WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 |

«ИССЛЕДОВАНИЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ И КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПРИ АНАЛИЗЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ ОСНОВНОГО ХАРАКТЕРА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Фомин Анатолий Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА

БУМАГЕ И КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПРИ АНАЛИЗЕ

АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ ОСНОВНОГО ХАРАКТЕРА В

БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Пермь – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант: доктор фармацевтических наук, профессор Хомов Юрий Александрович

Официальные оппоненты:

Ярыгина Татьяна Ивановна, доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры фармацевтической химии факультета очного обучения ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Нохрин Дмитрий Фокеевич, доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармацевтической химии ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Гейн Людмила Федоровна, доктор фармацевтических наук, доцент, заведующий кафедрой общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «25» декабря 2012 г. в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу:

614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Крупская, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru, «24» сентября 2012 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации http://www.pfa.ru «24» сентября 2012 г.

Автореферат разослан «__» _______ 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 208.068.01, кандидат фармацевтических наук, доцент

–  –  –

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Азотсодержащие соединения основного характера (АССОХ), как вещества обладающие сильным физиологическим действием, находят широкое применение в современной медицинской практике.

Вместе с тем, во многих развитых странах отмечается резкое увеличение количества острых и хронических отравлений, возникновение аллергических состояний при определённых условиях под воздействием лекарственных препаратов, в том числе АССОХ. В нашей стране эта проблема является также, актуальной. Диагностика отравлений представляет большие трудности, так как клиническая, патологоанатомическая и гистологическая картина при интоксикации АССОХ, как правило, не характерны. Поэтому основным доказательством причины интоксикации являются результаты химико-токсикологического исследования.

В то же время, в клинической хирургической практике в ряде случаев возникает потребность в проведении лабораторного анализа АССОХ в биологических средах.

Несмотря на значительное число работ, посвященных анализу АССОХ, до настоящего времени продолжают оставаться актуальными вопросы исследования в области разработки новых и дальнейшего совершенствования существующих методик их химико-токсикологического анализа. Эта проблема может быть успешно реализована при применении различных скрининговых систем и широком использовании современных физикохимических методов анализа на базе отечественного приборного обеспечения.

В анализе АССОХ в биологическом материале широко используются скрининговые программы, с применением метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). Вместе с тем, применение ТСХ-скрининга в химикотоксикологических лабораториях может быть затруднено из-за отсутствия набора дефицитных общих и частных систем растворителей, модифицированных хроматографических пластин.

В последние десятилетия пристальное внимание уделяется электромиграционным методам анализа веществ.

Электрофорез на бумаге является эффективным и родственным ТСХ (планарных) методом очистки органических соединений, сочетающийся с последующим обнаружением и идентификацией их на электрофореграмме (ЭФГ), при исследовании биологических объектов.

Метод отличается, также, простым аппаратурным оформлением, доступными расходными реактивами и материалами, длительной сохранностью проявленных ЭФГ.

В тоже время, он не изучен в варианте электрофореза-скрининга с целью проведения ненаправленного химико-токсикологического (судебнохимического) исследования биологического материала на неизвестный яд, а также при анализе фальсифицированных лекарственных средств.

Одним из современных и перспективных подтверждающих электромиграционных методов является капиллярный электрофорез, характеризующийся высокой эффективностью (превышающий ВЭЖХ в сотни тысяч раз), сочетанием разделения веществ ионогенной и нейтральной природы, с последующей их детекцией в УФ-области спектра непосредственно в кварцевом капилляре.

Однако, необходимо отметить, что его возможности, применительно к системному химико-токсикологическому и (судебно-химическому) лабораторному клиническому исследованию АССОХ, не изучены.

Цель и задачи исследования. Теоретическое и экспериментальное обоснование аспектов применения электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза, с целью расширения их возможностей как аналитических методов при системном анализе азотсодержащих соединений основного характера (АССОХ) в биологических объектах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Теоретически обосновать и экспериментально подтвердить 1.

оптимальные условия предварительного (скринингового) обнаружения АССОХ методом электрофореза на бумаге.

Разработать условия идентификации 2. (подтверждающего исследования) АССОХ методом капиллярного электрофореза.

Изучить ионный состав АССОХ в зависимости от pH среды 3.

методом капиллярного электрофореза.

4. Обосновать возможность идентификации по электрофоретическим спектрам (ЭФС) и определения величин pKa АССОХ методом капиллярного элетрофореза.

5. Изучить влияние соэкстрактивных веществ в составе биологических объектов (мочи, крови, ткани печени) на условия предварительного (скринингового) обнаружения и идентификации (подтверждающего исследования) АССОХ методами электрофореза.

6. Разработать на базе электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза экспрессные и чувствительные методики количественного определения АССОХ в биологических объектах.

7. Привести схему системного анализа АССОХ в биологических объектах, с использованием на 1 этапе электрофореза-скрининга (на базе электрофореза на бумаге) и подтверждающего исследования (на базе капиллярного электрофореза).

8. Изучить пригодность разработанных методик предварительного обнаружения, идентификации исследования) и (подтверждающего количественного определения АССОХ методами электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза для химико-токсикологической практики и клинической лабораторной диагностики.

Научная новизна. Впервые теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность системного анализа, на базе электромиграционных методов (электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза) лекарственных веществ, выделенных из биологических объектов.

При этом предложена методика электрофореза-скрининга изучаемых АССОХ, как в виде субстанций, так и выделенных из биологических объектов, для применения в системном ходе анализа лекарственных веществ.

В результате проведённых исследований по сравнительному электрофоретическому разделению АССОХ предложены оригинальные системы электролитов и показаны возможности использования их для скрининг-анализа.

Установлены условия идентификации (подтверждающих исследований) АССОХ с помощью электрофоретических спектров (ЭФС) на базе капиллярного электрофореза.

Показана эффективность предлагаемого маркера электроосмотического потока (ЭОП) – бензилового спирта при изучении исправленного времени миграции аналитов (tи), построения ЭФС по tи и расчёта на их основе pKa величин АССОХ.

Изучено ионное состояние АССОХ в зависимости от pH среды, с использованием капиллярного электрофореза.

Предложен способ количественной характеристики ЭФС АССОХ, выделенных из биологических объектов (tи, pKa).

Показана возможность ЭФС - идентификации АССОХ в жидких средах и внутренних органах экспериментальных животных, в экспертном материале, с использованием электрофоретических методов.

Разработаны экспрессные и чувствительные методики количественного определения ряда АССОХ в биологических объектах на основе капиллярного электрофореза.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования В рамках общего совершенствования химико-токсикологического анализа на основе принципов комплексного использования электромиграционных методов на бумаге, капиллярного электрофореза) (электрофореза разработаны методики системного (ненаправленного) анализа АССОХ в биологических объектах, позволяющих сократить время проведения экспертиз, и обеспечивающих универсальность и более эффективное решение судебно-химических задач.

С помощью разработанных методик может проводится определение АССОХ в биологических субстратах в условиях клиники, с целью оптимизации режима дозирования препаратов.

Результаты проведённых исследований рекомендованы для внедрения и используются в судебно-медицинской практике, в химикотоксикологических лабораториях медико-профилактических и наркологических центров.

Материалы исследования вошли в монографию «Электрофорез в анализе лекарственных азотсодержащих веществ основного характера с.)»; методическое пособие лечение острой (100 «Комплексное хирургической инфекции мягких тканей с синдромом системной реакции на воспаление (36 с.)».

Отдельные фрагменты диссертационной работы внедрены в практику бюро судебно-медицинской экспертизы, химико-токсикологических лабораторий наркологических больниц городов Ярославля, Перми, ЙошкарОла, в учебный процесс фармацевтических факультетов медицинских ВУЗов городов Ярославля, Тюмени, Кемерово.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на съездах, конференциях, совещаниях с опубликованием материалов: на Третьей Всесоюзной конференции по фармакокинетике «Современное состояние и перспективы развития фармакокинетики», Москва, 1991 г.; на VII Научно-практической конференции хирургов Федерального управления Саратов, г.; на «Медбиоэкстрем», 2004 конференции хирургов России, посвящённой 100-летию со дня рождения профессора В.С. Семёнова, Тверь, 2004 г.; на X съезде медицинских и фармацевтических работников Ярославской области, Ярославль, 2003 г.; на межвузовской научно-практической конференции с международным участием, Ярославль, 2004 г.; на межрегиональной научно-практической конференции, Ярославль, 2005 г.; на научных конференциях Ярославской государственной медицинской академии, 1994-2012 г.г.

В полном объёме результаты диссертационного исследования доложены на межкафедральной конференции фармацевтического факультета Ярославской государственной медицинской академии, 2012 г.

Личный вклад автора. Для получения результатов, изложенных в диссертации, автор лично изучил электрофоретические свойства 48 АССОХ методом электрофореза.

Предложил на этой основе схему системного анализа исследуемых оснований, включающую: разработанные автором методики предварительного (скринингового) обнаружения методом электрофореза на бумаге и идентификации исследования) методом (подтверждающего капиллярного электрофореза, как стандартных образцов, так и в присутствии соэкстрактивных веществ биологических объектов; методики количественного определения ряда АССОХ с использованием электрофорезо-спектрофотометрии, капиллярного электрофореза в растворах стандартных образцов, биологических объектах, экспертном материале и выполнил валидацию предложенных методик; провел лабораторные исследования доксициклина, артикаина с помощью разработанных электрофоретических методик идентификации и определения в биологических средах организма в условиях клиники при хирургических вмешательствах под местной анестезией и при антибиотикотерапии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 31 работа, из них 12 – в журналах Перечня ВАК РФ.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО ЯГМА Минздравсоцразвития (номер государственной регистрации 01201052735).

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 325 страницах машинописного текста, содержит 69 таблиц, 52 рисунка.

Работа состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы, включающего 316 источников, из них 223 на иностранных языках и приложения. В приложении представлены материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований: акты внедрения, информационное письмо («Химико-токсикологический анализ артикаина в моче капиллярным электрофорезом»).

Основные положения, выносимые на защиту.

На защиту диссертационной работы выносятся следующие результаты теоретических и экспериментальных исследований:

- результаты исследований по разработке ненаправленного (системного) метода анализа лекарственных веществ из группы АССОХ в биологических объектах, с использованием электромиграционных методов (электрофореза на бумаге, капиллярного электрофореза);

теоретическое изучение и экспериментальное подтверждение по сравнительной характеристике разделительной способности электролитов при проведении электрофореза-скрининга и внутригрупповой ЭФС – идентификации АССОХ методом электрофореза на бумаге;

результаты исследований по возможности идентификации подтверждающего исследования) АССОХ методом капиллярного электрофореза по ЭФС tи и их количественным характеристикам (pKa, Pi – внутреннему коэффициенту);

–  –  –

2. Объекты и методы исследования

В эксперименте были использованы объекты исследования:

- рабочие стандартные образцы азотсодержащих соединений основного характера (48 представителей), отвечающие требованиям НД;

- модельные смеси биоматериалов;

- внутренние органы и биологические жидкости лабораторных животных (моча, кровь, печень, почки, легкое, желудок, тонкий кишечник кроликов);

- клинические биологические субстраты (кровь, моча, мышечная ткань);

- экспертный биологический материал.

Оборудование и средства измерений Для разработки методики электрофореза-скрининга группы АССОХ использовали электрофорез на бумаге: прибор «ПВЭФ-1», с камерой для горизонтального электрофореза, без охлаждения полос бумаги; носитель – хроматографическая бумага марки «С», «ФН-15».

Для проведения измерений методом капиллярного электрофореза использовали приборы:

встроенный спектрофотометрический детектор

- «Капель-105», («Люмекс», г. Санкт-Петербург), программа записи и обработка данных «МультиХром для Windows» (ЗАО «Амперсенд», Россия), методика программа Данных аттестованная Государственным «База – 2003», комитетом РФ по стандартизации и метрологии в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 и ГОСТ Р ИСО 5725-2002;

спектрофотометрический детектор

- «Нанофор-01», (СанктПетербургский институт аналитического приборостроения РАН), зарегистрирован в Государственном реестре средств измерений (№ 22828Для проведения измерений методом ГХ-МС использовали газовый хроматограф Agilent 7890 А с масс-селективным детектором (Agilent Technologies (USA)), программно-аппаратный комплекс включает в себя базу данных NIST®2005.

3. Предварительное (скрининговое) обнаружение и идентификация (подтверждающее исследование) АССОХ методами электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза В настоящее время, вопросы связанные с разработкой новых эффективных методов очистки токсических веществ, в сочетании с предварительным (скрининговым) обнаружением их при ненаправленном химико-токсикологическом исследовании (судебно-химическом) биологического материала, являются актуальными.

Одним из эффективных методов очистки извлечений из биологического материала и последующего обнаружения токсикантов непосредственно на электрофореграмме (ЭФГ) является электрофорез на бумаге. Однако он не изучен в варианте электрофореза-скрининга.

В качестве подтверждающего метода, при системном химикотоксикологическом доказательстве ряда АССОХ, нами предложен интенсивно развивающийся в последние годы новый вариант разделения сложных смесей с высокой эффективностью – капиллярный электрофорез.

Условия предварительного (скринингового) обнаружения АССОХ методом электрофореза на бумаге. Разработаны оптимальные условия предварительного этапа электрофореза-скрининга АССОХ, с использованием электрофореза на бумаге: «ПВЭФ-1», носитель – хроматографическая бумага марки «С»; напряжение – 400 В, время электрофореза – 1 час; детектор – реактив Драгендорфа, модифицированный по Мунье.

На примере ряда АССОХ представителей, содержащих

– 12 первичные-, вторичные-, третичные аминогруппы, в том числе и атомы азота в составе гетероциклических структур установлено, что наблюдаемые электрофоретические подвижности исследуемых соединений характеризуются достаточно широким диапазоном величин ДПФ см, позволившим выделить (с интервалом в 2 см) пять электрофоретических групп, при использовании в качестве электролита как 5% раствора уксусной кислоты, так и буферного раствора Бриттона-Робинсона, рН 2,3 (табл. 1,2).

Установлено, что при использовании электролита 5% раствора уксусной кислоты, анализируемые соединения делятся на более равномерные электрофоретические группы и характеризуются меньшими величинами коэффициентов вариации их ДПФ см.

Электролит 5% раствор уксусной кислоты имеет также преимущество в доступности и простоте приготовления в лабораторных условиях. В связи с этим, для последующего расширенного электрофореза-скрининга АССОХ лекарственных соединений) нами был использован в качестве (48 электролита – 5% раствор уксусной кислоты (табл. 3).

–  –  –

При этом, чувствительность обнаружения исследуемых АССОХ на ЭФГ (детектор – реактив Драгендорфа, модифицированный по Мунье), находится в пределах 0,5 – 3,0 мкг вещества в пробах.

Внутригрупповая идентификация АССОХ методом электрофорезаскрининга с помощью ЭФС и их количественных параметров. На втором этапе электрофореза-скрининга предложена методика внутригрупповой ЭФС-идентификации ряда АССОХ, относящихся как к одним, так и разным электрофоретическим группам (ЭГ), с использованием электрофореза на бумаге (ПВЭФ-1, 400 В, 1 ч, электролит – буферный раствор БриттонаРобинсона с рН: 1,8; 2,3; 4,0; 6,0; 8,0). Результаты исследования показали, что профили ЭФС (графической зависимости ДПФ см от рН электролита) исследуемых соединений (как внутри, так и в составе других ЭГ) индивидуальны, не совпадают по форме и высоте, и могут быть использованы для идентификации АССОХ, после группового разделения их электрофорезом-скринингом (рис. 1).

Надежность ЭФС-идентификации исследуемых АССОХ значительно увеличивается с использованием их количественных характеристик (ДПФмакс, ДПФмин, Рi – внутренний коэффициент) и позволяет получить дополнительную индивидуальную информацию о наблюдаемой электрофоретической подвижности соединений в зависимости от рН электролита (табл. 4).

–  –  –

Условия идентификации (подтверждающего исследования) АССОХ методом капиллярного электрофореза При ненаправленном химико-токсикологического анализе веществ, наряду со скрининговой программой, необходимо использовать подтверждающие методы, обладающие высокими (независимые) селективными свойствами.

Для проведения электрофореза АССОХ использовалась отечественная система капиллярного электрофореза «Капель-105» («Люмекс», г. СанктПетербург), содержащая капилляр с внутренним диаметром 75 мкм и длиной 60 см, и программное обеспечение «МультиХром для Windows».

С целью выбора условий электрофореза АССОХ (на примере артикаина и бупивакаина) в катионной (протонированной) форме, нами проведена сравнительная характеристика рабочих электролитов: 20 мМ раствора фосфорной кислоты (РЭ I) и буферного раствора БриттонаРобинсона, рН 2,3 (РЭ II). При этом ввод пробы в капилляр осуществляли под давлением 30 мбар в течение 15 сек, при использовании положительного электрода со стороны введения рабочего электролита: +20кВ;

детектирование компонентов проводили с помощью встроенного УФспектрофотометрического детектора, нм нм 270 (артикаин), 200 (бупивакаин).

При анализе исследуемых АССОХ проводили концентрирование пробы на приборе в начальной стадии электрофоретического процесса с использованием «прямого стекинга», основанного на том, что проба вводится в капилляр в буферном растворе, имеющим электропроводность в 10 раз меньше, чем рабочий электролит (за счет понижения ионной силы).

На электрофореграмме (ЭФГ) с помощью программы «МультиХром для Windows» рассчитывали качественный электрофоретический параметр исследуемого иона - общее наблюдаемое время миграции, в минутах (tм).

–  –  –

Проведенные исследования показывают, что ЭФС по tи позволяет получить информацию об ионном состоянии исследуемых АССОХ и их количественные характеристики (pKa1, pKa2). При этом, данные величины, полученные при использовании в качестве рабочего электролита РЭ I – буферного раствора Бриттона-Робинсона (рН 2,3 10,0), обладают наименьшей погрешностью (табл. 6).

–  –  –

Примечание: Количественные характеристики рассчитаны на ЭФС по tи с использованием средних выборок результатов 5 параллельных электрофоретических исследований каждого из анестетиков при соответствующих величинах рН РЭ

4. Изучение влияния соэкстрактивных веществ в составе биологических объектов на условия скринингового обнаружения и идентификации (подтверждающего исследования) АССОХ методами электрофореза На электрофоретическую подвижность ионизированных частиц оказывает влияние не только внутреннее строение вещества, но и ряд внешних факторов (рН и температура электролита, напряжение, природа извлекателей и характер биологического материала).

Электрофорез-скрининг АССОХ в модельных биологических смесях Для изучения возможности электрофореза-скрининга представителей группы АССОХ в присутствии веществ, соэкстрагируемых из биологического материала (печени), ставились опыты на модельных смесях.

При этом, представляет интерес применение варианта электрофорезаскрининга АССОХ (на примере – новокаина, лидокаина, азалептина), с использованием наиболее широко известных извлекателей в химикотоксикологической практике – растворов органических кислот: щавелевой (рН 2,0), уксусной (рН 2,0), трихлоруксусной (рН 1,0) и ацетона. Полученные извлечения подвергали экстракционной очистке из щелочной среды (рН 10,0), с последующим реэкстрагированием буферным раствором БриттонаРобинсона (рН 2,3), разбавленным водой в 10 раз. К полученным реэкстрактам добавляли стандартные образцы АССОХ, с концентрацией исследуемых компонентов в пробе по 30 мкг/мл.

Полученные модельные биологические смеси (МБС) использовали для предварительного обнаружения исследуемых АССОХ в соответствии с описанными выше этапами электрофореза-скрининга АССОХ-стандартов.

Нами было установлено, что независимо от природы извлекателей ряда АССОХ из печени, исследуемые соединения в составе МБС располагаются по электрофоретическим группам, соответствующим расположению АССОХ-стандартов в разработанных условиях (табл. 7).

Исследования по идентификации ряда АССОХ в составе МБС на втором этапе электрофореза-скрининга методом электрофореза на бумаге («ПВЭФ-1») показали, что профили ЭФС соединений индивидуальны и аналогичны соответсвующим АССОХ-стандартов, независимо от природы извлекателя из биологического материала, а количественные характеристики ЭФС (ДПФмакс, ДПФмин, Рi) исследуемых оснований в составе МБС совпадают с количественными характеристиками ЭФС соответствующих

–  –  –

ЭФС-идентификация доксициклина (представителя амфотерных АССОХ) в составе МБС мочи, крови методом электрофореза на бумаге С целью изучения влияния соэкстрактивных веществ биологических жидкостей на ЭФС-идентификацию амфотерного соединения (доксициклина), готовили МБС, используя щелочные (рН 7,0) хлороформные извлечения образцов мочи и крови.

Электрофорез МБС проводили в приборе «ПВЭФ-1» в присутствии индикатора электроосмоса и реофореза – 1,3,5-тринитробензола (ТНБ) в условиях: носитель – хроматографическая бумага марки «С»; напряжение – 400 В; время – 1,5 ч; электролит – буферный раствор Бриттона-Робинсона, в

–  –  –

составе МБС (мочи, крови) и доксициклина-стандарта.

Полученные результаты исследований показали:

- конфигурации ЭФС по Исм доксициклина-стандарта и доксициклина в составе МБС (моча, кровь) аналогичны (рис. 6 и 7);

количественные характеристики ЭФС по Исм позволяют идентифицировать доксициклин в присутствии биокомпонентов мочи и крови. При этом величины рКа и Рi исследуемого соединения, полученные в составе МБС (моча, кровь), совпадают с соответствующими величинами доксициклина-стандарта (табл. 8).

ДПФсм

–  –  –

-2

-4

-6

-8 Рисунок 6 - ЭФСИ см по Исм доксициклина гидрохлорида (1), доксициклина в составе модельной смеси – мочи

–  –  –

Примечание: Количественные характеристики рассчитаны на ЭФС по И с использованием средних выборок результатов 3-х параллельных см электрофоретических исследований антибиотика при соответствующих величинах рН электролита Применение электрофореза на бумаге для ЭФС-идентификации тримекаина и мезидина в жидких средах и внутренних органах экспериментальных животных Нами изучена возможность применения электрофореза на бумаге для ЭФС-идентификации тримекаина и его метаболита - мезидина в жидких средах и внутренних органов экспериментальных животных (кроликов).

Электрофорез солянокислых остатков проводили в соответствии с разработанной нами методикой ЭФС-идентификации АССОХ на этапе электрофореза-скрининга (прибор – «ПВЭФ-1», 400 В, 1ч; носитель – хроматографическая бумага марки «FN-15»; электролит – буферный раствор Бриттона-Робинсона в диапазоне рН 1,8 – 10,0; детектор – реактив Драгендорфа, модифицированного по Мунье).

Средние арифметические значения ДПФсм исследуемых оснований в пяти повторностях, при соответствующих значениях рН электролита, использовали для построения ЭФС. Результаты исследований свидетельствуют о том, что ЭФС по ДПФсм тримекаина и его метаболита мезидина индивидуальны, при этом, профили ЭФС по ДПФсм тримекаина гидрохлорида и его основания, выделенного из печени, крови и места введения кролика, совпадают (рис. 8).

В свою очередь профили ЭФС по ДПФсм мезидина гидрохлорида и его основания, выделенного из желудка и крови кролика, также совпадают (рис.9).

Таким образом, опыты с введением тримекаина и мезидина экспериментальным животным показали, что способ установления ЭФС по ДПФсм может быть использован для идентификации исследуемых веществ, выделенных из жидких сред и внутренних органов животных (рис. 12, 13).

Рисунок 8 - ЭФС по ДПФсм тримекаина гидрохлорида (1) и его снования, выделенного из печени (2), крови (3) и места введения (4) кролика Рисунок 9 - ЭФС по ДПФ см мезидина гидрохлорида (1) и его основания, выделенного из желудка (2) и крови (3) кролика Идентификация ряда АССОХ в присутствии соэкстрактивных веществ мочи и крови методом капиллярного электрофореза В доступной нам литературе крайне редко встречаются данные по применению электрофоретических спектров (ЭФС) для идентификации лекарственных веществ в биологических объектах методом капиллярного электрофореза.

На общее наблюдаемое время миграции (tм) иона может оказывать существенное влияние ряд факторов: время миграции ЭОП, рН электролита, присутствие в пробе соэкстрактивных веществ биосубстратов.

Нами изучена возможность ЭФС-идентификации ряда АССОХ (бупивакаина, лидокаина, азалептина) методом капиллярного электрофореза в присутствии соэкстрактивных веществ биологических объектов в составе МБС мочи и крови.

–  –  –

Примечание: Количественные характеристики рассчитаны на ЭФС по tи с использованием средних выборок результатов 5 параллельных электрофоретических исследований каждого из АССОХ при соответствующих величинах рН РЭ Таким образом, разработана методика ЭФС-идентификации ряда АССОХ (лидокаина, бупивакаина, азалептина) в составе МБС мочи, крови с использованием системы капиллярного электрофореза («Капель-105») и установлено, что на количественные характеристики ЭФС по tи АССОХ не оказывают существенное влияние соэкстрактивные компоненты мочи и крови.

5. Количественное определение АССОХ в биологических объектах методами электрофореза на бумаге и капиллярным электрофорезом Для определения микроколичеств веществ в биологических субстратах наиболее целесообразно использование методов, позволяющих сочетать очистку, обнаружение, идентификацию и количественное определение искомых веществ. Такими возможностями обладают электромиграционные методы (электрофорез на бумаге, капиллярный электрофорез).

Определение доксициклина методом электрофореза на бумаге Предложена экспрессная методика планиметрического определения доксициклина на ЭФГ, позволяющая проводить предварительную оценку содержания исследуемого соединения на этапе электрофореза-скрининга методом электрофореза на бумаге в приборе «ПВЭФ-1», в выбранных выше условиях. Электролит – буферный раствор Бриттона-Робинсона (рН 2,3).

При этом, площади детектируемых зон доксициклина пропорциональны содержанию вещества в наносимых пробах в диапазоне от 2 до 10 мкг, а калибровочный график носит выраженный линейный характер.

Погрешность количественного определения доксициклина методом электрофореза на бумаге составила 4,62%.

Электрофорезо-спектрофотометрическое определение доксициклина в моче Электрофорез на бумаге как эффективный метод очистки успешно сочетается с другими инструментальными методами. Одним из широко распространенных и доступных инструментальных методов является УФспектрофотометрический метод, который применяется при исследовании лекарственных веществ в биологических жидкостях и субстратах;

используется и для скрининга на этапе подтверждающего анализа, после ТСХ выделения исследуемых веществ.

Нами разработана электрофорезо-спектрофотометрическая методика определения доксициклина в моче.

Изолирование доксициклина из мочи проводили прямой экстракцией хлороформом (рН 7,0). Сухие остатки, после упаривания органического растворителя растворяли в 30% растворе уксусной кислоты. Для отделения от метаболитов и устранения влияния эндогенных балластных веществ проводили электрофоретическое выделение доксициклина на приборе «ПВЭФ-1», в приведенных выше условиях электрофореза исследуемого антибиотика, с последующим его спектрофотометическим определением в элюате М раствор (0,01 хлористоводородной кислоты, длина волны – 268 нм; y = 0,00713 · x + 0,00823, R2 = 0,9998).

–  –  –

Предел обнаружения доксициклина на ЭФГ – 0,1 мкг вещества в пробе.

Предел определения методом УФ-спектрофотометрии после электрофоретического выделения составил для доксициклина 1 мкг/мл.

Экспрессный метод определения доксициклина в моче капиллярным электрофорезом («Нанофор-01») Нами предложена экспрессная методика анализа доксициклина в моче, с использованием отечественного прибора «Нанофор-01».

При проведении электрофореза доксициклина (рабочий электролит – боратный буферный раствор, рН 10,2; растворитель пробы – боратный буферный раствор, рН 8,0; ввод пробы – давлением (0,5 атм 200 сек);

напряжение: 15 кВ, нормальная полярность; диаметр капилляра – 30 мкм;

длина волны – 346 нм), мы проводили концентрирование пробы непосредственно в капилляре прибора в начальной стадии электрофоретического анализа, используя метод стекинга. Метод основан на том, что проба вводится в капилляр в буферном растворе, имеющем электропроводность в десять раз меньше, чем в рабочем электролите (за счет пониженной ионной силы). В таком растворителе как электрофоретическая, так и электроосмотическая подвижности увеличиваются, и зона анализируемого вещества сужается и обостряется. Для усиления этого эффекта использовали также понижение значения рН рабочего электролита.

Удаление буфера – растворителя пробы проводится электрокинетически при обратной полярности рабочих электродов. Окончание процесса концентрирования, т.е. формирование узкой зоны на входе капилляра, фиксируется по току: прекращается возрастание силы тока, и его значение выходит на плато. В дальнейшем, полярность электродов меняется на стандартную, т.е. катод находится на стороне «окна детектора», и проводится электрофорез.

Для построения калибровочного графика количественного определения доксициклина была выбрана длина волны детекции 346 нм, как более селективная и удовлетворяющая по уровню чувствительности. Линейная зависимость наблюдалась в диапазоне концентрации 10 – 500 мкг/мл.

Изолирование доксициклина из биологической жидкости (без экстракционного концентрирования) осуществляли с использованием самопроточной мини-колонки с бисерным полиакриламидным гелем «Акрилекс Р-10», в которую вносили аликвоту мочи, с последующим промыванием растворителем пробы – боратным буферным раствором, рН Дальнейший ход анализа доксициклина в элюате включает 8,0.

концентрирование пробы в капилляре прибора методом стекинга и электрофорез в разработанных условиях. Электрофореграмма мочи с содержанием доксициклина 5 мкг/мл приведена на рисунке 13.

Рисунок 13 - Анализ доксициклина в моче (5 мкг/мл) капилярным электрофорезом («Нанофор-01»).

Таким образом, за счет пробоподготовки и селективного детектирования удается полностью устранить наложение мешающих определению доксициклина низкомолекулярных компонентов мочи, а за счет обогащения пробы стекингом, удается обеспечить такую концентрационную чувствительность, при которой доксициклин надежно определяется при концентрациях меньше 5 мкг/мл, что значительно ниже терапевтического уровня.

Определение артикаина в биологических объектах методом капиллярного электрофореза («Капель-105») Важными вопросами при количественном определении лекарственных веществ в биологических жидкостях и субстратах методом капиллярного электрофореза являются вопросы пробоподготовки из (изолирование объектов и концентрирование исследуемых соединений).

В биообъектах возможно присутствие различных эндогенных компонентов, на фоне которых затрудняется детектирование искомых соединений в микрограммовых количествах. Кроме того, фотометрическое детектирование различных компонентов происходит непосредственно в капилляре, вследствие этого чувствительность детекции ограничена малой длиной оптического пути, равного внутреннему диаметру капилляра.

При разработке методики количественного определения АССОХ (на примере артикаина) в моче, крови, ткани печени на базе капиллярного электрофореза («Капель-105») эти осложняющие проблемы решали тем, что на этапе пробоподготовки для получения в достаточной степени очищенной и сконцентрированной пробы использовали жидкость-жидкостную экстракцию хлороформом (рН 9,0) образцов мочи, крови и воднокислых вытяжек из печени (раствор хлористоводородной кислоты, рН 2,0), с последующим реэкстрагированием исследуемых компонентов в рабочий электролит, разбавленный водой в 10 раз и проведением электрофореза пробы в разработанных нами условиях с целью идентификации артикаина.

При этом, перевод исследуемых компонентов в рабочий электролит, разбавленный водой в 10 раз, позволяет в процессе электрофореза в кварцевом капилляре дополнительно осуществить концентрирование пробы за счет стекинга (аналиты внутри зоны образца движутся с более высокой локальной скоростью, и, замедляясь на границе с зоной ведущего электролита, концентрируются).

Концентрацию исследуемого вещества в реэкстракте рассчитывали по калибровочному графику, предварительно построенному при электрофоретическом исследовании стандартных растворов артикаина в интервале концентраций от 1 до 20 мкг/мл (y = 0,4798 · х – 0,0368; R2 = 0,9999).

Показано, что в соответствии с разработанными методиками пробоподготовки, балластные вещества мочи, крови, печени не мешают фотометрическому определению артикаина, а применение процесса стекинга непосредственно в капилляре при проведении электрофореза, позволяет дополнительно сконцентрировать исследуемое вещество в пробе и тем самым проводить определение микрограммовых количеств анестетика в селективных условиях.

Нами проведена валидация разработанных методик определения АССОХ в биологических объектах методами электрофореза на бумаге и капиллярным электрофорезом, рассчитаны метрологические характеристики определения исследуемых соединений для трех концентраций и в трех повторностях в различных биологических объектах (моча, кровь, печень).

Проведенная валидационная оценка показала, что методики отличаются специфичностью, чувствительностью, правильностью, повторяемостью, линейной зависимостью, внутрилабораторной прецезионностью полученных результатов.

6. К объективной оценке уровня концентрации доксициклина и артикаина в клинических объектах методами электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза Разработанные электрофоретические методы анализа доксициклина, артикаина в биологических объектах, были применены для изучения объективной оценки уровня концентрации исследуемых соединений в клинических объектах.

Исследование особенностей фармакокинетики доксициклина при лечении острой гнойной хирургической инфекции Электрофорезо-спектрофотометрический методом определения доксициклина в биологической жидкости был применен для решения вопросов, связанных с изучением новых методов лечения острой гнойной хирургической инфекции в сочетании с традиционной химиотерапией.

Исследования проводились на базе клинической больницы им.Н.А.Семашко г.Ярославля совместно с сотрудниками кафедры общей хирургии Ярославской государственной медицинской академии. В качестве основного

–  –  –

Рисунок 11 - Динамика изменения концентрации доксициклина в моче Установлено, что при применении вакуум-терапии, скорость экскреции доксициклина с мочой ниже, чем при традиционном лечении гнойной хирургической инфекции, и её изменения носят волнообразный характер, что возможно объясняется повышенным привлечением препарата в ткани очага воспаления, вследствие локального увеличения уровня микроциркуляции и более быстрого роста грануляций.

В свою очередь, клинические данные свидетельствуют, что сочетанное применение вакуум-терапии и доксициклина в лечении острой гнойной хирургической инфекции оказывает выраженное позитивное влияние, наблюдаемое в быстрой ликвидации признаков интоксикации и в оптимизации местных регенеративных реакций.

Таким образом, разработанную электрофорезо-спектрофотометрическую методику определения содержания доксициклина предлагается использовать в качестве объективного критерия, косвенно позволяющего подтвердить синергизм взаимодействия антибиотикотерапии и других средств антисептики, в том числе позитивное действие вакуум-терапии на течение локальных воспалительных реакций в комплексном лечении гнойной хирургической инфекции мягких тканей.

Аналитическое обоснование объективного контроля уровня концентрации артикаина в биологических средах организма при хирургических вмешательствах под местной анестезией Разработанные нами методы определения артикаина в биологических объектах с использованием отечественной системы для капиллярного электрофореза («Капель-105») были применены в клинике общей хирургии Ярославской государственной медицинской академии, при проведении лабораторных анализов биологических жидкостей – мочи и крови, взятых от оперируемых больных под местной (артикаиновой) анестезией, а также – в стоматологической практике на кафедре стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ЯГМА, при определении артикаина в тканях операционного поля.

Было проведено изучение скорости элиминации артикаина из крови у больных печёночной дисфункцией (механическая желтуха) – уровень билирубина в крови от 200 до 300 мкМ/л. В контрольную группу вошли пациенты с нормальными показателями состояния печени (8-25 мкМ/л).

Исследование проводилось на пациентах, которым была сделана подкожная анестезия (2 мл 4% раствора ультракаина, т.е. 80 мг артикаина гидрохлорида при введении катетера для внутривенных инфузий в подключичную вену. Полученные результаты представлены в таблице 12.

–  –  –

Таким образом, можно сделать вывод, что функциональное состояние печени оказывает существенное влияние на метаболизм артикаина, а применение ряда последовательных местных анестезий, необходимое при некоторых видах хирургических вмешательств, у пациентов с острой дисфункцией печени требует коррекции дозировки препарата. Кроме того, установлено, что концентрация анестетика в системном кровотоке при внутримышечном способе введения выше, чем при подкожном, а кривая элиминации имеет несколько иной характер, что необходимо учитывать при индивидуальном подборе дозы препарата.

Во всех случаях, при анализе мочи был обнаружен артикаин в диапазоне концентраций от 300 до 500 нг/мл, что подтверждает возможность использования данного объекта с целью установления факта приёма исследуемого препарата.

Было проведено изучение распределения артикаина в тканях ротовой полости при проведении местной инфильтрационной анестезии.

В исследовании участвовали пациенты с двумя типами диагнозов:

«хронический одонтогенный гайморит» и «киста челюсти», от которых забирался операционный материал (фрагменты десны, гайморовой пазухи и кисты весом от 0,01 до 0,1 г), через 10 мин после инфильтрационной анестезии 2 мл 4% раствора ультракаина (80 мг артикаина гидрохлорида).

Образцы тканей подвергались анализу методом капиллярного электрофореза («Капель-105») по разработанной методике, с поправкой на вес объектов. Результаты исследований представлены в таблице 14.

–  –  –

Электрофореграммы клинических объектов (моча, кровь, ткани) представлены на рисунках 15-17.

Рисунок 15 - Электрофореграмма артикаина (клинический объект – кровь) Рисунок 16 - Электрофореграмма артикаина (клинический объект – моча) Рисунок 17 - Электрофореграмма артикаина (клинический объект – десна) Для подтверждения объективности разработанных методик определения артикаина методом капиллярного электрофореза в клинических объектах (моча, кровь, ткани) был проведён хромато-масс-спектральный анализ. В результате испытаний установлено, что предел обнаружения артикаина, с идентификацией по полному масс-спектру (библиотека: NIST

98) на уровне достоверности не менее 72%, составляет 50 нг/мл, по характерным ионам m /z 86,171, 44 – 10 нг/мл.

На основании проведенных теоретических и экспериментальных исследований предложена схема системного химико-токсикологического анализа АССОХ в биологических объектах с использованием электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза.

Схема системного химико-токсикологического анализа АССОХ в биологических объектах с использованием электромиграционных методов

ВЫВОДЫ

1. Изучены оптимальные условия электрфореза-скрининга ряда АССОХ методом электрофореза на бумаге («ПВЭФ-1»).

Показано, что на этапе группового обнаружения, наиболее воспроизводимые величины ДПФсм исследуемых соединений и более равномерная частота распределения их на ЭФГ по электрофоретическим группам получены при использовании в качестве электролита 5% раствора уксусной кислоты.

На втором этапе электрофореза-скрининга АССОХ предложена методика внутригрупповой идентификации («ПВЭФ-1», электролит – буферный раствор Бриттона-Робинсона, pH 1,8 8,0. Показано, что подлинность ЭФС-идентификации исследуемых соединений значительно увеличивается с использованием их количественных характеристик (ДПФмакс, ДПФмин, Pi).

Установлена возможность идентификации 2. (подтверждающего исследования) ряда АССОХ с использованием новой отечественной системы для капиллярного электрофореза - «Капель-105». Разработанные условия электрофореза показали, что наибольшая воспроизводимость качественного параметра (tм) исследуемых соединений, получены при использовании буферного раствора Бриттона-Робинсона, pH 2,3.

3. Предложена методика ЭФС-идентификации АССОХ по tи (маркер электроосмотического потока бензиловый спирт), с применением

– капиллярного электрофореза («Капель-105»). Установлено с помощью ЭФС по tи ионное состояние исследуемых соединений в зависимости от pH среды, рассчитаны их pKa.

4. Результаты исследований по предварительному (групповому) обнаружению АССОХ в присутствии соэкстрактивных веществ печени (извлекатели – водные растворы щавелевой, рН 2,0; уксусной, рН 2,0;

трихлоруксусной, рН 1,0 кислот и ацетона) методом электрофореза на бумаге показали, что независимо от природы извлекателей («ПВЭФ-1») исследуемые соединения располагаются в электрофоретические группы, соответствующие расположению АССОХ – стандартов при электрофорезескрининге в разработанных условиях.

Количественные характеристики ЭФС ДПФмин, (ДПФмакс, Pi) исследуемых оснований (в присутствии соэкстрактивных веществ, при использовании выше приведённых извлекателей), практически совпадают с количественными характеристиками ЭФС соответствующих АССОХстандартов, и позволяют в сочетании с ЭФС – профилями надёжно осуществлять их внутригрупповую идентификацию в модельных биологических смесях.

5. Проведённые исследования на экспериментальных животных (кроликах) показали, что способ установления ЭФС («ПВЭФ-1») может быть использован для идентификации АССОХ на примере тримекаина и его метаболита – мезидина), изолированных из жидких сред (крови, мочи) и внутренних органов животных (желудка, печени) и мышечной ткани с места введения анестетика. Специфичность доказательства их по ЭФС повышается с применением наряду ДПФсм, также и относительных электрофоретических величин (ДПФкод х 10, ДПФхин х 10).

Впервые установлена возможность ЭФС-идентификации 6.

(подтверждающего исследования) ряда АССОХ (лидокаина, бупивакаина, азалептина) методом капиллярного электрофореза в («Капель-105») присутствии соэкстрактивных веществ биологических объектов (мочи, крови). Профили ЭФС по tи АССОХ, их количественные характеристики (pKa1,2) в присутствии соэкстрактивных веществ практически совпадают с соответствующими профилями и характеристиками ЭФС АССОХстандартов.

7. Изучена возможность экспрессного количественного определения ряда АССОХ с использованием скринингового метода - электрофореза на бумаге («ПВЭФ-1») и подтверждающего электрофоретического метода – капиллярного электрофореза («Капель-105», «Нанофор-01»).

8. Продемонстрирована возможность использования разработанных методик для определения ряда АССОХ в биологических объектах при химико-токсикологических исследованиях.

Предложена схема системного химико-токсикологического анализа АССОХ в биологических объектах, с использованием электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза

9. Разработанные электрофоретические методики идентификации и количественного определения ряда АССОХ в моче, крови и тканях применены в условиях клиники с целью экспрессного контроля уровня препаратов в биологических средах организма при хирургических вмешательствах под местной анестезией и при антибиотикотерапии.

Объективность полученных результатов («Капель-105») подтверждена хромато-масс-спектральным анализом.



Pages:   || 2 |

Похожие работы:

«Герасимов Максим Александрович Аэрозольная санация воздушной среды кролиководческих помещений при профилактике респираторных заболеваний кроликов 06.02.05ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарносанитарная экспертиза АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2015 Работа выполнена ФГБОУ ВПО «Московская государственная сельскохозяйственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» на кафедре...»

«ОВСЯННИКОВ Алексей Юрьевич СЕЗОННАЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ХВОИ PICEA PUNGENS ENGL. И P. OBOVATA LEDEB. НА ТЕРРИТОРИИ БОТАНИЧЕСКОГО САДА УРО РАН (Г. ЕКАТЕРИНБУРГ) 03.02.08 — «Экология (в биологии)» Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботанический сад Уральского отделения Российской академии наук...»

«Бабушкина Инна Викторовна ВлИянИе модИфИцИроВанного клеточного ксенотрансплантата на ИндукцИю защИтных БелкоВ В поВрежденном мИокарде (экспериментальное исследование) 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Благовещенск – 2011 Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» (г. Иркутск) и Учреждении...»

«Темиров Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ 14.01.07 – глазные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2015г. Работа выполнена на кафедре офтальмологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Институт повышения квалификации Федерального...»

«Вечерковская Мария Фёдоровна Оценка микробиоты ротовой полости у детей с онкогематологическими заболеваниями 03.02.03. – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый Санкт Петербургский Государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения...»

«ГРИГОРЬЕВА ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА АГРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ ЯБЛОНИ В НАСАЖДЕНИЯХ ЦЧР РФ Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора сельскохозяйственных наук Краснодар, 2015 Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВО «Мичуринский государственный аграрный университет» Министерства сельского хозяйства РФ доктор сельскохозяйственных наук, профессор Научный консультант: Бобрович Лариса...»

«Гафаров Рамиз Рафикович Совершенствование лабораторной диагностики краснухи в условиях проведения массовой вакцинопрофилактики 03.02.02 Вирусология 14.03.10 Клиническая лабораторная диагностика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук Научные...»

«Курбонов Косим Муродович СОВРЕМЕННЫЕ ЭПИЗООТОЛОГО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И НАДЗОР ЗА БРУЦЕЛЛЕЗОМ В РЕСПУБЛИКЕ ТАДЖИКИСТАН 14.02.02 – эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Таджикском научно-исследовательском институте профилактической медицины Министерства здравоохранения и социальной защиты населения Республики Таджикистан Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор...»

«ПРОТОДЬЯКОНОВА ГАЛИНА ПЕТРОВНА ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ И ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТУБЕРКУЛЕЗА В ЯКУТИИ, УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Новосибирск 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего...»

«ПОПОВ Игорь Юрьевич ВЫМИРАНИЕ MARGARITIFERA MARGARITIFERA (L.) НА ЮГЕ АРЕАЛА В РОССИИ И МОДЕЛЬ ПРИРОДОХРАННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискания учёной степени доктора биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете Официальные оппоненты: Иешко Евгений Павлович, доктор биологических наук, Институт биологии Карельского научного центра РАН заведующий лабораторией паразитологии животных и...»

«СУДНИК Светлана Александровна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ СТРАТЕГИЙ КРЕВЕТОК 03.00.16 Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Калининград 2008 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Калининградский государственный технический университет» Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Буруковский Рудольф Николаевич Официальные...»

«Гармаева Татьяна Цыреновна ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ В И С У БОЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ СИСТЕМЫ КРОВИ 14.01.21 – Гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва 2012 Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научный консультант: д.м.н., профессор, академик РАМН Савченко Валерий Григорьевич...»

«КОМИССАР АЛЛА БОРИСОВНА КЛИНИКО-ОФТАЛЬМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОГЕННОГО ХОРИОРЕТИНИТА У КОШЕК 06.02.04 – ветеринарная хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва 2014 Работа выполнена на кафедре биологии и патологии мелких домашних, лабораторных и экзотических животных факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И. Скрябина»...»

«НАУМОВ Юрий Анатольевич АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРИБРЕЖНО-ШЕЛЬФОВЫХ ГЕОСИСТЕМ ОКРАИННЫХ МОРЕЙ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 25.00.36 – Геоэкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора географических наук Томск 2008 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования Владивостокского государственного университета экономики и сервиса Научный консультант: доктор географических наук, профессор Кочуров Борис Иванович Официальные оппоненты: доктор...»

«ДОБРЕНЬКОВ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЦЕНОТИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ ПОЛОСТИ РТА И МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИНЦИПОВ БИОКОРРЕКЦИИ 03.02.03 – Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения...»

«АЛИМОВА ФАРИДА КАШИФОВНА «Биологическое разнообразие видов рода Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) и их роль в функционировании микробиоты и защите растений в агроценозах различных почвенно климатических зон на территории Республики Татарстан» 03.00.07 микробиология 06.01.11 защита растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук КАЗАНЬ 2006 Работа выполнена на кафедрах микробиологии и биохимии Казанского государственного...»

«Орлова Кристина Вячеславовна ИЗУЧЕНИЕ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ КАРЦИНОМЫ МЕРКЕЛЯ 14.01.12 — онкология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» (директор – академик РАН, профессор Михаил Иванович Давыдов) Научные руководители: Демидов Лев Вадимович Доктор...»

«Беляев Евгений Анатольевич ФИЛОГЕНИЯ, СИСТЕМА И ЭВОЛЮЦИЯ СЕМЕЙСТВА ПЯДЕНИЦ (LEPIDOPTERA: GEOMETRIDAE) 03.00.09 – энтомология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт–Петербург Работа выполнена в лаборатории энтомологии Биолого-почвенного института Дальневосточного отделения Российской Академии наук Официальные оппоненты: доктор биологических наук Сергей Юрьевич Синёв доктор биологических наук Олег Григорьевич Горбунов доктор...»

«Шигапов Иршат Сайдашович ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ МАЛЫХ ОЗЕР УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (НА ПРИМЕРЕ ГОРОДА КАЗАНИ) 25.00.36 Геоэкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Москва 2014 Работа выполнена в федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет» на кафедре природообустройства и водопользования Научный...»

«ЕФИМОВ ПЕТР ГЕННАДЬЕВИЧ РОД PLATANTHERA Rich. (ORCHIDACEAE Juss.) И БЛИЗКИЕ РОДЫ ВО ФЛОРЕ РОССИИ 03.00.05. – «Ботаника» Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ Работа выполнена в Отделе Гербарий высших растений Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН. Научный руководитель: доктор биологических наук Аверьянов Леонид Владимирович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Шамров Иван Иванович, кандидат...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.