WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ПЕРВЫЕ ЭТАПЫ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ...»

-- [ Страница 3 ] --

В исследовании зависимости адгезии бактерий S. epidermidis 33 от их физиологического состояния при разных температурах окружающей среды установлено, что повышение температуры среды от 10 до 30°С приводило к практически одинаковому линейному возрастанию сорбции обеих групп клеток на полистироловой поверхности (Рисунок 10). Однако, при дальнейшем возрастании температуры до 42°С наблюдалось значительное увеличение адгезии клеток лог-фазы, в то время как динамика сорбции бактерий стационарной фазы оставалась прежней.

Несмотря на то, что проведенные эксперименты не выявили увеличения сорбционной активности клеток S. epidermidis 33 при температурах ниже 30°С, как то было показано для клинических изолятов S. epidermidis (Fitzpatrick et al.,

2005) и для S. epidermidis Staph 1597 при температурах 22 и 6 °С (Jaglic et al., 2011), результаты исследований согласуются с данными о том, что температурный стресс (42 °С) может усиливать адгезию стафилококков (Rachid et al., 2000). Одновременно с этим, пониженные температуры (25 °C) характеризуются сниженным числом сорбированных клеток (Hol et al., 2006).

Вероятнее всего, данный эффект связан с тем, что низкая температура повышает гидрофильные свойства клеток, что отрицательно влияет на способность бактерий S. epidermidis связываться с гидрофобными поверхностями, например, с полистиролом (Rode et al., 2007).

* различия статистически значимы при сравнении с бактериями стационарной фазы (p0,05) Рисунок 10. Адгезия бактерий S. epidermidis 33 логарифмической и стационарной фаз роста бактериальной популяции в среде LB при разных температурах.

4.3. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от кислотности среды Кислотность среды способна оказывать значительное влияние на первые этапы образования биопленок бактериями S. epidermidis за счет изменения заряда и гидрофобности поверхностных структур клеток (Chvez de Paz et al., 2007;

Dunne Jr and Burd, 1992; Zmantar et al., 2010).

Установлено, что изменение рН среды от кислых (рН 4) до слабощелочных (рН 8) значений не оказывало какого-либо значительного влияния на интенсивность сорбции бактерий S. epidermidis 33 стационарной фазы роста. В то же время для бактерий лог-фазы была характерна тенденция снижения адгезии в слабокислой зоне, достигавшая статистически значимого отличия при рН 4,0, и некоторое увеличение числа сорбированных клеток в слабощелочной зоне (Рисунок 11). Полученные результаты согласуются с данными об усилении адгезии бактерий некоторых штаммов S. epidermidis к поверхности полистирола при инкубации в слабощелочной среде (pH 8,0) (Dunne Jr and Burd, 1992).

Возможно, данный эффект связан с тем, что в щелочной среде бактериальные клетки наиболее склонны к агрегации с образованием кластеров из-за увеличения продукции внеклеточных белков (Chvez de Paz et al., 2007).

–  –  –

* рН * различия статистически значимы при сравнении с данными при рН 7,0 (p0,05) Рисунок 11. Влияние кислотности среды LB на адгезию бактерий S. epidermidis 33 логарифмической и стационарной фаз роста бактериальной популяции.

Полученные нами результаты согласуются также с данными о том, что при кислых значениях рН (3–6) адгезия бактерий S. epidermidis, в основном, ниже, чем в нейтральной среде при рН 7,0 (Dunne Jr and Burd, 1992; Zmantar et al., 2010).

Предполагается, что этот эффект может быть связано с изменением характера диссоциации D-аланиновых остатков в тейхоевых и липотейхоевых кислотах при снижении кислотности среды, что, в свою очередь, приводит к изменению уровня поверхностного заряда бактериальных клеток (Nostro et al., 2012).

4.4. Влияние осмолярности среды на адгезию и образование биопленок бактерий S. epidermidis Повышение осмолярности среды инкубации бактерий оказывает различное влияние на адгезивные свойства клеток. Так, показано, что адгезия бактерий S. epidermidis RP62A снижается при повышении содержания NaCl в среде до 0,776 М (Stewart et al., 2013), в то же время, при концентрации 0,85 М NaCl сорбция бактерий S. epidermidis 220-1 повышается по сравнению с бессолевым контролем (Rachid et al., 2000). Поэтому была проведена оценка влияния осмолярности среды на первые этапы образования биопленок всеми использованными в работе штаммами S. epidermidis (Рисунок 12).

Б 0.4

–  –  –

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p0,05) Рисунок 12. Влияние присутствия NaCl в среде LB на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis.

Аналогичные данные были получены при исследовании пленкообразования бактериями S. epidermidis (Stewart et al., 2013). Вероятно, данный эффект соли на сорбцию бактерий обусловлен тем, что инкубация даже в 0,9% (0,14 М) растворе NaCl индуцирует снижение экспрессии белка AtlE, основного аутолизина стафилококков, отвечающего за связывание бактерий непосредственно с полимерной поверхностью (Heilmann et al., 1997), как в планктонных, так и в прикрепленных к поверхности полистирола клетках (Vandecasteele et al., 2003). В тоже время показано, что добавление в питательную среду 0,68 М NaCl репрессирует синтез белка Aap (Hennig et al., 2007), необходимого для образования биопленок некоторыми штаммами S. epidermidis (Hussain et al., 1997).

Внесение более низких концентраций NaCl в среду инкубации S. epidermidis 33 практически не оказывали влияния на интенсивность адгезии бактерий к полистиролу. Незначительный стимулирующий сорбцию эффект, как логарифмических, так и стационарных клеток S. epidermidis 33, наблюдался при добавлении 50 мМ NaCl или KCl (Рисунок 13).

Количество клеток/поле зрения

* различия статистически значимы при сравнении с данными при 0 мМ (p0,05) Рисунок 13. Влияние ионов одновалентных металлов на адгезию к поверхностям полистирола бактерий S. epidermidis 33 логарифмической и стационарной фаз роста бактериальной популяции.

Действительно, известно, что адгезия бактерий может усиливаться при небольших концентрациях NaCl (менее 0,1 M) (Gordon and Millero, 1984). Кроме того экспериментально показано, что при содержании в среде 50 мМ NaCl происходит агрегация клеток стафилококков, бактерии собраны в крупные агломераты и одиночные клетки практически не обнаруживаются (Рисунок 14).

Возможно, увеличение скорости осаждения таких структур и облегчает их адгезию.

Рисунок 14. Микрофотографии клеток S. epidermidis 33 при адгезии в среде LB с разным содержанием NaCl (2500, микровизор µViso – 103, «Ломо», Россия): А – 0 мМ (контроль), Б – 50 мМ.

–  –  –

полистироловых и гидрофильных стеклянных поверхностях. Из данных, представленных на Рисунке 15, видно, что в контроле (растворе, не содержащем NaCl) численность бактерий, адгезированных на разных типах поверхностей, отличается почти в два раза.

* различия статистически значимы при сравнении с данными на стекле (p0,05) Рисунок 15. Влияние осмотической силы раствора на адгезию бактерий S. epidermidis 33 на стекле и полистироле.

Данный факт согласуется с известным мнением, что адгезия бактерий S. epidermidis на поверхности гидрофобных материалов выше, чем на гидрофильной поверхности стекла (Cerca et al., 2005b). Однако, с повышением концентрации соли в среде инкубации адгезия на стекле и полистироле снижалась, а при концентрации 1,0–2,0 М NaCl разница в количестве сорбированных клеток на разных типах поверхности нивелировалась. Известно, что стафилококки сохраняют жизнеспособностью в высокомолярных растворах NaCl (Шлегель, 1987), очевидно, поэтому в течение экспериментов количество живых клеток в среде оставалось постоянным.

Отмеченное нами ингибирующее действие высоких концентрациях ионов Na+ на адгезию может быть связано со способностью этих ионов не специфически связываться с отрицательно-заряженными группами на поверхности клеточной стенки, например тейхоевых, тейхоуроновых кислот, а также пептидогликана (Потехина, 2006). Вследствие этого, отрицательный поверхностный заряд бактериальных клеток снижается, что в свою очередь, приводит к изменению численности сорбированных клеток.

4.5. Адгезия и образование биопленок бактериями S. epidermidis при внесении в среду глюкозы Хорошо известно, что образование биопленок некоторыми штаммами КНС усиливается при внесении в среду роста глюкозы (Mack et al., 1992; Rachid et al., 2000).

Однако, результаты изучения возможных зависимостей адгезии и накопления биомассы пленок бактериями S. epidermidis от содержания в среде роста глюкозы показали, что концентрация 0,5% не приводила к значительным изменениям ни в количестве сорбированных на поверхности полистирола клеток, ни в биомассе образованных пленок (Рисунок 16).

Некоторыми авторами также отмечалось отсутствие влияния глюкозы на адгезионную активность и формирование биопленок бактерий S. epidermidis. В большинстве случаев, данный эффект связывали с PIA-отрицательным фенотипом изученных штаммов (Hennig, et al., 2007; Michu et al., 2011). Действительно, отсутствие способности к синтезу PIA у исследованных штаммов стафилококков было показано выше с помощью тестирования с использованием индикатора Конго красный (Рисунок 2).

Рисунок 16. Влияние присутствия глюкозы в среде LB на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis.

Таким образом, изменение физико-химических условий среды вследствие вариабельности гидродинамических усилий, температурного режима, кислотности и осмолярности среды приводит к существенным изменениям сорбционных характеристик и биопленкообразующей способности бактерий S. epidermidis.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ, МЕНЯЮЩИХ СВОЙСТВА

БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОВЕРХНОСТИ, НА АДГЕЗИЮ И ОБРАЗОВАНИЕ

БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS

5.1. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от содержания в среде ионов двухвалентных металлов Учитывая данные о наличии в пленках стафилококков белковых компонентов (Gtz, 2002), было проведено изучение влияния на адгезию и рост формирующихся пленок ионов биологически активных металлов, так как известно, что их присутствие во многом определяет активность внеклеточных протеаз и пептидаз (Mikhailova et al., 2005).

Исследования показали, что наличие в среде культивирования катионов кальция снижает количество сорбированных клеток и интенсивность формирования биопленок S. epidermidis 33. Количество адгезированных клеток штаммов 12228 и 29887 практически не меняется в присутствии Ca2+, однако интенсивность формирования пленок снижается в 2 раза (Рисунок 17).

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p0,05) Рисунок 17. Влияние ионов кальция (2,5 мМ) и цинка (2,5 мМ) в среде LB на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis.

Обнаружено также, что ингибирующим эффектом как на адгезию, так и образование биопленок для всех исследованных штаммов S. epidermidis обладают ионы цинка (2,5 мМ). Влияние ионов цинка наиболее значительно проявляется на первых этапах образования биопленок, приводя к уменьшению числа сорбированных клеток на 85–97 %, при этом образование биопленок снижается всего в 1,5-2 раза (Рисунок 17).

Отмечено, что ингибирующий эффект ионов цинка не связан с его бактерицидным действием, так как количество живых клеток после 30 мин адгезии не изменилось по сравнению с контролем (Таблица 6).

Таблица 6 Количество КОЕ после адгезии в течение 30 мин в среде LB с добавлением ионов кальция и цинка (х107 КОЕ/мл) Штамм S. epidermidis 33 S. epidermidis 12228 S. epidermidis 29887 Среда LB 1,9±0,2 1,1±0,2 1,1±0,4 2+ LB+Ca (2,5 мМ) 2,0±0,5 1,0±0,3 0,7±0,2 LB+Zn2+ (2,5 мМ) 2,1±0,2 1,2±0,4 1,5±0,6 Для более детального изучения влияния двухвалентных катионов было проведено исследование адгезии и образования биопленок бактериями S. epidermidis 33 при внесении в среду двухвалентных катионов (Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+) в диапазоне концентраций от 0 до 2,5 мМ (Рисунок 18). Результаты экспериментов (Рисунок 18А, Г) показали, что увеличение концентрации ионов кальция и марганца в среде культивирования до 0,5 мМ ведет к незначительной активации образования биопленок. Дальнейшее увеличение содержания ионов Ca2+ Mn2+ в и среде оказывал ингибирующий эффект на процессы пленкообразования.

Важно отметить, что возрастание содержания в среде ионов Mg2+ до 2,5 мМ повышает способность бактерий образовывать биопленки примерно в 2 раза (Рисунок 18Б). В тоже время, присутствие в среде ионов цинка оказывает ингибирующее действие на образование биопленок (Рисунок 18В), начиная от самой минимальной исследованной концентрации. Одновременно с этим, адгезия бактериальных клеток в значительной мере подавляется в присутствии всех исследованных в работе катионов.

Выраженное ингибирование пленкообразования S. epidermidis 33 при введении в среду роста ионов Ca2+, Zn2+, Mn2+ может рассматриваться как следствие активации внеклеточных протеолитических ферментов (Gossas and Danielson, 2006), приводящей к дефициту полноценных белковых компонентов, необходимых для построения матрикса формирующихся биопленок коагулазонегативных стафилококков.

Рисунок 18. Влияние содержания в среде LB ионов металлов Ca2+ (А), Mg2+ (Б), Zn2+ (В), Mn2+ (Г) на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis 33.

Известно, что ионы кальция и марганца способны ингибировать адгезию к полистиролу, межклеточную агрегацию и образование Bap-зависимых биопленок бактериями S. aureus (Arrizubieta et al., 2004). По-видимому, это обусловлено связыванием ионов кальция с белком Bap через EF-мотив данного белка, что приводит к неспособности к межклеточной агрегации и, тем самым, к образованию биопленок. Можно предположить, что подобный эффект характерен и для бактерий S. epidermidis, обладающих PIA-отрицательным фенотипом. Считается, что за адгезию стафилококков ответственны белки клеточной стенки Aap и SasG, которые имеют Zn-связывающие домены (Conrady et al., 2008). В соответствии с этим можно предположить, что избыток ионов цинка способен оказывать влияние на количество сорбированных клеток. Ионы марганца, возможно, связывались с этими белками не специфически, и тем самым, по-видимому, могли блокировать их основные функции и приводить к заметному снижению способности клеток стафилококков сорбироваться на поверхности полистирола.

Кроме того, в составе клеточной стенки грамположительных бактерий имеются компоненты (экзополисахариды, липотейхоевые кислоты), способные связывать ионы кальция (Josefsson et al., 1998; Потехина, 2006). Важно отметить, что такое неспецифическое связывание металлов с поверхностными структурами бактерий может приводить к изменению их электростатических свойств.

Действительно, результаты исследования влияния двухвалентных катионов на дзета-потенциал клеток S. epidermidis 33 подтвердили предположение об их способности оказывать влияние на электрический заряд бактериальных клеток (Таблица 7). Максимальное действие на величину дзета-потенциала бактериальных клеток оказывали ионы магния, изменяя его практически на 30%, меньший эффект проявляли ионы кальция, цинка (на 20 и 18%, соответственно) и, наконец, ионы марганца, вызывавшие изменение дзета-потенциала лишь на 7%.

Таблица 7 Дзета-потенциал клеток S. epidermidis 33 в среде LB, содержащей ионы двухвалентных металлов Mg2+ Ca2+ Zn2+ Mn2+ Контроль Среда (LB без KCl) (2,5 мМ) (2,5 мМ) (2,5 мВ) (2,5 мМ) Дзетапотенциал, mV * различия статистически значимы при сравнении с контролем (p0,05) Таким образом, присутствие двухвалентных катионов в среде, по-видимому, оказывает влияние на адгезию бактерий S. epidermidis с помощью двух различных механизмов: специфического связывания с белками и неспецифического связывания с отрицательно-заряженными группировками на поверхности бактериальных клеток, приводящего к изменению дзета-потенциала клеток.

5.2. Влияние ЭДТА на адгезию и развитие биопленок бактериями S. epidermidis Как было показано выше, катионы двухвалентных металлов обладают значительном влиянием на первые этапы взаимодействия бактериальных клеток с поверхностями материала. Поэтому присутствие в среде ЭДТА, известного в качестве универсального хелатирующего агента, также может оказывать ингибирующее действие на процессы сорбции бактериальных клеток на полистироле (Dunne Jr and Burd, 1992).

Действительно, внесение в среду ЭДТА (2,5 мМ) вызывало ингибирование процесса адгезии бактерий всех использованных в работе штаммов, а так же снижение интенсивности образования биопленок у S. epidermidis 33 и 29887 почти в 3 раза (Рисунок 19).

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p0,05) Рисунок 19. Влияние ЭДТА в среде LB на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis.

Для более детального изучения влияния ЭДТА было проведено исследование адгезии бактериями S. epidermidis 33 в диапазоне концентраций 0,5 до 10 мМ ЭДТА (Рисунок 20). Показано, что заметное снижение количества сорбированных клеток выявляется при 0,5–1 мM ЭДТА, что соответствует 0,5– 1хМПК этого соединения для данного штамма (Таблица 4), при этом, отмечено, что количество живых клеток во всем диапазоне исследованных концентраций остается одинаковым в течение 30 мин (Рисунок 20).

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB без ЭДТА) (p0,05) Рисунок 20. Зависимость количества сорбированных на полистироле и живых клеток бактерий S. epidermidis 33 от содержания ЭДТА в среде LB в течение 30 мин.

Полученные данные подтверждаются исследованием Juda et al., в котором было обнаружено, что процессы адгезии и формирования биопленок шестью клиническими изолятами S. epidermidis на поверхности полимерного материала ингибируются внесением в среду культивирования ЭДTA в концентрациях 1,0– 2,0 мМ (Juda et al., 2008).

В присутствии ЭДТА продукция внеклеточных полимерных веществ клиническими изолятами S. epidermidis значительно сокращалась (Ozerdem Akpolat et al., 2003). Известно также, что внесение ионов двухвалентных металлов к содержащей ЭДТА среде не восстанавливает прежний уровень биопленки, что означает, что действие ЭДТА основано не на хелаторных свойствах (Chang et al., 2012). Хотя механизм ингибиторного действия ЭДТА до конца не ясен, существует предположение, что действие ЭДТА, по-видимому, не связано с внешними компонентами бактериальных клеток, так как сканирующая электронная микроскопия не выявила каких-либо выраженных морфологических изменений в клеточных стенках бактерий после обработки их ЭДТА (Root et al., 1988). Также считается, что эффект ЭДТА может быть связан с предполагаемыми биоцидными свойствами молекулы (Percival et al., 2005).

5.3. Действие детергентов на адгезию бактерий S. epidermidis Специальные исследования были посвящены изучению сорбции бактерий S. epidermidis 33 в присутствии поверхностно-активных соединений. Так, тритон Х-100 и додецилсульфат натрия (SDS) в концентрации 0,1хМПК (Таблица 8), вызывали снижение количества прикрепившихся к полистиролу клеток на 50 – 75 % (Рисунок 21). Выявлено, что SDS оказывает практически одинаковое действие, как в водном растворе, так и в питательной среде LB, тогда как внесение тритона X-100 и цетавлона в питательную среду оказывает на адгезию менее выраженное действие, чем в водных растворах этих детергентов.

–  –  –

Ингибирующее действие детергентов на адгезию, скорее всего, связано с их способностью удалять белковые компоненты с поверхности клеточной стенки (Paul and Jeffrey, 1985).

Для сравнительной оценки силы связывания клеток S. epidermidis 33 с поверхностью полистирола исследовали устойчивость сорбированных в течение 30 мин бактерий S. epidermidis 33 к действию детергентов. Инкубация с растворами детергентов (0,1хМПК) в воде или питательной среде LB в течение 30 мин не приводила к достоверным изменениям количества сорбированных клеток (Рисунок 22).

–  –  –

Рисунок 22. Устойчивость сорбированных в течение 30 мин бактерий S. epidermidis 33 к действию детергентов.

S. epidermidis 33 Устойчивость бактерий к обработке детергентами, вероятнее всего, обусловлена тем, что за изученный период времени бактерии этого штамма способны необратимо связываться с поверхностью полистирола.

Действительно, согласно данным литературы, попытки удаления детергентами связавшихся с поверхностью стафилококков обычно мало эффективны (Gibson et al., 1999). Несмотря на то, что такая обработка может приводить к снижению количества живых бактерий, убитые клетки не теряют своей целостности и остаются прочно связанными с поверхностью (Gibson et al., 1999).

5.4. Влияние бактерицидных соединений на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis Эффективность антибиотических соединений во многом определяется чувствительностью к ним процессов формирования биопленок бактерий.

Известно, что этанол обладает выраженным бактерицидным действием на планктонные бактерии, однако, добавление в среду инкубации этанола, нпропанола и изопропанола в концентрации 2 об.% способно индуцировать образование биопленок бактериями S. epidermidis (Chaieb et al., 2011; Knobloch et al., 2002; Rachid et al., 2000).

Следует отметить, что имеются данные о том, что при субингибиторных концентрациях (до 0,25%) перекиси водорода, хорошо известного бактерицидного соединения, применяемого для обеззараживания поверхности кожи, заметно повышается образование биопленок на поверхности полистирола бактериями S. epidermidis (Chaieb et al., 2011), E. coli, S. aureus и K. pneumoniae (Бухарин и Сгибнев, 2012). И лишь повышение концентрации этого соединения в среде до 5% снижает образование биопленок бактерий S. epidermidis (Chaieb et al., 2011).

Наши исследования показали, что внесение этанола в среду (2 об.%) не влияет на интенсивность адгезии всех использованных в работе штаммов, но оказывает ингибирующее действие на формирование биопленок S. epidermidis 33 и 29887 (Рисунок 23).

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p0,05) Рисунок 23. Влияние этанола (2 об.%) и перекиси водорода (0,004 об.%) в среде LB на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis.

При изучении влияния перекиси водорода на адгезию и формирование биопленок показано, что присутствие в среде активных форм кислорода, продуцируемых при внесении этого соединения в среду инкубации, оказывает более выраженное влияние на процесс адгезии бактериальных клеток, чем на процесс формирования биопленок бактериями S. epidermidis. Так, внесение перекиси водорода в концентрации 0,004% снижает количество сорбированных на поверхностях полистирола клеток всех использованных в работе штаммов на 20но только в отношении одного штамма (S. epidermidis 33) проявляет выраженное ингибирующее развитие биопленок действие (Рисунок 23).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что сорбционная активность и процессы пленкообразования исследованных нами коагулазонегативных стафилококков достоверно снижаются при внесении в среду инкубации перекиси водорода и этанола в субингибиторных концентрациях.

S. epidermidis При изучении зависимости адгезии бактерий 33 от содержания этанола в среде показано, что внесение спирта в среду приводило к снижению связывания бактериальных клеток с поверхностью полистирола, несмотря на то, что концентрация живых клеток остается неизменной во всем диапазоне исследованных концентраций спирта (Рисунок 24). Обнаружено, что влияние этанола на процесс адгезии носило линейный дозозависимый характер.

Полученные результаты согласуются с данными других авторов, что повышение содержание этанола в среде (4 об.%) однозначно приводит к замедлению темпов сорбции и формирования биопленок бактериями S. epidermidis (Chaieb et al., 2011;

Knobloch et al., 2002).

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (0%) (p0,05) Рисунок 24. Зависимость количества сорбированных на полистироле и живых клеток бактерий S. epidermidis 33 от содержания этанола в среде LB в течение 30 мин.

–  –  –

Изучение действия ионофоров на бактерии, суспендированные в питательной среде LB, показало, что лишь наличие в среде нигерицина не оказывает существенного действия ни на адгезию бактерий, ни на образование биопленок (Рисунок 25). В то время как присутствие валиномицина вызывало снижение количества сорбированных на полистироле бактерий S. epidermidis 12228, а также интенсивность образования биопленок S. epidermidis 12228 и

29887. Аналогичное действие на формирование биопленок этих штаммов отмечалось в присутствии СССР.

Количество клеток/поле зрения 0.4 Б 0.3 0.2 ** ** 0.1

–  –  –

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB+спирт) (p0,05) Рисунок 25. Действие мембранотропных соединений (10-6 М) на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis в среде LB.

Скорее всего, данный эффект связан с тем, что в клетках стафилококков СССР вызывает снижение обеих составляющих трансмембранного потенциала, в то время, как валиномицин снижает его электрическую компоненту, а нигерицин снижает лишь значение рН (Vinnikov et al., 1989). Таким образом, результаты экспериментов свидетельствуют о том, что наибольший вклад в адгезию бактерий S. epidermidis вносит электрическая составляющая мембранного потенциала, в то время как изменение рН оказывает значительно меньшее влияние на процессы сорбции и развития биопленок данными бактериями.

5.6. Действие гидролитических ферментов, периодата натрия и ДНК на адгезию и формирование биопленок бактериями S. epidermidis Известно, что препараты различных гидролитических ферментов, а также факторы, окисляющие -гликольные группировки в углеводах, оказывают существенное влияние на процессы колонизации стафилококками абиотических поверхностей (Hussain et al., 1997; Izano et al., 2008; Rohde et al., 2005).

Действительно, как показали наши исследования, внесение в инкубационные среды одновременно с инокулируемыми бактериями препаратов ферментов, расщепляющих белки (трипсин), нуклеиновые кислоты (ДНКаза и РНКаза), клеточные стенки бактерий (лизоцим), внеклеточной ДНК и периодата натрия, окисляющего -гликольные группировки углеводных соединений, оказывает значительное влияние на адгезию и образование биопленок (Рисунок 26). Показано, что лизоцим, трипсин и периодат натрия отрицательно влияют на процессы адгезии и формирования биопленок бактериями всех использованных в работе штаммов.

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (p0,05) Рисунок 26. Действие ферментов, препаратов ДНК и периодата натрия на адгезию и образование биопленок бактерий S. epidermidis.

Поскольку трипсин в использованной концентрации не оказывал на тестированные штаммы стафилококков бактерицидного действия, можно предполагать, что в его присутствии происходит гидролиз определенных белков, необходимых для колонизации поверхности и образования биопленки. В то же время, действие лизоцима и периодата натрия, скорее всего, связано с их способностью разрушать пептидогликан и его углеводные компоненты.

Разрушение внеклеточной ДНК под действием ДНКазы подавляет формирование биопленок, начиная с процесса прикрепления бактерий к поверхности. Исключение составлял штамм S. epidermidis 29887, формирующий биопленки в присутствие ДНКазы на уровне, сравнимом с контролем. Важно отметить, что добавление внеклеточной ДНК (ДНК КРС) не оказывало значительного эффекта на процессы адгезии и формирования биопленок для всех изученных штаммов.

В результате экспериментов были обнаружены небольшие отличия между действием РНКазы на бактерии разных штаммов. Так, при внесении этого фермента бактерии S. epidermidis 12228 характеризовались более высоким уровнем сорбции в течение 30 мин. В то же время, наличие РНКазы в питательной среде угнетало развитие биопленок бактерий S. epidermidis 29887, не оказывая влияния на сорбцию этих бактерий.

Более детальное изучение влияния гидролитических ферментов на процесс бактериальной адгезии проведено на бактериях S. epidermidis 33. Для этого исследовали эффекты лизостафина и лизоцима в широком диапазоне концентраций, а так же проводили изучение влияния предобработки бактериальных клеток гидролитическими ферментами (трипсином, протеиназой К и лизоцимом) на интенсивность дальнейшей адгезии по сравнению с адгезией в присутствии этих ферментов.

Показано, что действие лизоцима и лизостафина на процесс адгезии, во многом, определялось концентрацией фермента в среде (Рисунок 27). Кроме того, лизостафин при использованных концентрациях вызывал резкое снижение уровня сорбированных на поверхности полистирола клеток, проявляя также выраженное бактерицидное действие (Рисунок 27А). Как видно из Рисунка 27Б антиадгезионный эффект был характерен и для лизоцима, но снижение числа связанных с поверхностью клеток наблюдалось только при концентрациях, выше 5 мкг/мл. Высокие концентрации нативного лизоцима (5 мкг/мл), которые, повидимому, не оказывали губительного действия на клетки в течение использованного периода времени, снижали адгезию клеток примерно в 2 раза.

Следует отметить, что инактивированный термической обработкой препарат лизоцима также был способен оказывать небольшое ингибирующее действие на адгезию бактерий S. epidermidis 33.

А Б 10 8 * *

–  –  –

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (p0,05) Рисунок 27. Действие лизостафина (А) и лизоцима (Б) на численность живых планктонных и сорбированных на полистироле клеток бактерий S. epidermidis 33 в течение 30 мин.

Представляют интерес результаты сравнительного изучения эффективности действия различных гидролаз (лизоцима, трипсина, бактериальной протеазы (Streptococcus griseus)) на сорбцию бактерий S. epidermidis 33 на поверхности полистирола как непосредственно после предобработки ферментами бактериальных клеток в течение 30 мин, так и при одновременном с бактериями внесении этих ферментов в среду инкубации. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение в среду инкубации нативных гидролаз приводит к снижению числа сорбированных клеток на 60% (трипсин), 75% (протеаза) и 55% (лизоцим) по сравнению с контролем (Рисунок 28). Тогда как в присутствии инактивированной протеазы количество сорбирующихся на поверхности полистирола бактерий не отличалось от контроля. Предобработка бактериальных клеток нативными и инактивированными протеазами повышала их адгезию в 1,5-2 раза, в то время как обработка бактерий лизоцимом приводила к заметному снижению числа прикрепленных клеток (Рисунок 28Б).

Количество клеток/

–  –  –

Многие исследователи придерживаются мнения, что присутствие экзогенной ДНК (экзДНК), одного из компонентов матрикса зрелых биопленок некоторых бактерий, способствует сорбции клеток благодаря увеличению интенсивности кислотно-основных взаимодействий как между клетками и поверхностью, так и непосредственно между бактериальными клетками (Das et al., 2010; Qin et al., 2007b). Последними данными также показано, что удаление экзДНК с поверхности клеток путем обработки ДНКазой не влияет на их дзета-потенциал, но делает поверхности бактериальных клеток более гидрофильными (Regina et al., 2014).

S. epidermidis Изучение влияния экзДНК на адгезию бактерий обнаружило, что разрушение этого полимера путем внесения в среду инкубации ДНКазы на 80 % снижало количество сорбированных клеток. Тогда как инактивированная форма фермента не влияла на процесс бактериальной сорбции (Рисунок 29). Это позволяет сделать вывод о том, что данный эффект не обусловлен неспецифическим белковым взаимодействием. Поскольку гидролиз экзДНК приводил к ингибированию первых этапов образования биопленок, было изучено влияние внесения экзДНК на адгезию бактерий S. epidermidis 33.

Известно, что экзДНК, находящаяся на поверхности бактериальных клеток, не отличается от хромосомной ДНК (Steinberger and Holden, 2005), поэтому в качестве экзДНК использовали различные виды ДНК, аутологичной – выделенной из бактерий изучаемого в работе штамма S. epidermidis 33, а так же бактерий P. acnes и ДНК КРС.

Обнаружено, что внесение в среду инкубации аутологичной ДНК приводило к увеличению числа сорбированных клеток в 1,5 раза (Рисунок 29).

При внесении чужеродных ДНК как бактериального, так и животного происхождения, значительных изменений в количестве связавшихся с поверхностью полистирола клеток не происходило. Полученные данные позволяют сделать вывод, о том, что действие экзДНК на сорбцию клеток стафилококков видоспецифично и, повидимому, определяется физико-химическими свойствами аутологичной ДНК.

* *

–  –  –

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (p0,05) Рисунок 29. Действие внеклеточной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis 33.

Подобный эффект дополнительной экзДНК на адгезию и формирование биопленок был обнаружен для актиномицетов Rhodococcus ruber, однако, усиление образования биопленок происходило как в случае использования собственной, так и чужеродной экзДНК (Gilan and Sivan, 2013).

Установлено, что стимулирующее действие ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis 33 проявляется в отношении живых клеток и зависит от концентрации экзДНК в среде (Рисунок 30).

–  –  –

повышении уровня адсорбированной на поверхности бактериальной клетки ДНК способность бактерий к межклеточной агрегации снижается (Das et al., 2011).

5.7. Действие гидролитических ферментов и периодата натрия на сформированные биопленки бактерий S. epidermidis Для выявления возможной зависимости действия гидролаз и NaIO4 на процессы адгезии с их воздействием на сформированные биопленки стафилококков была проведена обработка этими факторами суточных биопленок S. epidermidis. Показано, что все использованные протеолитические ферменты, лизостафин, а так же нуклеазы проявляли разрушающее суточные биопленки действие (Рисунок 31). Вместе с тем необходимо отметить, что биопленки всех использованных в работе штаммов были устойчивы к лизоциму и окислительному действию периодата натрия.

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (p0,05) Рисунок 31. Действие ферментов на суточные биопленки бактерий S. epidermidis.

Известно, что устойчивость биопленок стафилококков к действию периодата натрия и лизостафина, в основном, проявляется при отсутствии или низком содержании полисахаридного межклеточного адгезина в матриксе биопленок (Qin et al., 2007a). Биопленки, образованные бактериями с PIAотрицательным фенотипом, так же характеризуются чувствительностью к обработке трипсином (Rohde et al., 2007) и протеиназой К (Kogan et al., 2006), в связи с тем, что основным компонентом матрикса биопленки являются белки.

Действительно, проведенные нами эксперименты показали, что внесение трипсина и протеиназы К вызывало разрушение сформированных биопленок (S.epidermidis 12228 и 29887). Вместе с тем необходимо отметить, что суточные биопленки всех изученных нами штаммов обладали устойчивостью к лизоциму и окислительному действию периодата натрия.

Таким образом, полученные нами результаты действительно свидетельствуют о том, бактерии S. epidermidis 33, 12228 и 29887 используют РIA-независимый механизм формирования биопленок.

Общая сравнительная характеристика действия некоторых гидролаз и периодата натрия на процессы адгезии и формирования биопленок (Рисунок 26), а также разрушения сформированных биопленок бактерий S. epidermidis (Рисунок

31) приведена в Таблице 11.

Таблица 11 Сравнение влияния ферментов и периодата натрия на адгезию, формирование биопленок и суточные биопленки бактерий S. epidermidis Соединение Трипсин Лизоцим ДНКаза РНКаза NaIO4

–  –  –

Обозначения: 1 – адгезия в присутствие фактора (30 мин), 2 – формирование биопленок в присутствие фактора (24 ч), 3 – действие фактора на сформированные биопленки.

«–» – ингибирование, «+» – стимуляция, «0» – эффекта не обнаружено Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, о том, что факторы, ингибирующие процессы адгезии клеток к полистиролу, не всегда оказывают разрушающее действие на сформированные биопленки.

Так, наши исследования показали, что снижение количества сорбированных клеток под действием гидролаз хорошо согласуется с торможением процесса формирования биопленок в целом. Однако, в процессе развития биопленок стафилококков соотношение компонентов в матриксе, вероятнее всего, претерпевает существенные изменения, что приводит к изменению чувствительности биопленок к гидролитическим ферментам по сравнению с их действием на первых этапах развития этих бактериальных сообществ.

Исходя из полученных данных о том, что процессы адгезии и формирования биопленок существенно (в 2 раза) ингибировались трипсином и периодатом натрия, можно предполагать, что поверхностные белковые и углеводные структуры бактерий вносят важный сопоставимый вклад в колонизацию поверхности на первых этапах образования биопленок PIA-отрицательными стафилококками. Данный факт особо интересен в связи с тем, что согласно данным литературы (Rohde et al., 2007) и нашим результатам относительно чувствительности суточных биопленок стафилококков к трипсину и устойчивости к периодату натрия, матрикс суточных биопленок, образованных бактериями исследованных нами штаммов, имеет в своем составе преимущественно белковые компоненты.

Данные литературы свидетельствуют также о том, что ингибирование процесса образования биопленок при добавлении ДНКазы одновременно с инокулятом проявляется в большей степени (Qin et al., 2007b). В тоже время, нашими исследованиями показано, что собственная внеклеточная ДНК играет большую роль на всех этапах развития биопленок PIA-отрицательных стафилококков, так как внесение в среду инкубации ДНКазы вызывало значительное подавление процессов бактериальной колонизации поверхности, а также деструкцию суточных биопленок двух из трех штаммов S. epidermidis.

Несмотря на это, дополнительное внесение в среду инкубации препаратов чужеродной ДНК (КРС) не оказывало влияния на все стадии развития биопленок.

Интересно отметить, что все исследованные бактериальные штаммы проявляли различную чувствительность к действию РНКазы (Таблица 11). В связи с тем, что в литературе практически нет данных о каком-либо действии РНКазы на процессы образования биопленок стафилококков (Qin et al., 2007b), и РНК не считается важным компонентом матрикса биопленок, можно предполагать, что обнаруженные эффекты в первую очередь связаны с разрушением мРНК или тРНК, которые участвуют в процессах синтеза белка.

Таким образом, активными участниками процессов первичной адгезии S. epidermidis бактерий к поверхности полистирола и формирования многослойных клеточных кластеров являются разнообразные поверхностноассоциированные структуры бактерий, в том числе, белковые молекулы и полисахариды. Изменение этих структур за счет взаимодействия с ионами металлов, детергентами, бактерицидными соединениями или вследствие их ферментативного разрушения в большинстве случаев приводит к снижению сорбционных характеристик бактериальных клеток. Важную роль во взаимодействии бактерий S. epidermidis с поверхностью играет изменение поверхностного заряда бактериальных клеток под действием ионов двухвалентных металлов или мембранотропных соединений, а также за счет наличия аутологичной экзогенной ДНК.

ГЛАВА 6. ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА

АДГЕЗИЮ И ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ

S. EPIDERMIDIS

6.1. Действие линезолида на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis Полученные ранее результаты исследований показали, что основным механизмом адгезии и формирования биопленок изученных штаммов стафилококков на полистироле, вероятно, являются белковые взаимодействия, как на межклеточном уровне, так и на уровне «клетка-поверхность». В связи с этим дальнейшие эксперименты были направлены на исследование адгезионной способности клеток стафилококков в присутствии линезолида – антибиотика, ингибирующего синтез белка (Skripkin et al., 2008).

Обнаружено, что линезолид в концентрации 0,05хМПК не оказывал влияния на адгезию и образование биопленок всеми исследованными штаммами стафилококков (Рисунок 32). Внесение антибиотика в концентрации 0,5хМПК (Таблица 4) снижало как адгезию, так и способность образовывать биопленки бактериями S. epidermidis 33, 12228 и 29887 (Рисунок 32).

OD570 * различия статистически значимы при сравнении контролем (LB) (p0,05) Рисунок 32. Влияние линезолида (0,05 и 0,5МПК) на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis.

Известно, что сублетальные концентрации антибиотиков, в том числе линезолида, как и некоторые другие стрессовые факторы (повышение температуры и осмолярности среды, присутствие этанола) способны стимулировать адгезию бактерий S. epidermidis, продуцирующих полисахаридный межклеточный адгезин (Rachid et al., 2000). Однако, в отношении PIAS. epidermidis отрицательных бактерий антибиотики в субингибиторных концентрациях, в основном, оказывают отрицательное действие на процессы сорбции бактериальных клеток (Pascual et al., 1986; Cerca et al., 2005a).

6.2. Действие антибактериальных пептидов на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis Показано, что низкомолекулярные катионные пептиды особенно эффективны в отношении начальных этапов образования биопленок стафилококками (Overhage et al., 2008, Sandiford and Upton, 2012). В связи с этим, нами проведено изучение процессов адгезии бактерий S. epidermidis при введении в инкубационные среды низкомолекулярных катионных пептидов.

Низкомолекулярные катионные пептиды варнерин и хоминин были выделены из сред культивирования бактерий S. warneri KL-1 (Коробов и др.,

2010) и S. hominis KLP-1 (Патент РФ № 2528055).

Как показали результаты экспериментов, введение в среду иинкубации низкомолекулярного катионного пептида варнерина в концентрациях 1х и 10х МПК (Таблица 4) резко снижало сорбционную активность клеток всех исследованных штаммов стафилококков на поверхности полистирола, в том числе бактерий штамма S. epidermidis ATCC®29887, обладающего устойчивостью к метициллину (Рисунок 33).

В связи с тем, что внесение варнерина в среду инкубации не приводило к значительному сокращению количества живых клеток в течение 30 мин (Рисунок 33), можно предполагать, что его антиадгезионная активность не связана напрямую с его бактерицидным действием.

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (без пептида) (p0,05) Рисунок 33. Динамика численности живых планктонных и сорбированных на полистироле клеток бактерий S. epidermidis при возрастании концентрации варнерина в среде.

В дальнейших экспериментах проведен сравнительный анализ действия исследуемых пептидов на адгезию живых и убитых нагреванием бактерий S. epidermidis 33 к различным поверхностям. В контрольных экспериментах бактерии инкубировали в изотоническом растворе NaCl. В экспериментах с живыми клетками бактерий S. epidermidis 33 присутствие в среде обоих пептидов (0,5 мкг/мл) приводило к снижению числа сорбированных клеток как на гидрофобной поверхности полистирола, так и гидрофильной поверхности стекла практически в 2 раза. При этом, присутствие в среде как варнерина, так и хоминина не оказывало влияния на адгезию термостатированных клеток (Рисунок 34).

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (p0,05) Рисунок 34. Действие катионных пептидов варнерина (W) и хоминина (H) на адгезию живых и убитых бактерий S. epidermidis 33 на поверхностях стекла и полистирола.

–  –  –

Таким образом, можно сделать вывод, что изученные антибактериальные пептиды проявляю свой антиадгезионный эффект только в отношении живых клеток стафилококков. Под действием варнерина и хоминина уровень адгезии живых бактерий снижается до уровня сорбции мертвых клеток. Кроме того, ранее уже упоминалось, что живые и убитые с помощью термической обработки бактерии S.

epidermidis отличаются по величине дзета-потенциала (Kodziska et al., 2010). Анализируя данные факты, можно предположить, что основным механизмом действия варнерина и хоминина на адгезию бактерий S. epidermidis к поверхностям стекла и полистирола является изменение дзета-потенциала бактериальных клеток. Антиадгезионные свойства варнерина и хоминина могут быть так же связаны с их способностью связываться с внеклеточной ДНК (Sang and Blecha, 2008), которая способствует сорбции бактерий S. epidermidis благодаря увеличению интенсивности кислотно-основных взаимодействий как и между клетками и поверхностью, так и непосредственно между бактериальными клетками (Das et al., 2010; Qin et al., 2007b).

Анализ литературы свидетельствует о том, что особое внимание исследователей привлекает изучение возможностей подавления бактериального прикрепления и колонизации имплантатов за счет покрытия их поверхностей антимикробными пептидами (Costa et al., 2011). Действительно, в наших экспериментах предобработка поверхностей полистирола растворами обоих пептидов в течение 60 мин приводила к значительному снижению количества адгезированных бактерий (Рисунок 35). Полученные нами данные показали, что снижение уровня адгезии бактерий S. epidermidis 33 на поверхностях полистирола с иммобилизованными пептидами составило 48 % и 67 % от контроля для варнерина и хоминина, соответственно. Тогда как присутствие пептидов в среде инкубации приводило к снижению на 33% и 29% от контроля для варнерина и хоминина, соответственно.

–  –  –

Известно, что механизм действия большинства катионных пептидов связан с образованием нерегулируемых каналов и пор в плазматических мембранах бактериальных клеток (Shai, 1999), однако, имеющиеся в литературе данные указывают на то, что многие катионные пептиды сохраняют свою активность после иммобилизации на полимерных поверхностях (Costa et al., 2011).

В связи с тем, что иммобилизация варнерина и хоминина была проведена с помощью метода физической адсорбции пептидов на поверхности материала, сохранение их активности, скорее всего, связано с непрочным связыванием пептидов с поверхностью полимера. Такая связь определяется только электростатическими или гидрофобными взаимодействиями и может легко разрываться при встрече пептидов с бактериальной клеткой, которая несет больший отрицательный заряд, по сравнению с поверхностью полистирола, и представляет более доступную мишень для положительно заряженных пептидов.

Некоторые исследователи так же отмечают увеличение эффективности иммобилизованной формы пептидов по сравнению с растворимой (Costa et al., 2011). Скорее всего, это связано с непосредственным концентрированием антибактериальных пептидов на границе раздела фаз, где их действие особенно заметно.

Экспериментально было показано, что антиадгезивный эффект варнерина на клетки бактерий S. epidermidis 33 продолжается и после прекращения контакта клеток с пептидом (Рисунок 36).

Количество клеток/поле зрения

–  –  –

* различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (p0,05) Рисунок 36. Влияние предобработки варнерином (W) бактерий S. epidermidis 33 на адгезию к полистиролу.

Так, количество сорбированных бактерий после их контакта с варнерином и отмывки от него буферным раствором снижалось примерно в 5 раз, а после отмывки раствором NaCl всего в 2 раза. Возможный механизм такого действия варнерина на адгезию стафилококков, по-видимому, заключается в связывании пептида на поверхности бактериальных клеток с перманентным проявлением его антибактериальной активности.

Для изучения продолжительности ингибирующего эффекта варнерина и хоминина на развитие биопленок бактериями S. epidermidis после удаления пептидов из среды инкубации бактериальным клеткам позволяли прикрепиться к поверхности полистирола в течение 30 мин в присутствии 1хМПК (Таблица 4) катионных пептидов. Затем пептиды и несвязавшиеся бактерии удаляли с помощью ФБ или раствора NaCl (0,5 M), нейтрализующего действие катионных пептидов, и вносили питательную среду для последующего роста бактерий.

На основании полученных данных установлено, что продолжительность ингибирующего эффекта катионных пептидов различается между бактериями разных штаммов S. epidermidis и составляет 2 – 5,5 ч (Рисунок 37).

Количество клеток/поле зрения

–  –  –

0,8·105 0 4,2·10 1,2·10 2,3·10 0,6·10 1,8·10 1,8·106 1,3·106 3,6·105 1,9·105 4,0·105 3,9·105 1,5 6,8·106 3,9·106 1,2·106 1,7·106 1,1·106 2,4·106 3 1,1·107 1,5·107 0,6·107 1,2·107 0,6·107 1,6·107 4,5 Полученные данные свидетельствуют о том, что молекулы пептидов, связанные с адсорбированными на поверхности бактериальными клетками, не оказывают значительного антибактериального эффекта на планктонные клетки.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Похожие работы:

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Владимирова Элина Джоновна ИНФОРМАЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ЛЕСНОЙ КУНИЦЫ И НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ХИЩНЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ СО СРЕДОЙ ОБИТАНИЯ (CARNIVORA: CANIDAE ET MUSTELIDAE) Том 1 03.02.08 – экология, 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание...»

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«ДЯТЛОВА ВАРВАРА ИВАНОВНА ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Специальность: 03.02.03 – микробиология. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«УДК Тадж: 5+59+634.9 САНГОВ РАДЖАБАЛИ ЭКОЛОГИЯ ГЛАВНЕЙШИХ ВРЕДНЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ (LEPIDOPTERA) ОРЕХОВОЙ ПЛОДОЖОРКИ (SARROTHRIPUS MUSCULANA ERSSCH) И ЯБЛОНЕВОЙ МОЛИ (HYPONOMENTA MALINELUSUS SELL) И РАЗРАБОТКА ЭКОЛОГИЗИРОВАННОЙ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ ЛЕСОВ ТАДЖИКИСТАНА 06.01.07 – защита растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научные консультанты: СУГОНЯЕВ Е.С. доктор биологических...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ И БИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск 201...»

«Галкин Алексей Петрович ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Специальность 03.02.07 – генетика диссертация на соискание учной степени доктора биологических наук Научный консультант: Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....»

«Шемякина Анна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BETULA L. 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесникова Р.Д. Хабаровск – 20 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1.1 Общие...»

«ЖЕСТКОВА ДАРЬЯ БОРИСОВНА СОСТАВ И СТРУКТУРА ТРАВЯНИСТОГО ПОКРОВА ПРИДОРОЖНЫХ ТЕРРИТОРИЙ АВТОМАГИСТРАЛЕЙ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА Специальность: 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ЗАУЗОЛКОВА Наталья Андреевна АГАРИКОИДНЫЕ И ГАСТЕРОИДНЫЕ БАЗИДИОМИЦЕТЫ ЛЕСОСТЕПНЫХ СООБЩЕСТВ МИНУСИНСКИХ КОТЛОВИН 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – кандидат биологических наук, И. А. Горбунова Абакан – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ... ГЛАВА 1....»

«Мухачева Татьяна Александровна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Ковалев Сергей Юрьевич,...»

«ТОМОШЕВИЧ Мария Анатольевна ФОРМИРОВАНИЕ ПАТОКОМПЛЕКСОВ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» 03.02.08 – «Экология» Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: д.б.н., академик РАН Коропачинский И.Ю. Новосибирск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ: ВВЕДЕНИЕ.. 4 ГЛАВА 1. АНАЛИЗ...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»

«Кошелева Оксана Владимировна НАЕЗДНИКИ СЕМЕЙСТВА EULOPHIDAE (HYMENOPTERA, CHALCIDOIDEA) СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ СО СПЕЦИАЛЬНЫМ ОБСУЖДЕНИЕМ ПОДСЕМЕЙСТВА TETRASTICHINAE 03.02.05 – энтомология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, С. А. Белокобыльский Санкт-Петербург...»

«Зубенко Александр Александрович СИНТЕЗ И ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНЫХ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ В РЯДУ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук г. Новочеркасск – 2015 Содержание ВВЕДЕНИЕ.. 6 1.Обзор литературы..19 1.1. Проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов и пути её преодоления..19 1.2. Проблема...»

«Трубилин Александр Владимирович СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАПСУЛОРЕКСИСА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФАКОЭМУЛЬСИФИКАЦИИ КАТАРАКТЫ НА ОСНОВЕ ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ И МЕХАНИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.