WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ ...»

-- [ Страница 3 ] --

Для сенсибилизации планшетов в лунки вносили по 100 мкл раствора гликопротеина ВБ в КББ (0,05 М) в рабочей концентрации, и инкубировали в течение 20 часов при 4°С. Сенсибилизированный планшет три раза отмывали ТБСТ. После этого в лунки приливали по 200 мкл блокирующего буферного раствора и инкубировали в течение часа при температуре 37°С. Отмывали три раза ТБСТ.

Исследуемые сыворотки перед проведением анализа размораживали, тщательно перемешивали и центрифугировали в течение 20 минут при 4000g. Для исследования использовали супернатант. В качестве положительного контроля использовали референтную антирабическую сыворотку собак с активностью 4 МЕ/мл, в разведении 1:800 в ТБСТ. В качестве отрицательного контроля использовали ТБСТ. Для приготовления калибровочной сыворотки референтную антирабическую сыворотку собак с активностью 4 МЕ/мл разводили 1:100.

Исследуемые пробы сывороток крови животных разводили 1:100 или 1:200.

Контрольные препараты, калибровочную сыворотку и исследуемые образцы вносили по схеме представленной на рисунке 8.

В лунки вертикальных рядов В1-Н1 и В2-Н2 вносили по 100 мкл раствора ТБСТ. Лунки Н1 и Н2 служили отрицательным контролем. В лунки А1, А2, В1, В2 вносили по 100 мкл калибровочной сыворотки, которую титровали с двукратным шагом в вертикальных рядах В1-G1 и В2-G2. В лунки А3 и А4 вносили по 100 мкл раствора положительного контрольного препарата. В остальные лунки попарно вносили по 100 мкл исследуемых сывороток в соответствующем разведении. Планшет инкубировали в течение двух часов при температуре 37°С. Отмывали три раза ТБСТ.

–  –  –

В лунки планшета вносили по 100 мкл рабочего разведения универсального конъюгата в ТБСТ. Инкубировали один час при 37°С. Отмывали три раза ТБСТ.

Готовили раствор субстрат-хроматогена и вносили из расчета 100 мкл на лунку. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 50 мкл 3Н H2SO4.

Реакцию учитывали на сканирующем спектрофотометре «BioRad PR 2100»

при длине волны 492 нм.

Титры антител к гликопротеину ВБ в исследуемых сыворотках, выраженные в МЕ/мл, вычисляли с использованием математической модели линейной регрессии по следующей методике:

Вычисляли среднее значение ОП для каждого тестируемого образца и каждого разведения калибровочной сыворотки. Вычисляли показатель натурального логарифма (ln) для каждого среднего значения ОП и ln значения концентрации антител к ВБ для каждого разведения калибровочной сыворотки (с 4,0 до 0,0625 МЕ/мл, не принимая во внимание фактор разведения 1/100). С помощью значений ln, полученных в отношении разведений калибровочной сыворотки, устанавливали линейную регрессию между показателями ln концентраций антител к ВБ (выраженным в МЕ/мл) и показателями ln ОП каждой концентрации калибровочной сыворотки, для расчета соответствующей математической модели (уравнения линейной регрессии):

Показатель ln концентрации антител к ВБ = a + bс, где:

с – показатель ln ОП исследуемой пробы, а – коэффициент уравнения, рассчитанный по формуле:

(у х2 – х х у) / (n х2 – (х)2)

b – коэффициент уравнения, рассчитанный по формуле:

(n х у – х у) / (n х2 – (х)2) n – количество снимаемых показаний (разведений калибровочной сыворотки);

х – ln каждой ОП, соответствующей разведению калибровочной сыворотки;

у – ln разведения калибровочной сыворотки, выраженного в МЕ/мл.

Для каждого опытного образца вычисляли среднее значение ОП, а затем концентрацию антител к ВБ в образце, выраженную в виде МЕ/мл в соответствии со следующей моделью:

Концентрация антител к ВБ в образце (МЕ/мл) = е(a + bс), с – показатель ln ОП исследуемого образца Величина 0,5 МЕ/мл считается достаточной для защиты от бешенства, согласно определению ВОЗ. Если она 0,5 МЕ/мл, то считается, что животное не имеет достаточного для защиты от бешенства уровня антител.

Выявление антигенов ВБ в головном мозгу животных в твердофазном прямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа.

Антигены ВБ выявляли в соответствии с разработанными «Методическими указаниями по выявлению вируса бешенства в головном мозгу животных в твердофазном прямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа» (см.

Приложение Г).

Для сенсибилизации планшетов в лунки вносили поликлональные кроличьи антитела к РНП ВБ по 100 мкл в лунку, разведенные в КББ (0,05 М) до концентрации 5 мкг/мл, и инкубировали в течение 18-20 часов при 4°С.

Сенсибилизированный планшет три раза отмывали ТБСТ.

В лунки вертикального ряда по очереди в трех повторностях вносили положительный, отрицательный, безантигенный (промывочный буферный раствор), контроли и исследуемые пробы из рассчета 100 мкл в лунку. Планшет инкубировали один час при 37°С и затем трижды промывали ТБСТ.

В лунки планшета вносили по 100 мкл приготовленного антирабического пероксидазного коньюгата, инкубировали один час при 37°С и промывали пять раз ТБСТ. Рабочее разведение антирабического конъюгата с пероксидазой хрена готовили на ТБСТ с добавлением 5% нормальной сыворотки лошади.

Раствор субстрат-хроматогена вносили по 100 мкл на лунку. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 3н H2SO4.

Результаты реакции учитывали с помощью сканирующего спектрофотометра при длине волны 490 нм. Определяли среднюю ОП безантигенного, положительного и отрицательного контролей, а также среднюю ОП тестируемых образцов. После этого рассчитывали ОП тестируемых образцов, положительного и отрицательного контролей, вычитая среднюю ОП безантигенного ряда. Согласно рекомендациям ВОЗ, расчетная ОП отрицательного и положительного контролей должна быть не выше 0,1 и не ниже 1,5 единиц, соответственно. Исследуемые образцы считали положительными, если их расчетная ОП превышала расчетную ОП отрицательного контроля на 0,1 оптическую единицы.

Выявление вируса бешенства в твердофазном непрямом сэндвичварианте иммуноферментного анализа. ВБ выявляли в соответствии с «Методическими указаниями по выявлению антигенов вируса бешенства в головном мозгу животных в твердофазном непрямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа», разработанными в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2005 году.

Подготовка проб для иммуноферментного анализа. В пенициллиновый флакон с Трис-НСl буферным раствором помещали кусочки ткани головного мозга из разных отделов (продолговатый мозг, мозжечок, аммоновы рога, кора больших полушарий) в количестве необходимым для приготовления 30% суспензии. Содержимое флакона тщательно гомогенизировали путем интенсивного встряхивания и подвергали однократному замораживанию. Далее пробу подвергали частичному размораживанию при комнатной температуре, и интенсивно встряхивали для более полной гомогенизации. Затем содержимое флакона переносили в пластиковую центрифужную пробирку с крышкой в объеме 1,5 мл и центрифугировали в течение 20 минут при 1000g. Для исследования использовали супернатант в цельном виде. Оставшийся в пенициллиновом флаконе материал хранили при минус 20оС.

Обработка результатов. Подсчет уровня антител к гликопротеину в ИФА, статистическую обработку результатов, полученных в ходе выполнения диссертационной работы, а также построение графиков и диаграмм, проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2010.

3.2 Результаты собственных исследований Основным способом борьбы с бешенством в дикой природе является оральная вакцинация. Мониторинг является важной составляющей программы оральной вакцинации и направлен на определение трех основных показателей:

- поедаемость вакцинных приманок;

- уровень серопреволентности;

- эпизоотическая обстановка по бешенству в зоне вакцинации.

Определение всех трех показателей дает полную картину о качестве проведенных мероприятий направленных на ликвидацию бешенства на вакцинируемой территории. Поэтому нами были разработанны методы позволяющие определять все три показателя, с помощью которых оценивали оральную вакцинацию на примере некоторых районов.

3.2.1 Отбор проб патологического материала Для получения более качественных образцов проб зубной и костной ткани был усовершенствован метод отбора и пересылки проб патологического материала и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» методические указания (см. Приложение А). В усовершенствованной методике так же представлены несколько способов отбора образцов крови у отстреленных животных и описаны способы отбора проб головного мозга, в том числе более быстрый способ, позволяющий извлекать пробы головного мозга с помощью пластиковых трубок, не прибегая к распиливанию черепной коробки.

3.2.2 Контроль поедаемости оральных антирабических вакцин Поедаемость приманок с антирабической вакциной оценивали визуально, либо путем определения содержания антибиотиков тетрациклинового ряда в тканях костей и зубов флуоресцентным методом.

Визуальная оценка поедаемости. Данным методом проводили оценку поедаемости оральной антирабической вакцины Рабивак-О/333, изготовленной из штамма ERA G333, в Краснодарском крае и Владимирской обл. С этой целью были сформированы контрольно-следовые площадки. При этом использовали песок, который разравнивали в форме круга диаметром 1 м. Если естественный грунт в районе проведения испытаний был достаточно рыхлый, удаляли с площадки опавшую листву и ветки (рисунок 9.А, 9.Б). Формировали площадки в местах наиболее вероятного появления животных, в соответствии с рекомендациями службы охоты и рыболовства (по краям полей и опушек лесов, водопоев, на путях передвижения и миграции животных). В центр площадки помещали 2-3 вакцинные приманки. Координаты площадок фиксировали с помощью приборов спутниковой навигации, а также обозначали цветными флажками.

Площадки проверяли ежедневно. Учитывали количество съеденных приманок, наличие и целостность капсул с вакциной, количество и видовую принадлежность следов, оставленных на контрольно-следовой полосе (рисунок

9.В, 9.Г). Также регистрировали погодные условия в районе проведения испытаний и состояние оставшихся вакцинных приманок, в том числе повреждения, нанесенные приманкам нецелевыми видами животных (рисунок

9.Д, 9.Е). Результаты представлены в таблицах 2 и 3.

Б А Г В

–  –  –

В условиях Краснодарского края на 10 контрольных площадках, несмотря на неблагоприятные погодные условия (дождь, мокрый снег, дневная температура 5-8°С, ночная 1-3°С), 93,9% приманок были съедены в течение первых четырех суток. В местах раскладки приманок были обнаружены следы и помет диких плотоядных, на четырех площадках – блистеры с нарушенной целостностью и следами зубов лисиц и енотовидных собак (вакцинная суспензия в них отсутствовала). В первые сутки наблюдения целевыми видами животных (лисица, енотовидная собака) были съедены 27,3% всех приманок с вакциной на четырех контрольных площадках, на вторые сутки поедаемость достигла 60,6%, на третьи

– 75,8%. Общая поедаемость за период проведения опыта превысила 90%. Во время опыта, в ряде случаев, на приманках обнаруживали следы зубов мелких мышевидных млекопитающих, которые локализовались по ее краям и не достигали капсулы с вакциной.

–  –  –

2 1 0 – Поедаемость вакцины в условиях Владимирской области оценивали поздней осенью (дождь, дневная температура 2-5°С, ночная 1-3°С). На 13 контрольных площадках разместили 39 приманок. В первые сутки на девяти площадках животные съели 24 приманки (61,5%), на остальных четырех вакцина осталась нетронутой. На вторые сутки на 11 площадках поедаемость приманок составила 84,6%, на третьи сутки ситуация не изменилась. В местах раскладки приманок обнаружили следы и помет диких плотоядных (лисица, енотовидная собака, норка, хорек), на двух площадках – блистеры с нарушенной целостностью и следами зубов (вакцина в них отсутствовала). Общая поедаемость вакцины за весь срок наблюдения превысила 80%.

Метод визуального контроля позволяет в полной мере оценить качество и время поедания приманок, а также определить оптимальные места распределения приманок и погодные условия для их распространения. Однако он довольно трудоемок, что ограничивает применение при проведении широкомасштабных кампаний по оральной вакцинации диких животных. Его с успехом можно использовать на ограниченных и доступных территориях, на первых этапах при разработке планов реализации долгосрочных программ по оральной вакцинации диких животных.

Разработка метода определения скоплений тетрациклина в тканях костей и зубов животных флуоресцентным методом. Для обнаружения скоплений тетрациклина в качестве исследуемого материала использовали ткани зубов и костей хищников. Срезы делали с помощью низкоскоростной пилы Buchler Isomet, а также с помощью токарного станка, модернизированного для распиливания зубов и костей.

В связи с дороговизной и малодоступностью на отечественном рынке специализированных низкоскоростных пил нами предложен вариант оснащения токарного станка «Корвет 402» держателем для двух дисковых пил и препаратодержателем. Скорость вращения минимальная в соответствии с инструкцией к станку. Держатель для дисковых пил изготовили под фрезы диаметром 60 мм. Он представляет собой оправу с болтом для крепления двух фрез с зазором между ними 0,5-1,0 мм. Препаратодержатель изготовили из химической лапки пробиркодержателя от штатива, которую приварили к приспособлению, закрепляемому в резцедержателе.

Проведенные исследования показали, что наилучшие результаты по выявлению скоплений тетрациклина достигаются при использовании поперечных и продольных срезов зубов, наиболее для этого подходят поперечные срезы клыков, с прохождением среза через пульпарную полость. В срезах костной ткани тетрациклин обнаруживается, но значительно реже. Он выявляется в виде хаотично расположенных желтых флуоресцирующих колец. В тетрациклинположительных препаратах зубов выявляли ярко-желтые полосы вокруг пульпальной полости зуба (рисунок 10.А). Чем дальше они располагались от пульпальной полости, тем больше срок между поеданием приманки и датой отстрела животного (рисунок 10.В, 10.Г). Наличие нескольких полос свидетельствует о неоднократном поедании животным вакцинных приманок (рисунок 10.Д, 10.Е). В препаратах зубной ткани, не содержащих тетрациклин, регистрировали равномерное поле зеленовато-желтого цвета (рисунок 10.Б).

На основании полученных результатов были разработаны «Методические указания по обнаружению флуоресцентным методом антибиотиков тетрациклинового ряда в тканях зубов и костей животных для контроля поедаемости оральных антирабических вакцин», и утверждены заместителем руководителя Россельхознадзора РФ (см. Приложение Б) и рекомендуются к применению для оценки поедаемости оральных антирабических и других вакцин, содержащих в своем составе в качестве маркера тетрациклины. Этот метод позволяет определять поедаемость оральных вакцин при проведении широкомасштабных мероприятий по антирабической вакцинации.

Использование флуоресцентного метода определения скоплений тетрациклина в тканях костей и зубов животных для оценки оральной Разработанный метод использовали для оценки оральных вакцинации.

вакцинаций проводимых на территории нашей страны и за границей.

Мониторинг поедаемости в Калининградской области. В 2007 году при финансовой поддержке Европейского Союза была начата программа по оральной вакцинации диких животных в Калининградской области [11]. Цель данной программы – ликвидация бешенства на территории Калининградской области. С 2010 года вакцинацию начали проводить дважды в год. Вакцинация осуществляется с использованием самолетов малой авиации. Сбор образцов осуществляется следующим образом. Всю территорию области делили на отдельные квадраты. Затем случайным образом выбирали квадраты, из которых предполагалось проводить отбор определенного числа проб (рисунок 11).

А Б В Г Д Е Примечания: А – при исследовании животного поедавшего приманки с вакциной; Б – при исследовании животного не поедавшего приманки с вакциной;

В – при исследовании животного поедавшего приманки недавно; Г – при исследовании животного поедавшего приманки давно; Д, Е – при исследовании животного поедавшего приманки многократно.

Рисунок 10 – Положительная и отрицательная картина при исследовании тканей зубов флуоресцентным методом на предмет содержания тетрациклинов

–  –  –

Мониторинг антирабической вакцинации в Калининградской области до 2010 года проводился в ФГБУ «ВНИИЗЖ». Результаты поедаемости приманок с вакциной представлены на рисунке 12.

Число тетрациклин-позитивных проб, 52,9 38,7 37,3 29,4 % 3,9

–  –  –

Из таблицы 4 видно, что в 2009 году было исследовано 150 проб из 12 районов Калининградской области. Количество проб, присланных из разных районов, было приблизительно одинаковое. В Краснознаменском районе было выявлено более 70% тетрациклин-позитивных животных. В Зеленоградском и Озерском районах тетрациклин содержали более 50% проб, в остальных районах этот показатель составил менее 50%. В целом по области в 2009 году было выявлено 38,7% тетрациклин-позитивных животных.

–  –  –

Из таблицы 5 видно, что количество исследованных проб из разных районов было одинаковым, кроме Славского и Краснознаменского, откуда было прислано удвоенное количество. Всего было прислано 150 проб из 13 районов. Поедаемость приманок на уровне 70% была достигнута только в Полесском районе. В Гвардейском, Гурьевском, Зеленоградском, Озерском, Правдинском районах тетрациклин содержали более 50% проб, в остальных районах поедаемость приманок была на низком уровне. В Черняховском районе проб содержащих тетрациклин обнаружено не было. В среднем по области в 2010 году она составила 37,3%. Динамика изменения уровня выявления тетрациклинположительных проб по районам в 2009-2010 годах представлена на рисунке 13.

Из данных, представленных на рисунке 13, следует, что в Зеленоградском и Озерском районах поедаемость приманок стабильно выше 50%. Значительное снижение уровня поедаемости наблюдалось в Краснознаменском, Славском и Черняховском районах и напротив отмечалось повышение в Гвардейском, Гурьевском, Полесском и Правдинском районах. Из Гусевского района в 2009 году пробы не исследовали. Таким образом, в 2010 году отмечено снижение уровня поедаемости приманок в шести районах из 12 по сравнению с 2009 годом.

70 60 50 40 30 0

–  –  –

Мониторинг поедаемости оральных антирабических вакцин в других регионах Российской Федерации. Помимо Калининградской области в 2009 году нами был проведен мониторинг эффективности вакцинации в других регионах Российской Федерации, где проводились мероприятия по оральной вакцинации диких животных. Результаты представлены в таблице 6.

Из данных, представленных в таблице 6, следует, что поедаемость приманок на уровне выше 70% не наблюдалась ни в одном из исследуемых регионов.

Однако из большинства регионов было прислано недостаточное количество проб для получения точной оценки поедаемости приманок с вакциной. Наибольшее количество проб было прислано из Московской, Тульской и Нижегородской областей, где поедаемость приманок не превысила 30%. Всего было исследовано 242 пробы, 28,5% из которых содержали тетрациклин.

Мониторинг поедаемости оральных антирабических вакцин в Республике Беларусь. Оценку поедаемости антирабических вакцин проводили так же и в Республике Беларусь. В Республике Беларусь бешенство протекает в виде эпизоотии природного типа, в которую территория республики вовлечена

–  –  –

совместно с территориями граничащих государств (Польша, Литва, Латвия, Украина, Россия). Бешенством болеют главным образом дикие животные, удельный вес которых в общем количестве случаев заболевания составляет около 75%. Основные переносчики инфекции - лисица, енотовидная собака, волк.

В настоящее время в Республике Беларусь реализуется план мероприятий по профилактике бешенства, который предусматривает проведение ежегодной массовой иммунизации диких плотоядных животных, преимущественно с использованием авиации, обеспечение максимального охвата профилактической вакцинацией домашних животных и адекватной антирабической помощи населению. Помимо этого регулируется численность диких плотоядных и безнадзорных животных.

Предполагается, что в результате реализации мероприятий данного комплексного плана интенсивность распространения природного бешенства в республике будет снижена до единичных случаев.

С 2011 года проводится мониторинг эффективности вакцинации на территориях Белоруссии приграничных с Латвией, Литвой и Польшей. Зона вакцинации, на которой проводили мониторинг, показана на рисунке 14.

Мониторинг проводили в трех областях: Гродненской, Витебской, Минской. Наибольшее количество проб было получено из Гродненской области, где оценивали оральную вакцинацию на всей территории области (рисунок 14).

Результаты оценки поедаемости оральных антирабических вакцин в Гродненской области в 2011 и 2012 годах представлены в таблицах 7 и 8.

–  –  –

Из данных, представленных в таблице 7 следует, что в 2011 году исследовали 334 пробы из 17 районов Гродненской области. В среднем поедаемость приманок составила 61,7%. В шести районах (Берестовицкий, Гродненский, Дятловский, Ивьевский, Мостовский, Ошмянский) тетрациклин содержали более 70% проб. Так же в Вороновском и Лидском районах уровень поедаемости был близок к 70%. Низкая поедаемость приманок (ниже 50%) была в Волковысском, Зельвенском, Кореличском, Островецком и Слонимском районах.

Количество проб из районов было различным. Из Зельвенского, Мостовского и Свислочского было исследованно менее 10 проб.

–  –  –

Из данных, представленных в таблице 8 следует, что в 2012 году из 17 районов Гродненской области исследовано 984 пробы. В среднем поедаемость приманок составила 57,2%. В Вороновском и Островецком районах тетрациклин содержали более 70% проб. Близкий к 70% уровень поедаемости был в Дятловском районе. В 6 районах (Зельвенском, Кореличском, Новогрудском, Ошмянском, Свислочском и Слонимском) поедаемость составила ниже 50%.

Количество проб из районов было различным. Динамика изменения поедаемости вакцинных приманок в Гродненской области по районам в 2011-2012 годах представлена на рисунке 15.

Рисунок 15 – Поедаемость вакцинных приманок в 2011-2012 гг. в Гродненской области Из данных, представленных на рисунке 15, следует, что поедаемость приманок более 70% в течение 2011 и 2012 года не сохранялась ни в одном из районов. Стабильно высокие показатели (60% и выше) наблюдались в Берестовицком, Вороновском, Гродненском, Дятловском, Ивьевском, Мостовском и Щучинском, близкие результаты в Лидском районе. В Зельвенском, Кореличском и Слонимском районах, уровень поедаемости не превышал 40%. Заметное понижение процента положительных проб в 2012 году наблюдается в Берестовицком, Ивьевском, Кореличском, Ошмянском и Свислочском районах. В Островецком районе наблюдается увеличение поедаемости. В целом уровень поедаемости приманок в 2012 году снизился в 11 районах Гродненской области из 17 на 8,2-32,3%.

Также проводили исследования проб присланных из некоторых районов Витебской области. Результаты проведенных исследований представлены в таблицах 9 и 10.

–  –  –

Из таблицы 9 видно, что в 2011 году из семи районов Витебской области исследовали 45 проб. В среднем поедаемость приманок по области составила 62,2%. Из большинства районов было исследованно менее 10 проб. Более 10 проб прислали только из Докшицкого и Поставского районов. В трех районах (Верхнедвинский, Глубокский, Шарковщинский) количество отобранных проб

–  –  –

было менее пяти, поэтому в них оценить ситуацию невозможно. Только в Браславском районе поедаемость была выше 70%, в Докшицком, Миорском и Поставском районах выше 50%.

Из данных, представленных в таблице 10, следует, что в 2012 году из семи районов Витебской области исследовали 135 проб. Средняя поедаемость приманок по области составила 61,5%. Минимальная выборка составила 10 проб, что позволяет провести оценку поедаемости вакцины во всех семи районах. Выше 70% поедаемость была в Браславском, Докшицком и Поставском районах. В Глубокском и Шарковщинском районах больше 50% проб содержали тетрациклин, в Верхнедвинском и Миорском районах менее 50%. Динамика изменения поедаемости вакцинных приманок в Витебской области по районам за 2011-2012 годы представлена на рисунке 16.

Рисунок 16 – Поедаемость вакцинных приманок в 2011-2012 гг. в Витебской области Из данных, представленных на рисунке 16, следует, что в Браславском районе поедаемость приманок в 2011 и 2012 годы сохранялась выше 70%. Более 60% тетрациклин-позитивных животных было выявлено в Докшицком и Поставском районах. Резко снизился процент положительных проб в 2012 году в Миорском районе. В Глубокском и Шарковшинском районах в 2012 году более 50% проб содержали тетрациклин (сравнение с результатами 2011 года не корректно в виду недостаточного количества проб).

Результаты исследований проб зубной ткани из Минской области представлены в таблицах 11 и 12.

–  –  –

Из таблицы 12 видно, что в 2012 году из шести районов Минской области исследовали 57 проб. Средняя поедаемость приманок по области составила 64,9%.

Однако выборка из большинства районов очень мала, более 10 проб прислали только из Мядельского района. В Столбцовском районе количество отобранных проб составило менее пяти, поэтому в нем сложно оценить реальную ситуацию.

Выше 70% поедаемость отмечена в Вилейском, Логойском и Молодечненском районах. В Воложинском и Мядельском районах более 50% проб содержали тетрациклин. Динамика изменения поедаемости вакцинных приманок в Минской области по районам за 2011-2012 годы представлена на рисунке 17.

Рисунок 17 – Поедаемость вакцинных приманок в 2011-2012 гг. в Минской области Из данных, представленных на рисунке 17, следует, что в Вилейском районе поедаемость приманок в 2011 и 2012 годах сохранялась выше 70%. Близкие к 70% показатели поедаемости были отмечены в Логойском районе. В Мядельском районе поедаемость составила около 50%, в 2011 году немного ниже 50%, в 2012 немного выше. В 2012 году в Молодечненском районе поедаемость приманок составила более 70%, в Воложинском более 50%, данных по 2011 году по этим районам для сравнения не достаточно.

Всего в 2011 году было исследовано 444 пробы, из которых 266 (59,9%) оказались положительными. В 2012 году исследовали 1176 проб из них 683 положительных, что составило 58,1%.

3.2.3 Разработка метода определения антител к гликопротеину вируса бешенства в сыворотках крови животных в иммуноферментном анализе Одним из наиболее важных показателей при проведении мониторинга оральной вакцинации является уровень серопреволентности - доля животных в популяции, содержащих антирабические антитела в защитном количестве.

Основным методом при определении уровня ВНА является РН в культуре клеток.

В связи с трудоемкостью и дороговизной постановки данной реакции, была поставлена задача разработать метод оценки уровней антирабических антител на основе ИФА.

Получение и очистка гликопротеина. Наиболее высокая корреляция между РН и ИФА достигается при использовании в качестве антигена гликопротеина ВБ [95]. Гликопротеин получали путем деструкции вирионов ВБ штамм «ВНИИЗЖ» тритоном Х-100 в концентрации 2% в течение 30 минут при комнатной температуре, с последующим разделением антигенов высокоскоростным центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности CsCl в течение двух часов при 65000g и 15°С. Отбирали верхнюю фракцию, содержащую гликопротеин. Несвязанный с гликопротеином тритон Х-100 удаляли с помощью диализа.

Степень чистоты полученных антигенов контролировали методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия в денатурирующих условиях по Лемли. Результаты исследования представлены на рисунке 18.

На рисунке 18 видно, что препарат очищенного гликопротеина содержит следовые количества других вирусных белков.

–  –  –

Рисунок 18 – Результаты анализа в электрофорезе очищенных препаратов вируса бешенства и его гликопротеина Концентрирование и очистка вируса. Концентрированный очищенный ВБ, из которого потом выделяли гликопротеин, получали из культурального вирусного сырья, инактивированного димером этиленимина. Концентрирование проводили следующим образом. Культуральную жидкость центрифугировали при 500g в течение 15 минут для удаления клеток. К полученному супернатанту добавили ПЭГ-6000 до концентрации 6%, растворяли и центрифугировали при 1700g 40 минут, для осаждения вируса. Полученный осадок растворили в 80 мл буферного раствора.

Раствор центрифугировали при 1500g 4°С втечение 30 минут, для получения элюата. Далее к осадку добавили 80 мл буферного раствора и процедуру повторяли еще два раза для получения второго и третьего элюатов.

Элюаты центрифугировали при 45000g 4°С один час. Образовавшиеся осадки растворили в малом количестве буферного раствора.

Далее очищали вирус высокоскоростным центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности CsCl при 65000g, 15°С втечение двух часов.

Отбирали зоны градиента с плотностью 1,17-1,19 г/см3, содержащие ВБ.

Разбавили буферным раствором и центрифугировали при 50000g, 4°С один час, чтобы избавиться от CsCl. Полученный осадок растворили в 1 мл буферного раствора. Чистоту полученного вируса проверяли в электрофорезе. Концентрацию полученных препаратов определяли по методу Лоури. В ходе работы было получено четыре препарата очищенного ВБ с концентрацией 0,72 мг/мл, 2,16мг/мл, 2,1 мг/мл, 1,68 мг/мл.

Определение рабочего разведения гликопротеина. Рабочее разведение гликопротеина определяли методом титрования с использованием антирабического иммуноглобулина кролика (концентрация 16,4 мг/мл) с активностью в ИФА к целому ВБ 1/2187000, сыворотки неиммунного кролика и диагностических антител против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой (рабочее разведение 1/4000).

Гликопротеин в разведениях 1/50, 1/100, 1/200, 1/300 вносили в лунки планшета по два вертикальных ряда на каждое разведение и инкубировали в течение 19-20 часов при температуре 4°С. Планшет промывали и вносили 10% сыворотку неиммунной лошади для блокирования свободных сайтов на твердой фазе. Инкубировали в течение часа при температуре 37°С, далее промывали. Для каждого разведения гликопротеина в первый из двух вертикальных рядов вносили антирабический иммуноглобулин и титровали по вертикали с шагом три, начиная с разведения 1/1000, до последней лунки. В последнюю лунку вносили промывочный буферный раствор для контроля неспецифического связывания компонентов реакции. Аналогично титровали сыворотку крови неиммунного кролика во втором вертикальном ряду. Все сыворотки предварительно центрифугировали в течение 15 минут при 4000g. Планшет инкубировали в течение двух часов при 37°С, затем отмывали. В каждую лунку планшета вносили антивидовой конъюгат в рабочем разведении на промывочном буферном растворе с добавлением сыворотки неиммунной лошади до конечной концентрации 5%.

Инкубировали один час при 37°С. Промывали и вносили раствор субстратхроматогена. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте, остановили реакцию добавлением 3Н раствора серной кислоты. Реакцию считывали с использованием сканирующего спектрофотометра при длине волны 492 нм. Результаты исследования представлены в таблице 13.

–  –  –

Как видно из таблицы 13, наибольшее значение соотношения величины ОП с иммуноглобулином к величине ОП соответствующего разведения неиммунной сыворотки достигается при разведении гликопротеина ВБ 1/50. Поэтому за рабочее разведение гликопротеина приняли разведение 1/50.

Определение рабочего разведения конъюгата. В реакции использовали в качестве конъюгата стафилококковый белок А, меченый пероксидазой.

Стафилококковый белок А специфично связывается с большинством IgG, что увеличивает универсальность теста по сравнению с использованием антивидовых иммуноглобулинов.

Рабочее разведение конъюгата определяли с использованием антирабического IgG кролика (концентрация 16,4 мг/мл) с активностью в ИФА к целому ВБ 1/2187000. Его титровали с шагом два по вертикали начиная с разведения 1/50000 (0,328 мкг/мл) до 1/1600000, а в два последних ряда внесли буферный раствор не содержащий IgG. Инкубировали два часа при 37°С.

Планшет промывалили и наносили конъюгат в разведениях 1/500, 1/750, 1/1000, 1/1500, 1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/6000, 1/8000, 1/12000, 1/16000, 1/24000.

Инкубировали один час при 37°С. Планшет промывали и вносили субстратную смесь. Инкубировали при комнатной температуре 20 минут в затемненных условиях. Останавливали реакцию добавлением 3Н раствора серной кислоты.

Реакцию учитывали при длине волны 492 нм.

Рабочее разведение конъюгата определяли из соотношения ОП в лунках с иммуноглобулином и ОП в лунках без иммуноглобулина (ОП IgG / ОП без IgG).

Использовали для анализа три ряда с разведениями IgG 1/100000, 1/200000 и 1/400000, так как ОП в этих рядах была наиболее оптимальной (3,0-0,2).

Результаты титрования конъюгата приведены в таблицы 14.

–  –  –

Из таблицы 14 видно, что наиболее высокое значение ОП IgG / ОП без IgG достигается при разведении конъюгата 1/3000. Это разведение является оптимальным и в дальнейшей работе использовали конъюгат в данном разведении.

Для блокирования Подбор блокирующего буферного раствора.

свободных сайтов на твердой фазе использовали раствор казеина натриевой соли («Sigma») на промывочном буфере. Выбор данного агента обусловлен тем, что при применении коньюгата белок А – пероксидаза нежелательно использование блокирующих реагентов сывороточного происхождения. Для определения блокирующих свойств данного реагента провели исследования с использованием стандартной положительной и отрицательной сыворотки, которые вносили в разведении 1/100 и титровали с шагом два. В реакции использовали блокирующие растворы с концентрацией казеина натриевой соли 0,1% и 0,5%, а так же без использования блока. Гликопротеин использовали в разведении 1/50, конъюгат в разведении 1/3000. Результат оценивали при разведении 1/800, так как это разведение стандартной сыворотки соответствует 0,5 МЕ/мл. Результаты представлены в таблице 15.

–  –  –

Из таблицы 15 видно, что использование блока значительно снижает ОП отрицательной сыворотки, ОП положительной сыворотки тоже немного уменьшается. Похожие результаты были достигнуты при использовании гликопротеина в разведении 1/100 (таблица 16).

–  –  –

В результате проведенных исследований было показано, что при использовании казеина натриевой соли в концентрации 0,1 или 0,5% в качестве блокирующего буферного раствора снижается неспецифическая сорбция до приемлемого уровня.

Определение рабочего разведения сывороток крови для исследования в ИФА проб в одном разведении. Рабочее разведение сывороток крови определяли постановкой ИФА с использованием негативных сывороток крови диких и домашних животных. В качестве негативных сывороток крови использовали сыворотки с активностью меньше 0,5 МЕ/мл в РН в культуре клеток. Планшеты сенсибилизировали гликопротеином в разведении 1/50. В качестве блока использовали 0,1% раствор казеина натриевой соли, приготовленном на промывочном буферном растворе. На следующем этапе вносили в первый горизонтальный ряд стандартную антирабическую сыворотку и негативныесыворотки крови от домашних и диких животных и титровали с шагом два по вертикали, начиная с разведения 1/100. Последний горизонтальный ряд заполнили промывочным буферным раствором. Конъюгат использовали в разведении 1/3000. Субстратом служил ОФД. Реакцию учитывали при длине волны 492 нм. Активность негативных сывороток рассчитывали с использованием результатов титрования антирабической стандартной сыворотки и выражали в МЕ/мл. Результаты представлены в таблицах 17 и 18.

–  –  –

Из таблицы 17 видно, что наименьшее значение уровня антител к гликопротеину у негативных в РН сывороток крови диких животных достигается при разведении 1/200 и 1/400.

–  –  –

Из таблицы 18 видно, что наименьшее значение у негативных сывороток крови домашних животных достигается при разведении 1/100 и 1/200. Учитывая данные, представленные в таблицах, определили рабочее разведение сывороток крови от животных как 1/200.

Постановка ИФА с позитивными в РН сыворотками крови домашних животных (собак и кошек). Планшеты сенсибилизировали гликопротеином в разведении 1/50. В качестве блока использовали 0,1% казеин натриевую соль на промывочном буферном растворе. Пробы сывороток крови от домашних животных использовали в разведениях 1/100 и 1/200. В работе использовали сыворотки крови с активностью в РН 0,5 МЕ/мл и выше. Конъюгатом служил белок А, меченый пероксидазой, в разведении 1/3000. Субстрат – ОФД. Реакцию учитывали при длине волны 492 нм. Полученные результаты приведены в таблице 19.

–  –  –

Из таблицы 19 видно, что результаты, полученные при использовании разведений сыворотки 1/100 и 1/200, в большинстве случаев имеют близкие значения. В качестве окончательного результата реакции использовали среднее арифметическое от обоих разведений. Результат представлен в таблице 20.

–  –  –

Как видно из таблицы 20, уровни антител в РН и в ИФА в некоторых случаях значительно расходятся. Однако главным показателем является наличие в сыворотках крови защитного уровня антител (0.5 МЕ/мл). С этой точки зрения результаты, полученные в РН, полностью совпали с результатами, полученными в ИФА.

Оценка доверительного интервала контрольных проб. При проведении 12 тестов максимальная величина ОП в лунках (n=57) с отрицательным контролем была 0,069. На основании этих данных, валидационный порог для отрицательного контроля был определен, как не выше 0,07. Минимальная и максимальная средняя величина ОП в лунках c референтной антирабической сывороткой, соответствующей активности 0,5 МЕ/мл, составила, соответственно, 0,43 и 1,081. На основании этих данных, валидационный предел для положительного контроля был определен, как 0,4-1,1.

Определение уровней антител к гликопротеину вируса бешенства в сыворотках крови животных. Определившись с условиями реакции, провели тестирование с использованием сывороток крови собак, поступивших из региональных ветеринарных лабораторий. Кроме сывороток крови животных и положительной референтной сыворотки исследовали отрицательную референтную сыворотку, полученную из Франции, из национального антирабического референтного центра в Nancy.

Планшеты сенсибилизировали гликопротеином в разведении 1/50 на КББ. В качестве блока использовали 0,1% казеин натриевую соль на промывочном буферном растворе. Пробы сывороток крови от домашних животных использовали в разведении 1/200. Конъюгат, стафилококковый белок А, использовали в разведении 1/3000 на промывочном буферном растворе.

Субстратом служил ортофинилендиамин. Реакцию учитывали при длине волны 492 нм. Сыворотки с активностью 0,5 МЕ/мл и выше считали положительными, сыворотки с активностью меньше 0,5 МЕ/мл считали отрицательными.

Всего было исследовано 78 сывороток крови. Результаты определения антител к гликопротеину ВБ в сыворотках крови животных в ИФА и антирабических ВНА в РН в культуре клеток представлены в таблице 21.

Как видно из таблицы 21, в ИФА, как и в РН, из 78 исследованных сывороток 53 были положительными (0,5 МЕ/мл). Однако из 53 сывороток крови, оказавшихся положительными в РН, в ИФА было выявлено 48, что составило 90,6%, пять сывороток в ИФА были определены как отрицательные. С другой стороны, из 25 сывороток отрицательных в РН, в ИФА пять сывороток были определены как положительные, что составило 80%. При тестировании

–  –  –

отрицательной референтной сыворотки крови в РН и ИФА был получен отрицательный результат (0,5 МЕ/мл). Таким образом, диагностическая чувствительность и специфичность разработанного метода в данном исследовании по отношению к РН составила, соответственно, 90,6% и 80%.

Воспроизводимость результатов теста. Сыворотки, положительные в ИФА, но отрицательные в РН, а также ряд сывороток положительных и отрицательных в обоих методах были дополнительно двукратно исследованы в ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 22.

–  –  –

Как видно из таблицы 22, разработанный метод является воспроизводимым, все пробы подтвердили свой статус в ИФА по результатам трех исследований.

На основании полученных результатов были разработаны «Методические указания по определению антител к гликопротеину вируса бешенства в сыворотках крови животных в иммуноферментном анализе» и утверждены заместителем директора ФГУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложение В).

3.2.4 Разработка метода выявления антигенов вируса бешенства в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич варианте иммуноферментного анализа Для оценки эпизоотической обстановки по бешенству нами был разработан твердофазный прямой сэндвич-вариант ИФА, который позволяет за короткий срок исследовать большое количество проб патологического материала.

Получение антирабического конъюгата. Для получения антирабического пероксидазного коньюгата использовали поликлональные антирабические антитела морской свинки.

5 мг пероксидазы «Sigma» растворяли в 0,5 мл воды. 51 г периодата натрия растворяли в 1 мл воды и добавили 0,25 мл полученного раствора к раствору пероксидазы. Окраска раствора пероксидазы изменялась с коричневой на зеленую. Полученный раствор перемешивали и инкубировали 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем готовили раствор этиленгликоля, смешивая 45 мкл вещества с 1,25 мл воды, и добавляли 0,25 мл раствора к реакционной смеси для остановки реакции. Раствор инкубировали один час при комнатной температуре в темноте. Цвет раствора изменялся с зеленого на темнокоричневый.

К раствору добавили двадцатую часть от общего объема КББ (0,5 М), т.е.

0,05 мл. Затем добавили антирабический иммуноглобулин морской свинки.

Предварительно иммуноглобулин был подвергнут диализу против КББ (0,05 М) в течение двух суток при трёхкратной смене буферного раствора. После диализа измерили концентрацию иммуноглобулина с использованием спектрофотометра, которая составила 8,5 мг/мл, и путем добавления КББ (0,05 М) довели ее до 5 мг/мл. Добавяли в реакционную смесь 2 мл IgG, (т. е. 10 мг). Соотношение белка к пероксидазе два (10 мг) к одному (5 мг). Раствор инкубировали два часа при комнатной температуре, периодически перемешивая. При этом раствор приобретал бледно-коричневую окраску.

К реакционной смеси добавляли 0,03 мл раствора боргидрида натрия с концентрацией 18 мг/мл и инкубировали два часа при комнатной температуре, периодически перемешивая.

Полученный конъюгат подвергали диализу против ФСБ в течение 14 часов.

Затем определяли рабочее разведение конъюгата. Для удобства его разводили в пять раз ФСБ, добавили мертиолат 0,01% и БСА «Amresco» до концентрации 5 мг/мл. Затем раствор отфильтровывали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

К полученному раствору добавляли равный объем глицерина, перемешали и храненили при минус 20°С. Определяли рабочее разведение полученного антирабического конъюгата для дальнейшего использования.

Рабочее Определение разведения антирабического конъюгата.

разведение антирабического пероксидазного конъюгата определяли с использованием положительного и отрицательного контрольных препаратов. В качестве положительного контроля использовали лиофильно высушенную суспензию мозговой ткани кролика, содержащую инактивированный антиген ВБ, штамма CVS, а в качестве отрицательного контроля – лиофильно высушенную суспензию мозговой ткани кролика, не содержащую антигенов ВБ.

В лунки планшета вносили улавливающие антитела (концентрация 24,9 мг/мл), разведенные в КББ до концентрации 5 мкг/мл и инкубировали в течение 18-20 часов при 4°С. Планшет отмывали промывочным буферным раствором. Далее в лунки шести вертикальных рядов вносили контрольные препараты (три ряда – положительный контроль и три – отрицательный).

Контрольные препараты перед использованием центрифугировали при 1000 g в течение 20 минут. Планшет инкубировали один час при 37°С и затем отмывали. В лунки горизонтальных рядов вносили антирабический пероксидазный конъюгат в разведениях 1/500, 1/1000, 1/1500, 1/2000, 1/2500, 1/3000 на промывочном буферном растворе, с добавлением неимунной сыворотки лошади до концентрации 5%. Неимунную сыворотку лошади перед использованием центрифугировали при 4000 g в течение 10 минут. Инкубировали один час при 37°С, отмывали и вносили субстрат-хроматогенную смесь. Хромогеном служил ортофенилендиамин. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте, останавливали реакцию 3Н раствором серной кислоты. Учитывали реакцию с использованием сканирующего спектрофотометра при длине волны 492 нм. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 23.

–  –  –

За рабочее разведение пероксидазного конъюгата принимали наибольшее разведение, при котором средняя ОП положительного контроля находится выше 2,1. Средняя ОП отрицательного контроля выбранного разведения конъюгата не должна превышать 0,1. Из таблицы видно, что ОП выше 2,1 наблюдается при разведениях конъюгата 1/1500, 1/1000, 1/500. Наибольшим разведением из них является разведение 1/1500, при котором ОП положительного контроля составила 2,365. ОП отрицательного контроля при разведении конъюгата 1/1500 составила 0,087, что ниже 0,1. В дальнейшей работе конъюгат использовали в разведении 1/1500.

Определение влияния блокирующего раствора на результаты ИФА.

Для блокирования свободных сайтов на твердой фазе использовали 10% раствор неиммунной сыворотки лошади (ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава РФ), приготовленный на промывочном буферном растворе. Для определения влияния данного блока провели исследования с использованием положительного и отрицательного контролей, а также положительных и отрицательных проб. Для этого в сенсибилизированный планшет вносили пробы и контроли в двух повторностях, а также промывочный раствор в качестве контроля неспецифического взаимодействия компонентов системы. Конъюгат использовали в разведении 1/1500. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 24.

–  –  –

Из таблицы 24 видно, что использование блокирующего раствора приводит к небольшому понижению ОП проб и контролей, в том числе и понижению ОП в лунках с буферным раствором. Оптическая плотность в лунках с буферным раствором и отрицательным контролем снизилась при использовании блока на 0,004, с положительным контролем на 0,121, в лунках с пробами на 0,010, 0,056 и 0,024. ОП в лунках, содержащих буферный раствор составила 0,062 при использовании блока и 0,066 без блока. Результаты представлены в таблице 25.

–  –  –

Из таблицы 25 видно что, расчетная ОП отрицательного контроля была одинаковой как при использовании блокирующего раствора, так и без него и составила 0,054, что не превышает 0,1. Известно, что использование блокирующего раствора приведет к небольшому понижению аналитической чувствительности теста. А значит, для повышения чувствительности и уменьшения времени, необходимого для постановки анализа можно отказаться от использования блокирующего раствора. В дальнейших исследованиях блокирующий раствор не использовали.

Определение аналитической чувствительности. С целью измерения предела аналитической чувствительности разработанного метода провели анализ с использованием РНП ВБ известной концентрации. Отрицательный контроль имел ОП 0,0759, значит, отрицательными являются пробы со значением ОП ниже 0,1759. Зависимость ОП от концентрации РНП ВБ в исследуемом образце представлена на рисунке 19.

Рисунок 19 – Зависимость оптической плотности от концентрации РНП ВБ в исследуемом образце при постановке ИФА Из рисунка 19 видно, что предел чувствительности метода находится в диапазоне 11,7-23,4 нг/мл, около 15 нг/мл. Коэффициент вариации при определении чувствительности не превышал 5,3%.

Оценка специфичности теста. Для оценки специфичности разработанного прямого сэндвич-варианта ИФА исследовали 30 проб головного мозга от разных животных отрицательных по бешенству в РИФ. Расчетная ОП отрицательных проб была 0,013 ± 0,0004. В данном исследовании специфичность теста составила 100%.

Сравнение разработанного прямого сэндвич варианта ИФА с другими методами диагностики. Для изучения эффективности диагностики бешенства разработанным прямым сэндвич вариантом ИФА провели исследования 100 проб головного мозга животных, направленных в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для исследования на бешенство.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Похожие работы:

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.