WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Однако реакция занимает много времени, поэтому с этой целью чаще применяют более быстрый вариант – ПЦР-РВ (полимеразная цепная реакция в режиме реального времени), которая позволяет дифференцировать штаммы вируса без последующего секвенирования.

Рутинная диагностика бешенства с использованием свежей ткани головного мозга, продолжает выполняться с использованием РИФ, которая остается рекомендованной ВОЗ (Всемирная Организация Здравоохранения) как золотой стандарт. Однако чувствительность РИФ уменьшается при использовании сильно разложившегося мозга. В такой ситуации, методы молекулярной биологии могут быть значительно чувствительнее [98]. В случаях, когда требуется подтверждение отрицательного результата РИФ в других тестах (при покусах людей), молекулярные методы полезны для диагностики, так как они более экспрессны, чем выделение вируса [64].

Реакция агглютинации латекса (РАЛ). Принцип метода заключается в агглютинации частиц латекса, сенсибилизированных антителами при наличии в исследуемом материале ВБ. Преимущество метода по сравнению с традиционными методами, такими как, РИФ, ИФА и ПЦР, заключается в экспрессности и простоте постановки реакции, не требующей дорогостоящего оборудования. В качестве исследуемого материала возможно использование слюны, что позволяет проводить прижизненную скрининговую диагностику. В Таиланде при исследовании образцов слюны в РАЛ и образцов головного мозга в РИФ от 238 собак, чувствительность РАЛ была определена как 95%, а специфичность 99% [63].

Иммунохроматографический анализ (ИХА). ИХА – сравнительно молодой метод. Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет. Требуется только один этап для проведения теста, что значительно сокращает время проведения диагностики.

Этот экспресс-тест прост в исполнении, не требует специальной длительной подготовки проб, реакция проходит в короткие сроки (около 20 минут).

В основе ИХА, как и всех иммунологических методов, лежит реакция «антиген-антитело». В ИХА используется три типа антител. Во-первых, растворимые моноклональные антитела к исследуемому антигену, конъюгированные с коллоидным золотом (краситель, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях). Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в исследуемую жидкость. Во-вторых, поликлональные или моноклональные антитела к исследуемому антигену, жестко иммобилизованные в тестовой зоне полоски. В-третьих, вторичные антитела к коньюгату моноклональных антител, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски (используются для контроля реакции).

Принцип действия ИХА состоит в том, что при погружении теста в исследуемую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с жидкостью движутся и антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген, то происходит его связывание, с первым и со вторым типом антител. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тестовой зоне иммунохроматографической полоски, что проявляется в виде окрашенной полосы. Не связавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют с третьими антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая полоса [27]. Реакция в контрольной зоне должна проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в жидкости. Результаты определяются визуально. Схема работы иммунохроматографической полоски представлена на рисунке 7 [27].

Рисунок 7 – Схема работы иммунохроматографической полоски

2.5 Определение уровня антител в сыворотках крови Для оценки иммуногенности антирабических вакцин, а также степени защищенности животных или людей от бешенства необходимо определять уровень ВНА в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных.

Некоторые авторы считают, что наличие антител в крови диких животных, например песцов, может служить косвенным доказательством их переболевания бешенством, а, следовательно, служить диагностическим критерием [159]. Кроме того, при ввозе животных в свободные от бешенства страны, необходимо предоставлять информацию об уровне ВНА в крови. Для проверки наличия антител к ВБ в сыворотках крови существует несколько методов. С этой целью используют РН и ИФА.

Реакция нейтрализации вируса. РН является международно-признанным золотым стандартом и наиболее широко используемым методом для определения наличия ВНА к ВБ. Хотя существуют и другие иммунные механизмы, которые защищают от развития болезни, считается, что ВНА наиболее тесно связаны с защитой против бешенства [56, 65].

Наиболее широко используемыми являются два рекомендованные МЭБ варианта РН в культуре клеток: RFFIT (rapid fluorescent focus inhibition test), разработанный в 1973 году J.S. Smith с соавт. [188] и FAVN, разработанный в 1997 году F. Cliquet с соавт. [55]. RFFIT предназначен для исследования проб сывороток крови, полученных от диких животных, которые отличаются низким качеством и имеют высокую степень гемолиза. В качестве биологической модели используются культуры клеток BHK или MNA. FAVN, напротив, предназначен для исследования проб сывороток крови хорошего качества, полученных, как правило, от домашних и сельскохозяйственных животных. Для постановки этого метода используется культура клеток ВНК.

Антигенсвязывающие анализы. Это методы, при которых обнаруживают специфическое взаимодействие антигена с антителом, возникающее при контакте сыворотки с антигеном, связанным с твердой поверхностью. Такие реакции имеют обязательный этап при котором комплекс антиген-антитело инкубируют с анти-иммуноглобулином или Fc-связывающим белком (стафилококковой белок А или стрептококковой белок G), сопряженным с маркером (ферментом или флуорохромом). Концентрацию антител оценивают сравнением степени развития цвета или флуоресценции с эталоном. Исходя из цели исследования возможно изменение типа антигенов или антител: выбор конкретного варианта вируса, целого вируса или конкретного вирусного белка в качестве антигена для того, чтобы обнаружить в сыворотке присутствие специфических антител. К антигенсвязывающим анализам, к примеру, относят ИФА.

K.G. Nicholson и H. Prestage [138] разработали ИФА для выявления антирабических антител, который в дальнейшем был модифицирован для выявления IgG (иммуноглобулины класса G) к целому ВБ. Расчет количества антител в образцах сывороток проводили математическими методами с использованием значений ОП (оптическая плотность). Дальнейшие изменения в ИФА касались использования в качестве антигена очищенного гликопротеина вместо целого ВБ для выявления специфичных к гликопротеину антител [95].

Антитела к очищенному гликопротеину отвечают за нейтрализацию ВБ.

Опубликованная информация свидетельствует о том, что с использованием гликопротеина в качестве связывающего антигена, возросла корреляция между количеством антител обнаруженных в ИФА и ВНА в РН. Использование стафилококкового белка А вместо антивидовых антител повышает универсальность ИФА, позволяя выявлять антитела от разных видов животных [40, 132].

ИФА имеет ряд преимуществ в сравнении с RFFIT и FAVN, например, позволяя за короткий промежуток времени исследовать большое количество сывороток крови, обходясь, при этом, значительно дешевле. Для выполнения анализа не требуется лаборатории с высоким уровнем биологической безопасности. Для постановки ИФА применим автоматический учет результатов, и не используется живой ВБ.

Тем не менее, ИФА имеет некоторые недостатки. Использование конъюгатов на антивидовых IgG делает анализ видоспецифичным. Хотя использование вместо антивидовых IgG стафилококкового белка А расширяет возможности теста, так как такой конъюгат в состоянии обнаружить IgG от нескольких видов животных, он реагирует не со всеми формами IgG3 и, следовательно, приводит к занижению уровня антирабических антител в сыворотке крови, содержащей более высокие пропорции антител класса IgG3 [49].

Количество антител, которые связываются с гликопротеином ВБ, не будет точно соответствовать уровню ВНА присутствующих в сыворотке крови. Кроме того, единица измерения МЕ/мл (международная единица/мл) не совсем подходит для выражения результатов ИФА, так как характеризует нейтрализующую активность.

2.6 Меры борьбы с бешенством Противоэпизоотические Общие противоэпизоотические меры.

мероприятия в России проводятся согласно ветеринарным правилам «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Бешенство» [3] и санитарно-эпидемиологическим правилам «Профилактика бешенства среди людей» [16].

С целью предупреждения бешенства владельцы животных обязаны соблюдать установленные местной администрацией правила содержания животных, доставлять принадлежащих им животных в ветеринарные лечебнопрофилактические учреждения для осмотра и диагностических исследований.

Животные, покусавшие людей или других животных, подлежат немедленной доставке владельцем или специальной бригадой по отлову безнадзорных собак и кошек в ближайшее ветеринарное учреждение для осмотра и карантинирования под наблюдением специалистов в течение 10 дней. При возникновении бешенства, разрабатывается план антирабических мероприятий. По решению органов местной администрации накладывается карантин. По условиям карантина в неблагополучных по бешенству пунктах вводится ряд ограничений.

Специфическая профилактика с/х, домашних животных и человека.

Вакцинация животных является одним из основных эффективных способов предотвращения заболевания бешенством. Для вакцинации сельскохозяйственных, домашних животных и людей применяются инактивированные антирабические вакцины.

Главную роль в создании антирабической вакцины для людей, безусловно, сыграл великий французский ученый Луи Пастер, являющийся родоначальником профилактики бешенства.

Для создания инактивированных вакцин в прошлом применялось культивирование предварительно аттенуированного ВБ в головном мозге восприимчивых животных, прежде всего овец. Однако из-за наличия в таких вакцинах большого количества балластных веществ, которые приводят к поствакцинальным осложнениям, в настоящее время вакцинный вирус культивируют в куриных эмбрионах или в перевиваемых культурах клеток.

Производство культуральных антирабических вакцин высокотехнологично, позволяет организовать рентабельное крупномасштабное промышленное приготовление вакцин. Антирабические вакцины, приготовленные на основе культурального вируса, более активны в иммуногенном отношении, безопасны, ареактогенны.

Профилактика бешенства человека является одной из важнейших проблем во всем мире. В развивающихся странах, где регистрируется более 99% всех случаев бешенства человека, наиболее широко используются нейро-тканевые антирабические вакцины. Эти препараты имеют относительно низкую стоимость, однако обладают побочными эффектами. Вакцины чаще всего применяют внутримышечно и в довольно большой дозе. Также существуют эффективные и относительно дешевые антирабические вакцины, которые подходят для внутрикожного применения. Комитет экспертов ВОЗ в 1991 году рекомендовал внутрикожное применение современных антирабических вакцин для постэкспозиционного лечения [167].

Следует отметить, что, несмотря на постоянное усовершенствование вакцин, применяемых для профилактики бешенства, они не всегда эффективны [9]. В настоящее время ведутся работы по получению человеческих антирабических вируснейтрализующих моноклональных антител. Такие антитела можно использовать для экстренной профилактики бешенства вместо существующих поликлональных антирабических иммуноглобулинов. Считается, что такое использование моноклональных антител более безопасно и доступно благодаря наличию постоянного источника антител [196].

Оральная вакцинация. Для полного искоренения необходимо не только контролировать бешенство городского типа, но и уничтожить его в природных очагах. Следовательно, необходима разработка мер борьбы и профилактики бешенства диких плотоядных. Уменьшение численности диких плотоядных имеет лишь ограниченный эффект [13, 14]. В связи с этим встал вопрос о необходимости вакцинации диких животных против бешенства.

Оральные вакцины и штаммы. В связи с тем, что для оральной вакцинации диких животных инактивированные антирабические вакцины не применимы [35], возникла необходимость использовать живые вакцины из аттенуированных штаммов. В начале 60-х годов прошлого века G.M. Baer обнаружил, что лисицы могут быть иммунизированы посредством орального применения живого аттенуированного штамма ERA [38]. Испытание оральных антирабических вакцин было начато в середине 70-х годов прошлого века.

Первым аттенуированным штаммом был Пастеровский штамм PV, выделенный от больной бешенством коровы в 1882 году и аттенуированный путем многократных пассажей на кроликах, который затем был адаптирован к культивированию в организме кролика, а также в культурах клеток ВНК-21 и Vero. В 1935 году получен штамм SAD (Street-Alabama-Dufferin), выделенный от больной бешенством собаки в Алабаме (США), который был адаптирован к культивированию в организме мышей и в культуре клеток ВНК-21. Из него впоследствии были получены штаммы ERA (Evelyn Rokitniki Abelseth), SADBerne, Внуково-32 и некоторые другие. В настоящее время для оральной иммунизации используют три основных типа оральных антирабических вакцин.

К первому типу относят вакцины из живых, но ослабленных штаммов ВБ. В настоящее время применяют такие штаммы как SAD B19 и SAD P5/88, которые были получены из штамма SAD-Berne посредством аттенуации после нескольких пассажей в культуре клеток. На основе штамма SAD B19 создана одна из наиболее широко применяемых оральных антирабических вакцин, высокая иммуногенность и относительная безопасность которого подтверждена экспериментальным путем [102, 145, 146, 149]. Следует отметить, что Италия, Финляндия, Германия и многие другие страны при использовании вакцин из этого штамма приобрели статус стран, свободных от бешенства. В остальных странах отмечено резкое снижение числа случаев бешенства [31, 149]. В России применялись оральные антирабические вакцины, изготовленные с применением аттенуированных штаммов вируса бешенства ТС-80 и РВ-97 [2].

Ко второму типу относят рекомбинантные оральные антирабические вакцины VRG (vaccina rabies-glycoprotein), полученные путем встраивания копии ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) гена гликопротеина ВБ в геном вируса вакцины. Впервые такую вакцину разработали в Wistar Institute (Филадельфия) [82]. Полученная VRG вакцина была испытана в лабораторных и полевых условиях в различных странах, при этом был достигнут определенный успех, выразившийся в значительном снижении числа случаев бешенства [84, 143, 208, 214].

К третьему типу относят вакцины, содержащие мутантные вирусы. На пример к этому типу относят штаммы SAG1 и SAG2 (SAD-Avirulent-Gif). Они были сделаны из штамма SAD-Berne после последовательных мутаций одного и двух аргининовых остатков в позиции 333 гликопротеина ВБ, соответственно.

Любые изменения в этом кодоне приводит к значительной потере патогенности вируса [209]. В настоящее время показана высокая эффективность и безопасность оральных антирабических вакцин, созданных на основе штаммов SAG-1 и SAG-2 для различных видов животных [70, 87, 103, 106, 179].

В России в настоящее время широко применяют вирусвакцину для оральной иммунизации диких плотоядных животных против бешенства «Рабивак-О/333» Она изготовлена из культурального живого аттенуированного ВБ (штамм «ERA G333»).

Штамм «ERA G333» получен в Центре по контролю болезней, Атланта, США (CDC) методом обратной генетики путем замены аргинина на глютаминовую кислоту в позиции 333 эктодомена гликопротеина исходного штамма ERA ВБ [2].

Все три типа оральных антирабических вакцин широко применяются и доказали свою эффективность. Однако при исследовании способности этих вакцин преодолевать остаточный материнский иммунитет у щенков лис, они показали различные результаты. У щенков имеющих остаточные материнские антитела и вакцинированных VRG вырабатывается полноценный защитный иммунитет против заболевания бешенством [115]. Щенки, вакцинированные SAG2, были менее защищены от бешенства ввиду выработки меньшего количества ВНА. T.F. Muller с соавт. [67] доказали сильное влияние остаточных материнских антител на вакцинацию SAD B19, что повлияло на выработку защитного уровня антител у семи из десяти щенков лис. Следовательно, VRG лучше преодолевает последствия материнского иммунитета, чем другие вакцины.

При исследовании влияния температурных условий на активность вакцины были получены следующие результаты. При температуре ниже 30°C, в течение трех недельного периода наблюдения титр вируса падал незначительно, однако, вакцины SAG2, SAD B19 и SAD P5/88 показали значительные потери титра при нагревании до высоких температур (30°C или выше). Рекомбинантная вакцина VRG при данных температурах сохранила защитный титр.

Термостабильность ВБ в оральной вакцине необходима, чтобы гарантировать успех вакцинации. Однако приманки, содержащие оральную вакцину против бешенства, термостабильные в течение длительного периода времени и которые не были съедены целевыми видами животных, могут рассматриваться как потенциально опасные биологические отходы [131]. Следует отметить, что, как правило, большинство приманок с вакциной поедаются в течение семи дней после распределения [25, 29].

Безопасность является важным критерием оценки оральных антирабических вакцин. Требования распространяются на безопасность для целевых видов животных и нецелевых, таких как грызуны. Установлено, что первоначальный штамм SAD-Berne, из которого получены штаммы, применяемые в настоящее время, при оральном введении является высоко патогенным для бабуина [150] и нечеловекообразных приматов, которые в дальнейшем были использованы в качестве модели для определения воздействия вакцин на человека.

Штамм SAD B19 обладает остаточной патогенностью для диких грызунов, но в настоящее время считается, что штамм SAD B19 не имеет тенденции к циркуляции в диких популяциях этих животных [34, 181, 186].

Штамм SAG-1 оказался апатогенным для различных видов животных, в том числе шесть видов диких грызунов. Однако поскольку имеет место замена только одного нуклеотида в пределах данного сайта (приобретение серинового остатка в позиции 333 аминокислотной последовательности гликопротеина вместо аргинина), теоретически может произойти реверсия в исходный штамм в процессе пассажирования в популяции животных. Поэтому был разработан более стабильный штамм SAG-2, который отличается от штаммов SAG-1 и SAD-Bern приобретением глютаминового остатка в позиции 333. Замена двух нуклеотидных остатков уменьшает шансы реверсии в более вирулентный SAD-Bern [44].

Подготовка перед проведением вакцинации. На вакцинируемой территории проводят мониторинг бешенства, определяют основных переносчиков и численность популяции диких животных. Перед проведением оральной вакцинации устанавливают фоновый уровень ВНА [155, 172] и уровень вакцинных биомаркеров [28, 36, 79, 168, 170] в популяции целевых видов животных. Если используют рекомбинантные вакцины, проводят мониторинг циркуляции родственных вирусов, присутствующих в целевых видах животных, до и после распределения приманок, чтобы определить возможность рекомбинации между вакциной и естественным вирусом [184]. Кроме того, безопасность вакцинного вируса должна быть проверена на нецелевых видах, которые могут присутствовать в районе вакцинации [89, 178].

Размещение приманок с вакциной. В городских районах для контроля бешенства обычно используют ручной способ размещения приманок с вакциной [71, 74, 173]. В условиях дикой природы приманки размещают ручным и воздушным способом [206, 213]. Распространение приманок ручным способом включает размещение вручную или разбрасывание вдоль дороги с транспортных средств. В качестве воздушного средства распространения приманок используют вертолеты [68, 143, 213] и самолеты [71, 72, 74, 170, 195, 220]. При воздушном распространении разбрасывание производится вручную или с использованием автоматизированных систем. Решение о применении конкретного метода во многом зависит от масштаба кампании, финансовых возможностей и целевых видов животных. На практике ручной способ распространения приманок применялся в городских районах, на терриории приграничных территорий и других территориях, где применение авиации ограничено. Воздушный способ распространения более эффективен для равномерного покрытия больших площадей.

При проведении оральной вакцинации в Онтарио (Канада) воздушное распространение приманок оказалось более рентабельным, чем распространение вакцины вручную [220]. Там при распространении приманок для борьбы с бешенством в дикой природе использовали различные типы самолетов, в том числе Cessna, Turbo Beaver, Bell Helicopter и Twin Otter [71, 72, 74, 170, 195, 220].

Для проведения вакцинации в Калининградской области используются самолеты российского производства «СИНТАЛ-2». При проведении оральной вакцинации с использованием самолетов приманки распространяют с фиксированным интервалом [112].

Использование системы навигации в 1990 году значительно увеличило количество кампаний по распространению приманок с использованием самолетов. GPS (Global Positioning System) позволяет самолету двигаться с рассчитанной скоростью в соответствии с ранее запрограммированным маршрутом полета. Система позволяет вести точный учет сброшенных приманок и предотвращать возможные ошибки, особенно при разбрасывании большого количества приманок. В дополнение к использованию GPS разработано программное обеспечение, которое позволяет предварительно планировать маршруты полетов. Эта программа успешно используется в ряде крупных компаний по оральной вакцинации в Северной Америке [96].

Состав приманки должен соответствовать климатическим условиям, которые могут повлиять на их привлекательность для целевых видов животных.

Чтобы проверить активность вакцины производят в течение примерно четырех недель сбор приманок в зоне вакцинации для оценки титра вируса в вакцине.

Плотность распределения приманок. Большинство авторов рекомендуют применять 15-20 вакцинных приманок на км2, однако, в ряде случаев применялось до 185 приманок на км2 [146], так как плотность распределения должна коррелировать с плотностью животных на вакцинированной территории [170].

При этом учитывают плотность популяции всех животных поедающих приманки, а не только целевых видов. Необходимо при планировании оральной вакцинации учитывать размещение вакцинных приманок, сроки вакцинации, и изменения плотности популяций животных [143, 153, 178, 220].

К сожалению, многие нецелевые виды, которые потребляют приманки и плотность целевого вектора, как правило, различны [81], что затрудняет разработку стратегии распределения приманок. В настоящее время единственным способом определения параметров плотности и характера распределения приманок на конкретной площади являются эмпирические эксперименты.

Каждая географическая область и вид вектора обладают уникальными факторами, которые могут изменить результаты оральной вакцинации [200].

Одним из важных факторов является то, что животное обитает в пределах определенного участка и на территорию каждого такого участка должна попасть вакцина. С другой стороны, если выбрасывается слишком большое количество приманок, то вакцинация является экономически не эффективной. Другим фактором является изменчивость размеров ареала обитания в зависимости от пола и возраста животного. Взрослые, как правило, имеют больший ареал обитания, чем молодые животные, но молодые в популяции хищников более многочисленны [74, 171]. Параметры распределения приманки, следовательно, должны рассчитываться исходя из ареала обитания молодых особей [66, 67, 109, 143].

Большинство исследований показали, что более 50% приманок потребляется за первую неделю и более 80% на 1-3 неделе [81, 111, 148, 220].

Очень важно, чтобы приманки потреблялись целевыми видами животных за этот короткий период. Если ареал обитания небольшой и перемещение ограниченно, например, перемещение самок енотов весной в перинатальный период, то при больших расстояниях между линиями вакцинации, большое количество животных может остаться не вакцинированными.

Время года для проведения кампаний по вакцинации. Рядом учёных проведено множество экспериментов по определению наиболее подходящего времени года для распространения приманок с антирабической вакциной в целях обеспечения максимального уровня потребления приманок целевыми видами животных. В большинстве районов Европы успех борьбы с бешенством лисиц достигался путём проведения кампании по оральной вакцинации весной (мартмай) и осенью (сентябрь-октябрь) [211]. Во Франции, весной и осенью кампании по оральной вакцинации лис были более успешными, чем летом [162]. В Германии, A. Vos с соавт. [144] пришли к выводу, что если целью является вакцинация только взрослых лисиц, то приманки должны быть распределены в течение первой половины марта. Если должны быть привиты молодые лисы, то приманки в ранее вакцинированных областях не должны быть разложены до конца мая, из-за колострального иммунитета, который окажет отрицательный эффект на вакцинацию [67, 109; 144, 147]. T. Selhorst с соавт. [182] пришли к выводу, что июнь для контроля бешенства лисиц в Европе - лучшее время для распространения вакцинных приманок. Однако A. Vos [211] установил, что оптимальное время для распространения приманок в Европе при вакцинации лисиц, исходя из их привязанности к территории - поздняя осень (ноябрь) или начало зимы (декабрь). При распространении приманок, независимо от времени года, необходимо уделить внимание влиянию температуры окружающей среды на вакцинные приманки, а также изменению титра вакцинного вируса при хранении [122, 182]. В арктических регионах, в условиях экстремальных температур может потребоваться использование лиофилизированных оральных вакцин для иммунизации целевых видов, таких как песцы [88, 135]. Тем не менее, в Ньюфаундленде, в суровых условиях зимы использовали замороженные или полузамороженные приманки с вакциной и достигли поедаемости среди лисиц на уровне 66% [73].

Оценка оральной вакцинации животных. Основные принципы для успешной оральной вакцинации были разработаны и усовершенствованы с использованием некоторых показателей: возраст животного, уровень ВНА, наличие тетрациклиновых линий в клыках и их количество.

Учет поедаемости вакцинных приманок при ручном способе их распространения можно проводить визуально. Для этого место, куда была помещена приманка, помечают флажком или другой меткой [148]. Однако чаще используют биомаркеры, которые включают в состав приманок. Идеальные биомаркеры должны быть однородными с вакциной и не ухудшать ее эффективность, а также должны обнаруживаться в течение длительного времени после приема животным приманки. На сегодняшний день не разработано идеальных маркеров, совместимых с вакциной, долговечных, недорогих и безопасных. Обычно в качестве биомаркера используют тетрациклин [143]. Кроме того, возможно использование так называемых «прижизненных» биомаркеров, таких как сульфадиметоксин, обнаруживаемых в крови в течение 7-10 дней после попадания в организм [28].

Тетрациклины образуют долгосрочную метку в тканях костей и зубов [125].

Они оказались полезными при проверке не только контакта с приманкой, но и времени приема приманки рассчитываемого по флуоресцирующим линиям в зубном дентине и цементе. Возраст животного также может быть определен путём подсчета роста зоны цемента зуба. Обнаружение ежегодных линий биомаркеров в зубах может коррелировать с защитным уровнем ВНА [112, 212].

Использование биомаркеров позволяет отслеживать движение "меченых" животных из области вакцинации. Фоновый уровень обнаружения тетрациклинов в популяции диких животных обычно не превышает 5% и, как правило, имеет сельскохозяйственное происхождение [36]. Данный факт в некоторых случаях может искажать результаты оценки поедаемости оральных антирабических вакцин [124, 148]. Поэтому, если уровень тетрациклина у целевых видов животных определяли до вакцинации, то его принимают во внимание при конечной оценке поедаемости [30, 73, 79, 168]. Однако существует потребность в уникальных маркерах, которые при использовании в комбинации с тетрациклином могли бы указать конкретные сроки вакцинации. Такие биомаркеры помогут выделить недавно вакцинированных животных среди всех когда-либо потреблявших вакцинные приманки, что позволит провести на данной территории оральную вакцинацию при отсутствии сведений о снижении уровня ВНА [79].

Обнаружение флуоресценции тетрациклина в костях и зубах животных указывает на контакт с приманкой, что, тем не менее, не может характеризовать эффективность вакцинации, так как в число тетрациклин-позитивных животных попадают животных потреблявшие приманки в предыдущие годы. Тем не менее, количество линий тетрациклина у животных, может показать, распределялись ли приманки равномерно, или же некоторые животные потребляли слишком мало или слишком много приманок [30]. Животные в возрасте до одного года показывают наиболее точное количество линий тетрациклина, т.к. ткань зуба в этом возрасте растет особенно интенсивно, в отличие от старых животных, у которых рост происходит медленнее. У старых животных, несколько линий часто сливаются в одну.

Использование тетрациклинового маркера позволяет корректировать проведение вакцинации для повышения эффективности. Для этого нужно знать долю тетрациклин-позитивных животных в популяции, количество тетрациклиновых линий и возраст животных. Если в популяции более 80% животных являются тетрациклин-позитивными и среднее количество тетрациклиновых полос более двух, то эффективность распределения приманок считается высокой. Если тетрациклин обнаруживают менее чем у 70% животных, и среднее количество тетрациклиновых полос менее двух, то эффективность распределения приманок считается недостаточной и требует увеличения [30].

Определение антирабических антител в сыворотках крови животных в основном осуществляется с использованием RFFIT, FAVN и ИФА. Определение уровней антирабических антител в сыворотках крови обычно используются для проверки эффективности вакцины, но эти титры зачастую не отражают истинный иммунный статус животных в дикой популяции. Если сыворотка берется на анализ сразу после вакцинации, сероконверсия еще не произошла, если спустя несколько месяцев – титр антител находится на сниженном уровне. По этой причине, в состав приманки включают тетрациклин, который дает дополнительные доказательства контакта животного с вакциной [30, 79, 124, 143, 168, 170]. Со временем уровень ВНА у животных снижается, но они остаются тетрациклин-положительными. При проведении многолетней вакцинации это может привести к ложному заключению о том, что эффективность вакцины снижается в условиях очевидного увеличения поедаемости приманок. Для преодоления этого явления, проводят анализ профилей годовых линий тетрациклина в клыках, в сравнении с ежегодным ростом зон дентина и цемента, т. е. определяется «возраст» линии [112].

В качестве стандарта защитного уровня ВНА у животных принят титр 0,5 МЕ/мл. При оценке проведенной вакцинации определяют долю животных в популяции, имеющих защитный титр ВНА. Существенное снижение числа случаев заболевания достигается при уровне эффективной иммунизации, превышающем 74%. L. Tischendorf с соавт. [50] показали, что снижение риска возникновения бешенства может быть достигнуто путем повышения уровня иммунизации до 80%.

Важно также проведение ежегодного мониторинга среди диких животных для определения уровня заболеваемости бешенством на вакцинируемой территории. Используя полученные данные, отмечают изменения уровня заболеваемости и тем самым оценивают эффективность проводимых мероприятий.

2.7 Заключение по обзору литературы Бешенство – широко распространённое вирусное заболевание животных.

Оральная вакцинация является основным способом борьбы с бешенством в дикой природе. В Российской Федерации борьбе с бешенством в природной среде с помощью оральной вакцинации диких животных уделяется все большее внимание, как и вопросам мониторинга ее эффективности. Оценивают оральную антирабическую вакцинацию по трем показателям: поедаемости приманок, уровню серопревалентности в популяции диких плотоядных животных и изменению эпизоотической обстановки в зоне вакцинации.

Поедаемость оральных антирабических вакцин рекомендуют оценивать по уровню маркеров, которые включают в состав приманок. Уровень серопревалентности определяют с использованием РН в культуре клеток либо ИФА. Эпизоотическую обстановку по бешенству принято определять путем проведения лабораторных исследований проб головного мозга с помощью РИФ.

Проводить исследования по оценке эффективности антирабической вакцинации с использованием классических методов в настоящее время имеют возможность лишь крупные научно-исследовательские учреждения. Таким образом, актуальной задачей является разработка и усовершенствование существующих методов, позволяющих в ветеринарных лабораториях разного уровня качественно и быстро оценить результаты проведенной оральной антирабической вакцинации.

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы и методы

Фиксированные штаммы вируса бешенства и вакцины:

- штамм «ВНИИЗЖ» использовался для получения антигенов ВБ (гликопротеина и рибонуклеопротеина) и иммунизации лабораторных животных (цельный вирус или его антигены);

- штамм CVS (фиксированный лабораторный штамм ВБ), использовался в качестве контрольного штамма в различных диагностических реакциях (РН, РИФ, ИФА);

- антирабическая вакцина Рабивак-О/333, изготовленная из штамма ERA G333 (ОАО «Покровский завод биопрепаратов»).

Диагностические специфические препараты:

- конъюгат белок А – пероксидаза хрена («Sigma») – универсальный пероксидазный конъюгат специфично реагирующий с IgG;

- антирабический ФИТЦ-иммуноглобулин (ФГБУ «ВНИИЗЖ») – антирабические иммуноглобулины меченые флуоресцеинизотиоционатом (ТУ 9388-091-00495527-2004);

- антитела диагностические против IgG морской свинки меченные пероксидазой (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва).

Стандартные препараты:

- референтная антирабическая сыворотка собак (Nancy, Франция) – использовалась в качестве калибровочной сыворотки в ИФА для определения антител к гликопротеину ВБ в сыворотках крови животных;

- лиофилизированная инактивированная 20% суспензия ткани головного мозга кролика, инфицированного ВБ (штамм CVS) – служила положительным контролем в ИФА для выявления антигенов ВБ (ТУ 9388-091-00495527-2004);

- лиофилизированная 20% суспензия мозговой ткани здорового кролика – использовалась в качестве отрицательного контроля в ИФА для выявления ВБ (ТУ 9388-091-00495527-2004).

Животные. Для получения специфических гипериммунных сывороток в качестве доноров использовали клинически здоровых лабораторных животных:

кроликов, массой 1,5-3,0 кг и морских свинок, массой 0,3-0,5 кг. Биопробу ставили на белых беспородных мышах, массой 6-8 г.

Химические реактивы. При выполнении работы использовали химические реактивы фирм «Sigma», «Serva», «Fluka», «Amresco», «Pharmacia», а также реактивы российского производства марки “ч.д.а.” и “х.ч.”.

Приборы и оборудование. В работе использовали следующее основное оборудование: термостат суховоздушный «ТС-80» (Россия), pH метры «HANNA pH 211» (Румыния) и «pH-121» (Россия), низкоскоростная пила «BUEHLER IsoMet» (Германия), пипетки автоматические одно и многоканальные «Gilson»

(Франция) и «Finnpipette» (Финляндия), микроскоп флуоресцентный «Olympus CX 41» (Филиппины), ультрацентрифуга «Sorvall OTD 65B» (США), центрифуга настольная «Eppendorf» (Германия), центрифуга «MISTRAL 6L»

(Великобритания), вошер «BioRad PW 40» (Франция), ридер «BioRad PR 2100»

(США), весы аналитические «OHAUS» (Швейцария).

Растворы, использовавшиеся в работе.

Фосфатно-солевой буферный раствор, pH 7,4±0,2 (ФСБ). 7,74 г Na2HPO412H2O, 0,42 г KH2PO4 и 8,7 г NaCl в 1 л водного раствора. Вместо данного буферного раствора в ряде случаев использовали ФСБ «Sigma», приготавливаемый растворением таблетированной смеси солей в дистиллированной воде.

0,05 М Карбонатно-бикарбонатный буферный раствор рН 9,5±0,1 (КББ).

Раствор 1 1,59 г Na2CO3 в 500 мл дистилированной воды.

Раствор 2 2,93 г NaHCO3 в 500 мл дистилированной воды.

К раствору 2 добавляют раствор 1 до получения рН 9,5. Вместо данного буферного раствора также использовали, КББ «Sigma», приготавливаемый растворением таблетированной смеси солей в дистиллированной воде.

0,5 М Карбонатно-бикарбонатный буферный раствор pH 9,5±0,1 (КББ).

Раствор 1 15,9 г Na2CO3 в 500 мл дистилированной воды.

Раствор 2 29,3 г NaHCO3 в 500 мл дистилированной воды.

К раствору 2 добавляют раствор 1 до получения рН 9,5.

0,01М Трис-HCl буферный раствор с 0,15 М NaCl, рН 7,5±0,1(Трис-HCl).

Трис-(оксиметил)-аминометан – 1,21 г и NaCl – 8,77 г в 1 л водного раствора, рН 7,5 устанавливают конц. HCl..

Цитратный буферный раствор, рН 5,0 (ЦБР). 3,57 г лимоннокислого натрия в 100 мл водного раствора, рН 5,0 устанавливливают конц. HCl.

STE-буфер, рН 7,5±0,1. Трис-(оксиметил)-аминометан – 12 г, NaCl – 87,6 г и ЭДТА – 2,92 г в 1 л водного раствора, рН 7,5 устанавливают конц. HCl..

Трис-HCl буферный раствор с твином (ТБСТ) К 999 мл Трис-НСl буферного раствора добавляют 1 мл твин-20 (при постановке ИФА для выявления антигенов ВБ) или к 999,5 мл Трис-НСl буферного раствора добавляют 0,5 мл твин-20 (при постановке ИФА для выявления антител к ВБ).

Насыщенный раствор сульфата аммония, рН 7,0. В 1 л дистиллированной воды растворяют 750 г сульфата аммония, рН устанавливают 25% водным раствором аммиака.

Отбор проб. Отстрел диких животных осуществляли охотники и егеря.

Трупы животных доставляли в ветеринарные лаборатории, где проводили вскрытие черепной коробки с извлечением головного мозга, отбор проб крови и костной ткани. При отборе проб руководствовались разработанными «Методическими указаниями по отбору и пересылке проб головного мозга сывороток крови и костной ткани с целью диагностики бешенства животных и оценки эффективности оральных антирабических вакцин» (см. Приложение А).

Далее комплексные пробы (мозг, ветвь нижней челюсти с зубами и сыворотка крови) направлялись в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в замороженном виде. Также поступали пробы крови и невскрытые головы животных. В таких случаях вскрытие с извлечением головного мозга и отделение нижней челюсти проводилось в ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Обнаружение антибиотиков тетрациклинового ряда в тканях зубов и костей животных. В качестве биологического материала для проведения исследования на наличие тетрациклина использовали образцы ткани зубов или кости нижней челюсти животных. Для проведения исследований поступали пробы одной из ветвей нижней челюсти с зубами. Антибиотики тетрациклинового ряда определяли в тканях костей и зубов в соответствии с разработанными «Методическими указаниями по обнаружению флуоресцентным методом антибиотиков тетрациклинового ряда в тканях зубов и костей животных для контроля поедаемости оральных антирабических вакцин» (см. Приложение Б).

Все образцы зубной и костной ткани перед распиливанием выдерживали 3-5 минут в 70% растворе этилового спирта с целью дезинфекции. С поверхности поступившего материала удалили остатки слизистых оболочек, мышечных и других тканей. Далее ветвь нижней челюсти закрепляли в держателе пилы или токарного станка и производили распиливание, на глубину 3-7 мм. Полученные срезы промывали в растворе 70% этилового спирта в течение нескольких секунд и хранили до исследования при температуре минус 20оС.

Результаты обнаружения тетрациклина учитывали с помощью флуоресцентного микроскопа. Исследовали образцы при увеличении 40-100.

Образцы считали тетрациклин-положительными, если при просмотре в ткани зуба или кости в поле зрения микроскопа видны тонкие кольца, полукольца, дуги желтого цвета.

Очистка и концентрирование вируса бешенства. Подробное описание методики очистки и концентрирования ВБ опубликовано А.П. Пономаревым с соавт. [17]. В работе использовали суспензию инактивированного культурального ВБ, штамм «ВНИИЗЖ», полученную путем репродукции вируса в перевиваемой культуре клеток ВНК-21. Процесс очистки и концентрирования включал пять этапов: на первом этапе проводили осаждение суспензии клеток ВНК-21, содержащей антигены ВБ путём центрифугирования при низких скоростях (500g), затем проводили очистку путем осаждения вируса полиэтиленгликолем (2-й этап), дифференциальную элюцию ВБ из полученных осадков с последующим концентрированием вируса ультрацентрифугированием при 45000g (3-й этап), очистку вирусных частиц от сопутствующих белков в ступенчатом градиенте CsCl (4-й этап) и осаждение вируса из градиента (5-й этап).

Получение антигенов вируса бешенства. Гликопротеин ВБ получали из суспензии очищенного ВБ, методом деструкции вирионов тритоном Х-100, с последующим разделением антигенов высокоскоростным центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности CsCl 65000g. Далее проводили очистку полученных антигенов (гликопротеин и РНП) от тритона Х-100 и хлористого цезия с помощью диализа.

РНП ВБ получали из суспензии клеток ВНК-21, инфицированных ВБ (1-й этап при чистке вируса). Клетки разрушали перетиранием в ступке и проводили элюирование из осадка. Далее проводили очистку высокоскоростным центрифугированием (65000g) в ступенчатом градиенте плотности CsCl. Очистку полученного РНП ВБ от хлористого цезия осуществляли путём диализа.

Оценка чистоты и концентрации полученных антигенов. Концентрацию белка в полученных препаратах (ВБ и РНП) определяли по методу Лоури [156].

Степень чистоты контролировали методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия в денатурирующих условиях [121].

Получение поликлональных антител к антигенам вируса бешенства.

Для получения поликлональных антител к РНП ВБ использовали очищенный РНП ВБ, которым иммунизировали кроликов. Очищенный РНП ВБ вводили животным внутримышечно три раза по схеме – 0, 40, 54 дни, в дозе 400 мкг на голову.

Для получения поликлональных антирабических антител использовали инактивированный очищенный ВБ, которым иммунизировали морских свинок.

Антиген вводили животным внутримышечно четырехкратно в дозе 200 мкг на голову с интервалами в одну, пять и две недели.

При иммунизации морских свинок и кроликов первую инъекцию проводили с полным, а последующие - с неполным адъювантом Фрейнда. Через две недели после последней инъекции в сыворотках крови иммунизированных животных определяли титры специфических антител методом твердофазного непрямого варианта ИФА. Титрование проводили с шагом три, начиная с разведения 1:1000.

В дальнейшей работе использовали сыворотки крови с титрами антител к ВБ и РНП ВБ не ниже 1/243000. Из отобранных сывороток выделяли фракцию IgG методом трехкратного высаливания сульфатом аммония. Концентрацию белка в конечных препаратах определяли методом спектрофотомерии при длине волны 280 нм.

Определение рабочего разведения гликопротеина. Рабочее разведение гликопротеина определяли методом титрования в ИФА с использованием антирабического иммуноглобулина кролика и сыворотки неиммунного кролика. В качестве конъюгата использовали диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика, меченные пероксидазой (производства ГУ НИИЭМ имени Н.Ф. Гамалеи), субстрат – ОФД (ортофенилендиамин) «Sigma». Рабочее разведение определяли исходя из показаний ОП на спектрофотометре при длине волны 492 нм. За рабочее разведение гликопротеина принимали такое его разведение, при котором достигается наибольшее значение соотношения величины ОП суспензии содержащей иммуноглобулин к величине ОП соответствующего разведения неиммунной сыворотки.

Получение антирабического пероксидазного коньюгата. Для получения антирабического пероксидазного коньюгата использовали поликлональные антирабические антитела морских свинок. Конъюгаты антител были получены по методу Накане [19] с некоторыми модификациями. Суть метода в модификации пероксидазы хрена с образованием активных альдегидных групп, которые затем реагируют с аминогруппами антител с образованием основания Шиффа.

Альдегидные группы в пероксидазе возникают при окислении периодатом натрия углеводных компонентов фермента, аминогруппы которого, чтобы не происходило полимеризации окисленной пероксидазы, предварительно блокированы 1-фтор-2,4-динитробензолом или протонированы.

Определение рабочего разведения антирабического конъюгата. Рабочее разведение антирабического пероксидазного конъюгата предварительно определяли в прямом сэндвич-варианте ИФА методом последовательных разведений, с использованием положительного и отрицательного контрольных препаратов. В качестве улавливающих антител использовали иммуноглобулины кролика специфичные к РНП ВБ. Затем вносили положительный и отрицательный контрольные препараты. Титруемый конъюгат вносили в разных разведениях, в качестве субстрата для пероксидазы использовали – ОФД «Sigma». Показания ОП снимали на спектрофотометре при длине волны 492 нм. За рабочее разведение пероксидазного конъюгата принимали наибольшее разведение, при котором средняя ОП положительного контроля составляла более 2,1. Средняя ОП отрицательного контроля выбранного разведения конъюгата не должна была превышать 0,1 оптической единицы.

Определение рабочего разведения универсального конъюгата. Рабочее разведение универсального конъюгата (белок А – пероксидаза) определяли в ИФА с использованием антирабического иммуноглобулина кролика. За рабочее разведение универсального конъюгата принимали такое его разведение, при котором достигалось оптимальное соотношение величины оптического сигнала с антирабическим иммуноглобулином (за исключением разведений иммуноглобулина со сверхизбыточным по величине сигналом ОП) к средней величине оптического сигнала в лунках, соответствующих разведению титруемого конъюгата, куда не вносили иммуноглобулин.

РИФ. Постановку прямого варианта РИФ осуществляли в соответствии с ГОСТом 26075-84 с некоторыми модификациями. Мазки-отпечатки готовили из кусочков коры больших полушарий, мозжечка, аммонового рога и продолговатого мозга. Препараты высушивали при комнатной температуре с использованием направленного ламинарного потока воздуха и фиксировали в охлажденном ацетоне при минус 20°С не менее одного часа. Фиксированные препараты высушивали и окрашивали с использованием антирабического ФИТЦиммуноглобулина. Для этого на каждый мазок наносили 0,05 мл рабочего разведения ФИТЦ-иммуноглобулина и инкубировали во влажной камере при температуре 37°С в течение 30 минут. Затем препараты дважды промывали в ФСБ при комнатной температуре в течение 10 минут и один раз в течение пяти минут в дистиллированной воде, высушивали и исследовали с использованием флуоресцентного микроскопа при увеличении 400.

Интенсивность реакции учитывали общепринятым методом в крестах: «+»

заметная, но слабо выраженная специфическая флуоресценция с неотчётливо выявляемым цветом; «++» выраженная специфическая флуоресценция с отчётливо выявляемым цветом; «+++» яркая специфическая флуоресценция с хорошо выявляемым цветом; «++++» специфическая сверкающая флуоресценция яркого цвета; «» специфическая флуоресценция отсутствует.

Биопроба на мышах. Постановку биопробы на мышах проводили в соответствии с ГОСТом 26075-84 «Методы лабораторной диагностики бешенства». Для этого готовили 10% суспензию головного мозга на ФСБ (pH 7,4) с добавлением гентамицина в качестве антибиотика, проводили один цикл замораживания и оттаивания, центрифугировали при 1000g в течение пяти минут.

Полученный супернатант использовали для заражения мышей. Для исследования каждой пробы использовали по шесть мышей. Мышей заражали интрацеребрально в дозе 0,03 мл. За зараженными мышами наблюдали в течение 30 дней. Гибель мышей в первые 48 часов после заражения считали не специфической. Головной мозг мышей, погибших в более поздние сроки, исследовали в РИФ для подтверждения специфичности их гибели.

Для определения Реакция нейтрализации на культуре клеток.

количества ВНА использовали два варианта реакции нейтрализации в культуре клеток: FAVN и RFFIT. Их использовали в соответствии с разработанными в ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Методическими указаниями по определению вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках крови животных в реакции нейтрализации в культуре клеток ВНК-21 (FAVN)» и «Методические указания по определению вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции нейтрализации в культуре клеток ВНК-21 (RFFIT)».

Определение уровня антител к гликопротеину вируса бешенства.

Уровень антител к гликопротеину ВБ определяли в соответствии с разработанными «Методическими указаниями по определению антител к гликопротеину вируса бешенства в сыворотках крови животных в иммуноферментном анализе» (см. Приложение В).



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Похожие работы:

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.