WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ПЕРВЫЕ ЭТАПЫ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ЕРОШЕНКО Дарья Владимировна

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ПЕРВЫЕ ЭТАПЫ

ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ

STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS

03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, доцент Коробов В. П.

Пермь – 2015 СТР.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробные биопленки

1.1.1. Образование биопленок

1.1.2. Структура биопленок

1.1.3. Биопленки и биоматериал-ассоциированные инфекции

1.2. Бактерии рода Staphylococcus

1.1.1. Бактерии вида S. epidermidis

1.2.2. Роль S. epidermidis в БАИ

1.3. Факторы, влияющие на первые этапы образования биопленок

1.3.1. Окружающая среда

1.3.2. Поверхность материала

1.3.3. Характеристики бактериальной клетки

1.3.4. Белки сыворотки и тканей человека

1.4. Антибактериальные пептиды

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Бактериальные штаммы и среды

2.2. Культивирование и подготовка бактерий S. epidermidis

2.3. Определение количества колониеобразующих единиц

2.4. Определение способности бактерий S. epidermidis к секреции полисахаридного межклеточного адгезина

2.5. Определение минимальной подавляющей концентрации

2.6. Определение дзета-потенциала бактериальных клеток

2.7. Выделение полной геномной ДНК

2.8. Предобработка поверхности полистирола плазмой, сывороточными белками и катионными пептидами

2.9. Определение гидрофобности поверхностей бактериальных клеток и полистирола

2.10. Предобработка бактериальных клеток гидролитическими ферментами и антибактериальными пептидами

2.11. Определение адгезионной способности бактериальных клеток

2.12. Определение биопленкообразующей способности бактерий

2.13. Изучение действия ферментов и антибактериальных соединений на суточные биопленки

2.14. Атомно-силовая микроскопия

2.15. Получение и анализ фильтратов среды с ранних этапов образования биопленок

2.16. Статистика

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ ШТАММОВ

БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА АДГЕЗИЮ

БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS

4.1. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от гидродинамических условий культивирования

4.2. Изучение влияния температуры среды инкубации на адгезию бактерий S. epidermidis

4.3. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от кислотности среды............. 60

4.4. Влияние осмолярности среды на адгезию и образование биопленок бактерий S. epidermidis

4.5. Адгезия и образование биопленок бактериями S. epidermidis при внесении в среду глюкозы

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ, МЕНЯЮЩИХ СВОЙСТВА

БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОВЕРХНОСТИ, НА АДГЕЗИЮ И ОБРАЗОВАНИЕ

БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS

5.1. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от содержания в среде ионов двухвалентных металлов

5.2. Влияние ЭДТА на адгезию и развитие биопленок бактериями S. epidermidis71

5.3. Действие детергентов на адгезию бактерий S. epidermidis

5.4. Влияние бактерицидных соединений на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis

5.5. Действие мембранотропных соединений на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis

5.6. Действие гидролитических ферментов, периодата натрия и ДНК на адгезию и формирование биопленок бактериями S. epidermidis

5.7. Действие гидролитических ферментов и периодата натрия на сформированные биопленки бактерий S. epidermidis

ГЛАВА 6. ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА АДГЕЗИЮ И

ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ S. EPIDERMIDIS

6.1. Действие линезолида на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis

6.2. Действие антибактериальных пептидов на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis

ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ АДГЕЗИИ БАКТЕРИЙ S. EPIDERMIDIS В

ПРИСУТСТВИИ КОМПОНЕНТОВ КРОВИ

ГЛАВА 8. ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ АДГЕЗИИ БАКТЕРИЙ

S. EPIDERMIDIS

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Смена парадигмы в микробиологии, обусловленная пониманием выдающейся роли организованных микробных сообществ – бактериальных пленок – в формировании и функционировании всей биоты нашей планеты, определяет возрастающий интерес исследователей к процессам образования, персистенции и распространения этих особых живых структур.

В настоящее время уровень инфекционных заболеваний, в развитии которых формирование биопленок является главным патогенетическим событием, достигает 80% (Hidron et al., 2008). Характерной особенностью возбудителей этого вида патологических состояний является их высокая устойчивость к широко используемым в практике антибиотикам (Gill et al., 2005).

Staphylococcus, S. epidermidis, Бактерии рода в частности являются нормальными представителями микрофлоры кожи и слизистых человека и животных, составляя 65–90% от общей микрофлоры (Дерябин, 2000). Однако, способность стафилококков к образованию биопленок может приводить к возникновению осложнений, вплоть до летальных исходов, при заболеваниях, связанных с использованием долговременных медицинских устройств – внутрисосудистых и уретральных катетеров, контактных линз и различных полимерных и металлических трансплантатов. Обладая тропностью к различным материалам, коагулазонегативные стафилококки становятся возбудителями внутрибольничных инфекций, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом (Vuong and Otto, 2002). В связи с этим, изучение механизмов колонизации различных поверхностей и, в частности, первых этапов этого процесса, а также поиск путей предотвращения формирования бактериальных пленок имеют существенное значение для разработки стратегий предупреждения формирования биопленок как сапрофитных, так и патогенных бактерий.

Несмотря на большое количество работ, характеризующих роль бактерий S. epidermidis в развитии имплантат-ассоциированных инфекций, механизмы адгезии и формирования биопленок стафилококками до сих пор остаются изученными недостаточно (Otto, 2012). В связи с этим, получение новых данных о процессах бактериальной колонизации может значительно углубить понимание механизмов заселения стафилококками полимерных поверхностей и явиться основой для разработки эффективных способов предупреждения и борьбы с инфекциями, обусловленными формированием биопленок этими бактериями.

Цель настоящей работы – изучение чувствительности первых этапов процессов образования биопленок бактерий S. epidermidis к факторам внешней среды и ряду антибактериальным соединениям.

Основные задачи исследования:

1. Изучить влияние физико-химических параметров внешней среды (гидродинамические условия, температура, рН, осмолярность среды, концентрация глюкозы) на адгезию бактерий S. epidermidis к поверхностям полистирола и стекла.

2. Оценить роль катионов ряда биоактивных металлов (кальция, магния, цинка и марганца) в процессах адгезии и первых этапах образования биопленок бактериями S. epidermidis.

3. Охарактеризовать действие факторов, влияющих на свойства поверхностных структур бактериальных клеток (детергенты, мембранотропные соединения и гидролитические ферменты), на сорбционную активность и S. epidermidis формирование биопленок бактериями на поверхностях полистирола.

4. Исследовать влияние антибиотических соединений (линезолида и низкомолекулярных катионных пептидов) на адгезию бактерий S. epidermidis.

5. Оценить роль белковых компонентов крови в процессах колонизации поверхностей полистирола бактериями S. epidermidis.

6. Проанализировать возможность функционирования механизмов регуляции процессов адгезии бактерий S. epidermidis.

Научная новизна Впервые показано, что повышение осмолярности среды вызывает одинаковое S. epidermidis снижение численности сорбирующихся бактерий вида на гидрофобной и гидрофильной поверхностях. Установлено значение - и рНкомпонент мембранного потенциала бактерий S. epidermidis в процессах их сорбции и формирования биопленок. Выявлено видоспецифическое стимулирующее действие внеклеточной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis.

Обнаружена возможность предупреждения формирования биопленок бактериями S. epidermidis, в том числе их антибиотикоустойчивыми штаммами, внесением в среду культивирования низкомолекулярных катионных пептидов. Получены важные временные характеристики ингибирующего эффекта низкомолекулярных пептидов варнерина и хоминина на развитие биопленок бактерий S. epidermidis.

Оригинальными являются результаты исследований, показавших, что адгезия S. epidermidis бактерий сопровождается выделением во внешнюю среду соединений, по-видимому, обладающих ауторегуляторными функциями.

Теоретическая и практическая значимость работы Полученные результаты расширяют представления об особенностях адгезии и первых этапов образования биопленок бактериями S. epidermidis как при изменении физико-химических параметров внешней среды, так и под действием факторов, влияющих на поверхностные структуры бактериальных клеток.

Ингибирующее действие низкомолекулярных антибактериальных пептидов на процессы адгезии и первые этапы формирования биопленок стафилококков свидетельствуют о перспективах использования этих соединений для обработки поверхностей медицинских замещающих устройств с целью предупреждения формирования на их поверхностях биопленок коагулазонегативных стафилококков.

Положения, выносимые на защиту

1. Динамика связывания бактерий S. epidermidis с поверхностями атакуемых материалов существенно зависит от изменения физико-химических параметров внешней среды – гидродинамических условий, температуры, рН, осмолярности среды, концентрации энергетического субстрата.

2. Изменение физико-химических характеристик поверхности бактерий S. epidermidis под действием факторов внешней среды – катионов биоактивных металлов, детергентов, ионофоров, ферментов – оказывает существенное влияние на их адгезию к гидрофобной поверхности полистирола.

3. Низкомолекулярные катионные пептиды семейства лантибиотиков S. epidermidis, вызывают значительное снижение адгезии бактерий способствующее выраженному ингибированию первых этапов образования ими биопленок на поверхностях полистирола.

4. Обработка поверхностей полистирола белковыми компонентами крови приводит к существенным, определяемым природой белков, изменениям сорбции на них бактерий S. epidermidis.

5. Адгезия бактерий S. epidermidis сопровождается выделением в среду низкомолекулярных соединений, по-видимому, участвующих в регуляции начальных этапов колонизации бактериями атакуемой поверхности этого материала.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на I Всероссийской с международным участием школеконференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», Пермь, 2011; VIII Молодежной школеконференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2012;

5th Congress of European Microbiologists, FEMS, Leipzig, 2013; VI Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых ученых-биологов «СимбиозРоссия», Иркутск, 2013; 18-ой международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века», Пущино, 2014; III International Conference on Antimicrobial Research, Madrid, 2014.

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Работа изложена на 137 страницах Объем и структура работы.

машинописного текста и включают 20 таблиц и 43 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы содержит 227 источников, в том числе 16 отечественных и 211 зарубежных.

Связь работы с крупными программами и собственный вклад автора.

Работа выполнена в лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (11-04-96025р_урал_а, 12-04-01431-а и 14-04-00687), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (12-П-4и грантом Министерства образования и науки Пермского края «Международные исследовательские группы» (С-26/632).

Научные положения и выводы полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АМП – антимикробный пептид БАИ – биоматериал-ассоциированные инфекции БСА – бычий сывороточный альбумин ДНК – дезоксирибонуклеионовая кислота ДНК КРС – ДНК из селезенки крупного рогатого скота КНС – коагулазонегативные стафилококки КОЕ– колониеобразующая единица МПК – минимальная подавляющая концентрация ФБ – натрий-фосфатный буфер Фг – фибриноген Фн – фибронектин ЭДТА – этилендиаминтетраацетат экзДНК – внеклеточная ДНК Aap – ассоциированный с накоплением белок Bhp – Bap-гомологичный белок CCCP – карбонил-цианид-m-хлорфенилгидразон IgG – иммуноглобулин G LB – среда Лурия-Бертани MSCRAMMs – компоненты микробной поверхности, узнающие адгезивные молекулы матрикса OD570 – оптическая плотность при длине волны 570 нм OD600 – оптическая плотность при длине волны 600 нм PIA – полисахаридный межклеточный адгезин QS – система «quorum sensing»

Ra – средняя шероховатость Rz – средняя разница в высоте SDS – додецилсульфат натрия

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробные биопленки На протяжении значительного периода времени микроорганизмы характеризовались как одноклеточные формы жизни – свободноплавающие планктонные клетки, что оказало неоспоримое влияние на развитие метода «чистых культур» и понимание микробной физиологии (Davey, O’Toole, 2000).

Однако, с развитием методов микроскопии и молекулярно-генетических методик стало возможным прямое наблюдение огромного разнообразия микроскопических обитателей природных ниш, подтвердившее, что большинство бактерий существуют в этих условиях не в планктонном состоянии, а в виде прикрепленных к поверхностям упорядоченных сообществ – биопленок (Costerton et al., 1978).

С исторической точки зрения, открытие микробных биопленок можно связать с Антонием Ван Левенгуком, который в XVII веке, используя простой микроскоп, первым наблюдал микроорганизмы, выделенные из собственного зубного налета. Значительно позднее, в середине XX века, было обнаружено, что рост и жизнедеятельность бактерий существенно усиливаются при наличии поверхностей, к которым бактерии могут прикрепляться, и что число микроорганизмов на этих поверхностях значительно выше, чем в окружающей их среде (Zobell, 1943). А в 1978 г. Costerton с соавт. уже постулировали общую теорию господства биопленок (Costerton et al., 1978).

В настоящее время признано, что в естественной среде более чем 99% всех бактерий существуют в виде биопленок (Hall-Stoodley and Stoodley, 2009).

Это наводит на мысль о существенном преимуществе иммобилизованных на поверхностях бактериальных клеток перед планктонными. По-видимому, это связано с тем, что прикрепленные к поверхности бактерии находятся в более благоприятной среде с позиции защиты от внешних неблагоприятных факторов (Davey and O’Toole, 2000). Действительно, бактерии, находящиеся в биопленке, отличаются от растущих в планктоне как физиологически, так и по фенотипу (Hall-Stoodley et al., 2004). Главные фенотипические изменения в них связаны со специфической транскрипцией генов, изменением скорости роста, дыхания, потребления кислорода, уровня электрон-транспортной активности, синтеза внеклеточных полимеров, активности потребления субстратов и резистентности к антибиотическим факторам (Wilson, 2001; Donlan, 2002). Действительно, показано, что иммобилизованные в биопленках бактерии до 1000 раз более устойчивы к антибиотикам и факторам иммунной защиты хозяина по сравнению со свободно живущими клетками (Ceri et al., 1999).

В настоящее время биопленки могут быть определены как сообщества бактерий, которые необратимо прикреплены к биотической или абиотической поверхностям и заключены в межклеточный полимерный матрикс (Costerson et al., 1999). Этот матрикс преимущественно включает в себя такие внеклеточные полимерные вещества, как полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и другие соединения, которые синтезируются клеточными элементами и экспортируются на их поверхность и в окружающую среду, заполняя прилегающее межклеточное пространство (Davey, O’Toole, 2000).

1.1.1. Образование биопленок Образование биопленок включают в себя две основные функциональные фазы: первичную адгезию с адаптацией бактерий к поверхности и формирование многослойных клеточных слоев и кластеров, обусловленное продукцией внеклеточного полимерного матрикса (O’Toole et al., 2000). На начальной стадии бактериальной колонизации клетки приближаются к поверхности настолько близко, что их подвижность снижается, и возникают кратковременные контакты с поверхностью. В этот период первичная адгезия микроорганизмов в значительной степени определяется физико-химическими свойствами поверхностей как бактериальных клеток, так и атакуемого материала (von Eiff et al., 2002).

Главными действующими силами на этом этапе являются силы Ван-дер-Ваальса, уровень гидрофобности клеточной поверхности (Oliveira et al., 2001), величина заряда сорбирующихся клеток (van Loosdrecht et al., 1990), а так же гидрофобность, заряд, шероховатость и химический состав поверхности атакуемого материала (An and Friedman, 2000).

Гидрофобность клеточной поверхности и первичная адгезия бактерий, во многом, зависят от присутствия бактериальных поверхностно-ассоциированных белков (von Eiff et al., 2002). Однако, в природе бактерии чаще прикрепляются, не непосредственно к субстрату, а к слою адсорбированных на его поверхности молекул, так называемой «кондиционной пленке». В этом случае, прикрепление бактериальных клеток, в основном, зависит от специфических взаимодействий бактериальных адгезинов с их комплементарными рецепторами, находящимися на поверхности атакуемого субстрата. Такие особые белковые молекулы известны как компоненты микробной поверхности, узнающие адгезивные молекулы матрикса (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules, MSCRAMMs) (Patti et al., 1994). Одним из примеров такого типа поверхностных белков, взаимодействующих с матричными белками поверхностных структур, может служить Fbe – фибриноген-связывающий белок Staphylococcus epidermidis, локализованный на поверхности клеточной стенки (Vuong and Otto, 2002).

При завершении этапа первичной адгезии к поверхности материала в иммобилизованных бактериях активируются процессы деления и размножения с формированием микроколонии, создающих многослойные клеточные кластеры. В этом процессе принимают участие межклеточные адгезины и синтезируемые внеклеточные полимерные матричные молекулы, включающие белки и полисахариды.

С увеличением бактериальной популяции клетки начинают продуцировать химические сигналы, с помощью которых, через системы «quorum sensing» (QS) контактируют с другими бактериальными клетками. Установлено, что данные механизмы способны регулировать широкий спектр физиологических процессов (Ильина и др., 2006), в том числе, активировать гены, ответственные за продукцию экзополисахаридов (Costerson et al., 1999). Продолжающийся рост прикрепленных микроорганизмов приводит к образованию бактериальных агрегатов, погруженных в экзополимерный матрикс, характерный для зрелых биопленок (Wilson, 2001).

Под воздействием сильных механических и гидродинамических усилий, а так же регуляции по механизму QS зрелые биопленки могут вступать в процесс диссеминации с высвобождением в окружающее пространство отдельных клеток или их кластеров. В дальнейшем отделившиеся фрагменты могут колонизировать другой район субстрата с образованием новых микроколоний или диссеминировать в пространстве и формировать очаги образования биопленок на отдаленных от локализации первоначальной пленки субстратах (Chmielewski and Frank, 2003).

Протяженность процесса образования биопленок стафилококками, стрептококками и псевдомонадами чаще всего составляет около 2-4 дней и распределяется по основным этапам следующим образом: планктонные бактерии сорбируются на абиотической поверхности в течение нескольких минут (Frank, 2001); в течение последующих 2–4 ч образуются прочно соединенные микроколонии; в течение 6–12 часов с момента прикрепления к субстрату активируется продукция внеклеточных полисахаридов, и вместе с ней, появляется устойчивость к неблагоприятным условиям среды; затем в течение 2-4 дней в зависимости от вида бактерий и условий роста зрелые колонии биоплёнки, проходят процесс созревания и диссеминации от поверхности с высвобождением планктонных бактерий (Афиногенова и Даровская, 2011).

1.1.2. Структура биопленок С помощью современных видов микроскопии, таких как конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, а так же молекулярных и электрохимических методов высокого разрешения были исследованы структурная организация и функции сообщества биопленок. Исходя из современных данных, зрелые биопленки представляют собой высокогетерогенное организованное сообщество, структура которого представляет микроколонии бактериальных клеток, заключенные в разделенный водными каналами внеклеточный полимерный матрикс (Donlan and Costerton, 2002). В основном, всем типам биопленок присущи некоторые универсальные структурные атрибуты, но, несмотря на это, каждое микробное сообщество уникально (Tolker-Nielsen and Molin, 2000). В зависимости от свойств поверхности, доступности питательных веществ, состава и уровня гетерогенности микробного сообщества и гидродинамики структура биопленок может колебаться от модели плотной биопленки до рыхлой мозаичной модели, структура которой представляет собой сложную организацию, включающую грибоподобные агрегаты, разделенные водными пространствами (Николаев и Плакунов, 2007). Последний тип структуры обычно рассматривается как типичная архитектура биопленок (Costerton, 1995), характерная для сообществ, образованных при низких концентрациях питательных веществ, высоком сдвигающем усилии потока и отсутствии механических, абразивных и сжимающих сил (Wilson, 2001).

Считается, что вода является главным компонентом матрикса биопленки, на долю которого приходится до 97% (Zhang et al., 1998). Тогда как содержание бактерий составляет 10–50% от общего объема биопленки (Costerton, 1995).

Количество внеклеточных полимерных веществ колеблется в пределах 50–90% от общего количества органического углерода в биопленках (Flemming et al., 2000).

Кроме полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот или фосфолипидов в матриксе биопленок также могут быть обнаружены другие неклеточные материалы, такие как кристаллы минеральных соединений или компоненты крови, присутствие которых зависит от окружающей среды, в которой развивалось это сообщество (Donlan, 2002).

Водные каналы, которые отделяют погруженные в матрикс микроколонии, необходимы для поддержания жизнеспособности биопленки, так как они, представляя собой по сути сосуды, доставляют питательные вещества глубоко внутрь сложных сообществ (Stoodley et al., 2002), позволяя обмениваться продуктами метаболизма в слоях жидкостей (Costerton, 1995).

Гидродинамический поток жидкостей над и внутри биопленок также может содействовать отделению от поверхности небольших фрагментов с живыми клетками, которые могут переноситься потоком жидкости и откладываться где-то в другом месте для дальнейшей колонизации поверхности во внутренней среде макроорганизма (Dunne, 2002).

В биопленках клетки обмениваются информацией с помощью сигналов, так называемой системы QS, которые являются молекулами особых соединений, способными регулировать экспрессию генов, чувствительных к плотности клеток (Kong et al., 2006). Сигнальные молекулы QS грамположительных бактерий чаще всего являются пептидами, сравнимыми с феромонами и гормонами, которые управляют клеточным делением, и, кроме того, уровнем плотности популяции биопленки, а так же продукцией экзополимерного матрикса (Donlan and Costerton, 2002; Kong et al., 2006). Сложный уровень структурной организации объясняет поразительную метаболическую эффективность микробных биопленок.

1.1.3. Биопленки и биоматериал-ассоциированные инфекции Бактериальная адгезия к поверхности медицинских устройств рассматривается как основополагающий механизм возникновения внутрибольничных инфекций, т.е. инфекций, которые не были диагностированы на момент госпитализации пациента. Основными медицинскими имплантатами, которые подвергаются опасности инфицирования, являются внутривенные (центральные венозные катетеры); сердечнососудистые (сердечные клапаны, коронарные шунты); нейрохирургические (шунты желудочков, имплантируемые неврологические стимуляторы); ортопедические (артропротезы, устройства фиксации переломов); офтальмологические (большинство контактных линз) и стоматологические (зубные протезы) (von Eiff et al., 2005). Следует отметить, что поверхность катетеров, таких как центральный венозный катетер, внутривенный или мочевой катетеры, наиболее благоприятна для образования биопленок (Davey and O’Toole, 2000). Действительно, биоматериал-ассоциированные инфекции (БАИ), и, в частности, связанные с введением центрального венозного катетера, являются основной причиной развития бактериемии у госпитализированных пациентов (Elliott, 1993). При этом главным источником микробного инфицирования является место введения этих устройств в кожу, откуда бактерии мигрируют по внутрикожному пути на наружную поверхность катетера, приводя к последовательной внешней колонизации катетера или сепсису (Worthington et al., 2000). Таким образом, бактериальное обсеменение медицинских имплантатов способствует образованию на их поверхностях биопленок, которые обладают выраженной устойчивостью к факторам иммунной защиты хозяина (von Eiff et al.,

1999) и антибиотикам (Donlan and Costerton, 2002). Повышение устойчивости бактерий в биопленках к химико-терапевтическим факторам является результатом высокой фильтрующей способностью биоплёнок (Чеботарь и др., 2012), а также увеличения числа фенотипических изменений, которые обеспечивают резистентность бактериальных клеток в среде биопленки, и индукции инактивирующих антибиотики ферментов (Gilbert et al., 1997).

Многочисленные исследования биопленок показали, что основными микроорганизмами, ответственными за образование биопленок на имплантируемых устройствах являются дрожжи (Candida species), грамположительные (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans) и грамотрицательные (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa) бактерии (Табл. 1) (Davey and O’Toole, 2000).

Таблица 1 Заболевания или осложнения, обусловленные бактериальным инфицированием медицинских замещающих устройств

–  –  –

Выявлено, что в течение последних 20 лет у 6–14 % пациентов, помещенных в общий госпиталь, развиваются внутрибольничные инфекции (Vazquez-Aragon et al., 2003). В целом, до 65% всех нозокомиальных инфекций являются следствием развития и функционирования биопленок (Романова и Гинзбург, 2011). Данный факт позволяет рассматривать инфекции, связанные с образованием и функционированием биопленок, как основную причину заболеваемости и смертности. Кроме того, часто единственным выходом из таких состояний является хирургическое удаление инфицированных имплантированных устройств, которое, к сожалению, сопровождается дополнительными затратами материальных и человеческих ресурсов (Vinh and Embil, 2005; Wilson, 2001).

1.2. Бактерии рода Staphylococcus Бактерии рода Staphylococcus представляют собой грамположительные кокки, 0,5 – 1,5 мкм в диаметре и имеют низкое (около 33-40%) содержание Г+Ц в ДНК (Дерябин, 2000). Они чаще всего соединены в кластеры, которые напоминают гроздь винограда, но также могут встречаться в виде одиночных клеток или пар. Родовое имя Staphylococcus пришло из Греции (staphyle и kokkos), что означает «гроздь винограда», так как под микроскопом окрашенные по Граму бактерии очень часто напоминают такую же картину (Хоулт и др., 1997).

Впервые стафилококки были выделены Розенбахом (Rosenbach, 1884), который описал две пигментированные колонии и предложил соответствующую номенклатуру: Staphylococcus aureus (желтые) и Staphylococcus albus (белые).

Стафилококки являются факультативными анаэробами, энергетика роста которых обеспечивается аэробным дыханием либо путем анаэробного расщепления углеводов, конечным продуктом которого является молочная кислота (Хоулт и др., 1997; Gtz et al., 2006). Характерной особенностью стафилококков является окружающая клеточную мембрану мощная клеточная стенка, содержащая до 60 слоев пептидогликана, а так же тейхоевые и липотейхоевые кислоты (Дерябин, 2000). Каталазный тест очень важен для различия стрептококков (каталазанегативные) от стафилококков, которые являются сильными продуцентами каталазы. Важной характеристикой этих бактерий является высокая устойчивость к дегидратации (Хоулт и др., 1997), особенно когда они связаны с органическими субстратами, такими как кровь, гной и тканевые жидкости.

В зависимости от способности к продукции коагулазы, внеклеточного фермента, превращающего фибриноген в фибрин и вызывающего свертывание крови, стафилококки подразделяются на коагулазоположительные и коагулазонегативные. К первой группе относятся 5 видов стафилококков, среди является S. aureus, которых самым известным тогда как большинство представителей рода Staphylococcus относятся ко второй группе (Vuong and Otto, 2002). Эти бактерии являются привычными обитателями кожных покровов, слизистых дыхательных путей, кишечника и влагалища. Так же они известны под названием пиогенные кокки, т.е. производящие гной кокки, и в определенных условиях вызывающие различные гноеродные заболевания у людей, включая абсцессы, карбункулы, фолликулиты, синдром ошпаренной кожи (Дерябин, 2000).

К настоящему времени описано 42 вида бактерий, входящих в род Staphylococcus (Ghebremedhin et al., 2008), но S. aureus и S. epidermidis являются одними из наиболее значимых во взаимодействиях с человеком (Дерябин, 2000).

Это связано с тем, что до 30% здоровых людей являются носителями S. aureus, который наиболее часто колонизирует слизистые оболочки носа (DeLeo et al., 2010). Обычно носительство протекает бессимптомно, но в случае ослабления S. aureus иммунитета способен вызвать гнойно-воспалительные процессы практически всех тканей (Lowy, 1998). Представители вида S. epidermidis так же обычно являются частью нормальной флоры кожи здоровых людей, но с ними связано большое число БАИ (Otto, 2009).

1.1.1. Бактерии вида S. epidermidis S. epidermidis Вид является наиболее значительным представителем коагулазонегативных стафилококков (КНС) и составляет самый распространенный вид, главными нишами обитания которого является кожа и слизистые человека и животных, представляя важную часть нормальной микрофлоры – содержание всех стафилококков, выделенных из этих источников, составляет 65–90% от общей микрофлоры (Дерябин, 2000).

Как уже упоминалось выше, с точки зрения диагностики КНС отличаются от S. aureus по отсутствию продукции коагулазы (Vuong and Otto, 2002). Кроме того, КНС можно разделить на 2 группы в соответствии с их устойчивостью или чувствительностью к действию новобиоцина (von Eiff et al., 2002; Дерябин, 2000).

Вызываемая КНС бактериемия протекает, в основном, относительно легко и при соответствующем лечении быстро проходит. Вместе с тем имеются данные о смертельных исходах, в частности, у пациентов с ослабленным иммунитетом, а так же в случаях, когда инфекция вызвана несколькими вирулентными штаммами (Otto, 2009).

1.2.2. Роль S. epidermidis в БАИ В последние годы становится очевидным, что бактерии S. epidermidis являются одной из главных причин внутрибольничных БАИ (von Eiff et al., 2002;

Hidron et al., 2008). Следовательно, штаммы S. epidermidis живут и как комменсалы, и как патогены, создавая стратегии для того, чтобы преобразовать госпитальную среду обитания в новую для себя экологическую нишу (Ziebuhr et al., 2006). Согласно последним данным, коагулазонегативные стафилококки занимают первое место среди инфекций кровотока, связанных с центральными венозными катетерами (20,5%), второе место среди хирургических инфекций (11,7%) и третье место среди всех инфекций (11,4%) (Sievert et al., 2013). Кроме БАИ бактерии S. epidermidis также ответственны за эндокардит клапанов у новорожденных пациентов (Nishizaki et al., 2013).

Стафилококковые инфекции обычно развиваются при длительной госпитализации, а также у пациентов с ослабленным иммунитетом из-за приема иммунносупрессирующих препаратов или недоношенных детей (Ziebuhr et al., 2006). В отличие от S. aureus, которые вызывают острые инфекции, бактерии вида S. epidermidis в основном, являются этиологическими факторами хронических инфекций, которые длятся от месяца до года после введения протеза (Wilson and Devine, 2003). Важно отметить выраженную устойчивость и способность к рецидивам инфекций S. epidermidis и проявление выраженной патогенности при проникновении во внутренние среды (Gill et al., 2005).

Как уже было отмечено выше, развитие стафилококковых инфекции при заселении постоянных медицинских устройств включает два главных этапа:

адгезию клеток S. epidermidis к поверхности биоматериала и аккумуляцию на ней клеток с образованием биопленок. Хотя второй этап является наиболее значимым на патогенетическом этапе возникающей стафилококковой инфекции (Batzilla et al., 2006), поиск путей предотвращения развития инфекции на этапе сорбции клеток к поверхности кажется более перспективным.

1.3. Факторы, влияющие на первые этапы образования биопленок 1.3.1. Окружающая среда Бактериальная адгезия определяется физико-химическими свойствами прикрепляющихся клеток, субстрата и окружающей среды (von Eiff et al., 2002).

Большая часть факторов среды, такие как её состав (Hussain et al., 1992), гидродинамические условия (Neu and Marshall, 1990), температура (Fitzpatrick et al., 2005; Silva Meira da et al., 2012), время контакта, концентрация бактерий или присутствие антибиотиков и дезинфектантов (Cerca et al., 2005a; Стрелкова и др,

2012) могут влиять на бактериальную адгезию.

Так, известно, что рост биопленок некоторых штаммов КНС индуцировался введением в среду инкубации глюкозы (Mack et al., 1992; Rachid et al., 2000), тогда как мальтоза, лактоза, глюкоза и сахароза ингибировали адгезию S. aureus к эритроцитам (Фалова, 2011). Возможно, такой механизм стимуляции адгезии и последующего развития биопленок S. epidermidis связан с антиоксидантным действием глюкозы (Aiassa et al., 2012).

В проточных условиях показатели потока являются важным фактором в прикреплении бактерий к твердой поверхности (Stepanovi et al., 2001). Адгезия бактерий оптимальна при сдвигающем усилии в пределах 60–80 дин/см2, но также возможна при силе сдвига до 1300 дин/см2 (An and Friedman, 2000). Сдвигающие усилия в пределах 0–100 дин/см2 лежат в области физиологических значений и встречаются в кровеносной системе человека (Goldsmith and Turitto, 1986).

Показано, что сдвигающее усилие в 18,2 дин/см2 не влияет на адгезию бактерий S. epidermidis к полиэтилену в фосфатном буфере (Wang et al., 1993), тогда как кинетика адгезии S. aureus к коллагену зависит от усилий сдвига в пределах от 0 до 15 дин/см2 (Li et al., 2000).

Разнообразные исследования адгезии бактерий S. epidermidis и S. aureus показали зависимость этого процесса от температуры. Повышение температуры до 42°С стимулирует связывание бактерий S. epidermidis с поверхностью полистирола и последующее образование биопленок (Rachid et al., 2000). В то же время существуют данные, свидетельствующие о том, что понижение температуры среды до 30°С оказывает такой же стимулирующий эффект (Fitzpatrick et al., 2005).

Повышение ионной силы раствора усиливает адгезию бактерий по сравнению с исходной при концентрации соли менее 0,1 M NaCl (Gordon and Millero, 1984). Однако, при более высоких значениях возможна вариабельность последствий. Так, повышение осмолярности среды путем добавления NaCl до 0,85 М способствует адгезии биопленко-отрицательного штамма S. epidermidis 220 на поверхности полистирола (Rachid et al., 2000). В то же время, есть данные о том, что 0,776 M NaCl в 10 раз снижает адгезию бактерий S. epidermidis RP62A, известных как продуцента полисахиридного межклеточного адгезина (PIA) (Stewart et al., 2013). Возможно, эти противоречивые данные отражают физикохимические особенности поверхности клеток указанных штаммов стафилококков.

Содержание CO2 в среде (Hussain et al., 1992), как и кислотность (рН) среды культивирования также влияют на бактериальную адгезию. При снижении значений рН до 5,0 и 6,0 адгезия S. epidermidis, в основном, ниже, чем при рН 7,0 (Dunne Jr and Burd, 1992). Щелочные значения рН снижают как образование S. epidermidis, биопленок так и степень гидрофобности бактериальной поверхности (Nostro et al., 2012).

Показано, что присутствие ионов железа стимулирует адгезию S. aureus (Lin et al., 2012). В то же время, ионы кальция оказывают противоположный эффект, вызывая зависимое от концентрации снижение образование биопленок S. aureus (Shukla and Rao, 2013). Наличие в среде ионов магния и кальция в концентрации до 128 мМ существенно усиливает продукцию внеклеточных полимеров и образование биопленок 15 клиническими изолятами S. epidermidis, причем эффект ионов магния выражен в значительно большей степени (Dunne Jr and Burd, 1992).

Показано, что содержание в среде высоких концентраций ЭДТА (до 40 мМ) приводит к снижению адгезии бактерий S. epidermidis (Dunne and Burd, 1992), Кроме того, присутствие в среде ЭДТА способно заметно снизить образование биопленок бактериями Listeria monocytogenes, не влияя на рост планктонных клеток, при этом внесение ионов двухвалентных металлов не восстанавливает прежний уровень биопленки, следовательно, действие ЭДТА основано не на хелатных свойствах этого соединения (Chang et al., 2012).

Добавление в среду инкубации изопропанола и этанола индуцирует образование биопленок негативного по этому признаку штамма S. epidermidis (Chaieb et al., 2011; Rachid et al., 2000). Данный эффект был подтвержден для 18 из 37 клинических штаммов S. epidermidis, которые выявили повышение биопленкообразования в присутствии этих соединений (Knobloch et al., 2002).

Перекись водорода и гидроксильные радикалы в концентрациях 0,5 и 0,05 мМ вызывают снижение адгезии E. coli, S. aureus, K. pneumoniae к эритроцитам на 7 – 17%. Одновременно с этим, выявлена стимуляция образования биопленок бактериями E.

coli, S. aureus, K. pneumoniae на 11 – 40% активными формами кислорода (Бухарин и Сгибнев, 2012). В то же время показано, что перекись водорода в концентрации от 1 до 5% снижает образование биопленок. Однако, субингибиторные концентрации этого соединения (0,125 и 0,25%) стимулировали образование биопленок на поверхности полистирола бактериями штамма S. epidermidis S22, характеризующегося слабой способностью к формированию биопленок (Chaieb et al., 2011). Выявлено, что D-глюкозамин снижает адгезию S. epidermidis за счет опосредованного дозо-зависимого повышения в его присутствии концентрации активных форм кислорода (Aiassa et al., 2012).

Внесение антибиотиков в среду инкубации также влияет на адгезию и размножение бактерий на атакованных поверхностях. Культивирование бактерий S. epidermidis при субингибиторных (0,5хМПК) концентрациях цефазолина, клиндамицина и ванкомицина приводит к снижению адгезии на 30-80% (Pascual et al., 1986). Показано также, что субингибиторные концентрации ванкомицина, диклоксацилина и цефазолина способны ингибировать адгезию клеток КНС до 70% (Cerca et al., 2005a). Сублетальная доза ванкомицина уменьшает адгезию S. epidermidis в 10 раз (Stewart et al., 2013). Вместе с тем, имеются и противоположные данные, свидетельствующие о том, что субингибиторные концентрации эритромицина и тетрациклина повышают биопленкобразование S. epidermidis в 2,5 и 9 раз, соответственно (Rachid et al., 2000).

Представленное выше позволяет считать, что факторы окружающей среды могут оказывать влияние на бактериальную адгезию либо путем изменения физико-химических взаимодействий между бактерий и поверхностью на первых этапах адгезии, либо изменяя поверхностные характеристики бактериальных клеток или материала.

1.3.2. Поверхность материала К факторам, которые могут влиять на адгезию бактерий к твердой поверхности, можно также отнести химический состав материала (Oga et al., 1993), поверхностный заряд (Hogt et al., 1985a), гидрофобность и свободную энергию поверхности (Oliveira et al., 2001), а также шероховатость поверхности (An et al., 1995).

Согласно исследованиям Gristina с соавт. бактерии вида S. epidermidis предпочтительно прикрепляются к полимерным поверхностям, а микроорганизмы вида S. aureus – к металлическим (Gristina et al., 1987). Эти данные могут объяснить тот факт, что инфекции, вызываемые бактериями S. epidermidis, чаще всего ассоциированы с полимерными имплантатами, а бактерии вида S. aureus, обычно вызывают развитие БАИ, связанных с использованием металлических имплантатов.

Выявлено, что поверхность металлокерамики с добавлением S. epidermidis гидроксиапатита была наиболее атакуемой бактериями по сравнению с поверхностями нержавеющей стали, титана и титана с металлокерамическим покрытием (Oga, et al., 1993). Показано, что численность связывающихся с поверхностью металлов бактерий, зависит от типа металлических материалов (Shida et al., 2013).

Обнаружено значительное количество соединений, покрытие которыми поверхностей различных материалов препятствует бактериальной адгезии.

Например, использование детергентов (Bridgett et al., 1992), нестероидных противовоспалительных препаратов (Baveja et al., 2004; Flemming et al., 2000), а так же серебра (Marambio-Jones and Hoek, 2010) приводит к существенному снижению сорбции микробных клеток.

Гидрофобность поверхности субстратов является одним из самых важных свойств, оказывающих влияние на процесс бактериальной адгезии (Wiencek and Fletcher, 1997). Действительно, показано, что гидрофильные материалы более устойчивы к бактериальной адгезии по сравнению гидрофобными (Cerca et al., 2005b; Hogt et al., 1985a). Возможно, это связано с тем, что в водных средах адгезия между гидрофобными поверхностями наиболее предпочтительна, так как они могут входить в наиболее близкий контакт путем слияния и удаления слоя воды между ними (Wuertz et al., 2008).

Покрытие поверхности субстратов белками, снижающими гидрофобность, такими как бычий сывороточный альбумин (БСА), бычий гликопротеин или свободный от жирных кислот БСА, приводит к ингибированию бактериальной адгезии к «закрытой» поверхности (Fletcher and Marshall, 1982; Hogt et al., 1985a).

Подобный эффект БСА проявляется на многих типах полимерных поверхностей (Brokke et al., 1991; Patel et al., 2007). Показано так же, что изменение гидрофобности поверхностей титановых материалов (An and Friedman, 2000) и полимеров (Bridgett et al., 1992) путем покрытия их полиэтиленоксидом приводит к сокращению адгезии бактерий S. epidermidis на 98 и 97%, соответственно.

Гидрофобность поверхности материала оказывает большее влияние на бактериальную адгезию по сравнению с гидрофобностью самой бактериальной клетки, так как вне зависимости от значений собственной гидрофобности, адгезия бактерий S. epidermidis на поверхности гидрофобных материалов выше, чем на гидрофильной поверхности стекла (Cerca et al., 2005b). Данный эффект сохраняется и при сдвигающих усилиях до 65 дин/см2 (Katsikogianni and Missirlis, 2004).

Неровности поверхности материала обычно способствуют бактериальной адгезии и образованию биопленок (Scheuerman et al., 1998). Данный факт объясняется повышением как площади поверхности, так и количества микровпадин, которые обеспечивают более привлекательные места для колонизации (Katsikogianni and Missirlis, 2004). Однако, накопление бактерий в таких местах во многом зависит от размера бактерий и способа их деления.

(Katainen et al., 2006). И хотя подчеркивается чрезвычайно важная связь между ранними этапами бактериальной адгезии и шероховатостью поверхности (Scheuerman et al., 1998), имеются данные, свидетельствующие о том, что зависимость между шероховатостью поверхности и бактериальной адгезией не всегда линейна (Boyd et al., 2002). Так, небольшие увеличения в шероховатости могут привести к большим изменениям в адгезии бактерий, в то время как большое увеличение шероховатости может и не оказывать значительного эффекта на прикрепление клеток. В то же время показано, что снижение шероховатости поверхности приводит к значительному увеличению числа сорбированных клеток (Mitik-Dineva et al., 2008). Кроме того, в опытах in vivo показано, что шероховатость поверхности ниже пороговой величины (Ra=200 нм) не влияла на бактериальную адгезию (Tang et al., 2009). В дополнение к этому на металлических пластинах было установлено, что средняя шероховатость менее 10 нм имеет ограниченное влияние на адгезию S. epidermidis (Shida et al., 2013).

Тем не менее, несмотря на отрицание некоторыми авторами наличия корреляции между шероховатостью и бактериальной адгезией (Pereni et al., 2006), получены поверхности с субмикронной текстурой, способные противостоять связыванию с ними бактериальных клеток (Pogodin et al., 2013; Xu and Siedlecki, 2012a).

1.3.3. Характеристики бактериальной клетки Гидрофобность бактериальных клеток определяется архитектоникой поверхности их клеточных стенок, которая во многом отражает физиологическое состояние и условия обитания бактерий. Гидрофобность поверхности бактериальной клетки является важным физическим фактором, определяющим интенсивность адгезии, особенно когда поверхность субстрата обладает выраженными гидрофильными или гидрофобными свойствами. В основном, бактерии с гидрофобной поверхностью предпочитают материалы с такой же поверхностью, и наоборот, бактерии с выраженными обводненными внешними структурами предпочитают гидрофильные поверхности (Satou et al., 1988;

Vacheethasanee et al., 1998). Интересно отметить, что, в целом, гидрофобные бактерии сорбируются в большей степени, чем гидрофильные бактерии (van Loosdrecht et al., 1987). Так же было показано, что гидрофобность бактерий S. epidermidis хорошо коррелирует с адгезией к полистиролу (Galliani et al., 1994).

В случае же отделения клеток S. epidermidis с пониженной гидрофобностью с помощью обработки пепсином или экстракции водным раствором фенола, адгезия к фторэтиленпропилену заметно снижается или полностью сокращается (Pascual et al., 1986).

Однако, следует отметить, что результаты исследований по влиянию степени гидрофобности поверхности бактериальной клетки на адгезию бактерий могут зависеть от особенностей методов проведения исследования, поскольку скорость сдвига или поверхностное натяжение жидкой фазы могут существенно влиять на этот эффект. Так, было показало, что степень гидрофобности бактерий имеет определяющее значение при низких (0 – 8 дин/см2) скоростях сдвига и в свободных от белка растворах (Vacheethasanee et al., 1998). Таким образом, при высоких скоростях сдвига или в других растворах влияние бактериальной гидрофобности проявляется в меньшей степени.

Поверхностный заряд бактерий является другим важным физическим фактором, влияющим на взаимодействие бактерий с поверхностью. Однако, его влияние ограничивается лишь первыми этапами бактериальной колонизации (Hogt et al., 1985a; Jucker et al., 1996).



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Похожие работы:

«Бабкина Ирина Борисовна ИХТИОФАУНА БАССЕЙНА НИЖНЕЙ ТОМИ: ДИНАМИКА И СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ 03.02.04 – Зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Романов Владимир Иванович Томск – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение.. Глава 1....»

«Дандал Али Шебли ПАТОГЕНИТЕЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных...»

«БИТ-САВА Елена Михайловна МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЛЕЧЕНИЯ BRCA1/СНЕК2/BLM-АССОЦИИРОВАННОГО И СПОРАДИЧЕСКОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Специальности: 14.01.12 – онкология 03.01.04 – биохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор, член-корр. РАН В.Ф. Семиглазов Научный консультант:...»

«ВУДС ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА Фармакогенетические аспекты антиангиогенной терапии экссудативной формы возрастной макулярной дегенерации» 14.01.07 – Глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Будзинская Мария Викторовна кандидат биологических наук Погода Татьяна Викторовна Москва – 2015...»

«КУДРЯШОВА ЛЮДМИЛА ЮРЬЕВНА ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ АМЕРИКАНСКОГО ТРИПСА ECHINOTHRIPS AMERICANUS MORGAN И ПРИЁМЫ БОРЬБЫ С НИМ В ОРАНЖЕРЕЯХ СЕВЕРО-ЗАПАДА РФ Специальность 06.01.07 – Защита растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заслуженный...»

«УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических...»

«ЛИТВИНЮК ДАРЬЯ АНАТОЛЬЕВНА МОРСКОЙ ЗООПЛАНКТОН И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ЕГО ИЗУЧЕНИЯ Специальность 03.02.10. – Гидробиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Самышев Эрнест Зайнуллинович МОСКВА 2015 СОДЕРЖАНИЕ Стр. ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ РАЗДЕЛ 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. История изучения и методологические аспекты оценки...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ШАЯХМЕТОВ МАРАТ РАХИМБЕРДЫЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ПОЧВЕННОГО ПОКРОВА ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ НА ОСНОВЕ ДИСТАНЦИОННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ ЗЕМЛИ 03.02.13 – почвоведение Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Л.В. Березин Уфа...»

«Усов Николай Викторович Сезонная и многолетняя динамика обилия зоопланктона в прибрежной зоне Кандалакшского залива Белого моря в связи с изменениями температуры воды 25.00.28 – океанология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Руководители: доктор биологических наук, главный научный сотрудник А.Д. Наумов доктор биологических наук, ведущий...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«МАХАЧЕВА ХАННА ГАДЖИЕВНА СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ МОДЕРНИЗАЦИИ ОТОРИНОЛАРИНГОЛОГИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ В РЕСПУБЛИКЕ ДАГЕСТАН 14.01.03 – болезни уха, горла и носа 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Н.А. Дайхес доктор медицинских наук, профессор Л.М. Асхабова...»

«КОЛОТВИН АНДРЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ Прогностическая значимость генетического полиморфизма патогена и хозяина для оценки эффективности терапии и развития фиброза печени при хроническом гепатите С Молекулярная биология –...»

«Регузова Алёна Юрьевна Исследование специфической активности полиэпитопных Т-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования 03.01.03 – «молекулярная биология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные...»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«ЯКОВЛЕВ Роман Викторович Древоточцы (Ьер1^р1ега, Cossidae) Старого Света 03.02.05 энтомология диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2014 Оглавление Оглавление Введение Глава 1. История изучения древоточцев (Lepidoptera, Cossidae) Старого Света 1.1. Периоды изучения древоточцев Старого Света 1.1.1. Начальный этап 1.1.2. Этап первых...»

«ПЛОТНИКОВ ВАДИМ АЛЕКСЕЕВИЧ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ПТИЦ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 03.02.02 вирусология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководительдоктор биологических наук, профессор Алипер Т. И. Москва-20 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Щепитова Наталья Евгеньевна Биологические свойства фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«Дулепова Наталья Алексеевна ФЛОРА И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ РАЗВЕВАЕМЫХ ПЕСКОВ ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., c.н.с., А.Ю. Королюк Новосибирск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования 1.1. Район и объект исследования 1.2....»

«Шершнева Анна Михайловна ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ: ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА, ПРИМЕНЕНИЕ Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Шишацкая Екатерина Игоревна...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.