. Выделить и селекционировать микроорганизмы, способные к стереоселективному гидролизу рацемических амидов.

2. Исследовать влияние различных факторов среды на рост и амидазную активность штаммов.

3. Изучить влияние ряда факторов реакционной среды (температуры, рН) и различных способов иммобилизации на стереоселективные и каталитические свойства амидаз.

4. Определить способность изолятов к стереоселективному гидролизу D,L-фенилглицинонитрила.

5. Исследовать способность активных изолятов к биотрансформации фенилаланинамида.

Состояние вопроса Первые попытки использования живых организмов для разделения рацематов аминокислот основывались на способности животных усваивать лишь один антипод. При скармливании или введении животному рацемической смеси аминокислоты из его мочи удавалось выделить не усвоившийся D-энантиомер аминокислоты (Wolgemuth, 1905; Kyokawa, 1933). Несмотря на очевидные недостатки: безвозвратную потерю половины исходного вещества, трудности выделения из смеси, содержащей целый ряд всевозможных органических соединений, получение в результате физиологически обычно менее активного, а, следовательно, и менее ценного D-энантиомера аминокислоты, - этот метод не потерял до сих пор своего значения. В 1976 году в Японии начали получать D-аминокислоты и их эфиры после действия на рацемическую смесь аминокислот клеток микроорганизмов: Mycoplasma, Protaminobacter, Acetobacter, Pseudomonas, Aeromonas, Xanthomonas и Bacillus. В результате этой процедуры L-изомер ассимилировался бактериями, а D-изомер выделялся из культуральной среды после отделения клеток центрифугированием.

Большой успех был достигнут при использовании отдельных ферментных препаратов различной степени очистки. В этом случае протекает только одна химическая реакция, и удается выделить оба энантиомера аминокислоты. Все ферментативные методы разделения рацематов аминокислот можно разделить на следующие группы, указанные в порядке возрастания их практической ценности и степени использования (Швядас,

Галаев, 1983):

1) специфические методы разделения рацематов, пригодные лишь для отдельных аминокислот (лизин, цистеин, ароматические аминокислоты);

2) стереоселективное окисление и декарбоксилирование аминокислот;

3) энантиоселективный синтез амидной связи;

4) стереоселективный гидролиз амидов и сложных эфиров аминокислот;

5) энантиоселективный гидролиз N-ацилированных аминокислот.

Первое промышленное применение ферментов для получения энантиомеров аминокислот относятся к 50-м годам. C 1954 года компания Tanabe Seiyaku Co., Osaka (Япония) начала применять метод энзиматической резолюции для промышленного получения L-аминокислот с помощью аминоацилаз (N-ациламинокислотных амидогидролаз) (Chibata et al., 1976). В 1969 году иммобилизованная аминоацилаза стала первым в мире примером успешного промышленного применения иммобилизованных ферментов (Chibata, 1978).

В 1973 году японская фирма «Toray Industry» предложила комбинированный или хемо-энзиматический способ получения L-лизина (Fukumura et al., 1978). Технология процесса включает в себя органический синтез D,L--амино--капролактама (циклического ангидрида лизина) из циклогексана и его ферментативный гидролиз с участием гидролазы аминокапролактама (рисунок 1). Данная технология ведет к образованию Lлизина с 95%-ным выходом и 99%-ной оптической чистотой. Гидролазу аминокапролактама синтезируют дрожжи Candida, Trichospora, Cryptococcus (Sano, 1978; Fukumura, 1974), фермент стимулируется катионами цинка, магния, марганца. Источником рацемазы аминокапролактама могут служить бактерии Flavobacterium, Achromobacter (Fukumura, 1977).

Рисунок 1 – Комбинированный или хемо-энзиматический способ получения L-лизина (Fukumura, 1974).

Стереоселективный гидролиз амидов аминокислот для разделения рацематов на оптические антиподы впервые был применен в 1978 году. Был запатентован способ получения L- и D--аминокислот путем биотрансформации рацемических -аминоамидов с помощью L-аминоациламидаз (Boesten et al., 1978). Причем -аминоамиды и их предшественники -аминонитрилы предполагалось получать химическим синтезом из смеси альдегид-цианид-аммоний (синтез Штрекера):

R-CHO + CN- + NH3 = R-CH-(CH2)-CN + H2O = R-CH-(CH2)-CO-NH2.

Было показано, что некоторые базидиомицеты (Strobel, 1966, 1967) и бактерии рода Corynebacterium (Fukuda et al., 1973), способны гидролизовать D,L--аминоамиды в смесь D--аминоамида и L--аминокислоты. Была предложена общая схема для синтеза оптически активных -аминокислот (рис. 2).

–  –  –

Maestracci с соавт. предложили использовать стереоселективные амидазы аминокислот вместе с рацемазой, которая превращает D-аминоамид в исходный рацемат (Maestracci et al., 1988).

Был предложен метод разделения D-аминокислотного амида и Lаминокислоты. В реакционную смесь добавляют один эквивалент бензальдегида, в результате формируется Шиффово основание с Dаминоамидом, который нерастворим в воде, и поэтому может быть легко отделен. Далее возможны два пути - ферментативный гидролиз Dбензальдегид аминоамида до D-аминокислоты или рацемизация Dбензальдегид аминоамида до D,L-амида аминокислоты (рисунок 3, А). Также была разработана методика для рацемизации и восстановления Lаминокислоты (рисунок 3, Б). В присутствии концентрированной кислоты с последующим добавлением аммония происходит конверсия L-аминокислоты в эфир. Добавление бензальдегида и рацемизация в щелочных условиях (рН=13) дает D,L-аминокислотный амид (Kamphuis et al., 1990).

Рисунок 3 – Схема получения L- и D--аминокислот: А – гидролиз и рацемизация D-аминокислотного амида, Б – рацемизация L-аминокислоты в рацемат (Kamphuis et al., 1990).

Стереоспецифический гидролиз амидов аминокислот с использованием амидаз – новый и совсем недавно коммерциализированный процесс ферментативного разделения рацематов. Поэтому сведения, касающиеся характеристики амидаз аминокислот, в настоящее время ограничены. В литературе имеется небольшое число работ, посвященных изучению амидаз, специфичных для L- или D-конфигурации аминокислот.

Амидаза, выделенная из клеток Mycobacterium neoaurum ATCC 25795, была впервые описана как фермент, проявляющий активность по отношению к L--алкил-замещенным амидам аминокислот (Hermes et al., 1994). Позднее была выделена и охарактеризована L-аминокислотная амидаза, выделенная из штамма Pseudomonas azotoformans IAM 1603. Фермент имел узкую субстратную специфичность, будучи активным только по отношению к Lпролинамиду, L-аланинамиду и L-метионинамиду (Komeda et al., 2004).

Штамм Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321 проявлял высокую амидазную активность по отношению к,-дизамещенным -аминокислотным амидам,

-амидам гидроксикислот и -N-гидроксиаминокислотным амидам со строгой L-селективностью (Sonke et al., 2005). Komeda и Asano описали Lстереоселективную аминокислотную амидазу штамма Brevundimonas diminuta TPU 5720, которая проявляла стереоселективность по отношению к широкому ряду L-амидов аминокислот, включая L-фенилаланинамид, Lглутаминамид, L-лейцинамид, L-метионинамид, L-аргининамид и амид L-2аминомасляной кислоты (Komeda et al., 2006).

Среди D-стереоспецифических амидаз одной из первых была выделена амидаза штамма Ochrobactrum antropi SV3, которая катализировала энантиоселективный гидролиз ряда ароматических амидов аминокислот, включая D-фенилаланинамид, D-тирозинамид и D-триптофанамид (Komeda et al., 2000).

Термостабильная D-стереоспецифическая аланинамидаза, выделенная из термофила Brevibacillus borstelensis BCS-1, использовалась для гидролиза D-аланинамида (Sung et al., 2000; Baek et al., 2002). D-аланинамид специфическая амидогидролаза, выделенная из штамма Arthrobacter sp. NJтакже катализировала энантиоселективный гидролиз D,L-аланинамида с энантиомерным выходом 99% (Ozaki et al., 1992). Образующийся в результате гидролиза D-аланин используется в качестве сырья в синтезе подсластителей.

С помощью штамма 16 осуществлен Delftia acidovorans стереоселективный гидролиз D-tert-лейцинамида до D-tert-лейцина, одной из наиболее ценных D-аминокислот, коммерческая стоимость которой составляет более 100 долларов за грамм. Было установлено, что аминокислотная последовательность D-стереоселективной аминокислотной амидазы Delftia acidovorans на 67,9% гомологична D-аминокислотной амидазе бактерии Variovorax paradoxus (Hongpattarakere et al., 2005; Krieg et al., 2002).

Hayashi с соавт. описали R-энантиоселективную амидазу Comamonas acidovorans, которая гидролизует D-лейцинамид и D-фенилаланинамид, но имеет низкую стереоселективность (Hayashi et al., 1997).

На сегодняшний день нерешенными остаются несколько проблем стереоселективной трансформации аминокислотных амидов: выход процесса составляет 50%, возникают трудности при разделении L--аминокислоты от D--аминоамида, а также рацемизация последнего (Maestracci et al., 1988).

Эти недостатки могут быть устранены путем изучения свойств аминокислотных амидаз, получением мутантных штаммов, иммобилизацией клеток или выделенного фермента.

Таким образом, поиск и характеристика бактерий – продуцентов амидаз аминокислот остается актуальной задачей биотехнологии. Новые данные о природе и свойствах этих ферментов и их продуцентов позволят разработать новые, а также усовершенствовать существующие процессы биотрансформации.

Научная новизна Селекционированы культуры бактерий способные к стереоселективному гидролизу амидов аминокислот. Разработаны и синтезированы праймеры, комплементарные нуклеотидным последовательностям генов, кодирующих известные D-аминокислотные амидазы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Впервые определено влияние различных факторов – состав культуральной среды, температура и рН реакционной среды – на стереоселективные свойства амидаз штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1. Изучено влияние иммобилизации на каталитические и стереоселективные свойства биокатализаторов на основе целых бактериальных клеток и выделенных амидаз. Оптимизированы условия процесса биотрансформации D,Lфенилглицинонитрила и L-фенилаланинамида.

Теоретическое и практическое значение работы Полученные экпериментальные данные расширяют представления о процессах стереоселективной трансформации амидов клетками бактерий.

Определено влияние различных факторов внешней среды на стереоселективные свойства амидаз. Установлено, что для проявления стереоселективности амидазы в гетерогенном катализе определяющим фактором является присутствие носителя, который изменяет соотношение образующихся изомеров, что может быть использовано для увеличения энантиомерной чистоты продуктов ферментативной реакции.

Показана возможность получения изомеров фенилглицина и фенилаланина при трансформации соответствующих амидов стереоселективными амидазами. Оптимизирована среда культивирования наиболее перспективного изолята Arthrobacter sp., выделенного с целью дальнейшего использования в качестве биокатализатора гидролиза рацемических амидов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы – продуценты амидаз R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 способны к стереоселективной трансформации D,L-лактамида с максимальным энантиомерным избытком 44 и 43% соответственно.

Иммобилизация клеток и оптимизация условий роста бактерий не дают увеличения энантиомерной чистоты продукта.

2. Иммобилизация амидазы методом ковалентной сшивки с активированным хитозаном приводила к повышению термо- и операционной стабильности; методом поперечно сшитых ферментных агрегатов - к повышению стереоселективности трансформации амидов.

3. Изученные штаммы трансформировали D,Lфенилглицинонитрил до L-фенилглицина с разной степенью стереоселективности, гидролизовали L-фенилаланинамид до Lфенилаланина.

Основные результаты Апробация работы и публикации диссертационной работы доложены и обсуждены на IV, V, VI, VII Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия» (Воронеж, 2011; Тверь, 2012;

Иркутск, 2013; Екатеринбург, 2014), Международной школе-конференции «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2014).

Результаты проведенных исследований опубликованы в 10 научных работах: 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, тезисы 6 докладов.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 17 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 189 наименований работ, в том числе 17 отечественных и 172 зарубежных автора.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер государственной регистрации 0120.0406511). Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ №13р_урал_а «Исследование стереоселективной биотрансформации амидов и сложных эфиров почвенными бактериями с применением энзимологических, метагеномных и геномных методов», 2013-2015 гг.

Личный вклад автора состоял в планировании и проведении экспериментов, критическом анализе полученных результатов. Автор участвовал в подготовке результатов работы к публикации и их представлении на научных конференциях.

Список принятых сокращений:

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГХ – газовая хроматография;

ЕД – единица активности фермента, мкмоль/мг/мин;

МПА – мясопептонный агар;

ОП – оптическая плотность;

ПСФА – поперечно сшитые ферментные агрегаты;

ПЦР – полимеразная цепная реакция;

ФГ – фенилглицин;

ФГА – фенилглицинамид;

ФГН – фенилглицинонитрил;

ее – энантиомерный избыток;

LB – среда Луриа-Бертани;

LBА – агаризованная среда Луриа-Бертани.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Амидазы – нитрилгидролизующие ферменты Амидазы – это ферменты, катализирующие гидролиз амидов до карбоновых кислот и аммония. Эти ферменты вовлечены в метаболизм азота и широко распространены в природе: обнаружены как в прокариотических, так и в эукариотических клетках (Fournand et al., 2001).

На основании аминокислотных последовательностей и структурных различий амидазы подразделяются на две группы: нитрилазное суперсемейство и семейство амидаз (amidase Ферменты signature).

нитрилазного суперсемейства существуют в растворе в виде гомотетрамерных и гомогексамерных комплексов и имеют консервативную каталитическую триаду глутамин-цистеин-лизин в активном центре.

Ферменты семейства амидаз формируют гомодимерные и гомооктамерные комплексы и отличаются наличием высококонсервативной последовательности из приблизительно 130 аминокислот, содержащей каталитическую триаду из лизина и двух остатков серина (Лавров, 2010;

Ohtaki et al., 2009). Субстратная специфичность сигнатурных амидаз шире, чем амидаз, нитрилазного суперсемейства, они способны гидролизовать наряду с алифатическими амидами также ароматические и разветвленные амиды – фенилацетамид, 2-фенилпропионамид, амид миндальной кислоты.

Часто эти амидазы обладают стереоселективностью (Chen et al., 2009).

Известно, что у прокариот амидазная активность часто сопряжена с метаболизмом нитрилов в нитрилгидратзно-амидазном пути гидролиза этих соединений. Однако алифатические амидазы встречаются и у бактерий, метаболизирующих нитрилы с участием нитрилаз, а также и у неспособных трансформировать эти соединения (Перцович, 2005).

1.1.1. Применение L- и D-энантиомеров аминокислот В последние годы ученые уделяют большое внимание исследованию свойств, путей получения и возможностей применения аминокислот. Эти вещества, из которых в природе строятся все растительные и животные белки, представляют огромный практический интерес. Традиционно аминокислоты применяют в качестве пищевых и кормовых добавок, в качестве медицинских и фармацевтических препаратов (Шпак, 1983).

В настоящее время энантиомерно чистые L- и D-аминокислоты все чаще выступают хиральными строительными блоками в производстве различных соединений. Так, L-аминокислоты являются предшественниками лекарственных препаратов, полусинтетических антибиотиков и физиологически активных пептидов (таблица 1).

D-аминокислоты используются в синтезе биологически активных молекул таких, как полусинтетические антибиотики, пептидные гормоны, пиретроидные инсектициды и подсластители (таблица 2).

Применение аминокислот постоянно расширяется и лимитируется только необходимой степенью очистки и высокой стоимостью производства.

Поэтому во всем мире ведутся исследования, направленные на создание и развитие методов производства этих соединений (Беликов, 1980).

Одним из перспективных путей получения оптически чистых аминокислот является использование отдельных ферментов. Так, амидазы, способные осуществлять стереоселективный гидролиз аминокислотных амидов, ведут к получению как L-, так и D-энантиомеров аминокислот (Schoemaker et al., 1992).

–  –  –

1.1.2. L-селективные аминокислотные амидазы К настоящему времени выделено и охарактеризовано пять Lаминокислотных амидаз, включая ферменты, выделенные из штаммов бактерий Mycobacterium neoaurum ATCC 25795, Pseudomonas azotoformans IAM 1603, Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321, Brevundimonas diminuta TPU 5720 и Xanthomonas flavus NR303 (таблица 3).

L-аминоамидаза ATCC 25795 катализировала M. neoaurum энантиоселективный гидролиз -Н- и -алкилзамещенных амидов аминокислот, проявляя самое высокое сродство по отношению к D,L-алилаланинамиду, D,L--метилфенилаланинамиду и D,L-метиллейцинамиду. На основании изучения ингибирования активности было сделано предположение, что L-аминоамидаза M. neoaurum ATCC 25795 является металлозависимым ферментом (Komeda et al., 2006).

L-амидаза Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321 конвертировала широкий ряд -Н- и,-дизамещенных -аминокислотных амидов. Кроме того, фермент катализировал гидролиз амида миндальной кислоты и Nгидроксифенилаланинамида (Sonke et al., 2005). L-амидаза O. anthropi – это металлофермент, так как его активность была ингибирована металлхелатирующими компонентами ЭДТА и фенантролином. Активность амидазы, ингибированной ЭДТА, восстанавливали ионы Zn2+ (до 80%), Mn2+ (до 400%) и Mg2+(до 560%) (Komeda et al., 2006).

L-аминокислотная амидаза Pseudomonas azotoformans IAM 1603 – фермент фермент с узкой субстратной специфичностью, проявлял активность только по отношению к L-пролинамиду, L-аланинамиду и L-метионинамиду (Komeda et al., 2004).

Komeda и Asano описали L-стереоселективную аминокислотную амидазу TPU 5720, которая проявляла Brevundimonas diminuta стереоселективность по отношению к широкому ряду L-амидов аминокислот, включая L-фенилаланинамид, L-глутаминамид, L-лейцинамид, Lметионинамид, L-аргининамид и амид L-2-аминомасляной кислоты.

Активность фермента была ингибирована ЭДТА и восстанавливалась в присутствии инов Co2+, поэтому было сделано предположение, что аминокислотная амидаза B. diminuta TPU 5720 – кобальтзависимый фермент (Komeda et al., 2006).

Asano с соавт. описали новую L-амидазу, выделенную из Xanthomonas flavus NR303, для ферментативного разделения D,L--метилцистеинамида (Inoue et al., 2005). Этот внутриклеточный фермент, названный McaA, был очищен, а кодирующий его ген клонирован. Было установлено, что ген mcaA кодирует белок из 355 аминокислот с молекулярной массой 38 кДа. Ген Lамидазы X. flavus был клонирован в E.coli JM109, клетки этого штамма были использованы для ферментативного разделения различных амидов карбоновых кислот. Фермент проявлял активность по отношению к -Н-аминокислотным амидам с L-стереоселективностю. При использовании рекомбинантных клеток был получен L--метилцистеин из E.coli соответствующего амида (40%-ная конверсия) с энантиомерным избытком более 98%.

Таблица 3 – Характеристика L-специфических амидаз различных микроорганизмов

–  –  –

1.1.3. D-селективные аминокислотные амидазы В научной литературе встречаются сведения о применении амидаз для стереоселективного синтеза ряда D-аминокислот. Катализируемый Dстереоспецифичными бактериальными амидазами гидролиз D-амидов аминокислот приводит к образованию ценных хиральных продуктов.

Ферменты, гидролизующие амиды D--Н-аминокислот, были выделены из разных микроорганизмов (таблица 4). Одним из первых таких ферментов была D-аланинамидаза Arthrobacter sp. NJ-26, выделенная японскими учеными компании Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Штамм был получен методом накопительной культуры на среде с D,L-аланинамидом в качестве единственного источника азота и D-циклосерином для ингибирования аланинрацемазы. Этот фермент обладал высокой активностью по отношению к D-аланинамиду (специфическая активность 1380 мкмольмг-1мин-1) и характеризовался очень узкой субстратной специфичностью. При использовании 10гл-1 сухой биомассы Arthrobacter sp.

NJ-26 и 2.4 моль D,L-аланинамида в 5-часовой реакции трансформации было получено 1.2 моль D-аланина с энантиомерным избытком более, чем 99% (Ozaki et al., 1992).

D-стереоспецифическая амидаза SV3 Ochrobactrum antropi катализировала энантиоселективный гидролиз ряда ароматических аминокислотных амидов, включая D-фенилаланинамид, D-тирозинамид и Dтриптофанамид. Ген, кодирующий данный фермент, был клонирован и экспрессирован в клетках E. coli. Было показано, что амидаза BFB40 была более термостабильна, чем фермент штамма дикого типа. C использованием фермента BFB40 был осуществлен почти полный гидролиз 1 М рацемического фенилаланинамида за 2 часа (Komeda et al., 2002).

Kula с соавт. обнаружили другую интересную D-амидазу (Krieg et al., 2005). Применяя метод накопительной культуры с D,L-tert-лейцинамидом в качестве единственного источника азота, были выделены три штамма, которые гидролизовали этот рацемический амид с D-стереоселективностью.

Амидаза Variovorax paradoxus DSM 14468 проявляла самую высокую активность, поэтому была тщательно изучена. D-амидаза V. paradoxus катализировала гидролиз не только широкого ряда -аминокислотных амидов, но и амидов карбоновых кислот, а также амидов -гидроксикислот.

Самая высокая активность была обнаружена по отношению к Dфенилаланинамиду – она была в 890 раз выше, чем к D-tert-лейцинамиду (Krieg et al., 2002). Ген, кодирующий эту D-амидазу, был клонирован и экспрессирован в E. coli (Krieg et al., 2005). Сравнение аминокислотной последовательности фермента с другими белками показало, что D-амидаза V.

paradoxus принадлежит к сигнатурному семейству амидаз, так как имеет в активном сайте каталитическую триаду Ser178, Ser154 и Lys81. В результате клонирования удалось повысить степень экспрессии D-амидазы в 120 раз. В ходе трансформации клетками E. coli в течение 4,5 часов было получено 700 мг D-tert-лейцина.

В литературе появились сообщения о новой D-стереоспецифической аминокислотной амидазе, последовательность которой на 67,9% оказалось гомологичной D-амидазе V. paradoxus. Это амидаза Delftia acidovorans, штамм был выделен из почвы методом накопительной культуры с Dфенилаланиамидом в качестве единственного источника азота. Фермент катализировал гидролиз ряда D-аминокислотных амидов, проявляя высокое сродство к субстратам с алифатическими или ароматическими боковыми цепями, такими как D-фенилаланинамид, D-триптофанамид, D-норвалинамид и D-лейцинамид. Было установлено, что D-амидаза D. acidovorans представляет собой белок из 466 аминокислотных остатков с молекулярным весом 49 кДа и принадлежит к сигнатурному семейству амидаз (Hongpattarakere et al., 2003; 2005).

D-амидазная активность была обнаружена у штамма Brevibacterium iodinum TPU 5850. Амидаза проявляла активность к широкому ряду Dаминокислотных амидов, включая D-фенилаланинамид, D-метионинамид, Dлизинамид, D-глутаминамид, D-тирозинамид, D-аргининамид, Dлейцинамид, D-пролинамид и D-аланинамид. Фермент B. iodinum TPU 5850 катализировал процесс ферментативного разделения D,L-фенилаланинамида (180мМ) в течение 3 часов с образованием D-фенилаланина (ее=99,5%) (Komeda, Asano, 2008).

У термофила Brevibacillus borstelensis BCS-1 были идентифицированы две высоко термостабильные D-аминокислотные амидазы. Dметионинамидаза эффективно гидролизовала широкий ряд Dаминокислотных амидов, самая высокая активность наблюдалась по отношению к D-метионинамиду (100%), D-норвалину (78%), D-норлейцину (77%), D-лизину (60%) и D-лейцину (59%). С использованием этого фермента из рацемического амида был получен D-фенилаланин с энантиомерным избытком 97,1% (Baek et al., 2003).

D-аланинамидаза B. borstelensis BCS-1 проявляла очень высокую активность по отношению к D-аланинамиду (активность к D-метионинамиду составляла только 6,3% от вышеупомянутой), но фермент также эффективно гидролизовал ароматические, алифатические и разветвленные аминокислотные амиды. рН-оптимум и термооптимум составили 9.0 и 85°С соответственно. Фермент полностью восстанавливал свою активность после 30 минут инкубации при 70°С. Ингибиторами выступили дитиотрейтол, меркаптоэтанол и ЭДТА, активаторами – Co2+ и Mn2+. Ген D-аланинамидазы был клонирован в E. coli. При использовании клеток рекомбинантного штамма 0,2 М D,L-фенилаланинамид был трансформирован до Dфенилаланина, причем степень конверсии составила более 99%, энантиомерный избыток 97% (Baek 2003).

et al., Таблица 4 – Характеристика D-специфических амидаз различных микроорганизмов

–  –  –

1.2. Биотрансформация субстратов иммобилизованными амидазами Иммобилизация – это процесс прикрепления ферментов к поверхности природных или синтетических материалов, включение их в полимерные материалы, полые волокна и мембранные капсулы, поперечная химическая сшивка.

Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при их использовании в прикладных целях по сравнению с нативными предшественниками (Березин, 1987).

Во-первых, гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной среды, что дает возможность получать продукт, не загрязненный ферментом, и использовать катализатор повторно.

Во-вторых, иммобилизованные ферментные системы благодаря способности к длительному функционированию позволяют проводить ферментативный процесс непрерывно.

В-третьих, иммобилизация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности, зависимости каталитической активности от параметров среды и, что очень важно, его стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям.

Применение иммобилизованных ферментов является сегодня одним из важнейших и динамично развивающихся разделов современной биотехнологии (Тишков, 2008).

1.2.1. Иммобилизация клеток с амидазной активностью В отличие от данных, касающихся иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов с нитрилгидратазной и нитрилазной активностью, в научной литературе встречается немного сведений о получении и изучении свойств иммобилизованных биокатализаторов, обладающих амидазной активностью. Основное внимание исследователей уделяется включению содержащих амидазу клеток микроорганизмов в структуру гелей, среди которых альгинат, агар, полиакриламид, поливиниловый спирт/альгинат (Chand et al., 2004; Sogani et al., 2012).

Так, клетки Delftia tsuruhatensis CCTCC M205114, инкапсулированные в альгинат кальция, осуществляли энантиоселективный гидролиз (R)-2, 2диметилциклопропанкарбоксамида из рацемической смеси, приводя к аккумуляции S-амида, являющегося ключевым интермедиатом циластатина (Wang et al., 2010). Клетки Pseudomonas putida MTCC 6809, включенные в структуру геля альгината кальция, использовали как продуцент амидазы (Chacko et al., 2012). Образование никотиновой кислоты из никотинамида, катализируемое амидазой Microbacterium imperiale CBS 498-74, изучали в мембранном реакторе с перемешиванием (Cantarella et al., 2008). Клетки P.

aeruginosa, содержащие амидазу, иммобилизовали методом обращенных мицелл в системе катионного сурфактанта бромида тетрадецилтриметил аммония в гептане/октаноле (Bernardo et al., 2013). Клетки Pseudomonas aeruginosa L10, иммобилизованные в гранулы альгината натрия и поливинилового спирта, использовали в гидролизе ацетамида (Vieira et al., 2011).

Целые клетки Rhodococcus equi A4, проявляющие нитрилгидратазную и амидазную активность, были иммобилизованы в гранулах гидрогеля сополимера поливинилового спирта и полиэтиленгликоля LentiKats®.

Полученный иммобилизованный биокатализатор был использован для биотрансформации бензонитрила, 3-цианопиридина, (R,S)-3-гидрокси-2метиленбутанонитрила и (R,S)-гидрокси-2-метилен-3-фенилпропанонитрила до соответствующих кислот (Kub et al., 2006).

Клетки Rhodococcus sp. AJ270 иммобилизовали методом адсорбции на анионообменной смоле марки Amberlite и Dowex, а также включением в гели агара и агарозы. Оба способа иммобилизации повышали термостабильность амидазы Rhodococcus sp. AJ270 в 3-4 раза. Клетки, инкапсулированные в гранулы агара, проявляли амидазную активность, которая была в 8 раз выше у клеток, адсорбированных на Dowex (Colby et al., 2000).

1.2.2. Иммобилизация выделенных амидаз Сведения, касающиеся иммобилизации изолированной амидазы, немногочисленны. Для иммобилизации амидазы применяли включение в гели полимеров синтетического и природного происхождения, адсорбцию, ковалентное присоединение к носителю, образование поперечно-сшитых ферментных агрегатов. Термостабильная амидаза Geobacillus pallidus RAPc8, Eupergit®С иммобилизованная в гранулы полиакрилатного полимера (Degussa Rhm Gmbh&Co, Германия), катализировала D-селективный гидролиз лактамида. При этом сохранялось до 80% амидазной активности, и была отмечена высокая степень связывания фермента с гранулами Эупергита (Makhongela et al., 2007). Пенициллинамидаза, иммобилизованная в гранулы полимера Эупергит, была использована в промышленном масштабе (Cacaval 2012). Конъюгированная с декстраном et al., пенициллинамидаза была ковалентно связана с активированными аминогруппами диоксидом кремния, что способствовало увеличению ее термостабильности (Burteau et al., 1989). Коиммобилизованная на колонке из бутилсефарозы амидаза Rhodococcus erythropolis совместно с нитрилазой Aspergillus niger осуществляли гидролиз 4-цианопиридина в изоникотиновую кислоту (Vejvoda et al., 2006). Поперечно-сшитые ко-агрегаты амидазы R.

erythropolis и бычьего сывороточного альбумина, образованные осаждением сульфатом аммония и поперечной сшивкой глутаровым альдегидом, оставались стабильными при повышении температуры до 50°С и в диапазоне рН от 5 до 12 (Park et al., 2010).

Таким образом, иммобилизация, как целых клеток, так и ферментного препарата приводит к повышению стабильности фермента и, следовательно, к многократному увеличению количества продукта реакции.

1.3. Факторы, влияющие на стереоселективность ферментов Стереоселективность – преимущественное образование в химической реакции одного стереоизомера над другим. Если образующиеся стереоизомеры являются энантиомерами, то данное явление называется энантиоселективностью, если стереоизомерные продукты являются диастереомерами – диастереоселективностью. Количественно стереоселективность выражается при помощи энантиомерного избытка, который определяется уравнением:

, где Х и У – доли энантиомеров. Таким образом, энантиомерный избыток – это мера превышения количества одного энантиомера над другим.

Ферменты обладают исключительно высокой регио- и энантиоселективностью, катализируют реакции с образованием оптически активных соединений. Однако выход целевого продукта и его оптическая чистота зависят от условий, в которых протекает стереоселективная реакция (Потапов, 1988).

Структура субстрата Наиболее важным фактором для проявления селективности фермента является структура субстрата, его ориентация в активном сайте. На соотношение энантиомеров также влияет концентрация субстрата (Kinoshita, 1996).

Изучено влияние заместителей и их положение на энантиоселективность амидазы. Wu с соавт. исследовали асимметричный гидролиз,-дизамещенных малонамидов до энантиомерно чистых R-,дизамещенных малоновых кислот с использованием штамма Rhodococcus sp.

CGMCC. Оказалось, что среди субстратов с ароматическим кольцом в качестве заместителя в орто-, мета- или пара-положении самая высокая величина энантиомерного избытка наблюдалась в результате гидролиза субстратов с заместителем в пара-положении (Wu, Li, 2003).

Структура субстрата может вызвать инверсию стереоселективности фермента. Например, фермент Ochrobactrum anthropi LMG7991 известен как L-аминопептидаза/D-аланинэстераза/амидаза, гидролизующий Dконфигурации аланиновых субстратов (аланин-р-нитроанилид, аланинамид и метиловый эфир аланина), по отношению к ди- и трипептидам проявляет Lстереоспецифичность. Липазы Rhizomucor miehei и Humicola lanuginose проявляли разную энантиоселективность к эфирам 2-метилдекановой кислоты. Оба фермента гидролизовали преимущественно S-энантиомер 1гептил 2-метилдеканоата и в то же время R-энантиомер фенил 2метилдеканоата (Holmquist et al., 1993).

Пенициллинчувствительные D-пептидазы проявляют строгую Dспецифичность к ди- и трипептидам. Также эти ферменты гидролизуют различные эфиры и их аналоги. Так, D-пептидаза Actinomadura R39 гидролизовала тиоловые эфиры, чьи С-терминальные группы находились в L-конфигурации (Damblon et al., 1995).

Состав реакционной среды Естественной средой для ферментов являются водные растворы, где фермент поддерживает свою нативную конформацию и природную активность. Однако некоторые субстраты нерастворимы в воде, поэтому в качестве реакционной среды используют органические растворители, в различной степени обводненные (Klibanov, Cambou, 1987). Необходимым условием биокатализа в органической среде является сохранение активной конформации фермента. Взаимодействие субстрата и растворителя может вызвать снижение родства субстрата к активному сайту фермента, что приведет к значительному снижению ферментативной активности (Bell et al., 1995; Klibanov, 1997). Кроме того, в органической среде фермент гидратируется не полностью, он может сформировать ригидную структуру, что также приведет к снижению его активности (Zaks, Klibanov, 1988; Broos 1995). Повысить гидратацию фермента, а, следовательно, et al., ферментативную активность и энантиоселективность, можно добавлением небольших количеств воды к органическим растворителям.

Различные растворители могут оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на ферментативную активность, стабильность и селективность, это зависит от субстрата, фермента и реакционной среды (Kitaguchi 1989; Fitzpatrick, 1991). Было показано, что et al., энантиоселективность липазы, была выше при использовании алифатических растворителей, чем при использовании ароматических (Nakamura et al., 1995). Присутствие органического растворителя в среде может также привести к полной потере энантиоселективных свойств фермента (Tawaki, Klibanov, 1992; Wescott, Klibanov, 1993).

Таким образом, влияние растворителя является решающим в энзиматической реакции. Многие авторы пытаются связать изменение энзиматической селективности с физико-химическими свойствами растворителя такими, как диэлектрическая константа и дипольный момент.

Однако невозможно вывести какое-либо общее правило, которое объясняло бы корреляцию между этими параметрами и селективностью фермента.

Систематические исследования реакции этерификации в присутствии различных растворителей, катализируемой липазой Burkholderia cepacia, показали, что влияние одного и того же растворителя на разные субстраты различно. Другими словами, лучший растворитель для одного субстрата будет худшим для другого (Carrea et al., 1992).

Кроме того, исследования корреляции между физико-химическими свойствами растворителя привели к появлению трех теорий, объясняющих влияние органической среды на селективность фермента. Первая предполагает, что селективность может измениться, если молекулы растворителя связываются с активным центром фермента, поэтому меняется взаимодействие между ферментом и субстратом (Secundo et al., 1992;

Nakamura et al., 1991). Вторая теория предполагает, что растворитель может модифицировать конформацию фермента, тем самым изменяя способ процесса молекулярного распознавания субстрата ферментом (Wu et al., 1991). Третья теория предполагает зависимость селективности от энергетики растворения субстрата (Ke et al., 1996; Wescott et al., 1996).

Температура и рН Температура и рН оказывают значительное влияние не только на активность фермента, но и на его энантиоселективность.

Wang с соавт. показали, что путем изменения рН среды можно добиться повышения энантиомерной чистоты получаемого продукта.

Изменение рН буфера с 7.62 до 7.13 привело к повышению энантиоселективности нитрилазы, которая катализировала гидролиз D,Lфенилглицинонитрила (Wang et al., 2001).

В другой работе авторы продемонстрировали влияние температуры на энантиоселективность. Понижение температуры реакции с 30° до 20°С приводило к увеличению энантиоселективных свойств фермента Rhodococcus sp. AJ270, катализировавшего синтез оптически активной 2,2диметилциклопропановой кислоты (Wang et al., 2002).

Стереоспецифичность амидазы D. tsuruhatensis ZJB-05174 оказалась полностью зависимой от температуры. С повышением температуры реакции с 30° до 46°С наблюдали снижение энантиоселективности фермента в 5 раз.

Когда температура достигла 56°С, фермент потерял стереоспецифичность (Zheng et al., 2012). Это явление можно объяснить влиянием температуры на свободную энергию активации энантиомеров, которая подразделяется на энтальпический и энтропический компоненты (Pepechalov et al., 2001).

Влияние иммобилизации Данных о влиянии иммобилизации на стереоселективные свойства ферментов имеется немного. В результате иммобилизации селективность может повышаться, снижаться или оставаться неизменной. Очевидно, что каждый специфичный фермент будет вести себя по-разному, каждый способ иммобилизации будет давать различный эффект.

Показано снижение энантиоселективных свойств нитрилазы DSMZ, катализирующей гидролиз рацемического Alcaligenes faecalis манделонитрила, при иммобилизации фермента путем включения в альгинатные гранулы (Kaul et al., 2006), тогда как получение поперечносшитых ферментных агрегатов того же штамма приводило к стабилизации энантиоселективности и температурной устойчивости (Kaul et al., 2007).

Энантиоселективное ингибирование Некоторые ингибиторы, связываясь с аллостерическим участком фермента, вызывают конформационные перестройки в его активном сайте. В результате активность и селективность фермента может снижаться или повышаться. Например, декстрометорфан и левометорфан увеличивали энантиоселективность липазы Candida rugosa. Эти соединения ингибировали трансформацию одного энантиомера, что приводило к увеличению скорости трансформации другого энантиомера (Guo, Sih, 1989). Было обнаружено, что L-метионинол повышал скорость гидролиза R-энантиомера 3ацетоксинитрилов, катализируемого липазой Pseudomonas sp., тогда как гидролиз S-энантиомера он ингибировал. Можно сделать предположение, что субстрат и L-метионинол были связаны с ферментом в разных сайтах, и конформационные изменения, происходящие в результате связывания с Lметионинолом, вызвали изменение сродства фермента по отношению к субстрату (Itoh et al., 1991).

Таким образом, стереоселективность является не только специфическим свойством фермента, но и результатом влияния различных факторов среды, таких, как рН, температура, метод иммобилизации фермента, структура субстрата.

1.4. Энантиоселективная биотрансформация D,Lфенилглицинонитрила Энантиомеры фенилглицина являются ключевыми интермедиатами в синтезе полусинтетических антибиотиков. Некоторые пенициллины и цефалоспорины содержат D-фенилглицин (ампициллин и цефалоспорин) (рисунок 4) и D-гидроксифенилглицин (амоксициллин) в качестве боковых цепей (рисунок 5) (Alonso et al., 2007; 2008; Bruggink, 2001). Эти неприродные аминокислоты обладают высокой устойчивостью к протеолитическому воздействию, тем самым препятствуют развитию бактериальной резистентности.

L-фенилглицин также является важным строительным блоком для получения некоторых антибиотиков (Liu et al., 2014), интермедиатом в синтезе медицинских и фармацевтических препаратов, например, таксола – противоракового препарата (Hensel et al., 2002). L-фенилглицин – стартовый материал для получения метилового эфира L-аспартил-L-фенилглицина, который используется в качестве сахарозаменителя (Moriarty et al., 1976).

Рисунок 4 – D-фенилглицин в составе А – ампициллина, Б – цефалексина (Bruggink, 2001).

Рисунок 5 – D-p-гидроксифенилглицин в составе амоксициллина (Alonso et al., 2007).

Для получения L- или D-энантиомеров фенилглицина возможны два пути: химический синтез с последующим разделением рацемической смеси и энантиоселективная биотрансформация предшественников.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Похожие работы:

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«ИВАНОВ Сергей Иванович Особенности воспроизводства атлантического лосося (Salmo salar L.) в озерно-речной системе реки Шуя (Республика Карелия) Специальность 03.02.06 – ихтиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«МАКАРОВ Андрей Олегович Оценка экологического состояния почв некоторых железнодорожных объектов ЦАО г. Москвы специальность 03.02.13 – «почвоведение» и 03.02.08 – «экология» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук, Яковлев А.С. кандидат биологических наук Тощева Г.П. Москва 201 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О...»

«Минаева Наталья Викторовна Отдаленные последствия высокодозной химиотерапии и аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами 14.01.21 – гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Толмачева Алла Викторовна УДК 633.34:551.АГРОКЛИМАТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА УСЛОВИЙ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ СОИ В УКРАИНЕ 11.00.09 – метеорология, климатология, агрометеорология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: Полевой Анатолий Николаевич, доктор географических наук, профессор Одесса – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ РАЗДЕЛ І. БИОЛОГИЧЕСКИЕ...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Лямина Наталья Викторовна УДК 591.148:574.52(262.5) ДИНАМИКА ПАРАМЕТРОВ ПОЛЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В ЧЁРНОМ МОРЕ И ИХ СОПРЯЖЁННОСТЬ С ФАКТОРАМИ СРЕДЫ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., профессор Ю. Н. Токарев Севастополь 2014 г. СОДЕРЖАНИЕ Стр. ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ. ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ ИСТОРИЯ...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«Никитенко Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Борок – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 ГЛАВА 2. ФИЗИКО–ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНОВ...»

«ТРИФОНОВА Кристина Эдуардовна Особенности распределения штамма мезенхимальных стволовых клеток в условиях опухолевого роста после сингенной трансплантации мышам линии C57BL/6 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата...»

«СЛАДКОВА Евгения Анатольевна ЦИТОАРХИТЕКТОНИКА И СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ У ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ (ДОНОРОВ) И ПРИ РАЗВИТИИИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ НА ОСНОВЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ДЯТЛОВА ВАРВАРА ИВАНОВНА ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Специальность: 03.02.03 – микробиология. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Регузова Алёна Юрьевна Исследование специфической активности полиэпитопных Т-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«БУЛГАКОВА МАРИНА ДМИТРИЕВНА КАТАЛЕПТОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ГАЛОПЕРИДОЛА У КРЫС И ЕЕ ИЗМЕНЕНИЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЯИЧНИКОВ И НАДПОЧЕЧНИКОВ 14.03.06 Фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:...»

«Шемякина Анна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BETULA L. 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесникова Р.Д. Хабаровск – 20 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1.1 Общие...»

«ЕГОРОВА Ангелина Иннокентьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У МУЖЧИН КОРЕННОЙ И НЕКОРЕННОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ ЯКУТИИ В РАЗНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Д.К....»

«Чечулова Анна Васильевна ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ НАСЛЕДСТВЕННЫХ И ПРИОБРЕТЕННЫХ ФАКТОРОВ РИСКА ВЕНОЗНОГО ТРОМБОЭМБОЛИЗМА У ПАЦИЕНТОВ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА 14.01.21 – гематология и...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.