WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ПЕРВЫЕ ЭТАПЫ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ...»

-- [ Страница 2 ] --

Известно, что в водных суспензиях большинство частиц обладает электрическим зарядом вследствие ионизации поверхностных групп. Этот поверхностный заряд привлекает из среды ионы с противоположным зарядом, формируя, тем самым, двойной электрический слой. Поверхностный заряд обычно характеризуется изоэлектрической точкой (Harden and Harris, 1953), электрокинетическим потенциалом (дзета-потенциалом) или электрофоретической подвижностью (Gilbert et al., 1991). Бактерии в водных суспензиях всегда заряжены отрицательно (Hogt et al., 1985a), при этом, несущие высокий поверхностный заряд, чаще всего имеют гидрофильную поверхность.

Следует отметить, что и бактерии с гидрофобной поверхностью также могут иметь относительно высокий поверхностный заряд (Hogt et al., 1985a).

Поверхностный заряд, так же как и гидрофобность, является видоспецифичным признаком, а так же зависит от среды роста, возраста бактериальной культуры и поверхностных структур клетки (Gilbert et al., 1991).

Разнообразные поверхностно-ассоциированные макромолекулы, включая белки, являются активными участниками как первых этапов адгезии, так и последующего накопления клеток на атакованной ими поверхности (Sun et al., 2005). Белки клеточной стенки грамположительных бактерий составляют семейство поверхностных белков, которые напрямую взаимодействуют с белками хозяина (Navarre and Schneewind, 1999). Часто эти взаимодействия важны для бактериальной адгезии и защиты от иммунной системы хозяина. Кроме того, наиболее вероятно, что гидрофобность поверхности бактериальной клетки в большей степени определяется поверхностно-ассоциированными белками (Vadyvaloo and Otto, 2005), которые включают такие специфические адгезины, как поверхностные белки стафилококков «staphylococcal surface proteins» (SSP-1 и SSP-2) (Veenstra et al., 1996), основной аутолизин AtlE (Heilmann et al., 1997) и тейхоевые кислоты (Hussain et al., 2001) (Рисунок 1).

Основной аутолизин стафилококков AtlE – это белок с мол. массой 148 кДа, состоящий из двух бактериолитически активных доменов, обладающих амидазной (60 кДа) и глюкозаминидазной (52 кДа) активностями, который через гидрофобные взаимодействия помогает бактериям связываться непосредственно с полимерной поверхностью (Heilmann et al., 1997). Кроме того, этот белок так же способен участвовать на более поздних этапах взаимодействия бактерий с атакуемой поверхностью и развития биопленки, поскольку он так же обладает способностью к связыванию с витронектином – матричным белком хозяина (Heilmann et al., 1997). В дополнение к прямому действию на адгезию, AtlE обладает аутолитической активностью, благодаря которой происходит лизис части популяции бактерий, а высвобождающаяся внеклеточная ДНК (экзДНК) способствует образованию биопленок клетками оставшейся части популяции (Qin et al., 2007b).

Рисунок 1. Схема механизмов адгезии, используемых бактериями S.

epidermidis, на нативной и модифицированной белками полимерной поверхности (Mack et al., 2009). Fbe, SdrG – фибриноген-связывающий белок S. epidermidis, Embp – фибронектин-связывающий белок S. epidermidis, Aap – белок, связанный с накоплением, AtlE – аутолизин S. epidermidis, Aae – аутолизин/адгезин S. epidermidis, SSP-1 – поверхностный белок стафилококков, GehD – липаза S. epidermidis, SdrF – коллаген связывающий белок S. epidermidis, Teichoic acid – тейхоевые кислоты, PS/A – полисахарид/адгезин, eDNA – внеклеточная ДНК, Col

– коллаген, Fg – фибриноген, Fn – фибронектин.

Другие белки – SSP-1 и SSP-2 являются специфическими адгезинами с мол.

массами, приблизительно, 280 и 250 кДа, соответственно. Они локализованы на поверхностях бактериальных клеток в виде фимбриаподобных структур и S. epidermidis способствуют взаимодействию с нативной поверхностью биоматериалов, в частности, полистирола (Veenstra et al., 1996). Недавними исследованиями показано, что SSP-1 может быть связан с белком Aap, формирующим на поверхности бактерий S. epidermidis фибриллярные выросты, способствующие закреплению клеток на поверхности (Macintosh et al., 2009).

В адгезии бактерий S. epidermidis так же могут принимать участие и тейхоевые кислоты – поверхностно-заряженные полимеры, которые составляют существенную часть клеточной стенки многих стафилококков (Потехина, 2006).

Их роль в первичном прикреплении особенно ярко проявляется усилением адгезии бактерий S. epidermidis к иммобилизованному Фн (Hussain et al., 2001).

Все поверхностные белки, способные связываться с компонентами матрикса хозяина, были определены как MSCRAMM (Patti et al., 1994). В большинстве случаев, MSCRAMM ковалентно связаны с клеточной стенкой бактерий (Patti et al., 1994) и способны связывать больше, чем один матричный компонент хозяина (Navarre and Schneewind, 1999).

На поверхности бактерий S. epidermidis HB и NCTC11047 были обнаружены белки Fbe/SdrG и Embp с высоким сродством к фибриногену и фибронектину, соответственно (Hartford et al., 2001a; Williams et al., 2002). Гены, кодирующие белок Fbe/SdrG, часто встречаются у клинических бактериальных изолятов (Hartford et al., 2001a; Rohde et al., 2007). В связи с высокой вариабельностью экспрессии этих генов многие штаммы не обладают способность связывать фибриноген (Arrecubieta et al., 2007). Кроме того, в клинических изолятах S. epidermidis часто встречается гигантский белок Embp (Rohde et al., 2007) с мол.

массой 1000 кДа (Williams et al., 2002). Показано, что связывание этого белка и фибронектина происходит через N-терминальный конец последнего (Jarvis and Bryers, 2005).

Показано, что секретируемая бактериями S. epidermidis липаза GehD специфически связывается с коллагеном, тем самым способствуя прикреплению к (Bowden et al., 2002).

коллаген-покрытым поверхностям Недавно было обнаружено, что поверхностный белок бактерий S. epidermidis SdrF так же отвечает за специфическое связывание с коллагеном I типа (Arrecubieta et al., 2007).

Однако, некоторые другие белки также важны для образования биопленок.

Например, ассоциированный с накоплением белок (accumulation-associated protein, Aap) с мол. массой 140 кДа является необходимым для образования биопленок некоторыми штаммами S. epidermidis (Hussain et al., 1997). Кроме того, предполагается, что Aap играет роль в удерживании PIA на поверхности клетки S. epidermidis, так как мутанты по гену aap, продуцируют PIA, который слабо прикрепляется к поверхности бактерий (Hussain et al., 1997). В более поздних исследованиях (Rohde et al., 2005) предполагалось, что Aap с мол. массой 140 кДа является усеченной изоформой более крупного Aap с мол. массой 220 кДа, и что именно меньший белок участвует в аккумуляции биопленок независимо от PIA.

Было показано, что это изменение размера белковой молекулы необходимо для образования биопленок, так как способность штамма S. epidermidis 1585 формировать биопленку появляется лишь при усеченной форме Aap, и это свойство терялось, когда экспрессировался полноразмерный Aap (Rohde et al., 2005). Продукция Aap часто встречается в клинических изолятах S. epidermidis (Rohde et al., 2004), однако, механизм, благодаря которому Aap служит связующим звеном в образовании биопленок, до сих пор не известен. При этом показано, что Aap может как секретироваться во внеклеточное пространство, так и накапливаться на клеточной стенке S. epidermidis (Sun et al., 2005).

Предполагается, что другой белок – Bhp, заякоренный в клеточной стенке бактерий S. epidermidis и гомологичный белку Bap у S.aureus, тоже усиливает межклеточную адгезию во время образования биопленок бактериями S. epidermidis (Cucarella et al., 2001). Белок Bhp обнаруживается у 10-19% S. epidermidis et al., клинических изолятов (Cucarella 2001). Сходство последовательностей позволяет предположить, что bhp гены также вовлечены в образование биопленок клиническими изолятами S. epidermidis, как это показано для генов bap в животных изолятах S. aureus. Однако, механизм, благодаря которому белки Bap и Bhp способствуют образованию биопленок, пока неизвестен (Vadyvaloo and Otto, 2005).

В процессе образования биопленок стафилококков не последнюю роль играет и экзДНК, так как разрушение этого полимера под действием ДНКаза I типа вызывает снижение темпов формирование биопленок в момент образования, а также разрушает уже сформированные пленки (Izano et al., 2008; Tetz et al., 2009; Qin et al., 2007b). Кроме того, удаление внеклеточной ДНК с помощью обработки ДНКазой или отсутствие её вследствие мутации (atlE) значительно сокращает количество сорбированных клеток, находящихся в больших агрегатах (Das et al., 2010).

В первичном прикреплении к немодифицированной поверхности силиконовых катетеров участвует капсульный полисахаридный адгезин PS/A, обнаруженный на поверхности бактерий S. epidermidis RP62A. Позднее было показано, что, по-видимому, он идентичен полисахаридному межклеточному адгезину (PIA) S. epidermidis (Sadovskaya et al., 2005) Первичное прикрепление запускает процесс межклеточной адгезии, во время которой бактерии начинают размножаться и создавать многослойные клеточные кластеры (von Eiff et al., 2002). Для большинства КНС ключевым фактором для адгезии и последующей аккумуляции биопленок является синтез полисахаридного межклеточного адгезина – PIA (McKenney et al., 1998). PIA представляется собой полимер N-ацетилглюкозамина, синтезируемый ферментами, закодированными в ica опероне, и ответственный за формирование связующего компонента биопленки (Mack, 1999). Продукция PIA и связанное с этим формирование биопленки зависит от различных факторов среды – уровня осмолярности, наличия глюкозы, этанола, аэрации, температуры и субингибиторных концентраций антибиотиков (Tormo et al., 2005).

1.3.4. Белки сыворотки и тканей человека В условиях in vivo непосредственное взаимодействие между бактериальной клеткой и свободной абиотической поверхностью играет минимальную роль, так как после контакта с кровью поверхностью субстрата почти мгновенно покрывается белками сыворотки или тканей (Herrmann et al., 1988; Ishiguro et al., 2005). Эта «кондиционная пленка» способна изменять физико-химические свойства поверхности, влияющие на бактериальную адгезию (Fletcher, 1976).

Известно, что белки крови и тканей (альбумин, фибронектин, фибриноген, ламинин, а так же денатурированный коллаген) способны усиливать или снижать бактериальную адгезию путем связывания с поверхностью субстрата или с бактериальной поверхностью (Brokke et al., 1991). Следует отметить, что большинство связей между бактериями и белками в гетерогенных системах являются специфическими лиганд-рецепторными взаимодействиями.

Показано, что на покрытых плазмой крови поверхностях фторэтиленпропилена адгезия всех штаммов КНС была значительно ниже, чем на необработанных контрольных поверхностях (Hogt et al., 1985b). Pascual с соавт.

впервые обнаружили, что прединкубация тефлоновых катетеров в сыворотке крови человека снижает адгезию S. epidermidis на 80–90% (Pascual et al., 1986).

S. epidermidis Значительное сокращение числа сорбированных клеток в присутствии сыворотки или плазмы обнаруживается и на поверхностях полиуретана, причем подобное действие оказывает и прединкубация бактерий S. epidermidis в сыворотке (Ardehali et al., 2003).

Предполагается, что такое ингибиторное действие сыворотки и плазмы, в основном, связано с взаимодействием с альбумином, в то время как антитела IgG и Фн оказывают значительно меньшее действие. Скорее всего, это связано, вопервых, с высоким содержанием альбумина в сыворотке крови (35–50г/л) (Грызунов, Добрецов, 1994), во-вторых, с тем, что при контакте поверхности субстрата с кровью, альбумин адсорбируется первым, затем он замещается IgG, которые в свою очередь, замещается Фн и высокомолекулярным киногеном.

Данный процесс последовательной адсорбции и десорбции сывороточных белков крови на абиотической поверхности известен как Вромановский эффект (Vroman et al., 1980). Имеются сведения о том, что ингибирование бактериальной адгезии сывороткой крови в значительной степени связано с апо-трансферрином (Ardehali et al., 2003).

Получены многочисленные данные о том, что сам альбумин в чистом виде, адсорбированный на поверхности, оказывает заметный ингибирующий эффект на бактериальную адгезию к поверхности полимеров (Brokke et al., 1991; Fletcher and Marshall, 1982; Hogt et al., 1985a; Linnes et al., 2012; Pascual et al., 1986) и металлов (Kinnari et al., 2005). Кроме того, в условиях in vivo животные с имплантатами, покрытыми альбумином, имели более низкую скорость инфицирования (27 %), чем в случаях использования имплантатов без покрытия (62 %) (An et al., 1997).

В связи с тем, что в опытах с I-меченным альбумином показано, что клетки стафилококков не сорбируют этот белок (Brokke et al., 1991), считается, что механизм ингибиторного действия альбумина на бактериальную адгезию связан с изменением гидрофобности поверхности субстрата, что проявляется в снижении контактного угла смачивания полистирола (Fletcher, 1976) и фторэтиленпропилена (Hogt et al., 1985a) после адсорбции на них бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Первоначально фибронектин был описан как посредник адгезии эукариотических клеток к поверхностям и позднее была показана его способность связываться непосредственно с поверхностью бактериальных клеток S. aureus (Kuusela, 1978). Фн явно стимулирует адгезию S. aureus к поверхности субстратов (O’Neill et al., 2008; Vaudaux et al., 1984). Однако, существуют противоположные мнения относительно влияния Фн на адгезию S. epidermidis к поверхности медицинских материалов. Действительно, часть исследователей утверждает, что S. epidermidis покрытие поверхности Фн стимулирует адгезию бактерий (Herrmann et al., 1988; Hussain et al., 2001; Schroeder et al., 2008; Xu and Siedlecki, 2012b), в тоже время другие авторы сообщают о том, что предобработка поверхности Фн ведет к уменьшению количества сорбированных бактерий S. epidermidis или не оказывает существенного эффекта (Brokke et al., 1991; An et al., 1995; Galliani et al., 1994; Linnes et al., 2012). По-видимому, данная вариабельность результатов свидетельствуют о наличии специфического лигандрецепторного взаимодействия поверхностных белковых структур клеточной стенки стафилококков со связанным с поверхностями Фн. Этот факт был S. epidermidis подтвержден при обнаружении на поверхности бактерий NCTC11047 белка Embp, обладающего высоким сродством связывания к Фн (Williams et al., 2002).

Фибриноген (Фг) также является важным компонентом сыворотки крови, который участвует в бактериальной адгезии к биоматериалам и тканям хозяина.

Показано, что адсорбированный Фг способствует адгезии бактерий, особенно стафилококков, к биоматериалам (Dickinson et al., 1997). Так, адсорбция Фг на на полиметилметакрилатных стеклах стимулировала адгезию всех использованных к работе штаммов S. aureus и нескольких штаммов КНС (Herrmann et al., 1988). При исследовании in vitro предобработка этим белком только бактериальных клеток или как бактерий, так и полиэтиленовых катетеров усиливала бактериальную адгезию. По предположению авторов, данный эффект возможен из-за наличия лигандов для Фг на поверхности клеток стафилококков (Brokke et al., 1991), которые, действительно, позднее были обнаружены и названы Fbe/SdrG (Hartford et al., 2001a). Однако, несмотря на то, что по данным ПЦР-анализа большая часть клинических изолятов S. epidermidis несет ген fbe (Hartford et al., 2001a; Rohde et al., 2007), наблюдается высокая гетерогенность адгезионной активности бактерий S. epidermidis в отношении Фг-покрытой поверхности (Arrecubieta et al., 2007).

Данный факт может отражать разный уровень экспрессии белка Fbe бактериями различных штаммах или может свидетельствовать о том, что Fbe связывает лиганды, отличные от Фг, когда экспонирован на поверхности клетки.

Другим важным фактором в функционировании сосудистых протезов и других имплантируемых устройств является коллаген, который так же может выступать матриксом для колонизации бактерий. В основном, присутствие коллагена имеет сходный с фибронектином эффект и проявляется в стимуляции адгезию S. aureus (Vaudaux et al., 1984). Позднее, у бактерий S. epidermidis была обнаружена липаза GehD и поверхностный белок SdrF, которые отвечают за специфическое связыванием с коллагеном (Bowden et al., 2002; Arrecubieta et al., 2007).

1.4. Антибактериальные пептиды Антимикробные пептиды (АМП) являются частью врожденного иммунитета всех многоклеточных организмов, а также продуцируются одноклеточными организмами для подавления ближайшего бактериального окружения (Guan-Guerra et al.

, 2010). К настоящему моменту описано 2439 АМП, из них большая часть выделена из эукариотических организмов и лишь около 10% принадлежит к классу бактериальных бактериоцинов (The Antimicrobial Peptide Database). Хотя АМП составляют семейство очень гетерогенных по своей структуре и составу соединений, как правило, это небольшие пептиды из 12-50 аминокислот, с мол. массой до 5 кДа и со значительным содержанием катионных аминокислот, определяющих общий положительный заряд их молекул. В составе некоторых АМП обнаруживаются редкие аминокислоты, например, D-аланин, лантионин, дегидроаланин или дегидробутират (Guan-Guerra et al., 2010).

Суммарный положительный заряд позволяет молекулам АМП связываться с анионными группировками клеточных оболочек бактерий. Дальнейшее электростатическое взаимодействие пептидов с плазматическими мембранами приводит к формированию нерегулируемых каналов и пор, что в итоге приводит к гибели атакованных клеток (Shai, 1999). Среди существующих моделей действия антибактериальных пептидов есть и, так называемая, «ковровая» модель, в которой положительно заряженные молекулы пептидов сорбируются на отрицательно заряженном внешнем листке мембраны бактерии, образуя молекулярный «ковер», который при насыщении пептидами начинает разрываться на фрагменты (Wimley, 2010).

Помимо этого, имеются данные, указывающие на способность пептидов облегчать поступление в бактериальные клетки различных биологически активных агентов, в частности, -лактамов, ванкомицина и других антибиотиков, в результате чего при совместном применении значительно возрастает эффективность действия антибиотиков на патогенные бактерии, в том числе, и антибиотикорезистентные штаммы (Vivs et al., 2008). Кроме того, проникая в цитоплазму бактерий, антимикробные пептиды, будучи заряжены положительно, связываются с клеточными полианионами (такими как ДНК и РНК), что также приводит к гибели бактериальных клеток (Sang and Blecha, 2008). Помимо выраженного антибактериального действия, катионные пептиды проявляют высокий аффинитет и нейтрализуют липополисахариды, предупреждая тем самым развитие токсического шока при септических состояниях (Giuliani et al., 2010). Таким образом, по формирующемуся мнению, катионные пептиды могут заменить традиционные антибиотики в качестве эффективных природных лечебных факторов (Vaara, 2009).

Известно, что АМП проявляют свое литическое действие не только в отношении планктонных культур, но и способны разрушать уже сформировавшиеся биопленки, в частности, стафилококков (Sandiford, Upton, 2012). Кроме того, показано, что некоторые АМП оказываются особенно эффективными на начальном этапе образования биопленок. Так, кателицидин LLчеловека ингибирует адгезию и формирование биопленок S. epidermidis и способен существенно снижать биомассу уже образованных биопленок, хотя он и не относится непосредственно к группе АМП (Overhage et al., 2008). Выделенный из штамма S. epidermidis 224 эпидермицин NI01 эффективен в отношении формирующих биопленки штаммов S. aureus и S. epidermidis (Sandiford, Upton, 2012).

Кроме того, особое внимание уделяется возможности подавления бактериального прикрепления и колонизации имплантатов за счет покрытия их поверхностей антимикробными агентами, среди которых, в качестве перспективных, рассматриваются низкомолекулярные катионные пептиды бактерий (Fontana et al., 2006). Показано, что низин способен адсорбироваться на полимерных поверхностях без снижения присущей ему антибактериальной активности, проявляя при этом бактерицидное действие на прикрепляющиеся к поверхности бактерии (Bower et al., 1998). В опытах in vitro установлено, что другие бактериальные АМП (Рер5 и эпидермин) при предобработке ими поверхностей силиконовых катетеров существенно замедляют образование биопленок S. epidermidis, а при действии пептидов на связавшиеся бактерии количество жизнеспособных клеток значительно снижается (Fontana et al., 2006).

Получены и другие данные об эффективности покрытия на основе АМП в предотвращении бактериальной адгезии на различных полимерных поверхностях (Costa et al., 2011; Rapsch et al., 2014), а так же на поверхностях титана и их производных (Yoshinari et al., 2010; Трахтенберг и др., 2013) Механизм действия АМП может быть связан не только с их бактерицидной активностью. Так, показано, что пептид LL-37, выделенный из лейкоцитов человека, ингибирует образование биопленок за счет влияния на гены, участвующие в процессах формирования биопленок (Overhage et al., 2008).

Возможно, такой механизм связан с управлением, например, agr системой, способной активироваться короткими аутоиндукторными пептидами (Donlan, Costerton, 2002). Подобный эффект ингибирования образования биопленок бактерий S. epidermidis также обнаружен у АМП гепцидин 20, выделенного из гепатоцитов человека (Brancatisano et al., 2014).

Таким образом, разнообразие механизмов действия катионных пептидов и способность убивать медленно растущие и покоящиеся клетки, которые преобладают в биопленках, а так же синергизм действия АМП с некоторыми антибиотиками делает их привлекательными соединениями в новых подходах к подавлению биопленок.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Бактериальные штаммы и среды В качестве объектов исследований были использованы штаммы бактерий S. epidermidis GISK 33 (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов ГИСК им Л.А. Тарасевича, сейчас ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, г.

Москва), а так же S. epidermidis ATCC®12228 и S. epidermidis ATCC®29887. Для оценки влияния неродственной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis использовали препарат, полученный из бактерий Propionibacterium acnes АС 1450 (Всероссийская коллекция микроорганизмов, г. Москва). Все использованные в экспериментах химические реагенты имели квалификацию х.ч., ч.д.а. или о.с.ч.

(Россия; «Difco», США; «Sigma-Aldrich», США).

Бактерии культивировали на жидкой питательной среде Luria-Bertani – LB (Atlas, 1993), содержащей 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 0,64% KCl, рН 7,1–7,2. Для получения плотной среды LB к указанным компонентам добавляли 1,4% агара.

S. epidermidis Тестирование бактерий на способность к секреции полисахаридного межклеточного адгезина (PIA) проводили на агаризованной среде LB с добавлением 0,08% индикатора Конго красный.

Для выявления антибактериальной активности катионных пептидов варнерина и хоминина использовали среду LB, не содержащую KCl.

Для изучения действия различных факторов среды на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis использовали полноценную или не содержащую KCl среду LB, с добавлением веществ, представленных в Таблице 2.

В ряде экспериментов для изучения адгезии, несвязанной с ростом бактерий, в качестве среды использовали 10 мМ натрий-фосфатный буфер (ФБ) (рН 7,2) или изотонический раствор NaCl (0,9%, рН 7,0), а также 10-6 М растворы валиномицина и СССР в трис-HCl буфере (10 мМ, рН 7,2) с добавлением 50 мМ KCl и нигерицина в трис-HCl буфере (10 мМ, рН 6,0) с добавлением 50 мМ KCl.

–  –  –

В ряде экспериментов использовали донорскую плазму крови человека, бычий сывороточный альбумин (БСА) и фибронектин человека (Фн). Для получения плазмы цельную кровь здоровых доноров собирали в пробирки с ЭДТА («Improvacuter», Китай) и форменные элементы крови отделяли центрифугированием (3500хg, 5 мин, 5415R, «Eppendorf», Германия).

Надосадочную жидкость использовали для приготовления 10 об.% раствора плазмы в 0,9% NaCl. Растворы БСА (5 мг/мл) и фибронектина (25 мкг/мл) готовили из лиофилизированных коммерческих препаратов в этом же растворе NaCl.

2.2. Культивирование и подготовка бактерий S.

epidermidis Бактерии S. epidermidis переносили со скошенного LB-агара в жидкую питательную среду LB и культивировали в термостате при 37°С в течение 14– 16 ч, затем культуру пересевали в свежую среду LB и выращивали при 37°С на шейкере Certomax IS («Sartorius», Германия) с аэрацией (160 об/мин) до достижения бактериальной популяцией логарифмической или стационарной фаз роста, затем клетки осаждали на центрифуге 5415R («Eppendorf», Германия) в течение 5 мин при 12000хg, осадки дважды промывали 0,9% раствором NаCl, используя те же условия осаждения клеток, после чего суспендировали до содержания бактерий 108 КОЕ/мл в среде LB, если исследовали действие факторов в питательной среде, или в ФБ в случае дальнейших исследований в ФБ или 0,9% растворе NаCl.

2.3. Определение количества колониеобразующих единиц Количество колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) выявляли микрометодом точечных высевов последовательных десятикратных разведений бактериальных суспензий на агаризованную среду LB (Herigstad et al., 2001).

2.4. Определение способности бактерий S. epidermidis к секреции полисахаридного межклеточного адгезина S. epidermidis Тестирование бактерий на способность к секреции полисахаридного межклеточного адгезина (PIA) проводили с использованием среды с добавлением индикатора Конго красный (Freeman et al., 1989). Для постановки данного теста в чашки Петри вносили 15 мл агаризованной среды, содержащей 0,08% Конго красного. После затвердевания среды производили посев суточных культур стафилококков, выращенных на LB с добавлением 0,5% глюкозы. Инкубацию проводили в термостате в течение 24 ч при 37 °С, после чего фиксировали результат.

2.5. Определение минимальной подавляющей концентрации Минимальные подавляющие концентрации (МПК) ЭДТА, детергентов и линезолида для всех исследуемых штаммов определяли методом серийных разведений согласно МУК 4.2.1890-04.

Для этого в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа («Медполимер», Россия) вносили по 100 мкл среды LB, затем в первую лунку ряда вносили 100 мкл раствора исследуемого соединения и готовили серию двукратных разведений. Затем в каждую лунку S. epidermidis, вносили 10 мкл суспензии клеток исследуемого штамма содержащей 1106 КОЕ/мл. Результаты оценивали через 16-18 ч культивирования при 37°С. В качестве МПК принимали самую низкую концентрацию препаратов, вызывающую полную задержку роста бактерий.

МПК катионных пептидов (варнерина и хоминина) определяли указанным выше способом с последующим установлением содержания антибактериальных пептидов в образце путем сравнения МПК исследуемого препарата для бактерий S. epidermidis GISK 33 со значением МПК референс-образца с точно известным количеством антибактериального пептида.

Количество пептида в референс-образце было установлено с помощью аминокислотного анализа очищенного гомогенного препарата варнерина и хоминина. *

2.6. Определение дзета-потенциала бактериальных клеток S. epidermidis Дзета-потенциал бактерий определяли на лазерном анализаторе размера частиц и дзета-потенциала Zetasizer NanoZS («Malvern», Великобритания) с программным обеспечением «ZetaSizer Software 6.20»

(«Malvern», Великобритания) методом динамического светорассеяния под углом 90° по изменению распределения частиц в электрическом поле. Для этого отмытые бактериальные клетки S. epidermidis непосредственно перед измерением суспендировали до содержания 107 КОЕ/мл в питательной среде LB без KCl, содержащей двухвалентные ионы кальция, магния, цинка или марганца в определенной концентрации и проводили измерения при 37°С в течение 30 мин.

_________________________

*Исследования проведены научным руководителем работы В.П. Коробовым в лаборатории биохимии пептидов Абердинского университета (Абердин, Великобритания)

2.7. Выделение полной геномной ДНК Для оценки действия внеклеточной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis 33 использовали препараты полной геномной ДНК, выделенные из бактерий этого штамма и из бактерий P. acnes AC 1450. Для этого из ночных культур бактерий этих штаммов, выращенных на среде LB, выделяли полную геномную ДНК с применением набора «Bacterial Genomic DNA Miniperp Kit»

(«Axygen», США) по прописи фирмы-изготовителя. Количество полученной ДНК определяли по степени поглощения на спектрофотометре UV-1700 («Zhimadzu», Япония) при длине волны 260 нм. В качестве референс-образца использовали раствор препарата ДНК КРС. Затем полученные препараты ДНК вносили в питательную среду LB до одинаковой конечной концентрации и использовали в экспериментах.

2.8. Предобработка поверхности полистирола плазмой, сывороточными белками и катионными пептидами На поверхность полистироловых чашек Петри (диаметр 40 мм, «Медполимер», Россия) наносили по 2 мл подготовленных растворов плазмы крови человека (10 об.%), БСА (5 мг/мл), Фн (25 мкг/мл), варнерина (32 мкг/мл) или хоминина (32 мкг/мл). В качестве контролей использовали чашки, предобработанные 0,9% раствором NaCl. Предобработку поверхностей чашек Петри проводили в течение 60 мин при 37°С, затем жидкие среды удаляли аспирацией, чашки однократно промывали 2 мл ФБ (10 мМ, рН 7,2) и на поверхность чашек наносили бактериальные суспензии.

2.9. Определение гидрофобности поверхностей бактериальных клеток и полистирола Уровень гидрофобности поверхностей бактерий S. epidermidis определяли с помощью BATH-теста в двухфазной системе с гексадеканом (Rosenberg, et al., 1980). Для этого подготовленные бактериальные клетки ресуспендировали в 0,9% растворе NaCl до OD600 0,3–0,5. Готовые суспензии (1,2 мл) вносили в фотометрические откалиброванные пробирки диаметром 10 мм, а затем на их поверхность аккуратно наслаивали по 0,2 мл гексадекана и измеряли оптическую плотность водной фазы (А0) при 600 нм на спектрофотометре PD-303 («Apel», Япония). Затем пробирки выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре для насыщения, интенсивно перемешивали на вортексе («Biosan», Латвия) на максимальной скорости в течение 120 с и оставляли при комнатной температуре на 15 мин для полного расслаивания эмульсии, после чего снова измеряли оптическую плотность водной фазы (А1). В контрольные пробы вносили 0,9% раствор NaCl. Степень гидрофобности (Af, %) определяли по формуле (1):

Af = ((A0 – A1)/A0)100 (1) Определение уровня гидрофобности поверхностей полистирола проводили путем измерением краевого угла смачивания по модифицированному методу сидячей капли. На исследуемую поверхность наносили несколько капель дистиллированной воды объемом 10 мкл, затем в течение 60 с после контакта фотографировали профиль полученных капель, используя цифровую фотокамеру D90 («Nikon», Япония). После чего на полученных фотографиях c помощью программного обеспечения «GIMP 2.0» вручную измеряли радиус (r) и высоту (h) капли. Контактный угол (, °) вычисляли по формуле (2) (Yuan and Lee, 2013) =2arctg(h/r) (2)

2.10. Предобработка бактериальных клеток гидролитическими ферментами и антибактериальными пептидами Отмытые клетки бактерий S. epidermidis 33 суспендировали в 0,9% растворе NaCl до 108 КОЕ/мл, осаждали на центрифуге (12000хg, 5 мин), затем осажденные клетки ресуспендировали в растворах трипсина (0,5 мг/мл), протеазы из Streptomyces griseus (0,5 мг/мл) или лизоцима (10 мкг/мл) и инкубировали в течение 30 мин при 37° С. В случае предобработки варнерином (0,5 мкг/мл) инкубацию проводили в течение 60 мин при 37° С и перемешивании 160 об/мин.

В контрольных образцы вносили 0,9% раствор NaCl или соответствующий буферный раствор без фермента. Затем клетки дважды промывали от ферментов с помощью 0,9% раствора NaCl и от варнерина, используя 0,5 М раствор NaCl или 10 мМ трис-HCl буфер (рН 7,2). Полученные осадки ресуспендировали в питательной среде LB до концентрации 107 КОЕ/мл и исследовали адгезионные свойства бактериальных клеток.

2.11. Определение адгезионной способности бактериальных клеток Для определения адгезии на поверхности полистирола подготовленные суспензии бактерий S.

epidermidis логарифмической или стационарной фаз роста доводили до концентрации 107 КОЕ/мл в исследуемой среде. Полученные бактериальные суспензии вносили по 2 мл в полистироловые чашки Петри (диаметр 40 мм, «Медполимер», Россия) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С без перемешивания. После инкубации жидкую часть культур осторожно удаляли, а поверхности чашек трижды промывали ФБ для удаления планктонных бактерий. После высушивания в течение 30 мин при 37°С связавшиеся с поверхностью бактериальные клетки окрашивали раствором кристаллического фиолетового (0,1%) в течение 2 мин, отмывали от красителя деионизированной водой, высушивали на воздухе и подсчитывали их количество с помощью микровизора Viso-103 («Ломо», Россия), просматривая не менее 10 полей зрения при увеличении х2500.

При изучении адгезии бактерий S. epidermidis на гидрофильной стеклянной поверхности использовали покровные стекла размером 2424 мм2 («МиниМед», Россия), предварительно обезжиренные спиртово-эфирной смесью, прошедшие паровую стерилизацию (121°С, 60 мин) и помещенные горизонтально на дно стерильных стеклянных стаканов (диаметр 40 мм).

Исследование динамики первых этапов образования биопленок проводили аналогично, изменяя время инкубации до 30, 60, 120 и 240 мин.

В экспериментах по изучению зависимости адгезии бактерий от температуры инкубацию проводили в течение 30 мин при 3, 28, 37 и 42°С.

Для исследования влияния гидродинамических условий на адгезию бактерий чашки с бактериальными суспензиями помещали на 30 мин в статические условия или на орбитальный шейкер («Biosan», Латвия) с частой вращения 150 об/мин. Для расчета сдвигающих усилий, происходящих в полистироловой чашке Петри при инкубации на орбитальном шейкере, использовали формулу (3) (Ley et al., 1989) max=a(µ(2f)3) (3) где а – орбитальный радиус вращения шейкера (2 см); – плотность среды LB (1,000 г/см3); µ – динамическая вязкость среды LB при 37°С (0,0074 Пуаз) (Support Fluxion, 2013); f – частота вращения шейкера (2,5 с-1). Усилие сдвига в данных условиях (37°С, среда LB, 150 об/мин) составляло 10,7 дин/см2.

В некоторых экспериментах проводили расчет время удвоения (t1/2, мин) численности адгезированных клеток по формуле (4) t1/2=ln(2)/k (4) где k – тангенс угла наклона прямой при построении графика зависимости ln (количество сорбированных клеток / поле зрения) от времени (мин).

Оценку продолжительности действия антибактериальных пептидов на образование биопленок бактериями S. epidermidis проводили в питательной среде LB, содержащей варнерин или хоминин (в концентрации 1xМПК для каждого штамма). По истечении 30 мин адгезии в стандартных условиях планктонные клетки удаляли путем двукратной промывки ФБ (10 мМ, рН 7,2) или NaCl (0,5 М, рН 7,2), затем в каждую чашку Петри вносили по 2 мл свежей питательной среды LB и инкубировали статически при 37 °С в течение 0, 2, 4 и 5,5 ч. После чего определяли число сорбированных клеток методом прямого подсчета.

2.12. Определение биопленкообразующей способности бактерий Биопленки выращивали в плоскодонных 96-луночных полистироловых планшетах («Медполимер», Россия). Бактериальные суспензии с концентрацией 107 КОЕ/мл вносили по 100 мкл в лунку. После инкубации при 37°С в статических условиях в течение 24 ч питательную среду осторожно удаляли аспирацией, лунки трижды промывали ФБ для удаления свободных планктонных бактерий и высушивали в течение 30 мин при 37°С в перевернутом виде.

Полученные биопленки окрашивали раствором кристаллического фиолетового (0,1%) в течение 30 мин, а затем дважды отмывали от красителя деионизированной водой. Биомассу образованных биопленок определяли путем

–  –  –

2.14. Атомно-силовая микроскопия Исследование поверхностей полистирола после предобработки их препаратами плазмы крови, БСА и Фн проводили на атомно-силовом микроскопе Dimension Icon («Veeco», США). Использовали зонды NSG01 («NT-MDT», Россия) с номинальным радиусом острия 10 нм и жесткостью кантилевера ~7 Н/м.

Оценку результатов экспериментов проводили в режиме наномеханического картирования с наноиндентацией поверхности в каждой точке рельефа с частотой 2 кГц. Для каждой поверхности получали по три изображения размером 20х20 мкм2 с разрешением 512х512 точек в плоскости xy. В работе кроме рельефа анализировали так же карты адгезии зонда к поверхности. Обработку полученных изображений и данных проводили с помощью программного обеспечения «Nanoscope» («Bruker», США).

2.15. Получение и анализ фильтратов среды с ранних этапов образования биопленок Отмытые бактерии S. epidermidis суспендировали в питательной среде LB до концентрации 107 КОЕ/мл и наносили по 2 мл на полистироловую или стеклянную поверхность, затем инкубировали в статических условиях при 37°С в течение 0, 30, 60, 120 и 240 мин. По истечении заданного времени жидкую часть удаляли аспирацией и освобождали от клеток с помощью центрифугирования (12000g, 5 мин, 4 °С), надосадочную жидкость стерилизовали фильтрованием (0,20 мкм, «Millipore», Германия) и использовали в дальнейших экспериментах в качестве среды инкубации.

Для масс-спектрометрического анализа фильтраты среды получали описанным выше способом только в качестве среды инкубации использовали ФБ (10 мМ, рН 7,2) и изменяли время контакта бактерий S. epidermidis 33 и поверхности до 30 и 60 мин. Полученные стерильные фильтраты среды досуха высушивали на концентраторе Concentrator 5301 («Eppendorf», Германия), затем осадки растворяли в дистиллированной воде и проводили масс-спектрометрию полученных образцов методом MALDI-TOF. ** _________________________

** Исследования проведены на базе Института биофизики микроорганизмов РАН, г. Пущино.

Оценку действия протеолитических ферментов на бесклеточные фильтраты проводили путем обработки сред, полученных после контакта бактерий S. epidermidis 33 с поверхностью полистирола в течение 60 мин, растворами трипсина и протеиназы К (100 мкг/мл) при 37°С в течение 2 ч. В контрольные пробы вносили 10 мМ трис-HCl (pH 7,2). По истечении времени ферменты отделялись с помощью фильтрования через мембрану (10 кДа, «Sartorius», Германия). Полученные фильтраты использовали в дальнейших экспериментах в качестве среды инкубации.

2.16. Статистика Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью программного обеспечения «Prism 6» («GraphPad Software Inc.», США) с использованием однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA). Все эксперименты проводили в трех–пятикратной повторности, при этом в каждом опыте использовали не менее двух параллелей. Достоверность полученных результатов оценивали при p0,05.

Данные в таблицах указаны как среднее ± стандартное отклонение, тогда как на графиках указано среднее ± доверительный интервал (95%).

–  –  –

Известно, что морфология колоний стафилококков, выращенных на агаре с индикатором Конго красным, существенно различается в зависимости от их способности продуцировать межклеточный полисахаридный матрикс (polysaccharide intercellular adhesin, PIA), способствующий образованию биопленок на твердых поверхностях (McKenney et al., 1998). Колонии бактерий, выделяющих полисахариды, приобретают при росте на данной среде черный цвет, могут иметь матовую или глянцевую поверхность (Freeman et al., 1989).

В результате проведенных нами исследований было обнаружено, что колонии всех использованных в работе штаммов, выращенные на агаре с индикатором Конго красным, обладали красной окраской (Рисунок 2), что свидетельствовало об отсутствии PIA. В таком случае, согласно литературным данным, основным компонентом матрикса биопленок стафилококков, чаще всего, являются белковые соединения (Rohde et al., 2007).

Рисунок 2. Детекция PIA на плотной среде с индикатором Конго красный при росте бактерий S.

epidermidis 33, 12228 и 29887.

Результаты исследования динамики формирования биопленок бактериями S. epidermidis на поверхностях полистирола представлены на Рисунке 3. Как видно из данных, все изученные бактериальные штаммы проявляли практически одинаковый характер формирования биопленок на поверхностях полистирола как в первые часы, так и по истечении суток культивирования.

OD570

Рисунок 3. Динамика накопления биомассы S.

epidermidis на поверхностях полистирола при её определении по связыванию генцианвиолета (А) и подсчетом количества адсорбированных клеток в поле зрения (Б).

Увеличение количества клеток на поверхности полистироловых чашек по мере культивирования бактерий наглядно продемонстрировано на Рисунке 4.

Через 30 мин после внесения бактерий в среду наблюдалось активное деление связанных с поверхностью бактерий, расположенных попарно или небольшими кластерами. Через 90 мин «освоения» бактериями поверхности заметно образование клеточных агрегатов, образованных неразошедшимися после деления клетками, а через 150 мин площадь колонизированной поверхности значительно увеличивается.

Рисунок 4. Микрофотографии первых этапов развития биопленок бактериями S.

epidermidis 33 (1000, микровизор µViso – 103, «Ломо», Россия): 1 – 30 мин, 2 – 90 мин, 3 – 150 мин.

Исследована зависимость динамики процесса адгезии бактерий S. epidermidis 33 к абиотическим поверхностям от функционального состояния бактериальных клеток (Рисунок 5). Показано, что количество сорбирующихся клеток полученных из культуры в log-фазе вдвое превышает количество прикрепленных к поверхности бактерий стационарной фазы развития культуры.

Рисунок 5. Динамика первых этапов образования биопленок на поверхности полистирола бактериями S.

epidermidis 33, полученных с логарифмической () и стационарной () фазах роста планктонной культуры.

Данный факт уже отмечался исследователями и, по-видимому, связан со способностью бактерий в ранней экспоненциальной фазе быстро изменять свойства клеточной поверхности в результате экспрессии генов, ответственных за образование биопленок (Hood and Zottola, 1997). Кроме того, в экспериментах показано, что клетки бактерий разных физиологических фаз роста отличаются по темпу удвоения числа адгезированных клеток на абиотической поверхности. Так, время удвоения для клеток log-фазы было значительно меньше, чем для клеток стационарной фазы, и составило 92±7 и 169±22 мин, соответственно.

Известно, что неспецифическая обратимая адгезия к поверхностям материалов характерна как для живых, так и для мертвых бактериальных клеток (Paul, 1984; Kodziska et al., 2010). Для оценки различий в сорбции таких клеток была изучена адгезия живых и убитых кипячением бактерий штамма S. epidermidis 33, полученных с разных фаз роста планктонной культуры (Рисунок 6). В связи с тем, что количество сорбированных клеток логарифмической фазы роста в случае живых и убитых бактерий отличается практически в два раза, можно предположить, что клеток в этой фазе в течение 30 мин происходит не только неспецифическое связывание, а последующий этап развития биопленок – необратимая адгезия к поверхности полистирола. Кроме того, отмеченная разница в сорбционных характеристиках живых и убитых клеток, возможно, обусловлена, тем, что убитые клетки стафилококков обладают более низким дзета-потенциалом по сравнению с живыми (Kodziska et al., 2010).

* различия статистически значимы при сравнении с «живыми» бактериями (p0,05) Рисунок 6. Адгезия живых и убитых бактерий S. epidermidis 33 логарифмической и стационарной фаз роста планктонной культуры.

Для клеток стационарной фазы достоверного различия между адгезией в живом и убитом состоянии не выявлено, что, вероятнее всего, свидетельствует о неспецифическом связывании с поверхностью полистирола клетками в этой фазе роста за данный промежуток времени.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА АДГЕЗИЮ

БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS

4.1. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от гидродинамических условий культивирования Известно, что гидродинамические условия культивирования оказывают значительное влияние на первые этапы адгезии бактериальных клеток (An and Friedman, 2000; Stepanovi et al., 2001).

Результаты исследования влияния гидродинамических условий культивирования на адгезию бактерий S. epidermidis 33 разных периодов роста планктонной популяции представлены на Рисунке 7. Так, в первые 30 мин инкубации приложение силы сдвига в 10,7 дин/см2 снижает адгезию как для бактерий логарифмической и стационарной фаз роста примерно в 2,5 раза.

Количество клеток/поле зрения Рисунок 7. Динамика сорбции бактерий S. epidermidis 33 логарифмической (А) и стационарной (Б) фаз роста в разных гидродинамических условиях.

В тоже время изменение угла наклона кривых (Рисунок 7) свидетельствует о том, что интенсивное перемешивание влияет также и на темп прироста количества сорбированных клеток. Для клеток логарифмической фазы интенсивность прироста в статических условиях составляет 88%/час, а при сдвигающем усилии в 10,7 дин/см2 этот показатель снижается до 61%/час. Клетки стационарной фазы роста проявляют меньшую чувствительность к изменению гидродинамических условий культивирования, так как при приложении тех же усилий сдвига интенсивность прироста изменяется незначительно, с 85 до 78%/час.

Изменение интенсивности формирования биопленок хорошо заметно на микрофотографиях препаратов (Рисунок 8).

Рисунок 8. Микрофотографии клеток S.

epidermidis 33 при адгезии в разных гидродинамических условиях (2500, микровизор µViso – 103, «Ломо», Россия):

А – в статических условиях, Б – при силе сдвига в 10,7 дин/см2. 1, 2 – клетки логарифмической фазы роста, 30 и 120 мин; 3, 4– клетки стационарной фазы роста, 30 и 120 мин.

После 30 мин инкубации в статических условиях на поверхности полистирола обнаруживались небольшие конгломераты клеток (10-12 штук), хотя чаще встречались группы по 2-6 клеток. Увеличение времени инкубации до 120 мин приводит к возрастанию количества закрепленных на полистироле клеток.

По-видимому, это происходит в результате размножения бактерий, прикрепившихся на первых этапах сорбции. По существу, к этому моменту в препаратах обнаруживались небольшие кластеры делящихся клеток (до 20 штук), покрывающие значительные участки атакованной поверхности. В условиях перемешивания такой четкой разницы между точками отбора проб не наблюдалось, что возможно, связано с тем, что при перемешивании крупные агломераты клеток разрушаются, и плохо закрепленные бактерии удаляются с поверхности, а сорбируются лишь клетки, обладающие наибольшими адгезионными свойствами.

Аналогично бактериям, находящимся в стадии логарифмического роста, в экспериментах с клетками стационарной фазы через 120 мин также наблюдалось увеличение числа клеток в кластерах. Менее интенсивное возрастание количества бактерий, по-видимому, связано с более протяженным временем генерации, характерным для клеток этой фазы роста (Рисунок 6). Также отмечено, что при адгезии в условиях перемешивания в течение 2 ч клетки бактерий, в основном, располагаются поодиночке или малыми группами, содержащими не более восьми клеток.

Таким образом, сдвигающее усилие в 10,7 дин/см2, которое лежит в области физиологических значений (Goldsmith and Turitto, 1986), приводит к резкому изменению числа сорбированных на поверхности полистирола клеток. Бактерии логарифмической фазы роста культуры проявили большую чувствительность к динамическому воздействию по сравнению с клетками стационарной фазы роста.

Полученные нами данные противоречат выводам Wang с соавт. о независимости адгезии бактерий S. epidermidis от силы сдвига в пределах до 18,2 дин/см2 (Wang et al., 1993). Однако, отличие в полученных результатах можно объяснить различием использованных сред и подходов. В нашем исследовании изучалась адгезия, со временем приводящая к формированию биопленок, в то время как в работе Wang с соавт. исследовались процессы сорбции, не связанные с дальнейшим ростом бактериальной популяции.

4.2. Изучение влияния температуры среды инкубации на адгезию бактерий S. epidermidis Изучение влияния температуры окружающей среды на процессы сорбции исследованных бактерий на полистироловые поверхности показало, что данный фактор оказывает сходный эффект на адгезию всех исследованных штаммов S. epidermidis (Рисунок 9).

При сравнении зависимости численности сорбированных клеток в питательной среде и 0,9% растворе NaCl от температуры окружающей среды было обнаружено, что стимулирующее действие высоких температур проявляется и в том, и в другом случае (Рисунок 9). Однако, в богатой питательной среде этот эффект более выражен. Показано, что при низких температурах (3°С) адгезия снижается по сравнению с контролем (37 °С) и достигает одинакового уровня в обеих инкубационных средах.

* различия статистически значимы при сравнении с данными при 37 °С (p0,05) Рисунок 9. Адгезия бактерий S. epidermidis на поверхностях полистирола при разных температурах в среде LB (А) или изотоническом растворе NaCl (Б).



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Похожие работы:

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«ПОЕДИНОК НАТАЛЬЯ ЛЕОНИДОВНА УДК 602.3:582.282/284:57.086.83]:[681.7.069.24+577.34 БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТЕНСИФИКАЦИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СЪЕДОБНЫХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ МАКРОМИЦЕТОВ С ПОМОЩЬЮ СВЕТА НИЗКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ 03.00.20 – биотехнология Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук Научный консультант Дудка Ирина...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«СИМАНИВ ТАРАС ОЛЕГОВИЧ ОПТИКОМИЕЛИТ И ОПТИКОМИЕЛИТ-АССОЦИИРОВАННЫЕ СИНДРОМЫ ПРИ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ 14.01.11 – Нервные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук М. Н. Захарова Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Обзор литературы Оптиконевромиелит Аквапорины и их биологическая функция 13 Патогенез...»

«Минаева Наталья Викторовна Отдаленные последствия высокодозной химиотерапии и аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами 14.01.21 – гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель...»

«ХАФИЗОВ ТОИР ДАДАДЖАНОВИЧ ОСОБЕННОСТИ РОСТА, РАЗВИТИЯ И ПРОДУКТИВНОСТИ ЧАЙОТА (SECHIUM EDULE L. – CHAYOTE) В УСЛОВИЯХ ГИССАРСКОЙ ДОЛИНЫ ТАДЖИКИСТАНА Специальность: 06.01.01. – общее земледелие, растениеводство ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор, Гулов С.М. Душанбе – 201 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1.Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1 Экологическая...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«УДК 5 КАРАПЕТЯН Марина Кареновна АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОСТНОГО ПОЗВОНОЧНИКА (ПО МЕТРИЧЕСКИМ И ОСТЕОСКОПИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 03.03.02 «антропология» по биологическим наукам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор исторических наук, чл.-корр. РАН А.П. БУЖИЛОВА...»

«Кузнецова Татьяна Сергеевна ПРОГНОЗИРОВАНИЕ РЕФРАКЦИОННОГО РЕГРЕССА ПОСЛЕ ЭКСИМЕР-ЛАЗЕРНОЙ КОРРЕКЦИИ БЛИЗОРУКОСТИ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ПРИ МЕХАНИЧЕСКОЙ И ФЕМТОЛАЗЕРНОЙ ТЕХНОЛОГИЯХ ФОРМИРОВАНИЯ ЛОСКУТА РОГОВИЦЫ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«Долгова Анна Сергеевна ЗАЩИТА ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ПОСРЕДСТВОМ ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ТЕРМИНИРУЮЩИХ ТРАНСКРИПЦИЮ. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук (Специальность 03.01.07 – молекулярная генетика) Научный руководитель: академик, д.б.н., профессор П.Г. Георгиев Москва 2015 Оглавление Оглавление 1....»

«_ ТЕМИРОВ Николай Николаевич КОРРЕКЦИЯ АФАКИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА МУЛЬТИФОКАЛЬНЫМИ ИНТРАОКУЛЯРНЫМИ ЛИНЗАМИ С АСИММЕТРИЧНОЙ РОТАЦИОННОЙ ОПТИКОЙ Специальность 14.01.07 – «Глазные болезни» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«ОВСЯННИКОВ Алексей Юрьевич СЕЗОННАЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ХВОИ PICEA PUNGENS ENGL. И P. OBOVATA LEDEB. НА ТЕРРИТОРИИ БОТАНИЧЕСКОГО САДА УРО РАН (Г. ЕКАТЕРИНБУРГ) 03.02.08 «Экология (в биологии)» диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«БАБЕШКО Кирилл Владимирович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОЧТЕНИЯ СФАГНОБИОНТНЫХ РАКОВИННЫХ АМЕБ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ГИДРОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА БОЛОТ В ГОЛОЦЕНЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Цыганов...»

«ШАЙКЕВИЧ Елена Владимировна ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ НАСЕКОМЫХ И РОЛЬ СИМБИОНТОВ В ИХ ЭВОЛЮЦИИ (НА ПРИМЕРЕ КОМПЛЕКСА ВИДОВ Culex pipiens И Adalia spp). 03.02.07 – генетика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант член-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Захаров-Гезехус Илья...»

«Мануйлов Виктор Александрович Генетическое разнообразие вируса гепатита В в группах коренного населения Сибири 03.01.00 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: член-корр. РАН, профессор, д.б.н. С.В. Нетесов...»

«УДК 256.18(268.45) ШАВЫКИН АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭКОЛОГО-ОКЕАНОЛОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОСВОЕНИЯ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИЧЕСКОГО ШЕЛЬФА (НА ПРИМЕРЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ) Специальность 25.00.28 «океанология» Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Мурманск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.